CN104862385B

CN104862385B - 等温核酸扩增

Info

Publication number: CN104862385B
Application number: CN201510103597.7A
Authority: CN
Inventors: M.J.霍瑟
Original assignee: Geneform Technologies Ltd
Current assignee: Geneform Technologies Ltd
Priority date: 2008-06-11
Filing date: 2009-06-11
Publication date: 2018-11-23
Anticipated expiration: 2029-06-11
Also published as: HRP20171356T1; US9657340B2; CN104862385A; CY1119346T1; EP2304054A1; DK2660336T3; LT2660336T; JP6301881B2; PL2304054T3; EP2660336A1; JP5798917B2; CA2727212A1; CN102119225A; PT2660336T; HRP20171286T1; US10472659B2; EP2660336B1; EP2304054B1; LT2304054T; SI2660336T1

Abstract

本发明涉及等温核酸扩增。一种扩增核酸靶分子的等温方法，其依赖于上游引物、下游引物、链插入系统和寡核苷酸，其中上游和下游引物不是扩增过程期间链插入系统的底物，并且没有链插入系统就不扩增靶分子，其中寡核苷酸是链插入系统的底物。

Description

等温核酸扩增

本申请是国际申请日为2009年6月11日的国际申请PCT/GB2009/050662进入中国、申请号为200980131223.9的题为“等温核酸扩增”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及核酸的扩增，尤其涉及用于扩增双链核酸靶分子的等温方法。

背景技术

在核酸和遗传材料技术范畴，经常需要确定基因、基因的一部分或核苷酸序列是否存在于活的生物体、该生物体的细胞提取物或生物样品内。因为任何基因或基因的一部分的特征在于特定序列的核苷酸碱基，所以只需要在包含多核苷酸混合物的样品中直接查找所述特定序列的全部或部分的存在。

对于特定多核苷酸序列的查找存在巨大兴趣，尤其是对于致病生物的检测，等位基因存在的确定，宿主基因组中病变存在的检测，或细胞宿主的特定RNA或修饰的存在。因此可以通过分析个体的核酸诊断遗传性疾病诸如亨廷顿氏病，Duchenne's病，苯丙酮酸尿症和β地中海贫血。还有可能通过使用核探针的测试诊断或鉴定病毒，类病毒，细菌，真菌，原生动物，或任意其他形式的植物或动物。

一旦已知生物体或疾病的特定序列，应当从样品提取核酸，并确定是否存在这种序列。核酸检测的各种方法已经在文献中描述。这些方法基于DNA-DNA，DNA-RNA，和RNA-RNA双链中互补核酸链的嘌呤-嘧啶配对的特性。这种配对过程通过双链DNA的腺嘌呤-胸腺嘧啶(A-T)和鸟嘌呤-胞嘧啶(G-C)碱基之间建立的氢键来实现；腺嘌呤-尿嘧啶(A-U)碱基对也可以通过DNA-RNA或RNA-RNA双链中的氢键键合形成。用于确定指定核酸分子的存在或缺失的核酸链配对通常被称为“核酸杂交”或简单地被称为“杂交”。

检测核酸样品中靶序列存在最直接的方法是获得“探针”，其序列与靶核酸的一部分充分互补以与其杂交。可以在包含核酸样品中使用预先合成的探针。如果存在靶序列，则探针将与靶形成杂交产物。当不存在靶序列时，将没有杂交产物形成。可以利用本领域已知的许多方法检测探针杂交。通常可以将探针与可检测的标记物缀合。荧光或酶标记物形成均匀体系中分子信标、Taqman以及其他可切割探针的基础。可选的，使用探针捕获扩增或标记的材料，这样的话可以将与扩增子杂交的探针和未杂交的材料分离后检测扩增子。

但是，这种方法的主要困难在于不直接适用于以下情况：样品中存在的靶序列拷贝数较低，低于大约10⁷个拷贝。在这些条件下，很难将探针与其靶序列的特异性粘附和探针与不同于靶序列的序列非特异性的粘附区分开来。这个问题的一个解决方案是使用由增强检测信号组成的扩增技术，通过设计用于特异性并且显著增加靶核酸片段(如果其存在于样品中)的拷贝数的预备技术。

Lewis (1992, Genetic Engineering News 12: 1-9)以及Abramson和Myers(1993, Curr. Opin. Biotechnol. 4: 41-47)的文章是扩增技术的良好全面综述。该技术主要基于：扩增过程中需要多个循环的技术或在单一温度下进行的技术。

循环技术由需要热循环的方法举例说明，使用最广泛的这类技术是PCR (聚合酶链式反应，美国专利号4,683,195，4,683,202，和4,800,159；欧洲专利号0 201 184)，其能够扩增来自DNA或RNA的感兴趣区域。这种方法通常由三个步骤组成∶

(i) 通过热变性/熔解将双链DNA分解(变性)为单链DNAs (图1B)；

(ii)将引物寡核苷酸与单链DNA退火(图1B)；和

(iii)从引物合成(延伸)互补链以便拷贝感兴趣的DNA的区域(图1C)。

在此过程完成后，加热系统(分离互补链)，并重复上述过程。通常进行20-40个循环将基因组DNA扩增到可以进一步分析的程度。

大部分指数级核酸扩增过程依赖于过量的上游和下游引物，它们与被研究的靶核酸模板的3'末端和5'末端的互补序列结合，如图1A-C所示。

扩增技术的第二类(被称为等温技术)是在单一温度进行的技术，或其中扩增过程的主要方面是在单一温度进行。与PCR过程(其中加热反应产物以分离两条链，这样的话其他引物可以结合模板以重复上述过程)不同，等温技术依赖于链置换聚合酶以便分离/置换双链的两条链和再拷贝模板。这种公知的特性是许多科学论文的主题(参见例如Y.Masamute and C.C. Richardson, 1971, J. Biol. Chem. 246, 2692-2701; R. L.Lechner et al., 1983, J. Biol Chem. 258, 11174-11184; or R. C. Lundquist andB. M. Olivera, 1982, Cell 31, 53-60)。区分等温技术的关键点是使用的方法以便起始重复的过程。

广义的等温技术可以被再分成以下方法：依赖于引物的置换以起始重复的模板拷贝(以下举例说明，HDA (解旋酶依赖性扩增)，核酸外切酶依赖性扩增(EP1866434)，重组酶聚合酶扩增(RPA)和环介导的扩增(LAMP))的方法和依赖于单引物分子的持续再使用或从头合成(以下举例说明，SDA (链置换扩增和基于核酸的扩增(NASBA和TMA))的方法。

重组酶聚合酶扩增(RPA)是一种方法，其中重组酶介导的寡核苷酸与DNA靶的靶向与聚合酶的DNA合成结合(Morrical SW et. Al. J Biol Chem. 1991 Jul 25;266(21):14031-8和Armes and Stemple, US申请10/371,641)。WO 2008/035205描述了扩增双链靶核酸分子的RPA方法，包括以下步骤：(a)将UvsX、UvsY和gp32蛋白与对所述双链靶核酸分子特异的第一和第二单链核酸引物接触以形成第一和第二核蛋白引物；(b)将第一核蛋白引物与所述双链靶核酸分子接触以在所述双链靶核酸分子的第一部分产生第一D环结构，将第二核蛋白引物与所述双链靶核酸分子接触以在所述双链靶核酸分子的第二部分产生第二D环结构，这样的话所述第一核酸引物和所述第二核酸引物的3'端在相同的双链靶核酸分子上朝向彼此并且没有将靶核酸分子完全变性；(c)利用一种或更多种能够进行链置换合成的聚合酶和dNTPs延伸所述第一和第二核蛋白引物的3'端以产生第一和第二双链靶核酸分子和第一和第二置换的核酸链；和(d)通过(b)和(c)的重复持续反应直至达到所需的扩增程度。

为了将靶的扩增与产生假象的无用扩增区别开来，可以使用基于探针的系统，其检测被研究的扩增子(在提供给系统的引物中不存在)的序列。

所有这些方法只依赖于模板，所述模板在它们的末端包括针对两条引物的结合位点。具备这些性能的模板可由上游和下游引物之间的非特异性相互作用单独产生，产物(引物-二聚体)可以不依赖被研究的模板有效扩增，如图1D-E所示。作为这种无用扩增的结果，测定成分被非生产性事件消耗，限制了测定方法的敏感性。

本发明的目的是提供一种选择性等温核酸扩增技术。本发明的另一目的是提供一种指数扩增技术。另一目的是最小化或消除扩增假象，从而提供一种特异性和/或敏感性增加的扩增核酸的方法。

发明内容

本发明因此提供一种扩增核酸靶分子的等温方法，其依赖上游引物、下游引物、链插入系统和寡核苷酸，其中上游和下游引物不是扩增过程期间链插入系统的底物，并且没有链插入系统就不扩增靶分子，其中寡核苷酸是链插入系统的底物。

在一个实施方案中，本发明提供一种等温方法，包括下列步骤∶

(a)提供上游引物、下游引物、链插入系统和寡核苷酸，其中上游和下游引物不是扩增过程期间链插入系统的底物，并且没有链插入系统就不扩增靶分子，其中寡核苷酸是链插入系统的底物；

(b)将寡核苷酸用于靶分子，允许其插入双链从而使靶分子的一些或全部变成单链；

(c)将上游引物用于靶分子的单链区，利用聚合酶和dNTPs延伸上游引物的3'端以产生双链核酸靶分子；

(d)将下游引物用于单链靶分子，利用聚合酶和dNTPs延伸下游引物的3'端以产生另外的双链核酸靶分子；

(e)通过(b)到(d)的重复持续反应。

在另一个实施方案中，本发明提供一种等温方法，包括下列步骤∶

(a)提供∶

(i)上游和下游引物，每种包括小于30个核苷酸的单链DNA分子，其至少一部分与靶分子的序列互补；

(ii)包括至少30个核苷酸的单链DNA分子的寡核苷酸，其至少一部分与插入正向和反向引物的靶分子的序列互补，和任选的在其3'端还包括下游元件，其与靶分子的序列互补并且不是聚合酶底物；

(b)将寡核苷酸(ii)与重组酶接触以使其插入靶分子的互补区，从而使得靶分子的互补区和相邻区变成单链；

(e)通过(b)到(d)的重复持续反应。

有利地这些方法提供靶核酸分子的等温和指数扩增。上述扩增方法的特异性和敏感性比已知方法更高，产生最小的扩增假象或无扩增假象。

优选的链插入系统包括重组酶系统，诸如T4 UvsX / gp32 / UvsY系统。优选的寡核苷酸的至少一部分与插入上游和下游引物的靶序列的一部分互补。优选的寡核苷酸包括至少30个核苷酸的单链DNA分子，其具有不可延伸的3'端。

优选的用于链插入系统的底物促进靶模板双链的分离或靶核酸上引物延伸的产物。一种或更多种其他的寡核苷酸可以通过插入的寡核苷酸促进靶双链的分离。优选的寡核苷酸在其3'端包括下游元件，其与靶序列互补并且不是有效的聚合酶底物。这可以结合寡核苷酸释放的靶链，分枝迁移入邻近的双链核酸进一步分离双链。

在另一个实施方案中，本发明提供一种等温扩增核酸靶分子的试剂盒，包括上游引物、下游引物、链插入系统和寡核苷酸，其中上游和下游引物不是扩增过程期间链插入系统的底物，并且没有链插入系统就不扩增靶分子，其中寡核苷酸是链插入系统的底物。

附图说明

图1显示在引物依赖性扩增反应中引物二聚体的形成。

1A：将上游和下游引物与双链模板温育。模板在其末端与引物同源。模板的一条链与上游引物同源，另一条链与下游引物同源。

1B∶模板链被分离，这使得上游和下游引物可以结合。

1C∶模板结合引物的延伸产生两条相同的双链。每条双链可以参与反应的前面几步，这样的话模板被指数扩增。

1D-E：在没有模板的情况下上游和下游引物彼此拷贝。这些可能取代被研究的模板，还可能指数扩增造成假象。

图2显示本发明的基础扩增系统以及任选的基于探针的检测系统。

图3显示一种扩增方法，其中下游元件用于防止非特异性的扩增产物。

图4显示一种利用反向互补寡核苷酸的扩增方法，这样的话不会形成非特异性产物。

图5显示在三部分系统(tripartite system)中造成引物假象的事件的先后顺序。

图6A显示模板/引物配置。

图6B显示2-引物系统中的扩增(通过Sybr Green荧光检测)。

图7A显示模板/引物/寡核苷酸配置。

图7B显示三部分系统中的扩增(通过Sybr Green荧光检测)。

图8显示三部分系统中引物长度的影响。

图9A显示模板/引物/寡核苷酸配置，包括下游2-O-甲基化寡核苷酸和探针。

图9B显示使用具有甲基化下游元件的中间寡核苷酸的效果。

图10显示三部分系统可以扩增生物来源的DNA。

图11A显示利用75nM下游甲基化的中间寡核苷酸的三部分系统的扩增结果。

图11B显示利用下游甲基化中间物的三部分系统的灵敏性可以达到单个分子的水平。

图12显示群集试剂(crowding agents)在三部分系统中的使用。

图13显示通过探针探询的三部分系统中的扩增。

具体实施方式

本发明描述一种实现等温和指数扩增靶核酸的方法。核酸序列可包括DNA，逆转录的RNA（cDNA）或基因组DNA。核酸也可以包含修饰的或非天然的核苷，它们可以在聚合酶的作用下被拷贝。

与其他核酸扩增方法不同，结合核酸末端的上游和下游引物(末端引物)是单独的，不能诱导靶核酸的指数扩增。扩增的指数方面由一种或更多种寡核苷酸(中间或插入寡核苷酸，IO)实现，它们与一定比例的插入上游和下游引物的模板序列同源。因为单独的与上游和下游引物同源的模板不是有效的扩增单位，系统可以被设计成不受敏感性损失(由图1描述的引物二聚体假象以及其他误引发(mispriming)假象造成)的影响。

在没有IO序列的情况下引物不能扩增，优选的IO是不可延伸的。于是假象扩增被消除或显著减少，因为IO自身无法实现假象扩增。此外在本发明的一些方面，IO包括不是聚合酶底物的序列，这样的话在没有被研究靶的情况下不存在可以复制可扩增序列的假象事件。

在一个方面，本发明提供一种扩增核酸靶分子的等温方法，其依赖于上游引物、下游引物、链插入系统和寡核苷酸，其中上游和下游引物不是扩增过程期间链插入系统的底物，并且没有链插入系统就不扩增靶分子，其中寡核苷酸是链插入系统的底物。

在另一实施方案中，本发明提供一种用于扩增双链核酸靶分子的等温方法，包括下列步骤∶

(e)通过(b)到(d)的重复持续反应。

用于扩增双链核酸靶分子的优选等温方法包括下列步骤∶

(a)提供∶

(ii)包括至少30个核苷酸的不可延伸的单链DNA分子的寡核苷酸，其至少一部分与插入正向和反向引物的靶分子的序列互补；

(e)通过(b)到(d)的重复持续反应。

本发明方法依赖于下列组分。

上游引物(或正向引物)在插入寡核苷酸(IO)的5'区或其附近结合靶核酸分子的一条链。

下游引物(或反向引物)在IO的3'端或其附近结合靶核酸分子的一条链。它结合与上游引物结合的相反的链。

实质上，引物结合模板，并在聚合酶的作用下延伸。正向和反向引物必须是有效的聚合酶底物。在一些方面，当与重组酶系统联用时，引物不应是有效的重组酶底物。这意味着它们应当小于30个核苷酸的长度。优选的引物是小于25个核苷酸。最优选的引物是大约15到23个核苷酸。引物能够结合靶核酸分子的相反链。整条引物结合靶序列(与其互补)并不重要。

插入或中间寡核苷酸(IO)是链插入系统(SIS)的底物。用于链插入系统的底物促进靶模板双链的分离或靶核酸上引物延伸的产物，从而允许引物结合靶分子上的互补单链DNA。

在一个实施方案中，IO可包括肽核酸(PNA)，其能够不依靠重组酶而插入双链DNA分子。在这个实施方案中，PNA起到寡核苷酸和链插入系统两种作用。

在优选的实施方案中，链插入系统包括重组酶系统。在这个实施方案中，寡核苷酸的至少一部分应当与插入上游和下游引物的靶序列的一部分互补。插入寡核苷酸应当包括是重组酶底物的区域。由于重组酶优选的作用超过约30个核苷酸的底物寡核苷酸(FormosaT. and Alberts B., JBC, (261) 6107-6118, 1986; Gamper B et al., Biochemistry,(42) 2643-2655, 2003)，优选寡核苷酸包括至少约30个核苷酸的单链DNA分子或总共超过30个核苷酸碱基的DNA序列和改造序列。此外，它应当优选的具有长度足以有效插入模板的同源区，因此至少一部分IO应当与插入正向和反向引物的靶序列互补。通常这最少是24个碱基，最佳大约38个碱基。互补序列的5'部分优选的足够接近双链末端，剩余双链的熔解温度导致结合后剩余双链的解离。通常这表示互补序列的5'端应当距双链末端不超过15-20个核苷酸。

IO还可以包括不与模板同源的5'端，以便有效地利用重组酶接种(seed)同源区。通常其应超过12个碱基。因此IO的总长度优选的为至少36个碱基，更优选的至少50个碱基，包括同源区。它还可以包括不与模板同源的3'端。

优选的IO具有不可延伸的3'端。这可以通过掺入数种修饰核苷酸的一种或更多种来实现。通常这将掺入末端核苷酸的3'修饰。这些修饰核苷酸的实例是双脱氧核苷酸，3'氨基-烯丙基，不同长度的3'-碳间隔物，相反方向掺入的核苷酸(3'-3'键)，3'磷酸，3'生物素，3'salyl，3'-巯基。可选的所述末端可以包括不适合通过聚合酶延伸的核苷酸，这是因为它们较差的作为底物的能力，诸如PNA或LNA或2'-5'-连接的DNA或2'-O-甲基RNA。

重组酶系统

如上所述，优选的链插入系统包括重组酶系统。重组酶应当结合长于约30个核苷酸的DNA分子。优选的，它们对单链DNA具有较强偏爱，对于双链DNA的偏爱相对较弱。在本发明的方法中，这使得它们结合IO但不结合上游或下游引物。

各种重组酶系统是本领域技术人员已知的，已经被广泛的综述过(例如Piero R.Bianco et al. Frontiers in Bioscience 3, d570-603, 1998, 570 DNA StrandExchange Proteins: A Biochemical and Physical Comparison)。任意重组酶系统都可用于本发明的方法，用于核酸双链插入的重组酶的详细应用是本领域技术人员已知的(Kodadek T et. Al., JBC 264,1989; and Liu J, JBC Na Qian1, 281, 26308–26319,2006)。

重组酶系统可包括源自酵母、细菌噬菌体或哺乳动物或其他真核生物的成分。重组酶系统可以是嗜温或嗜热的。例如，重组酶可以源自肌病毒科噬菌体。肌病毒科噬菌体可以是，例如，T4, T2, T6, Rb69, Aehl, KVP40, 不动杆菌属噬菌体133, 气单胞菌属噬菌体65, 噬蓝藻体P-SSM2, 噬蓝藻体PSSM4, 噬蓝藻体S-PM2, Rbl4, Rb32, 气单胞菌属噬菌体25, 弧菌噬菌体nt-1, phi-1, Rbl6, Rb43, 噬菌体31, 噬菌体44RR2.8t, Rb49, 噬菌体Rb3, 或噬菌体LZ2。在优选的实施方案中，可以使用T4重组酶UvsX。也可以使用真核生物的Rad系统或大肠杆菌的recA-Reco系统或其他原核系统。

通常重组酶将按照5'-3'方向在单链寡核苷酸上聚合。如本文所述的本发明涉及这类重组酶。但是，重组酶可以按照3'-5'方向聚合，这类重组酶也可用于本发明的方法。在这种情况下并参考所述成分的方向性，应用反向。

重组酶辅助蛋白可以包括在所述系统中，诸如单链结合蛋白(例如gp32)和重组酶加载剂(例如UvsY)。在优选的实施方案中，重组酶系统包括T4 gp32，UvsX和UvsY。当使用这类系统时，所有单链元件(即引物和IO)被单链结合蛋白(例如gp32)包被。重组酶加载剂(例如UvsY)作为重组酶的辅因子并包被IO。重组酶(例如UvsX)只有效包被IO，因为只有这个元件包括足以诱导所述过程的长度。

重组酶(例如UvsX)，以及使用时重组酶加载剂(例如UvsY)和单链DNA结合蛋白(例如gp32)，可以各是来自相同或不同肌病毒科噬菌体来源的天然、杂合或突变的蛋白。天然蛋白可以是蛋白的野生型或天然变体。突变蛋白(也称为遗传改造的蛋白)是在N端、C端或内部(N端和C端之间)具有天然或人为的突变诸如插入、缺失、取代或其组合的天然蛋白。杂合蛋白（也称为嵌合蛋白）包括来自至少两种不同生物体的序列。例如，杂合UvsX蛋白可以包含来自一个物种(例如，T4)的氨基酸，但还包含来自另一个物种(例如，T6)的DNA结合环。杂合蛋白可以包含与天然蛋白相比提高的特性。所述提高的特性可以是增加的或更快的扩增速率，或降低的或更可控的扩增速率。

其他用于增强重组酶系统效率的因素可包括用于控制DNA相互作用的化合物，例如脯氨酸，DMSO或群集试剂(已知其增强重组酶在DNA上的加载)(Lavery P et. Al JBC1992, 26713, 9307-9314; WO2008/035205)。而群集试剂诸如PVA、胶质或白蛋白已知影响酶动力学，通过体积占用(volume occupation)增加试剂的有效浓度(Reddy MK et. Al.Methods Enzymol. 1995; 262:466-76; Harrison B, Zimmerman SB.Anal Biochem.1986 Nov 1;158(2):307-15; Reddy MK, Weitzel SE, von Hippel PH. Proc Natl AcadSci U S A. 1993 Apr 15;90(8):3211-5; Stommel JR et. Al. Biotechniques. 1997Jun;22(6):1064-6)，DMSO、甜菜碱、脯氨酸和去污剂可以通过改变寡核苷酸在测定中的Tm或二级结构来增强所述系统。

聚合酶

用于本发明方法的聚合酶优选的是那些具有链置换活性的那些聚合酶。这种活性是一些DNA聚合酶的公知特性(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2nd edition, pp. 5.33-5.35, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor)。DNA聚合酶的特性，尤其是其中一些的链置换活性，由Kornberg和Baker等详细给出，DNA Replication, 第2版, 第113-225页, Freeman, N.Y. (1992)。链置换不是所有DNA聚合酶共有的特性，因为其中一些(例如T4 DNA聚合酶)不能单独实现链置换。在这些情况下可以通过添加聚合酶辅助蛋白实现链置换。最初大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段显示链置换活性(Masamune and Richardson, 1971, J. Biol. Chem. 246:2692-2701)，其赋予该酶从双链DNA裂解位点的3' OH末端起始核酸复制的能力。这种链置换活性还显示于热稳定的DNA聚合酶诸如Tli DNA聚合酶(Kong et al., 1993. J. Biol.Chem. 268: 1965-1975)。在这种情况下还显示该酶的突变形式不具有核酸外切酶5'-3'活性，这具有更高的链置换能力。对于T7 DNA聚合酶(Lechner et al., 1983. J. Biol.Chem. 258: 11174-11184)和HIV逆转录酶(Huber et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:4669-4678)也显示了这种链置换活性。

优选的，使用没有5'-3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶来实现本发明的扩增循环，因为在没有这类核酸外切酶活性的酶中链置换活性的效率更高。大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段是没有5'-3'核酸外切酶活性的聚合酶的实例，聚合酶诸如T7 DNA聚合酶或测序酶(US Biochemical)也是如此。还可以使用T5 DNA聚合酶或Phi29 DNA聚合酶。但是，当不阻止扩增过程进行时，可以使用具有这种5'-3'核酸外切酶活性的DNA聚合酶。在这种情况下，扩增反应的产量可以通过在所用反应条件下对DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性的特异性抑制来提高。

还可以通过使用稳定单链而不是双链DNA的酶系统或其他元件来增强链置换。这类系统的实例是应用DNA解旋酶，通过单链结合蛋白的稳定化以及用于所述系统的特定聚合酶的影响。增强链置换的方法不干扰链插入系统是非常重要的。

合适的聚合酶包括polI或polI片段或变体，诸如来自大肠杆菌(E. Coli)、枯草芽孢杆菌(Bacilus bubtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacilus stearothermophilus)的那些或T7聚合酶。同样的可以使用诸如针对噬菌体T4描述的聚合酶全酶复合物。优选的聚合酶是klenow，exo-，T7聚合酶或BST phi29或枯草杆菌的pol-I或全酶。在一些实施方案尤其是使用下游元件或反向互补的情况下，优选的聚合酶不具有与大肠杆菌polI的Klenow片段一样的强链置换活性。在其他实施方案中，聚合酶的强链置换活性可能是优势。

ATP再生系统

当重组酶用于链插入步骤的情况下，所述系统可能要求能量来源。这些酶的大多数利用ATP作为能量来源，但是因为ATP整理(collate)酶活性必需的镁离子，因此有利的提供另外的ATP再生系统而不是提高ATP的浓度。ATP生成系统可以涉及糖酵解或其他生化途径以及ATP消耗中的各种酶，这些酶以及SIS酶诱导伴随AMP和ADP产生的正磷酸盐和/或焦磷酸盐的积聚。无机磷酸盐的积聚也能螯合镁，在多个方面对所述系统是不利的。可以通过焦磷酸酶实现焦磷酸盐向正磷酸盐的转化，正磷酸盐向危害性较低的有机磷酸盐的转化也被广泛报道。

优选的无机磷酸盐或正磷酸盐向有机磷酸盐的转化利用蔗糖和蔗糖磷酸化酶或其他糖磷酸化酶。可选的可以使用烟酰胺核糖核苷和嘌呤磷酸化酶。

因为一些ATP再生系统只利用ADP作为底物，利用肌激酶将一些重组酶产生的AMP转化为ADP是有利的。这也避免了ATP资源的提前耗竭。在实施例描述的标准操作条件下，T4重组酶不产生AMP，这步可以省略。

ATP再生系统自身通常使用磷酸肌酸和肌酸激酶或磷酸-苯基-丙酮酸和丙酮酸激酶。因为UVSX重组酶可以在一分钟内消耗多达300个ATP分子并且可以使用3μM UVSX，所以使用含有40-100mM磷酸肌酸的系统是有利的。

实际上在反应溶液中包括一种或更多种上述能源是有利的，例如，一种或更多种ATP，磷酸肌酸，肌酸激酶，肌激酶，焦磷酸酶，蔗糖，蔗糖磷酸化酶。

用于系统优化的总体考虑

实际上当实施本发明的方法时，可能要求标准操作步骤中所示系统各组成的标准滴定以确保最适扩增。组成的滴定包括蛋白性金属离子和盐滴定。就盐来说，可以评估阳离子和阴离子的性质以及最适浓度以实现最适扩增。

因此，还可以包括各种组成诸如∶镁离子；磷酸肌酸及其平衡离子，pH调节剂，DTT或其他还原剂，各种分子量分布的BSA/PEG或其他群集剂，ATP及其平衡离子，dNTP，蔗糖，肌酸激酶，肌激酶，焦磷酸酶，蔗糖磷酸化酶，UvsX，UvsY，gp32 (NEB，10 mg/ml），Klenow，exo-或其他聚合酶。

扩增方案中使用的缓冲系统应当与提供给系统的所有元件相容。显然所有组成的最适条件不可能在单个缓冲系统中实现。存在许多可能可用于平衡试验条件以便系统有效工作。

引物和寡核苷酸设计也会影响系统的平衡，因为各种引物和寡核苷酸的长度和熔解温度以及选择的扩增子长度的改变可能会改变双链分离和引物延伸的平衡。

熔解温度（Tm）是相同双链群的一半分离的温度。双链的长度和序列与Tm有关，这样的话更长的双链倾向于具有更高的Tm。同样的扩增期间使用的缓冲液可以改变Tm，因为各种盐和其他成分可以改变模板和引物间的亲和力(Chadalavada S.V. FEBS Letters410 (1997) 201-205)。在本发明的环境下，Tm与没有被IO插入的双链区有关。尽管此处的细节涉及开发的在大约40℃工作的系统，但是有可能开发出在不同温度起作用的系统，例如从约21到50℃，优选的从约25到45℃，最优选的约37-40℃。所以靶和引物的长度和序列可以相应调整。当被研究的模板是负超螺旋的情况下，这些倾向不适用于起始模板，因为负超螺旋DNA可以如同单链DNA一样处理。在扩增的第一轮，必须加热或另外化学/酶变性或切割靶以启动扩增过程。按照先前的报道，可以使用称为缓冲引物(bumper primer)的附加引物启动第一轮扩增(Nuovo G.J;Diagn Mol Pathol. 2000 (4):195-202)。此外，如果在扩增的第一轮系统实现上游或下游引物延伸较慢，则没有另外的特征是必需的，但是将会有因为初始扩增事件的受阻造成的延缓期(lag phase)。

扩增方法

说明书的以下部分将描述本发明的一个实施方案，其中所述方法依赖于重组酶诱导的链插入系统 (SIS)。重组酶与单链寡核苷酸底物反应，使其插入双链核酸内的互补链，置换所述双链的其他突出链(OS)。

本发明的基本要点在于提供插入双链核酸靶的寡核苷酸(IO)。这一事件的后果是靶双链的链被分离，不仅在与插入寡核苷酸同源的模板区解离，而且在插入位点外但与其相邻的区域解离，这使得末端引物结合组成链并且延伸，从而产生两个双链拷贝。该过程自身递归重复，产生靶的指数扩增。

在本发明的一个实施方案中，在重组酶的作用下单链不可延伸的寡核苷酸(IO)插入双链靶核酸的中间区域。寡核苷酸的插入干扰双链稳定性使得双链分离变成单链。这将结合位点暴露于上游和下游引物(它们不是重组酶的底物)，在分离链上的这些延伸产生两个拷贝的双链(图2)。

图2显示本发明的基础扩增系统以及任选的基于探针的检测系统。该系统在某种程度上防止非特异性的扩增，但在温育延长后可能形成非特异性产物，如图5所示(下文讨论)。图2到4是关于T4 gp32、UvsX和UvsY重组酶系统的讨论，但可以使用任何重组酶系统或其他链插入系统。

2A:该系统的元件如I-IV所示。双链模板如虚线所示。I代表上游引物，其不是底物或只是所述的SIS的最差底物（即它不结合重组酶）。II显示所述系统的中间成分，IO，其可以在聚合酶的作用下延伸或不可延伸。该核酸元件是SIS的底物，因为它结合重组酶并插入靶双链。它不需要受到聚合酶的作用。该元件还可以任选的包括延伸的3'或5'尾(它们不与插入的序列同源)。插入寡核苷酸的同源区的5'区与双链末端足够接近，这样的话残余双链的熔解温度低于系统的环境温度，导致残余上游双链在结合后的解离。III显示任选的探针系统诸如T7核酸外切酶敏感探针或分子信标的可能位点。IV代表下游引物，其不是底物或只是SIS的最差底物。

该系统的所有单链元件被单链结合蛋白GP32包被。作为UVSX辅因子的UVSY也包被IO。GP32包被的元件具有减弱的分枝迁移能力。UVSX只有效包被IO，因为只有这个元件包括足以诱导所述过程的长度。

2B:在用重组酶包被IO (II)后，它能够插入双链。双链分离，在插入区以及相邻区变成单链，通常长度为大约15到20个核苷酸。这释放双链核酸的上游末端。

2C:上游引物（I）能够结合释放的链。引物浓度、温度和其他系统成分诸如变性剂被优化，这样的话引物有效结合，尽管其接近其熔解温度。

2D:上游引物（I）延伸，这稳定其产物并置换IO（II）。这重新创造出初始双链。下游引物（IV）以及任选的探针（III）能够结合被置换的下游区。可以将系统优化，这样的话上游或下游引物浓度是不对称的，通过这种机制过量的下游引物确保在反应结束时诱导单链过量的下游产物，并且提供探针的结合位点。

2E:下游引物延伸使双链数量翻倍。

通常两条互补寡核苷酸按照由同源区的长度和序列决定的亲和力结合到一起。两条链只在高于特定温度时分离，这一温度被称为熔解温度(Tm)。同源区的长度与Tm成正比。Tm还受镁和一价盐浓度的影响，在单链结合蛋白存在的条件下Tm也降低。重组酶在寡核苷酸上的短暂存在将增加其Tm。因此相关的熔解温度参数通常按照经验进行评价。

双链可以被重组酶包被的寡核苷酸插入，这依赖于其与插入双链的一条链同源。双链的另一条链被称为突出链(OS)，其基本上与双链的同源链分离，变成单链。因此当插入区外的残余双链具有导致Tm低于环境温度的长度和序列的情况下，完整的双链将解离产生两个单链末端(其可以结合末端引物)。

大部分重组酶从寡核苷酸的5'区向其3'区聚合，一旦包被的寡核苷酸插入双链，则SIS继续聚合到插入寡核苷酸的3’的双链（下游）。插入系统的包被元件比未包被区结合更紧密。还值得注意的是与模板(被重组酶包被)结合的引物不能被延伸，直至重组酶去聚合(depolymerised)并被除去。

作为上述观察的结果，如果IO的模板双链末端上游接近插入区，则所述末端将分离，因为它没有包被重组酶，引物可能结合并延伸置换IO，这样的话它可以被所述系统再次使用。在相同情况下，下游末端将结合在一起，直至重组酶去聚合/脱离(falls off)(其也是按照5'到3'方向)。如果下游末端的Tm比环境温度更高，则其链甚至在重组酶去聚合后仍然相连，但链仍将分离，因为上游引物延伸并置换初始双链的链。这使得下游引物随后能够结合和延伸（图2）。

如果上游末端不接近插入区但下游末端的相邻足够接近以允许熔解，则可以预料下游末端将在重组酶去聚合后分离。意外的是情况不是这样，因为当重组酶去聚合置换插入的寡核苷酸、在其伴侣上重新定位突出链并重新形成初始双链时，双链的闭合上游末端分枝迁移并且不给下游引物结合提供机会。在这种情况下，分枝迁移是快速的，因为突出链仍然以具绞旋线的构象围绕复合物，即使被置换时仍与其同源链紧密相连。

这些事件的后果是对于有效的系统来说，SIS实现双链分离，然后靶双链的上游末端必须在链插入事件期间分离。这通过确保邻近插入位点的双链上游区具有接近或低于环境温度的熔解温度得以实现。这可以由技术人员使用标准技术轻易确定，但受到系统成分诸如单链结合蛋白、金属离子浓度和盐浓度的影响。

因此，应当优选的将IO设计为：其与靶分子互补，在同源区的任一边只留下约10-20个碱基，优选的约15-17个碱基。因此，例如，当所述应用在40℃进行时，给系统提供不可延伸的IO，这样的话其在同源区的任一边留下双链的10-17个碱基。当IO插入时，双链的上游末端(相对于插入寡核苷酸)熔解，而3'末端结合在一起，这归因于重组酶在下游双链上的插入依赖性聚合。上游引物结合熔解的双链上游末端并延伸，从而置换IO。双链的下游末端可以通过上游引物的连续延伸而分离，或其足够短以致当重组酶去聚合时它也发生熔解。

上文方案描述了重组酶按5'-3'方向（上游到下游）聚合的结果。此处说明描述了利用这类重组酶的扩增。当使用按相反方向聚合的重组酶时，然后该系统的配置也是颠倒的。大部分重组酶倾向于IO上游末端的12-15个碱基的区域以促进重组酶的接种(seeding)，可以包括这一特征，这样的话IO包括上游非同源区。

在上述方法中，尽管扩增假象被降到最低，但是引物有可能在IO上非特异性拷贝，并且这种延伸的产物可以被置换，如图5所示在其他引物上拷贝。

图5显示通过其引物假象可以在不包括下游元件的三部分系统中存在的机制。

5A：诱导假象扩增的系统成分包括上游引物(I)，中间寡核苷酸(II)和下游引物(III)

5B: 下游引物偶尔可以在中间寡聚物上拷贝。

5C：任意其他的寡核苷酸引物可以在下游引物占据的位置上游的中间物上拷贝。

5D∶其他寡核苷酸引物的延伸将导致下游引物延伸产物的置换。

5E∶最后，如果上游引物在置换的产物上拷贝，则可以产生可扩增的单元。

这些事件比那些涉及图1描述的双引物系统的引物二聚体假象产生的事件更复杂，这导致用于评价待测模板存在的系统的灵敏性高于只依赖于双引物的系统。

尽管这类事件是罕见的，但所得的寡核苷酸序列将有可能是可扩增单元。但是，这种偶然性将被下文描述的本发明实施方案消除。为了消除非特异扩增的任何可能性，可以利用下列现象。

当由于IO的插入导致只有双链的一端被分离时，同源引物可以结合解离的末端，但部分栓系的突出链仍保持非常接近。因为突出链还包括与引物相同的区域，其能够与引入的引物竞争结合模板。此外，在重组酶去聚合后栓系的末端也可以分枝迁移，在结合分离末端的引物有机会延伸前恢复初始双链。在这些情况以及只有上游末端被熔解时，上游引物的延伸受到影响，变成依赖于下游末端的分离，这样的话双链的链不再栓系并脱离。通过这种方法，消除突出链的竞争。因此，可以将系统设计成：无论双链上游方面的分离与否，上游引物只在下游末端也被分离的条件下是有效的。该系统对两个末端分离的依赖增加了系统的特异性，可以通过以下方式实现：改变有利于突出链恢复的上游引物的能力，或使用低浓度的聚合酶或具有弱的链置换活性(Klenow exo-活性)的聚合酶，因为这也将影响引物延伸与双链恢复的平衡。无论如何当双链的两条链分离时，发现扩增基本上更快。因此如果特定靶的扩增诱导链分离，不给予这一性质的假象扩增将被超越。

上游引物的能力可以通过数种机制改变，例如∶

(i)可以将上游引物设计成与插入IO重叠。重叠的区域优选的是约5到10个核苷酸。重叠引物的延伸将依赖于引物在模板上的预先分枝迁移置换IO。在一些情况下，具体的是存在单链结合蛋白的情况下，分枝迁移是缓慢的并暂停引物的延伸，这样的话引物的结合和延伸对起始双链的恢复(re-instatement)的竞争有利于恢复。该实施方案的另一个优点是如果长度大于18-23个碱基，则邻近IO的末端不分离。这样的话熔解温度高于反应的环境温度(其中为约40℃)。该构建体中描述的引物具有高于该数值的Tm，但产生具有低于环境温度的Tm的末端。如果使用这类引物，其可以结合熔解双链的同源末端，其3'区将分枝迁移到双链的插入方面(如果其是同源的)，随后在聚合酶的作用下延伸。如果引物变成非特异性/不依赖模板的产物的一部分，除非它用IO区精确定位，否则它不可能是有效的扩增单元。

(ii)上游引物可能被暂时阻断，延伸前依赖酶促切割。这通过以下例证：3'阻断的引物包括邻近3'末端的RNA碱基以及RNAse H。使用选择性核酸内切酶的类似系统可以用做减缓引物进展的任意机制。

在如上所述的实施方案中，扩增变成依赖于下游末端以及上游末端的熔解。设计为依赖下游末端熔解的系统可以添加对扩增的绝对特异性。如果下游引物的Tm高于环境温度，则下游末端不会熔解，另外非特异性的假象产物不会扩增。这是使用这类引物的一个优点，但仍存在以下问题：具有超过反应环境温度的Tm的引物如何诱导将分离的末端。这通过利用其他附加的序列依赖性元件熔解下游末端来实现。

例如，可通过一种或更多种附加寡核苷酸(其通过插入寡核苷酸促进靶双链的分离，其功能取决于IO插入步骤)的结合分离下游栓系的末端。这种方法的价值在于这类寡核苷酸可以被设计成能结合和分离双链，但既不是聚合酶的底物也不是重组酶的底物。这类寡核苷酸无法参与引物假象的产生，因为它不是聚合酶底物，如图5所示这是重要的。优选的所述附加的寡核苷酸结合IO释放的链，分枝迁移入邻近的双链核酸。重要地当其功能要求分枝迁移并且发现分枝迁移被单链结合蛋白抑制时，其可以被设计成不显著结合单链结合蛋白。该方法通过以下举例说明∶

(i)IO包括是其3'末端(下游元件，DE)延伸的序列，其与靶末端区同源，如图3所示以及下文的描述。

在该实施方案中，DE包括元件，其不是聚合酶底物，任选的既不是重组酶底物也不是SSB底物。通常这可以通过利用2'修饰的核苷酸实现。2'位的典型修饰包括羟化，甲基化和烷化。它可选的可通过碱基糖或磷酸盐成分的修饰(产生模板和/或引物无效的性质)进行诱导。合适的元件包括RNA和RNA类似物，诸如锁核酸（LNA），吗啉代，肽核酸（PNA）以及实现杂交的其他核酸修饰。这些寡核苷酸是不同的，因为它们具有不同的主链糖但仍然根据Watson和Crick配对与RNA或DNA结合，但不能扩增，因为聚合酶无法识别它们。重要的是该元件能够与其靶序列杂交。

DE可以是IO的延伸，能够分枝迁移插入部分的下游，干扰剩余双链并留下具有低于环境温度的Tm的完整双链区，分离双链，这样的话引物可以结合和延伸。在下游引物和DE之间存在同源重叠。重要的是DE和下游引物无法彼此拷贝，这样的话DE不应是引物，也不应是聚合酶的模板底物，即它不应允许引物在超过其与IO的接头的区以及在IO上结合和延伸。DE的3'末端任选的可具有附加的假(spurious)碱基和/或被阻断延伸以促进其，例如通过将不可延伸的单元置于其3'末端或通过在该区域添加非同源碱基。通常通过掺入一个或更多个数种修饰的核苷酸阻断3'末端的延伸。通常这将掺入末端核苷酸的3'修饰。这些修饰核苷酸的实例是双脱氧核苷酸，3'氨基-烯丙基，不同长度的3'-碳间隔物，相反方向掺入的核苷酸(3'-3'键)，3'磷酸，3'生物素，3'salyl，3'-巯基。可选的所述末端可以包括不适合被聚合酶延伸的核苷酸，这是因为它们较差的作为底物的能力，诸如PNA或LNA或2'-5'-连接的DNA或2'-O-甲基RNA。

(ii)可以提供附加的寡核苷酸(反向互补序列，RC)，其具有与IO 3'区同源的3'区，以及与靶末端同源的5'区，如图4所示以及下文的描述。

反向互补序列具有与IO 3'区同源的3'区，并在该区域结合突出的模板链。RC的5'末端与邻近IO区的靶双链同源并在突出链上。3'区应当足够长以结合突出链，并足够稳定以诱导其5'方面分枝迁移入邻近的双链。通常该3'区长度应为10-20个碱基，优选的10-14个碱基。

重要的是它不显著干扰IO的功能，因为它与该寡核苷酸同源，其优选包括不是重组酶底物的碱基，诸如2'修饰的元件，RNA或2-O-甲基RNA或PNA或LNA。此外该寡核苷酸不是聚合酶的模板是有帮助的。在存在系统组件的条件下，5'区应能按照类似于下游元件的方式分枝迁移入邻近的双链。为这个目的优选的该区域包括不是单链结合蛋白的底物的修饰。

RC与下游引物指向相同方向，因此其与该元件的相互作用是不重要的。与下游元件相比，RC结合双链的相反链，因此下游引物将与RC重叠但不与其同源。因为RC与IO的一部分同源，以下对于IO来说可能是优点：被阻断延伸（例如用假3'碱基或如上所述）和/或在其3'末端（不与模板同源）具有一些附加的碱基。这将防止IO形成可扩增单元。对于RC的3'末端也是如此，为这个目的可以在RC的3'末端将其阻断以进一步避免延伸，可以在其3'末端(不与模板同源)包括一些附加的碱基。

3A∶该系统的元件如I-IV所示。双链模板如虚线所示。I代表上游引物；II代表插入寡核苷酸(IO)；III代表下游元件(DE)，其是IO的3'延伸，可以正在其3'末端包括非同源碱基。与IO不同，该下游元件不是聚合酶的底物，也可以不是重组酶的底物。IV代表下游引物。

扩增的基础类似于图2所示，但在该系统中两个末端引物具有高于系统环境温度的熔解温度，因此不会扩增，除非该系统的限制因素被满足。

上游引物与IO重叠，下游引物与DE重叠，因此与该元件部分同源。

该系统的所有单链元件变成被单链结合蛋白GP32包被，尽管这不是DE必需的。作为UVSX辅因子的UVSY也包被IO。GP32包被的元件具有减弱的分枝迁移能力。UVSX只包被IO，因为只有这个元件包括足以诱导所述过程的长度。

3B∶重组酶包被的IO插入双链熔解上游末端。下游末端是不熔解的，因为其Tm高于环境温度，还因为UVSX在该区域聚合将双链夹紧在一起。上游引物结合但不立即延伸，因为其3'区与IO重叠，必需首先分枝迁移。它与栓系的突出模板链(其在结合方面胜过引物)竞争，系统仍然是无效的。还有可能在重组酶去聚合后栓系的下游末端向后分枝迁移闭合初始双链，但不管怎样，系统不会充分扩增。

3C∶DE分枝迁移入下游双链，因为剩余下游双链的Tm低于环境温度，它被分离。UVSX去聚合，因为上游末端结合引物，双链被完全分离。

3D∶这使得下游引物结合并延伸，还给予上游引物分枝迁移并延伸产生两个拷贝的双链的机会。

值得注意地，任何引物假象需要包括DE的结合序列。因为DE由不是聚合酶底物的元件组成，所以这不会发生。

4A∶该系统的元件如I-IV所示。双链模板如虚线所示。I代表上游引物；II代表在其3'末端具有非同源碱基的插入寡核苷酸；III代表在其3'末端与非同源碱基的反向互补序列和IV代表下游引物。

在该系统中，两个末端引物具有高于系统的临界熔解温度的长度，因此不会形成非特异性假象，除非非特异性假象与靶模板相同。

上游引物与IO在相同方向重叠。下游引物不与IO重叠，但与附加的元件RC重叠。RC既不是聚合酶底物也不是重组酶底物，与下游引物和IO重叠。这样的话，下游引物包括具有与RC的5'区相同的序列的3'末端。RC包括与下游引物类似的5'序列以及与IO互补的3'序列。

除了DE之外的该系统所有单链元件被GP32包被。作为UVSX辅因子的UVSY也包被这些元件。包被的元件具有减弱的分枝迁移能力。UVSX只有效包被IO，因为只有这个元件包括足以诱导所述过程的长度。

4B∶重组酶包被的IO插入双链熔解上游末端，因为它低于临界温度。下游末端是不熔解的，因为它高于临界温度，还因为UVSX在该区域聚合将双链夹紧在一起。上游引物结合但不立即延伸，因为其3'区与IO重叠，必需首先分枝迁移。它与栓系的突出模板链(其在结合方面胜过引物)竞争，系统仍然是无效的。

4C∶UVSX去聚合，但双链保持部分熔解。这使得RC结合IO，然后分枝迁移入下游双链。

4D∶因为剩余双链低于临界温度，其被分离并脱离。这使得下游引物结合并延伸，还给予下游和上游引物分枝迁移并延伸产生两个拷贝的双链的机会。

探针

如上所述的任意方法还可以包括通过测量可检测信号来监测扩增。可以将检测系统与作为扩增系统一部分的一种或更多种寡核苷酸相连。检测系统可以是产荧光的。扩增期间可以产生与信号产生系统同源的序列。

许多基于探针的检测系统是本领域已知的，描述在别处，例如WO 2006/087574。这些系统通常由双重标记的荧光寡核苷酸组成，其包括荧光团和受体部分(其可以是荧光团或荧光猝灭剂)的FRET对。探针结合序列可以是如图2所示IO扩增子下游的一部分，或它可以是引物、IO、RC和/或DE的一部分。所有这些元件可以包括非同源碱基，可以将它们设计成被外源元件捕获以定位扩增单元。这与侧向流系统相同。

嵌入染料诸如Sybr green I和噻唑橙(thiazole orange)能够对DNA扩增的常规过程产生信号。可选的或此外可以使用对特定扩增子的扩增产生信号的探针。这样基于探针的系统可以用于在单个管中多重数种扩增方法。这通过利用针对具有不同类型的输出的每种系统的探针实现。这通过针对每种探针的不同波长的荧光发射举例说明。多重技术也是包括内部阴性和阳性实验对照的方法的重要部分。

探针系统的实例包括下列∶

(a)荧光团可以与引物相连，这可以用作Fret受体，其中该系统包括通用嵌入染料。

(b)荧光团可以与引物相连，这样的话当引物掺入扩增产物时存在可检测的荧光变化。这可以通过以下方式实现：将两个或更多个荧光团紧密靠近，这样的话它们自我猝灭或基态猝灭直至掺入扩增产物。

(c)可以将荧光团和猝灭剂或受体荧光团掺入IO或其DE，这样的话当IO掺入扩增产物时存在可检测的荧光变化。

(d)荧光团受体/猝灭剂(FRET)对可以插入扩增系统的元件，这样的话它们通过可切割的元件分离，其中FRET对的部分通过可切割的元件分离，而可切割的元件受到双链特异性核酸酶的作用。如果元件掺入扩增产物，该元件的切割将诱导FRET对的完全分离，从而增强系统的荧光。可切割元件可以是IO的一部分，或它可以是引物系统的一部分或添加到系统的扩增子并与其同源的附加元件。

当可切割元件是引物系统的一部分时，可切割元件可以在引物结合位点的5'端或引物结合位点的3'端。如果可切割元件被置于部分结合区的3'端，将非同源碱基三引物置于可切割元件是有利的，这些碱基可以包括荧光团或猝灭剂/受体的粘附。可以将具有这些性质的引物设计如下：其不是模板扩增系统的一部分，但将包括在任何假象扩增内。具有这些性质的引物可以用做阴性对照，例如它在3'端或其附近具有与IO同源的区域，产生图5描述的假象。

切割酶通过RNASE-H或8-氧代鸟嘌呤或无碱基核酸内切酶作为示例。通常可切割元件包括RNA，8-氧代鸟嘌呤或无碱基位点。RNASE-HII家族的酶(包括T. kodakaraensis的酶)识别DNA-RNA双链中的单一RNA底物，并使单个RNA碱基插入其同源元件。此外，切割酶可以是5'-3'核酸外切酶诸如T7 gene6，在这种情况下通过使用硫代磷酸酯元件(除了包含被切割的荧光团的寡核苷酸的5'方面)防止该系统受到这种酶的作用。

当可切割元件插入引物时，它可以是引物模板结合位点的5'边或相对该位点的3'。当可切割碱基位于引物结合位点的3'端时，它可以被置于最后一个同源碱基或该碱基的任一边。在该元件3'的所有碱基可以与模板非同源，3'末端可以阻止延伸直至受到RNASE-H或其他核酸内切酶的作用。显然，重要的是切割后荧光团供体或受体从邻近其伴侣处被去除，这通过确保切割单元一侧的熔解温度低于系统的环境温度得以实现。

(e)荧光团和猝灭剂或受体荧光团可以掺入不同的元件，这样的话当掺入扩增单元时存在可检测的荧光变化。

在另一个实施方案中，本发明提供一种等温扩增核酸靶分子的试剂盒，包括上游引物、下游引物、链插入系统和寡核苷酸，其中上游和下游引物不是扩增过程期间链插入系统的底物，并且没有链插入系统就不扩增靶分子，其中寡核苷酸是链插入系统的底物。该试剂盒的每个元件，包括优选的特征，在上面被详细描述。例如，优选的特征可以包括：链插入系统包括重组酶系统和/或寡核苷酸在其3'末端包括下游元件。

实施例

实验步骤

试剂和溶液

UVSX和UVSY按照先前的描述(Timothy Formosa and Bruce M. Alberts; JBCVol. 261, 6107-6118, 1986)进行纯化。

RNASEHII-KOD-I按照先前的描述(Haruki M et. al. J Bacteriol. 1998 Dec;180(23):6207-14)进行纯化。

从下列浓缩物组合测定法。

镁缓冲液.100 mM Tris;100 mM 醋酸镁; 20 mM DTT; pH 8.0

500 mM (di-Tris-)磷酸肌酸(Sigma) 利用氨水调节pH到7.8。

200 mM DTT，溶于H₂O

100x BSA (10 mg/ml)，溶于H₂O

100 mM ATP-二钠盐 (Jena Biosciences)，溶于H₂O

10 mM dNTPs (Sigma D7295)

50% PEG 1000 (w/v) (Fluka)，溶于H₂O

2 M 蔗糖(Fluka)，溶于H2O

肌酸激酶，来自兔肌肉的I型(Sigma C3755) 在40%甘油/ 50mM KAc pH8溶解到10u/μl

肌激酶，来自鸡的肌肉(Sigma M3003)

在40%甘油 / H₂O中溶解到9 u/μl (200x)

焦磷酸酶(Sigma I1643) 在40%甘油 / H₂O溶解到0.4 u/μl (200x)

蔗糖磷酸化酶(Sigma S0937) 在40%甘油 / H₂O中溶解到0.4 u/μl

UvsX, UvsY; 100 μM, 溶于300 mM醋酸钾; 50%甘油.

gp32 (NEB, 10 mg/ml)

Klenow, exo^- (Jena Biosciences, 50 u/μl)使用终浓度为0.05 u/μl

** = 发现是优化但不是扩增必要的成分。

向除了UVSX和klenow以外的反应成分的混合物中添加待测模板。将反应成分与待测样品在工作温度(40℃)温育5分钟，然后添加UVSX和klenow。总的样品体积是20ul，置于小体积的384孔微量滴定板中。在BMG-fluostar-II上检测荧光。对于Sybr绿色荧光通过在480 nm激发并在520 nm读取发射光，每隔1分钟监测荧光(除非另有说明)。

实施例1 双引物系统，无中间寡核苷酸（现有技术系统）

使用的方案与如上所述的那些相同，除非另有说明。寡核苷酸组分包括终浓度为150nM的两条引物以及模板A。模板/引物配置显示于图6A。除非声明，否则模板A浓度是1nM，扩增之后是Sybr绿色荧光。

结果显示于图6B。在这种双引物系统中，当引物长度等于或超过32个碱基时(U32+D32；U35+D35和U40+D40)，发生扩增。利用23和20个碱基的引物(U23+D23和U20+D20)没有扩增发生。对于40个碱基的引物（无模板）显示发生引物二聚体假象。这些假象通常在模板浓度为10 pM的同时出现，这将该技术的灵敏性限制在这一水平。

实施例2－三引物系统（使用两条引物和不可延伸的中间寡核苷酸）

使用的方案与如上所述的那些相同，除非另有说明。模板/寡核苷酸/引物配置显示于图7A。引物是U16和D16，各使用200nM的浓度。中间寡核苷酸浓度是150nM，模板浓度是100fM。信号由Sybr绿色荧光产生。

图7B显示按照图7A所示配置的三寡核苷酸系统的扩增，分别使用上游和下游引物U16和D16。利用长度为16个碱基的引物实现扩增，这取决于不可延伸的寡核苷酸（IO）。该系统更不倾向于假象。如果中间寡聚物是同源的(IO1+引物+模板1；IO2+引物+模板2)，则16BP的引物能够扩增。引物不会单独扩增（只有引物）；中间物也不会单独扩增（没有引物）。在一些系统中，假象可以在没有模板的情况下发生，灵敏性被限制为1到10fM，得到为双引物系统1000倍大的灵敏性。

实施例3－在使用的条件下（取决于引物的熔解温度和环境温度和变性剂）三部分系统的引物长度必须小于20个碱基

使用的方案与如上所述的那些相同，除非另有说明。引物具有不同的长度，各使用200nM的浓度。中间寡核苷酸（IO1）使用150nM，模板浓度是100fM。信号由Sybr绿色荧光产生。

结果显示于图8。12、14和16个碱基的引物有效扩增。18个碱基的引物组扩增效率较低，20个碱基的引物组不扩增，因此不会形成假象。

实施例4－可以使用中间寡核苷酸中的甲基化下游元件去除假象

使用的方案与如上所述的那些相同，除非另有说明。模板/寡核苷酸/引物配置显示于图9A。引物使用的浓度均为300nM。中间寡核苷酸（IO1）使用150nM，模板浓度是10pM。信号由Sybr绿色荧光产生。

在三引物系统中，更长的引物(20BP)不能扩增(IO1+U20+D20和IO1met+U20+D20)，因为插入中间寡核苷酸的上游区和下游区太长以致不能分离，从而不允许引物结合。此外，在中间寡核苷酸结合事件完成并且重组酶去聚合（脱离寡核苷酸）后，没有完全分离的双链倾向于通过分枝迁移再次闭合。

如果下游引物是长的，上游引物是短的，则扩增是缓慢(IO1+U16+D20)但观察得到的。这是因为当IO插入允许上游引物结合时上游区被分离，但它必须与部分栓系的双链在延伸期间竞争。

如果上游引物较长但与中间物有重叠，则利用长的下游引物(IO1+U20over+D20)也观察到一些缓慢的扩增。这是因为，尽管引物是扩增模板的长区域，但IO的上游仍然是短的(参见图9A)。

如果下游引物较长并且甲基化下游元件掺入中间物(IO1meth+U16+D20和IO1meth+U20over+D20)中，则扩增速率增加到与短下游引物类似。这是因为IO的甲基化区分枝迁移入双链的下游区，缩短剩余双链，分离双链以允许引物结合并使得上游引物的延伸不与部分栓系的模板竞争。甲基化元件必须是同源的，因此能够分枝迁移，因为IO1Met2+U20over+D20不显示加速的扩增。甚至当上游引物较长时(如果其与中间物(IO1meth+U20over+D20)重叠)也是这种情况。

尽管利用长引物和甲基化中间物的快速扩增，如果长上游引物不与中间物重叠，则没有扩增也没有假象（IO1meth+U20+D20）。有可能这归因于以下观点：当上游区保存完整的时候，扩增必须起始于下游引物。中间物的下游区倾向于被重组酶覆盖直至重组酶去聚合，因此无法结合引物直至重组酶在双链由于分枝迁移闭合时去聚合。这些观察证明利用甲基化中间寡核苷酸和长引物的快速扩增是可能的，这依赖于中间物的同源甲基化区。因为甲基化部分的同源区不是聚合酶的底物，所以假象是不可能的。

实施例5－三寡核苷酸系统可以扩增生物来源的DNA

除非另有说明，否则使用的方案与上述相同，寡核苷酸按图9A的图例所示以及配置。引物使用的浓度均为300nM。中间寡核苷酸（IO1）使用150nM，模板浓度是1fM。利用IDT-DNA (San-Diego)将紧挨着寡核苷酸上游具有另外的ALU1敏感性agct序列的模板1插入质粒载体PXero-2。信号由Sybr绿色荧光产生。利用100ul的0.1ug质粒(1nM)和溶于NEB缓冲液4的5单位ALU1(New England Biolabs)在37℃将质粒切割和消化30分钟。随后按照标准操作步骤所述将质粒模板用水稀释。

将插入质粒的这种模板1的扩增与合成模板的扩增以及紧挨着模板序列上游切割的质粒的扩增进行比较。正如以上的讨论（实施例4），中间寡核苷酸的上游模板区需要较短以便有效扩增。在生物系统中，靶模板通常是DNA长序列的一部分，中间寡核苷酸上游的双链可以比希望用于有效扩增的更长。这可能影响这类系统的第一个扩增循环，除非在扩增前加热模板以使得模板变成单链。利用质粒DNA评估这个问题的重要性。

结果显示于图10。对于质粒的扩增存在数分钟的延缓，而质粒切割掉模板上游时延缓更短。有可能质粒的负超螺旋促进第一轮扩增，但是切割掉模板下游的质粒在类似延缓后也产生扩增。可选的，双链的偶然呼吸(breathing)可能在延缓后实现扩增。观察到无模板对照的扩增，但这是在单分子的模板已经被检测到之后。有可能IO1的甲基化部分被聚合酶以非常缓慢的速率拷贝，最终形成假象。在引物末端与中间物的甲基化区和中间物的DNA部分(能够实现该区域的最终通读)的重叠之间只存在单个甲基化碱基。在后续实验中，增加引物和中间物的DNA部分之间的碱基数目以避免所有假象扩增。

实施例6－利用甲基化中间物的系统的灵敏性可以达到单个分子的水平

使用的方案与如上所述的那些相同，除非另有说明。使用的寡核苷酸是U20over，模板1，IO1methextra和D20back 。使用这种配置以避免任何假象扩增事件，因为与IO1meth相比，IOmethextra包括附加的2'甲基化RNA碱基，进一步将下游引物通过附加的2'-甲基化碱基拷贝的可能性降低到使其成为不可能。寡核苷酸配置显示于图9A。信号由Sybr绿色荧光产生。

结果显示于图11A和11B。在图11A中，使用的中间物为75nM，而在图11B中，使用的中间物为150nM。引物浓度是200nM。在图11A中，添加1百万，1000和100个分子。在图11B中，测定法包括将10、5、0.5、0.05和0个分子的模板1添加到每次测试中，这样的话0.5个分子具有1/2的机会包含单分子。每个浓度制备3份样品，并显示结果。所有样品具有10和5个扩增的分子。3份样品中的1份具有1/2的机会包含一个扩增的分子(具有延缓扩增的样品)。没有别的样品扩增。

实施例7－群集剂可以改进系统的动力学

除非另有说明，否则使用的方案与实施例1中描述的相同。寡核苷酸如图9A图例所示和配置。引物是U16和D16，各使用200nM的浓度。中间寡核苷酸（IO1）浓度是150nM，模板-1浓度是100pM。信号由Sybr绿色荧光产生。

结果显示于图12。在没有群集剂时该系统是有效的，但如先前的报道，在有不同类型的PEG或白蛋白的条件下扩增更加有效 (Reddy MK et. Al. Methods Enzymol. 1995;262:466-76; Lavery P et. Al. JBC 1992, 26713, 9307-9314; WO2008/035205)。

实施例8－可以用探针替代Sybr Green探询(interrogate)扩增以便多重反应或为了掺入阳性和阴性对照

除非另有说明，否则使用的方案与实施例1中描述的相同。使用的寡核苷酸是U20over (200nM)，模板1，IO1meth (75nM)，以及浓度均为100nM的D20和D20探针的混合物。模板浓度是100fM。寡核苷酸配置显示于图9A。添加终浓度为1nM的来自T. kodakaraensis的RNASEH以及其他成分。在480/520 nm激发和读取系统以评价扩增或540/600 nm激发和读取系统以探询探针裂解。掺入探针作为下游引物系统的一部分。引物在其3'端包括模板同源区，RNA碱基和阻断的非同源区。当引物结合模板允许引物延伸时，用RNASEHII切割RNA碱基。因为引物在RNA碱基的两边包括猝灭剂和荧光团，它们在RNA碱基切割时变成分离的以产生信号。图13显示Sybr green产生的信号以及探针诱导的信号。

可以使用设计成能评价模板存在的探针引物以及掺入选择性荧光团的附加探针引物。可以为了阳性和阴性对照配置这类系统，其中添加已知浓度的对照模板作为系统的一部分。可选的，在系统可以诱导假象扩增的情况下，然后可以添加诱导初期的假象扩增的探针引物，其中信号由这类探针的扩增产生，然后终止检测。这通过使用图9a的D20对照探针和D20back举例说明，其中D20对照将诱导初期的假象扩增，因为其更接近于中间物的DNA碱基。

序列

X = 包括3'氨基-6碳-间隔物的阻断碱基

X = 2’-O-甲基RNA

X = RNA碱基

TQ是与BHQ2连接的T

TF是与四甲基罗丹明(TAMRA)连接的T

序列表

<110> GeneForm Technologies

<120> 等温核酸扩增

<130> HB/P41597WO

<150> GB0810650.2

<151> 2008-06-11

<160> 30

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> U40 引物

<400> 1

gttacgattg tcctaatgga gagtgagttg tgatgatgtc 40

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> U35 引物

<400> 2

gattgtccta atggagagtg agttgtgatg atgtc 35

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> U32 引物

<400> 3

tgtcctaatg gagagtgagt tgtgatgatg tc 32

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> U23-重叠引物

<400> 4

gagttgtgat gatgtcattc gca 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> U23 引物

<400> 5

cgagagtgag ttgtgatgat gtc 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> U20 引物

<400> 6

gagtgagttg tgatgatgtc 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> U18 引物

<400> 7

gtgagttgtg atgatgtc 18

<210> 8

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> U15 引物

<400> 8

agttgtgatg atgtc 15

<210> 9

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> U12 引物

<400> 9

tgtgatgatg tc 12

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> D40 引物

<400> 10

tctggcatgt tacaaggtca agatgaacca accacttata 40

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> D35 引物

<400> 11

catgttacaa ggtcaagatg aaccaaccac ttata 35

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> D32 引物

<400> 12

gttacaaggt caagatgaac caaccactta ta 32

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> D23 引物

<400> 13

tcaagatgaa ccaaccactt ata 23

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> D20 引物

<400> 14

agatgaacca accacttata 20

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> D18 引物

<400> 15

atgaaccaac cacttata 18

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> D16 引物

<400> 16

gaaccaacca cttata 16

<210> 17

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> D14 引物

<400> 17

accaaccact tata 14

<210> 18

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> D12 引物

<400> 18

caaccactta ta 12

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> D20back 引物

<400> 19

ggtcaagatg aaccaaccac 20

<210> 20

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 寡核苷酸 IO1

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (52)..(52)

<223> 包括3' 氨基-6碳-间隔物的阻断碱基

<400> 20

tgagcataga cggcattcgc agatccagtc agcagttctt ctcactcttc aa 52

<210> 21

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 寡核苷酸 IO2

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (51)..(51)

<223> 3' 氨基-6碳-间隔物

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (51)..(51)

<223> 包括3' 氨基-6碳-间隔物的阻断碱基

<400> 21

gaggctaagg aatacacgca aaggcggctt ggtgttcttt cagttcttca a 51

<210> 22

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 寡核苷酸 IO1met

<220>

<221> misc_RNA

<222> (53)..(57)

<223> 2'-O-甲基 RNA

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (58)..(58)

<223> 包括3' 氨基-6碳-间隔物的阻断碱基

<400> 22

tgagcataga cggcattcgc agatccagtc agcagttctt ctcactcttc aagtatag 58

<210> 23

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 寡核苷酸 IO1met extra

<220>

<221> misc_RNA

<222> (53)..(62)

<223> 2'-O-甲基 RNA

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (63)..(63)

<223> 包括3' 氨基-6碳-间隔物的阻断碱基

<400> 23

tgagcataga cggcattcgc agatccagtc agcagttctt ctcactcttc aagtataagt 60

gga 63

<210> 24

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 寡核苷酸 IO1met2

<220>

<221> misc_RNA

<222> (53)..(57)

<223> 2'-O-甲基 RNA

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (58)..(58)

<223> 包括3' 氨基-6碳-间隔物的阻断碱基

<400> 24

tgagcataga cggcattcgc agatccagtc agcagttctt ctcactcttc aattctag 58

<210> 25

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 模板 A

<400> 25

gttacgattg tcctaatgga gagtgagttg tgatgatgtc ctgtataagt ggttggttca 60

tcttgacctt gtaacatgcc ag 82

<210> 26

<211> 118

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 模板 1

<400> 26

gttacgattg tcctaatgga gagtgagttg tgatgatgtc attcgcagat ccagtcagca 60

gttcttctca ctcttcaagt ataagtggtt ggttcatctt gaccttgtaa catgccag 118

<210> 27

<211> 118

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> 模板 2

<400> 27

gttacgattg tcctaatgga gagtgagttg tgatgatgtc acacgcaaag gcggcttggt 60

gttctttcag ttcttcaagt ataagtggtt ggttcatctt gaccttgtaa catgccag 118

<210> 28

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> D20探针

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (16)..(16)

<223> BHQ2-修饰的碱基

<220>

<221> misc_RNA

<222> (20)..(20)

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (24)..(24)

<223> 四甲基罗丹明(TAMRA) - 修饰的碱基

<400> 28

agatgaacca accacttata ttttttt 27

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> D20探针2

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (2)..(2)

<223> 四甲基罗丹明(TAMRA) - 修饰的碱基

<220>

<221> misc_RNA

<222> (7)..(7)

<220>

<221> 修饰的碱基

<222> (11)..(11)

<223> BHQ2-修饰的碱基

<400> 29

tttttttaga tgaaccaacc acttata 27

<210> 30

<211> 4

<212> DNA

<213> 人工的

<220>

<223> ALU1 敏感序列

<400> 30

agct 4

Claims

1.作为重组酶反应中能量来源的组合物，其包含ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、肌激酶、焦磷酸酶、蔗糖和蔗糖磷酸化酶。

2.权利要求1的组合物，其中所述重组酶是Uvs X。

3.权利要求1的组合物作为等温DNA扩增中能量来源的用途。