CN104245959B - 基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验的从靶核酸序列的核苷酸变异检测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及利用包含探测和标记寡核苷酸‑核苷酸变异的探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO Cleavage and Extension)试验的核苷酸变异检测的新的方法及试剂盒。并且，本发明提供利用包含具有非‑碱基对部分的探测和标记寡核苷酸‑核苷酸变异的探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验的从靶核酸序列检测核苷酸变异的新的方法及试剂盒。

Description

基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验的从靶核酸序列的 核苷酸变异检测
【技术领域】
本发明涉及基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTOCE，PTO Cleavageand Extension)试验的从靶核酸序列的核苷酸变异检测。
【背景技术】
DNA杂交(hybridization)是分子生物学的基本的过程，受离子强度、碱基结构、核酸片段的长度、错配程度以及变性剂的存在的影响。基于DNA杂交的技术将成为决定特定核酸序列的非常有用的用具，将会明确有助于临床诊断、基因研究及法医学上的实验分析。
但是，在仅依赖杂交的现有的方法以及过程中，发生因探针和非-靶序列之间的非-特异性杂交引起的假阳性结果的可能性高。因此，现有的方法以及过程存在改善可靠性的问题。
除探针杂交过程以外还提出了利用酶反应的几种接近法，例如，TaqManTM探针方法。
在TaqManTM探针方法中，与靶核酸序列杂交的标记探针基于上游引物-依赖性DNA聚合酶的5’核酸酶活性被切割，来产生表示靶序列存在的信号(美国专利第5210015号、第5538848号以及第6326145号)。TaqManTM探针方法提出用于信号产生的两个接近法：聚合-依赖性切割(polymerization-dependent cleavage)以及聚合-独立性切割(polymerization-independent cleavage)。在聚合-依赖性切割中，上游引物的延伸必须在核酸聚合酶与标记探针的5’-末端接触之前发生。随着延伸反应的进行，聚合酶逐渐地切割标记探针的5’-末端。在聚合-独立切割中，上游引物以及标记探针非常邻近，由此与靶核酸序列进行杂交，上游引物的3’-末端和核酸聚合酶的结合使上述核酸聚合酶与标记探针的5’-末端接触来放出标记。并且，TaqManTM探针方法公开，通过在其5’-末端部位具有不与靶序列杂交的5’-尾巴区域的标记探针被切割来形成包含5’-尾巴区域的片段。
也有对具有对靶序列非-互补的5’-尾巴区域的探针被5’核酸酶切割，放出包含5’-尾巴区域的片段的几种方法的报告。
例如，美国专利第5691142号就公开了对基于DNA聚合酶的5’核酸酶活性来被切割的切割结构。公开中例示了有对包含对模板非-互补的5’部位以及对模板互补的3’部位的寡核苷酸与模板杂交，并且，上游寡核苷酸与模板非常邻近而由此与模板进行杂交的切割结构。切割结构通过被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或具有减少的合成活性的变形DNA聚合酶切割，来放出与模板非-互补的5’部位。之后，被放出的5’部位与具有发夹结构的寡核苷酸杂交，形成切割结构。由此，诱导渐进性的切割反应来检测靶序列。
美国专利第7381532号公开了具有3’-末端被阻断的上游寡核苷酸的切割结构通过被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或瓣状核酸内切酶切割，来放出非-互补的5’皮瓣(flap)部位，被放出的5’皮瓣部位基于大小分析或相互作用性双重标记来被检测的过程。美国专利第6893819号公开了能够检测的被放出的皮瓣基于核酸合成依赖性的、皮瓣-媒介连续性扩增方法而生成的内容。在此方法中，从第一个切割结构放出的皮瓣，以核酸合成依赖性方式切割第二个切割结构来从第二个切割结构放出皮瓣，并检测被放出的皮瓣。美国专利第7309573号公开了包括基于核酸合成生成的被放出的皮瓣的生成、被放出的皮瓣的延伸、在皮瓣延伸期间的寡核苷酸的切割及切割寡核苷酸而生成的信号检测的方法。
借助液相中的荧光-标记探针的杂交，即使利用一种荧光标记，也能够基于解链曲线分析来同时检测多个靶核酸序列。但是，在基于相互作用性-双重标记探针的5’核酸酶介导的切割来检测靶序列的现有技术中，在检测多重靶时，对相互不同的靶序列需要相互不同的种类的荧光标记，由于这种荧光标记的种类数量有限，因而检测出的靶序列的数量受限。
美国申请公开号第2008-0241838号中公开了利用在靶核酸序列具有非-互补的5’部位的探针的切割以及捕捉(capture)探针的杂交的靶检测方法。标记位于非-互补的5’部位。杂交于靶序列的标记探针被切割而放出片段，之后，片段与捕捉探针杂交而检测靶序列的存在。在此方法中，非切割的/完好无损的(uncleaved/intact)探针不与捕捉探针杂交是必须的。为此，需要长度短的捕捉探针在固相底物实现固定化。但是，这种限制会降低固相底物上的杂交效率，并且使反应条件的最优化变得困难。
因此，对开发以更加便利、具有可靠性以及再现性的方式，不仅基于杂交，还基于5’核酸切割反应(5’nucleolytic reaction)等的酶反应，在液相以及固相中检测靶序列，更优选地检测多个靶序列的新颖的接近法的要求正在抬头。并且，在本发明所属领域中正需求一种不受限于标记(尤其，荧光标记)种类的数量的新颖的靶检测方法。
另一方面，核苷酸变异在研究及临床领域很重要。其中，单核苷酸多态性(SNP，single nucleotide polymorphism)在人类基因组中最常发现，并起到对于疾病相关位置及药物遗传学的标记作用(Landegren et al.，1998；Roses，2000)。单核苷酸多态性在人类基因组中以每1000bp约1个的比率被发现，总数推定为约300万个。据报告，有用于检测如单核苷酸多态性、缺失、插入及移位(translocation)之类的核苷酸变异的各种等位基因区别技术。
等位基因-特异性TaqMan探针设计成仅在聚合酶链式反应(PCR)的延伸步骤中与靶序列完美匹配的情况下进行杂交。TaqMan探针具有报道分子及可从报道分子对荧光信号进行猝灭的猝灭分子。与靶序列杂交的TaqMan探针借助Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性而被切割，报道分子及猝灭分子为了生成靶信号而被分离。为了区别等位基因，使用与小沟结合物(MGB，minor groove binder)相结合的13-20mer的探针(Livak，et al.，Genet。Anal。14:143-149(1999))。利用TaqMan探针的等位基因区别方法不仅利用杂交反应，而且利用5’核酸酶活性的酶反应，使得特异性增加。但是，上述方法存在如难以设计等位基因-特异性探针、难以将可区别基于一个错配的差异的反应条件最优化之类的严重的问题。并且，与小沟结合物的结合为对等位基因-特异性TaqMan探针的问题的解决方法之一。
因此，要求开发一种克服现有技术的缺点，并且能够以更加便利、具有可靠性、且可再现的方式能够检测核苷酸变异的新颖的接近法。
本说明书全文中，参照了多个专利及文献，并用括号来表示了其引用。这种专利及文献的公开内容全部包括在本说明书作为参照，从而更加明确说明本发明所属的技术领域的水平及本发明的内容。
【发明概述】
本发明人为了开发具有更加得到改善的准确性以及便利性，尤其以多重方式检测靶序列的新颖的接近法而锐意研究努力。其结果，本发明人定立了用于检测靶序列的新颖的方案，这种靶检测借助探针杂交、酶探针切割、延伸及延伸二聚物(extended duplex)的检测来达成。本发明的方案不仅优秀地适用于固相反应，而且也能够优秀地适用于液相反应，能够以具有更加得到改善的准确性以及便利性的方式检测多个靶序列。
并且，本发明人为了开发具有更加得到改善的准确性以及便利性，尤其以多重方式检测核苷酸变异的新颖的接近法而锐意研究努力。其结果，本发明人定立了用于检测核苷酸变异的新颖的方案，根据该新颖的方案，核苷酸变异的检测借助探针杂交、酶探针切割、延伸及延伸链的检测来达成。尤其，有趣的是，本发明人设计成可根据受关注的核苷酸变异的存在或不存在来调节上述探针切割位置，且在相互不同的位置被切割而放出的片段根据在人为的模板上的延伸可能性来区别。本发明的方案不仅能够很好地适用于固相反应，还能够很好地适用于液相反应，且能够以具有更加得到改善的准确性以及便利性的方式检测多个核苷酸变异。
因此，本发明的目的在于，提供利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTOCleavage and Extension)试验来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法。
本发明的再一目的在于，提供利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTOCleavage and Extension)试验来从靶核酸序列检测核苷酸变异的方法。
本发明的另一目的在于，提供利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTOCleavage and Extension)试验来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒。
本发明的还一目的在于，提供利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTOCleavage and Extension)试验来从靶核酸序列检测核苷酸变异的试剂盒。
与所附的发明要求保护范围及附图一同，以下详细的说明能够使本发明的其他目的及优点更加明确。
【附图说明】
图1示出了利用于探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验(PTOCE assay)的探测和标记寡核苷酸(Probing and Tagging Oligonucleotide)以及捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide)的图式性结构。优选地，探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端被阻断，用于防止延伸。
图2图式性地示出了包括解链分析的PTOCE试验。捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子。
图3图式性地示出了包括解链分析的PTOCE试验。捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化部位具有报道分子。上述报道分子需要根据存在于单链形态或双链形态表示不同的信号强度。
图4图式性地示出了包括解链分析的PTOCE试验。捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化部位具有iso-dC残基及报道分子。猝灭-iso-dGTP在延伸反应期间向延伸二聚物内插入(incorporated)。
图5图式性地示出了包括解链分析的PTOCE试验。探测和标记寡核苷酸在其5’-标记部位具有报道分子，捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化部位具有iso-dC残基。猝灭-iso-dGTP在延伸反应期间向延伸二聚物内插入。
图6图式性地示出了包括解链分析的PTOCE试验。探测和标记寡核苷酸在其5’-标记部位具有报道分子及猝灭分子。
图7图式性地示出了包括解链分析的PTOCE试验。探测和标记寡核苷酸在其5’-标记部位具有报道分子。上述报道分子需要根据存在于单链形态或双链形态表示不同的信号强度。
图8图式性地示出了包括解链分析的PTOCE试验。探测和标记寡核苷酸在其5’-标记部位具有猝灭分子，捕捉和模板化寡核苷酸在其捕捉部位具有报道分子。
图9图式性地示出了包括指定温度下的检测的PTOCE试验。捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子。捕捉和模板化寡核苷酸通过其3’-末端在固相底物实现固定化。
图10图式性地示出了包括指定温度下的检测的PTOCE试验。报道-标记dATP在延伸反应期间向延伸二聚物内插入。捕捉和模板化寡核苷酸通过其3’-末端在固相底物实现固定化。
图11图式性地示出了包括指定温度下的检测的PTOCE试验。捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化部位具有iso-dC残基，报道-iso dGTP在延伸反应期间向延伸二聚物内插入。捕捉和模板化寡核苷酸通过其3’-末端在固相底物实现固定化。
图12图式性地示出了包括指定温度下的检测的PTOCE试验。探测和标记寡核苷酸在其5’-标记部位具有报道分子。捕捉和模板化寡核苷酸通过其5’-末端在固相底物实现固定化。
图13图式性地示出了包括利用嵌入标记的指定温度下的检测的PTOCE试验。捕捉和模板化寡核苷酸通过其5’-末端在固相底物实现固定化。
图14示出了基于包括解链分析的PTOCE试验的淋病奈瑟菌(NG，Neisseriagonorrhoeae)基因的检测结果。捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子。
图15示出了基于包括解链分析的PTOCE试验的淋病奈瑟菌基因的检测结果。探测和标记寡核苷酸在其5’-末端具有猝灭分子，捕捉和模板化寡核苷酸在其3’-末端具有报道分子。
图16示出了延伸二聚物的Tm值基于捕捉和模板化寡核苷酸序列调节的结果。
图17示出了基于利用聚合酶链式反应扩增的PTOCE试验的淋病奈瑟菌基因的检测结果。捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子。图17A示出了包含实时聚合酶链式反应检测的PTOCE试验的结果，图17B示出了包含聚合酶链式反应后的解链分析的PTOCE试验的结果。
图18示出了基于利用聚合酶链式反应扩增的PTOCE试验的淋病奈瑟菌基因的检测结果。捕捉和模板化寡核苷酸在其5’-末端具有iso-dC残基及报道分子。猝灭-iso-dGTP在延伸反应期间向延伸二聚物内插入。图18A示出了包含实时聚合酶链式反应检测的PTOCE试验的结果，图18B示出了包含聚合酶链式反应后的解链分析的PTOCE试验的结果。
图19示出了基于利用聚合酶链式反应扩增的PTOCE试验的淋病奈瑟菌基因的检测结果。探测和标记寡核苷酸在其5’-末端具有猝灭分子，捕捉和模板化寡核苷酸在其3’-末端具有报道分子。图19A示出了包含实时聚合酶链式反应检测的PTOCE试验的结果，图19B示出了包含聚合酶链式反应后的解链分析的PTOCE试验的结果。
图20示出了基于包含聚合酶链式反应后的解链分析的PTOCE试验的淋病奈瑟菌基因及金黄色葡萄球菌(SA，Staphylococcus aureus)基因的同时性检测结果。捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子。
图21示出了基于微阵列中的包括解链分析的PTOCE试验的淋病奈瑟菌基因的检测结果。捕捉和模板化寡核苷酸通过其5’-末端实现固定化。探测和标记寡核苷酸在其5’-标记部位具有报道分子。
图22示出了基于微阵列中的包括指定温度下的实时检测的PTOCE试验的淋病奈瑟菌基因的检测结果。捕捉和模板化寡核苷酸通过其5’-末端实现固定化。探测和标记寡核苷酸在其5’-标记部位具有报道分子。
图23示出了基于包含微阵列中的指定温度下的实时检测的PTOCE试验的淋病奈瑟菌基因的检测结果。捕捉和模板化寡核苷酸通过其3’-末端实现固定化，且在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子。
图24示出了基于微阵列中的包括指定温度下的终点检测的PTOCE试验的单一或多个靶检测结果。捕捉和模板化寡核苷酸通过其5’-末端实现固定化。探测和标记寡核苷酸在其5’-标记部位具有报道分子。将淋病奈瑟菌基因及金黄色葡萄球菌基因利用为靶核酸序列。
图25图式性地示出了用于核苷酸变异检测的PTOCE试验。这种适用被命名为基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的变异检测(VD-PTOCE，Variation Detection by PTOCleavage and Extension)试验。核苷酸变异区别位点位于3’-靶向部位的5’-末端一部分的5’-末端。检测延伸链的存在来决定核苷酸变异的存在。切割位置根据受关注的核苷酸变异的存在与否而不同。
图26图式性地示出了VD-PTOCE试验的一例。核苷酸变异区别位点位于从3’-靶向部位的5’-末端一部分的5’-末端隔开1核苷酸的位置。
图27图式性地示出了VD-PTOCE试验的一例。作为非-碱基对部分的人为错配核苷酸存在于3’-靶向部位的5’-末端一部分。非-碱基对部分扩大第一初期切割位置及第二初期切割位置之间的距离。
图28图式性地示出了VD-PTOCE试验的一例。核苷酸变异区别位点位于3’-靶向部位的5’-末端一部分的5’-末端。捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子，用于产生信号。
图29图式性地示出了包括解链分析的VD-PTOCE试验的一例。核苷酸变异区别位点位于从3’-靶向部位的5’-末端一部分的5’-末端隔开1核苷酸的位置。捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子，用于产生信号。
图30图式性地示出了包括解链分析的VD-PTOCE试验的一例。作为非-碱基对部分的人为错配核苷酸存在于3’-靶向部位的5’-末端一部分。捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子，用于产生信号。
图31图式性地示出了微阵列中的包括指定温度下的检测的VD-PTOCE试验的一例。来自单一荧光标记的信号在指定温度下被检测。
图32图式性地示出了微阵列中的包括指定温度下的检测的VD-PTOCE试验的一例。报道-标记ddUTP在延伸反应期间向延伸链插入。来自报道分子的信号在指定温度下被检测。
图33示出了基于VD-PTOCE试验的BRAF基因的V600E突变检测结果。对四种探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异进行了试验，上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异在其3’-靶向部位的5’-末端一部分的单一核苷酸变异区别位点的位置存在差异。
图34示出了基于利用具有作为非-碱基对部分的人为错配核苷酸的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的VD-PTOCE试验检测BRAF基因的V600E突变的结果。单一核苷酸变异区别位点从3’-靶向部位的5’-末端位于第四核苷酸。对不包含人为错配的一个探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异及具有作为非-碱基对部分的人为错配核苷酸的三种探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异进行了试验。
图35示出了基于利用上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的PTOCE试验检测淋病奈瑟菌基因的结果。图35A示出了不利用上游寡核苷酸的包括指定温度下的实时检测的PTOCE试验结果。图35B示出了不利用上游寡核苷酸的包括解链分析的PTOCE试验结果。
【发明详述】
本发明提供利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO Cleavage andExtension)试验来检测核酸序列的新颖的方法。尤其，本发明提供利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO Cleavage and Extension)试验来从靶核酸序列检测核苷酸变异的新颖的方法以及利用PTOCE试验来检测核苷酸变异的试剂盒。
用于检测核苷酸变异的本发明作为PTOCE试验，基于探测和标记寡核苷酸切割以及捕捉和模板化寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸片段的延伸，对此的详细说明在对于PTOCE试验的说明之后。为了更好的理解，以下，对PTOCE试验进行说明。
【I.基于包括解链分析的PTOCE的靶检测过程】
根据本发明的一实施方式，本发明提供利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO Cleavage and Extension)试验来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法，上述利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO Cleavage and Extension)试验来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及探测和标记寡核苷酸(PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide)进行杂交；上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游；
步骤(b)，在用于上述探测和标记寡核苷酸切割的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；上述上游寡核苷酸或其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的上述探测和标记寡核苷酸切割，这种上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide)进行杂交；上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，其包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的上述捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用上述步骤(c)的结果物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应；与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段被延伸，来形成延伸二聚物，上述延伸二聚物具有能够基于如下长度而调节的Tm值：(i)上述片段的序列和/或长度，(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度或(iii)上述片段的序列和/或长度及上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度；
步骤(e)，在规定范围的温度下，使上述延伸二聚物解链(melting)来提供表示上述延伸二聚物的存在的靶信号；上述靶信号基于(i)与上述片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的最少1个标记、(ii)在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记、(iii)在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记和与上述片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入标记(intercalating label)提供；以及
步骤(f)，测定上述靶信号来检测上述延伸二聚物；上述延伸二聚物的存在表示上述靶核酸序列的存在。
本发明人为了开发具有更加得到改善的准确性以及便利性，尤其以多重方式检测靶序列的新颖的接近法而锐意研究努力。其结果，本发明人定立了用于检测靶序列的新颖的方案，这种靶检测借助探针杂交、酶探针切割、延伸及延伸二聚物(extended duplex)的检测来达成。本发明的方案不仅优秀地适用于固相反应，而且也能够优秀地适用于液相反应，能够以具有更加得到改善的准确性以及便利性的方式检测多个靶序列。
本发明利用以下的连续事件。即，探针杂交、探测和标记寡核苷酸(Probing andTagging Oligonucleotide)的切割及延伸、作为靶-依赖性的延伸二聚物的形成以及延伸二聚物的检测。因此，将本发明命名为探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTOCleavage and Extension)试验。
在本发明中，延伸二聚物具有提供信号的标记的特征，上述信号借助解链分析或指定温度(pre-determined temperature)下的检测而表示延伸二聚物的存在。并且，延伸二聚物的特征为具有可调节的Tm值，这在多个靶检测或非-靶信号的区别方面起到重要的作用。
由于只在靶核酸存在的情况下生成延伸二聚物，因此延伸二聚物的存在表示靶核酸的存在。
以下，对包括解链分析的PTOCE试验进行更详细的说明。
【步骤(a)：靶核酸序列和上游寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸的杂交】
根据本发明，首先，使靶核酸序列与上游寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸(Probing and Tagging Oligonucleotide)进行杂交。
在本说明书中使用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶序列”意味着所要检测的核酸序列，且在杂交、退火或扩增条件下与探针或引物进行退火或杂交。
在本说明书中使用的术语“探针(probe)”意味着与靶核酸序列实质上互补的部位或包含这些部位的单链核酸分子。
在本说明书中使用的术语“引物”意味着寡核苷酸，在诱导与核酸链(模板)互补的引物延伸产物的合成的条件，即，如核苷酸和DNA聚合酶之类的聚合剂的存在以及适合的温度与pH的条件下，可起到合成的起始点的作用。
优选地，探针以及引物为单链脱氧核糖核苷酸分子。在本发明中利用的探针或引物可包含天然(naturally occurring)脱氧单磷酸核苷(dNMP)(即，脱氧腺苷酸(dAMP)、dGMP(脱氧鸟苷酸)、dCMP(脱氧胞苷酸)及dTMP(脱氧胸苷酸))、变形的核苷酸或非-天然核苷酸。并且，探针或引物还可包含核糖核苷酸。
就引物而言，应充分长，以便能够在聚合剂的存在之下引发延伸产物的合成。引物的适合的长度取决于包括例如，温度、应用领域及引物的根源(source)的多个因素。在本说明书中使用的术语“退火”或“引发”意味着在模板核酸并置(apposition)寡脱氧核苷酸或核酸，就上述并置而言，通过聚合酶对核苷酸进行聚合而在模板核酸或其一部分形成互补的核酸分子。
在本说明书中使用的术语“杂交(hybridization)”意味着互补的单链核酸形成双链核酸。在两个核酸链之间的互补性完全匹配(perfect match)时发生杂交，或即使存在一部分错配(mismatch)碱基也能发生杂交。杂交所需的互补性的程度可根据杂交条件而不同，尤其是可根据温度来进行调节。
上游寡核苷酸以及探测和标记寡核苷酸与靶核酸序列的杂交可在通常基于最佳化步骤而决定的合适的杂交条件下实施。温度、成分的浓度、杂交及清洗次数、缓冲液成分及它们的pH及离子强度之类的条件可根据包含寡核苷酸(上游寡核苷酸以及探测和标记寡核苷酸)的长度及糖皮质激素(GC)含量以及靶核苷酸序列的各种因子而不同。例如，在利用相对短的寡核苷酸的情况下，优选地，选择低的严格条件(stringent condition)。用于杂交的详细条件可以在Joseph Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)；以及M.L.M.Anderson，Nucleic Acid Hybridization，Springer-Verlag New York Inc。N.Y.(1999)确认。
术语“退火”和“杂交”没有区别，在本说明书中混用。
上游寡核苷酸以及探测和标记寡核苷酸具有与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列。在本说明书中使用的术语“互补的”意味着在预定的退火条件或严格条件下引物或探针以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分地互补，并全部包括“实质上互补的(substantially complementary)”及“完全互补的(perfectly complementary)”，优选地，意味着完全互补的意思。
探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位具有与靶核酸序列非-互补的核苷酸序列。捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide)的模板化部位具有与探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列。在本说明书中使用的术语“非-互补的”意味着在预定的退火条件或严格条件下引物或探针不以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分地非-互补，并全部包括“实质上非互补的(substantially non-complementary)”及“完全非-互补的(perfectly non-complementary)”，优选地，意味着完全非-互补的意思。
例如，揭示探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位而所使用的术语“非-互补的”意味着在预定的退火条件或严格条件下，上述5’-标记部位不以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分地非-互补，并全部包括“实质上非互补的(substantially non-complementary)”及“完全非-互补的(perfectly non-complementary)”，优选地，意味着完全非-互补的意思。
在本说明书中使用的术语“探测和标记寡核苷酸(PTO，Probing and TaggingOligonucleotide)”意味着寡核苷酸，上述寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，其起到探针的作用；以及(ii)5’-标记部位，其包含与靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，与靶核酸序列杂交后被切割，来从探测和标记寡核苷酸放出。探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位以及3’-靶向部位必须以5’→3’的顺序而置。在图1中以图式性方式示出了探测和标记寡核苷酸。
优选地，在3’-靶向部位与靶核酸序列杂交，且5’-标记部位不与靶核酸序列杂交的严格条件下实施步骤(a)的杂交。
探测和标记寡核苷酸不要求任何特定的长度。例如，探测和标记寡核苷酸可具有15-150核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸、20-150核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-60核苷酸、20-50核苷酸、30-150核苷酸、30-100核苷酸、30-80核苷酸、30-60核苷酸、30-50核苷酸、35-100核苷酸、35-80核苷酸、35-60核苷酸或35-50核苷酸的长度。只要探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位与靶核酸序列特异性地杂交，那么就可以具有任何长度。例如，探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位可具有10-100核苷酸、10-80核苷酸、10-50核苷酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-50核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-50核苷酸、20-40核苷酸或20-30核苷酸的长度。只要5’-标记部位与捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位特异性地杂交后被延伸，那么就可以具有任何长度。例如，探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位可具有5-50核苷酸、5-40核苷酸、5-30核苷酸、5-20核苷酸、10-50核苷酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、10-20核苷酸、15-50核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸或15-20核苷酸的长度。
探测和标记寡核苷酸的3’-末端还可具有3’-OH末端(terminal)。优选地，探测和标记寡核苷酸的3’-末端被“阻断”，由此防止其延伸。
阻断可通过现有方法来达成。例如，阻断可通过在最后核苷酸的3’-羟基上追加如生物素、标记、磷酸基、烷基、非-核苷酸连接肽、硫代磷酸酯或烷烃-二醇残基之类的化学组成部分(moiety)来实施。择一性地，阻断可通过去除最后核苷酸的3’-羟基或利用如双脱氧核苷酸之类的没有3’-羟基的核苷酸来实施。
择一性地，可设计成使探测和标记寡核苷酸具有发夹结构。
探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及靶核酸序列之间的非-杂交意味着在特定杂交条件下，它们之间不形成稳定的双链。根据优选一实例，不参与和靶核酸序列的杂交的探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位形成单链。
上游寡核苷酸位于探测和标记寡核苷酸的上游。
并且，与靶核酸序列杂交的上游寡核苷酸或其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的探测和标记寡核苷酸切割。
基于上游寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割的诱导可通过2种方式来达成。(i)诱导上游寡核苷酸延伸-独立性切割；以及(ii)诱导上游寡核苷酸延伸-依赖性切割。
在上游寡核苷酸与探测和标记寡核苷酸相邻近，进而能够充分诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的上述探测和标记寡核苷酸的切割反应的情况下，与上游寡核苷酸结合的上述酶能够无需延伸反应而切割探测和标记寡核苷酸。相反，在上游寡核苷酸从探测和标记寡核苷酸隔开的情况下，具有聚合酶活性的酶(例如，模板-依赖性聚合酶)促进上游寡核苷酸(例如，上游引物)的延伸，且与延伸产物相结合的具有5’核酸酶活性的酶切割探测和标记寡核苷酸。
因此，上游寡核苷酸能够以2种方式位于与探测和标记寡核苷酸相对的位置。上游寡核苷酸可位于与探测和标记寡核苷酸邻近的位置，由此以延伸-独立性方式能够充分诱导探测和标记寡核苷酸切割。择一性地，上游寡核苷酸可位于充分能够以延伸-依赖性方式诱导探测和标记寡核苷酸切割的从探测和标记寡核苷酸隔开的位置。
在本说明书中揭示方位(positions)或位置(locations)而使用的术语“邻近的(adjacent)”意味着上游寡核苷酸紧位于与探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位相近的位置形成缺口(nick)。并且，上述术语意味着上游寡核苷酸位于从探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位隔开1-30核苷酸、1-20核苷酸或1-15核苷酸的位置。
在本说明书中揭示方位或位置而使用的术语“隔开(distant)”包含能够充分产生延伸反应的某种位置或位点。
根据优选一实例，上游寡核苷酸可位于从探测和标记寡核苷酸隔开的位置，由此以延伸-依赖性方式能够充分诱导探测和标记寡核苷酸切割。
根据优选一实例，上游寡核苷酸为上游引物或上游探针。上游引物适合诱导延伸-独立性切割或延伸-依赖性切割，上游探针适合诱导延伸-独立性切割。
选择性地，上游寡核苷酸可具有与探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-一部分部分重叠的序列(partial-overlapped sequence)。重叠的序列优选为1-10核苷酸长度、更优选为1-5核苷酸长度、尤其优选为1-3核苷酸长度。在上游寡核苷酸具有与探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-一部分部分重叠的序列(partial-overlapped sequence)的情况下，在步骤(b)的切割反应中，3’-靶向部位将与5’-标记部位一起被部分切割。并且，重叠的序列能够使3’-靶向部位中所需的特定部位被切割。
根据优选一实例，上游引物通过其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的探测和标记寡核苷酸切割。
只要上游寡核苷酸能够诱导与靶核酸序列杂交的探测和标记寡核苷酸切割，使得包含探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的一部分的片段被放出，那么与基于上游寡核苷酸的切割反应相关的现有技术就能够适用于本发明。例如，美国专利第5210015号、第5487972号、第5691142号、第5994069号、第7381532号以及美国申请公开号第2008-0241838号就能够应用于本发明。
根据优选一实例，上述方法在存在下游引物的情况下实施。下游引物能够使与探测和标记寡核苷酸杂交的靶核酸序列追加生成，并能够提高靶检测的灵敏度。
根据优选一实例，在利用上游引物以及下游引物的情况下，为了引物的延伸可追加使用模板-依赖性核酸聚合酶。
根据优选一实例，上游寡核苷酸(上游引物或上游探针)、下游引物和/或探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位具有由本发明人开发的双重引发寡核苷酸(DPO)结构。具有DPO结构的寡核苷酸与现有引物以及探针相比表现出相当得到改善的靶特异度(参照WO2006/095981；Chun等，Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detectionof respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19gene，Nucleic AcidResearch，35:6e40(2007))。
根据优选一实例，探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位具有由本发明人开发的变形双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构。变形双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构与现有的探针相比表现出相当得到改善的靶特异性(参照WO2011/028041)。
【步骤(b)：从探测和标记寡核苷酸放出片段】
接着，在用于探测和标记寡核苷酸切割的条件下，使步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触。与靶核酸序列杂交的探测和标记寡核苷酸被具有5’核酸酶活性的酶切割，因而放出包含探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段。
在本说明书中使用的术语“用于探测和标记寡核苷酸切割的条件”意味着对基于具有5’核酸酶活性的酶发生与靶核酸序列杂交的探测和标记寡核苷酸切割的充分的条件，例如，温度、pH、离子强度、缓冲液、寡核苷酸的长度及序列和酶。例如，在利用作为具有5’核酸酶活性的酶的Taq DNA聚合酶的情况下，用于探测和标记寡核苷酸切割的条件包含Tris-HCl缓冲液、KCl、MgCl2以及温度。
在探测和标记寡核苷酸与靶核酸序列杂交的情况下，虽然探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位与靶核酸序列杂交，但是5’-标记部位就不与靶核酸序列杂交，而是形成单链(参照图2)。像这样，可基于在本发明所属领域中公知的各种技术，利用具有5’核酸酶活性的酶来切割均包含单链以及双链结构的寡核苷酸。
探测和标记寡核苷酸切割的位置根据上游寡核苷酸(上游探针或上游引物)的种类、上游寡核苷酸的杂交位置以及切割条件而多样(参照美国专利第5210015号、第5487972号、第5691142号、第5994069号以及第7381532号或美国申请公开号第2008-0241838号)。
为了探测和标记寡核苷酸的切割反应，可利用多个现有技术，并放出包含5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段。
综上所述，在步骤(b)的切割反应中可有三种切割位置。第一切割位置为探测和标记寡核苷酸的杂交部位(3’-靶向部位)以及非-杂交部位(5’-标记部位)之间的连接位置(junction site)。第二切割位置为从探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的3’-末端沿着3’-方向隔开一部分核苷酸的位置。第二切割位置可位于探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端一部分。第三切割位置为从探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的3’-末端沿着5’-方向隔开一部分核苷酸的位置。
根据优选一实例，上游引物被延伸的同时基于具有5’核酸酶活性的模板-依赖性聚合酶而开始探测和标记寡核苷酸切割的位置是探测和标记寡核苷酸及靶核酸序列之间的双链开始的方位或从其开始方位隔开1-3核苷酸的位置。
因此，在本说明书中揭示基于具有5’核酸酶活性的酶的探测和标记寡核苷酸切割而使用的术语“包含探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段”意味着包含(i)5’-标记部位、(ii)5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端一部分以及(iii)5’-标记部位的一部分。并且，在本说明书中，术语“包含探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段”表现为“探测和标记寡核苷酸片段”。
根据一实例，探测和标记寡核苷酸具有阻断剂部位，上述阻断剂部位包含对具有5’核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的1个阻断剂，上述阻断剂部位用于调节切割位置和/或连续性切割。
根据一实例，探测和标记寡核苷酸具有阻断剂部位作为阻断剂(blocker)，上述阻断剂部位包含对具有5’核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的最少1个核苷酸。
例如，为了在探测和标记寡核苷酸的杂交部位(3’-靶向部位)以及非-杂交部位(5’-标记部位)之间的连接位置(junction site)诱导切割，探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端一部分可以由阻断剂阻断。
阻断剂部位中所包含的阻断剂的数量不受限制，优选为1-10阻断剂，更优选为2-10阻断剂，尤其优选为3-8阻断剂，最优选为3-6阻断剂。存在于探针的阻断剂能够以连续或不连续的方式存在，优选为连续的方式。作为阻断剂的核苷酸，即包含对5’→3’外切核酸酶活性具有耐性的主链的核苷酸包含本领域中公知的任何核苷酸。例如，上述核苷酸包含各种硫代磷酸酯连接、膦酸酯连接、磷酰胺酯连接及2’-碳水化合物变形。根据本发明的更优选的一实例，包含对5’→3’外切核酸酶具有耐性的主链的核苷酸包含硫代磷酸酯连接、烷基磷酸三酯连接、芳基磷酸三酯连接、膦酸烷基酯连接、膦酸芳基酯连接、氢膦酸酯连接、烷基磷酰胺酯连接、芳基磷酰胺酯连接、硒代磷酸酯连接、2’-O-氨基丙基变形、2’-O-烷基变形、2’-O-烯丙基变形、2’-O-丁基变形、α-异头寡脱氧核苷酸及1-(4’-硫代-β-D-呋喃核糖)变形。
根据一实例，核苷酸包含锁核酸(LNA，locked nulceic acid)作为阻断剂。
在本说明书中揭示如探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的一部分、探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端一部分以及捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位的5’-末端一部分的探测和标记寡核苷酸或捕捉和模板化寡核苷酸而使用的术语“一部分(part)”意味着由1-40、1-30、1-20、1-15、1-10或1-5核苷酸组成的核苷酸序列，优选为1核苷酸、2核苷酸、3核苷酸或4核苷酸。
根据优选一实例，具有5’核酸酶活性的酶为具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或瓣状核酸内切酶，更优选为具有5’核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶或瓣状核酸内切酶。
适合于本发明的具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶为从各种细菌种得到的热稳定性DNA聚合酶，其包含Thermus aquaticus(Taq)、Thermus thermophilus(Tth)、Thermusfiliformis、Thermis flavus、Thermococcus literalis、Thermus antranikianii、Thermus caldophilus、Thermus chliarophilus、Thermus flavus、Thermus igniterrae、Thermus lacteus、Thermus oshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermusscotoductus、Thermus silvanus、Thermus species Z05、Thermus species sps17、Thermus thermophilus、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana、Thermosiphoafricanus、Thermococcus litoralis、Thermococcus barossi、Thermococcusgorgonarius、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana、Thermosiphoafricanus、Pyrococcus woesei、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、Pyrodictiumoccultum、Aquifex pyrophilus以及Aquifex aeolieus。最优选地，热稳定性DNA聚合酶为Taq聚合酶。
择一性地，本发明可使用变形为虽然具有5’核酸酶活性，但减少聚合酶活性的DNA聚合酶。
所使用的瓣状核酸内切酶(FEN，flap endonuclease)为5’皮瓣-特异性核酸酶(5’flap-specific nuclease)。
适合于本发明的瓣状核酸内切酶包含从各种细菌种得到的瓣状核酸内切酶，其包含Sulfolobus solfataricus、Pyrobaculum aerophilum、Thermococcus litoralis、Archaeaglobus veneficus、Archaeaglobus profundus、Acidianus brierlyi、Acidianusambivalens、Desulfurococcus amylolyticus、Desulfurococcus mobilis、Pyrodictiumbrockii、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus zilligii、Methanopyrus kandleri、Methanococcus igneus、Pyrococcus horikoshii、Aeropyrum pernix以及Archaeaglobusveneficus。
优选地，在步骤(a)中利用上游引物的情况下，用于探测和标记寡核苷酸切割的条件包含上游引物的延伸反应。
根据优选一实例，在步骤(a)中利用上游引物，为了使上述上游引物延伸，利用模板-依赖性聚合酶，上述模板-依赖性聚合酶为与具有5’核酸酶活性的酶相同的酶。
选择性地，在步骤(a)中利用上游引物，为了使上述上游引物延伸，利用模板-依赖性聚合酶，上述模板-依赖性聚合酶为与具有5’核酸酶活性的酶不同的酶。
【步骤(c)：从探测和标记寡核苷酸放出的片段与捕捉和模板化寡核苷酸的杂交】
从探测和标记寡核苷酸放出的片段与捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturingand Templating Oligonucleotide)杂交。
捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含与探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，其包含与探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列。
捕捉和模板化寡核苷酸起到用于延伸从探测和标记寡核苷酸放出的片段的模板的作用。起到引物作用的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸杂交，并通过被延伸来形成二聚物。
只要模板化部位具有与探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的序列，那么就可以包含任何序列。并且，只要模板化部位能够起到用于延伸从探测和标记寡核苷酸放出的片段的模板的作用，那么就可以包含任何序列。
如上所述，优选地，在放出具有探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的片段的情况下，捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位应被设计成包含与5’-标记部位互补的核苷酸序列。优选地，在放出具有5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端一部分的片段的情况下，捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位应被设计成包含与5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端一部分互补的核苷酸序列。优选地，在放出具有探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的一部分的片段的情况下，捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位应被设计成具有与5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列。
另一方面，可通过预想探测和标记寡核苷酸切割位置来设计捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位。例如，在捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位被设计成包含与5’-标记部位互补的核苷酸序列的情况下，具有5’-标记部位的一部分的片段或具有5’-标记部位的片段可与捕捉部位杂交，之后将被延伸。在放出包含5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端一部分的片段的情况下，上述片段可能与被设计成包含与5’-标记部位互补的核苷酸序列的捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，即使在上述片段的3’-末端部位存在错配核苷酸，也能够成功地被延伸。这是因为即使引物的3’-末端包含一部分错配核苷酸(例如，1～3错配核苷酸)，引物也能够根据反应条件而被延伸。
在放出包含5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端一部分的片段的情况下，能够通过将捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位的5’-末端一部分设计成具有与被切割的上述3’-靶向部位的5’-末端一部分互补的核苷酸序列，来解决与错配核苷酸相关的问题(参照图1)。
优选地，就与被切割的3’-靶向部位的5’-末端一部分互补的捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位的5’-末端一部分的核苷酸序列而言，可根据探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位上的预想到的切割位置来选择。与被切割的3’-靶向部位的5’-末端一部分互补的捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位的5’-末端一部分的核苷酸序列优选为1-10核苷酸，更优选为1-5核苷酸，尤其优选为1-3核苷酸。
捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端可包含不包含于与片段的杂交的追加的核苷酸。并且，只要捕捉和模板化寡核苷酸与上述片段稳定地杂交，那么捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位就能够包含仅与上述片段的一部分(例如，包含片段的3’-末端部位的片段的一部分)互补的核苷酸序列。
如上所述，在本说明书中使用的术语“包含与5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列的捕捉部位”将包括捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位的各种设计以及结构来进行说明。
捕捉和模板化寡核苷酸可被设计成具有发夹结构。
捕捉和模板化寡核苷酸的长度可以多样。例如，捕捉和模板化寡核苷酸具有7-1000核苷酸、7-500核苷酸、7-300核苷酸、7-100核苷酸、7-80核苷酸、7-60核苷酸、7-40核苷酸、15-1000核苷酸、15-500核苷酸、15-300核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸、20-1000核苷酸、20-500核苷酸、20-300核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-60核苷酸、20-40核苷酸、30-1000核苷酸、30-500核苷酸、30-300核苷酸、30-100核苷酸、30-80核苷酸、30-60核苷酸或30-40核苷酸的长度。只要与从探测和标记寡核苷酸放出的片段特异性地杂交，那么捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位就可以具有任何长度。例如，捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位可以具有5-100核苷酸、5-60核苷酸、5-40核苷酸、5-30核苷酸、5-20核苷酸、10-100核苷酸、10-60核苷酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、10-20核苷酸、15-100核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸或15-20核苷酸的长度。并且，只要捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位在从探测和标记寡核苷酸放出的片段的延伸反应中可起到模板的作用，那么捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位就可以具有任何长度。例如，捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位可以具有1-900核苷酸、1-400核苷酸、1-300核苷酸、1-100核苷酸、1-80核苷酸、1-60核苷酸、1-40核苷酸、1-20核苷酸、2-900核苷酸、2-400核苷酸、2-300核苷酸、2-100核苷酸、2-80核苷酸、2-60核苷酸、2-40核苷酸、2-20核苷酸、5-900核苷酸、5-400核苷酸、5-300核苷酸、5-100核苷酸、5-80核苷酸、5-60核苷酸、5-40核苷酸、5-30核苷酸、10-900核苷酸、10-400核苷酸、10-300核苷酸、15-900核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸或15-20核苷酸的长度。
捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端可以具有3’-OH末端。优选地，捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端被阻断，用于防止延伸。通过现有方法就能够实现阻断捕捉和模板化寡核苷酸的非-延伸。例如，可以通过在捕捉和模板化寡核苷酸的最后核苷酸的3’-羟基追加如生物素、标记、磷酸基、烷基、非-核苷酸连接肽、硫代磷酸酯或烷烃-二醇残基之类的化学组成部分(moiety)来实施阻断。择一性地，阻断可通过去除最后核苷酸的3’-羟基或利用如双脱氧核苷酸之类的没有3’-羟基的核苷酸来实施。
从探测和标记寡核苷酸放出的片段与捕捉和模板化寡核苷酸杂交，并提供适合于片段的延伸的形态。并且，即使非切割探测和标记寡核苷酸通过其5’-标记部位与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，由于探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位不与捕捉和模板化寡核苷酸杂交，因而防止延伸二聚物的形成。
参照对步骤(a)中的杂交的说明，就能够详细地说明步骤(c)中的杂交。
【步骤(d)：片段的延伸】
利用模板-依赖性核酸聚合酶及步骤(c)的结果物来实施延伸反应。与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的片段被延伸，来形成延伸二聚物。相反，与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的非切割探测和标记寡核苷酸不被延伸，也不形成延伸二聚物。
在本说明书中使用的术语“延伸二聚物”意味着基于将模板-依赖性核酸聚合酶和捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位利用为模板使与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的片段被延伸的延伸反应而形成的二聚物。
延伸二聚物的Tm值与非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物(hybrid)的Tm值不同。
优选地，延伸二聚物的Tm值大于非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的Tm值。
延伸二聚物的Tm值可根据(i)片段的序列和/或长度、(ii)捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度或(iii)片段的序列和/或长度以及捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度来调节。
在步骤(e)中，为了基于延伸二聚物的解链来提供表示延伸二聚物的存在的靶信号，使用延伸二聚物的可调节的Tm值，这是本发明的大特征。
在本说明书中使用的术语“Tm”意味着双链核酸分子的群体(population)的一半解离为单链分子的解链温度。Tm值可根据杂交的核苷酸的长度及G/C含量来决定。Tm值可利用如Wallace rule(R.B。Wallace等，Nucleic Acids Research，6:3543-3547(1979))及nearest-neighbor方法(SantaLucia J。Jr.等，Biochemistry，35:3555-3562(1996))；Sugimoto N.等，Nucleic Acids Res.，24:4501-4505(1996))之类的现有的方法来计算。
根据优选一实例，Tm值意味着实际使用的反应条件下的实际Tm值。
在步骤(d)中使用的模板-依赖性核酸聚合酶包含任何核酸聚合酶，例如，E.coliDNA聚合酶I的“克列诺(Klenow)”片段、热稳定性DNA聚合酶以及噬菌体T7DNA聚合酶。优选地，聚合酶为能够从各种细菌种得到的热稳定性DNA聚合酶，其包含Thermus aquaticus(Taq)、Thermus thermophilus(Tth)、Thermus filiformis、Thermis flavus、Thermococcus literalis、Thermus antranikianii、Thermus caldophilus、Thermuschliarophilus、Thermus flavus、Thermus igniterrae、Thermus lacteus、Thermusoshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermus species Z05、Thermus species sps 17、Thermus thermophilus、Thermotogamaritima、Thermotoga neapolitana、Thermosipho africanus、Thermococcus litoralis、Thermococcus barossi、Thermococcus gorgonarius、Thermotoga maritima、Thermotoganeapolitana、Thermosiphoafricanus、Pyrococcus furiosus(Pfu)、Pyrococcus woesei、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、Pyrodictium occultum、Aquifexpyrophilus以及Aquifex aeolieus。最优选地，模板-依赖性核酸聚合酶为Taq聚合酶。
根据优选一实例，在步骤(b)中利用的具有5’核酸酶活性的酶与在步骤(d)中利用的模板-依赖性核酸聚合酶相同。更优选地，在步骤(b)中利用的具有5’核酸酶活性的酶、为了使上游引物延伸而利用的模板-依赖性核酸聚合酶以及在步骤(d)中利用的模板-依赖性核酸聚合酶相同。
延伸二聚物具有(i)与探测和标记寡核苷酸片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的最少1个标记、(ii)在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的标记、(iii)在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的标记以及与探测和标记寡核苷酸片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)来源于嵌入标记(intercalating label)的标记。
在靶核酸序列存在的情况下，形成延伸二聚物，因此延伸二聚物的存在能够表示靶核酸序列的存在。为了以直接的方式检测延伸二聚物的存在，在步骤(d)中形成具有提供能够检测的信号的标记的延伸二聚物。利用于延伸二聚物的标记根据延伸二聚物是否为双链或单链来提供信号变化，最终，根据延伸二聚物的解链来提供表示延伸二聚物的存在的靶信号。
【步骤(e)：延伸二聚物的解链】
在延伸反应之后，延伸二聚物在规定范围的温度下被解链，来提供表示延伸二聚物的存在的靶信号。
靶信号根据(i)与上述片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的最少1个标记、(ii)在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记、(iii)与在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记及上述片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入标记(intercalating label)来提供。
在本说明书中使用的术语“靶信号”意味着能够表示延伸二聚物的存在的所有信号。例如，靶信号包含来自标记的信号(信号产生或消灭)、来自标记的信号的变化(信号增加或减少)、解链曲线、解链模式及解链温度(或Tm值)。
根据优选一实例，靶信号为在解链步骤中，来自延伸二聚物的标记的信号的变化。可通过在至少两个不同的温度下测定信号来得到信号的变化。择一性地，靶信号为在规定温度的范围内测定来自延伸二聚物的标记的信号来得到的解链曲线、解链模式及解链温度(或Tm值)。优选地，温度的范围为用于解链曲线分析的温度的范围或延伸二聚物的Tm值的周围温度。
延伸二聚物的Tm值大于非切割探测和标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的Tm值。因此，延伸二聚物及杂交物表示相互不同的解链模式。通过这种不同的解链模式区别非-靶信号和靶信号。不同的解链模式或解链温度与适当的标记系统一起产生靶信号。
在本发明中使用的适当的标记系统在种类、位置及信号产生方式方面多样。
以下，可详细说明在本发明中有用的标记系统。
【(i)与片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记】
根据优选一实例，上述信号根据与片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的最少1个标记来提供。延伸二聚物形成于探测和标记寡核苷酸片段及捕捉和模板化寡核苷酸之间，因此探测和标记寡核苷酸片段或捕捉和模板化寡核苷酸的标记存在于延伸二聚物，从而在解链步骤中提供靶信号。
标记包含相互作用性双重标记及单一标记。
【(i-1)相互作用性双重标记】
相互作用性标记系统为能量以非-放射性(non-radioactively)方式向供体分子和受体分子之间传达的信号产生系统。作为相互作用性标记系统的代表性例，荧光共振能量转移(FRET，fluorescence resonance energy transfer)标记系统包含荧光报道分子(供体分子)及猝灭分子(受体分子)。在FRET中，能量供体为荧光性，但是能量受体可以为荧光性或非-荧光性。在相互作用性标记系统的再一例中，能量供体为非-荧光性，例如为发色团(chromophore)，能量受体为荧光性。在相互作用性标记系统的另一例中，能量供体为发光性(luminescent)，例如为生物发光性、化学发光性或电化学发光性，能量受体为荧光性。在本发明中，可将供体分子及受体分子分别说明为报道分子及猝灭分子。
优选地，表示延伸二聚物的存在(即，靶核酸序列的存在)的信号借助相互作用性标记系统产生，更优选地，借助FRET标记系统(即，相互作用性双重标记系统)产生。
【实例1(链内相互作用性-双重标记)】
在相互作用性双重标记系统的实例1中，片段或捕捉和模板化寡核苷酸具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记，在上述步骤(e)中的延伸二聚物的解链诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化，来在步骤(e)中提供靶信号。在图2、图6及图9中图式性地示出相互作用性双重标记系统的实例1。实例1被命名为链内相互作用性-双重标记。
【图2中的实例1(链内相互作用性-双重标记)】
参照图2，对例示的实例进行说明。捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位具有报道分子及猝灭分子。与靶核酸序列杂交的探测和标记寡核苷酸被切割并放出片段，且上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交并被延伸，来形成延伸二聚物。
在步骤(d)中形成延伸二聚物的情况下，捕捉和模板化寡核苷酸的报道分子及猝灭分子在结构上(conformationally)相互隔开，使得猝灭分子不对来自报道分子的信号进行猝灭；在步骤(e)中延伸二聚物被解链的情况下，报道分子及猝灭分子在结构上相互接近，使得猝灭分子对来自报道分子的信号进行猝灭，由此提供靶信号，并在步骤(e)中表示延伸二聚物的存在。
在本说明书中使用的表达“报道分子及猝灭分子在结构上接近”意味着片段或捕捉和模板化寡核苷酸的形态结构，例如，意味着借助无规卷曲(coli)及发夹结构使报道分子及猝灭分子以三维方式相邻。
在本说明书中使用的表达“报道分子及猝灭分子在结构上隔开”意味着基于双链的形成的片段或捕捉和模板化寡核苷酸的形态结构的变化，使报道分子及猝灭分子以三维方式隔开。
优选地，在步骤(e)中提供的靶信号包含测定在步骤(d)中产生的荧光信号的变化来得到的解链曲线、解链模式或Tm值。
根据优选一实例，只要与延伸二聚物解链依赖性地对来自报道分子的信号进行猝灭或不对来自报道分子的信号进行猝灭，那么报道分子及猝灭分子可以位于捕捉和模板化寡核苷酸的任何位置。
根据优选一实例，报道分子及猝灭分子均与捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位或捕捉部位相连接。
根据优选一实例，报道分子及猝灭分子位于捕捉和模板化寡核苷酸的5’-末端及3’-末端。
根据优选一实例，捕捉和模板化寡核苷酸的报道分子及猝灭分子中的一个位于其5’-末端或从其5’-末端隔开1-5核苷酸的位置，另一个位于根据捕捉和模板化寡核苷酸的形态来对来自报道分子的信号进行猝灭和不对来自报道分子的信号进行猝灭的位置。
根据优选一实例，捕捉和模板化寡核苷酸的报道分子及猝灭分子中的一个位于其3’-末端或从其3’-末端隔开1-5核苷酸的位置，另一个位于根据捕捉和模板化寡核苷酸的形态(conformation)来对来自报道分子的信号进行猝灭和不对来自报道分子的信号进行猝灭的位置。
根据优选一实例，报道分子及猝灭分子相互最大隔开80核苷酸，更优选为最大60核苷酸，尤其优选为最大30核苷酸，最优选为最大25核苷酸。根据优选一实例，报道分子及猝灭分子隔开最少4核苷酸，更优选为最少6核苷酸，尤其优选为最少10核苷酸，最优选为最少15核苷酸。
在本发明中，能够形成非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物。
如图2所示，捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位由相互作用性双重标记标记的情况下，不会从非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的标记诱导信号的变化。因此，杂交物不提供非-靶信号。
捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位由相互作用性双重标记标记的情况下，在解链步骤中，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物提供非-靶信号。这种情况下，可根据延伸二聚物及杂交物的Tm值的差异来区别延伸二聚物的靶信号和杂交物的非-靶信号。
【图6中的实例1(链内相互作用性-双重标记)】
参照图6，对例示的实例进行说明。探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位具有报道分子及猝灭分子。与靶核酸序列杂交的探测和标记寡核苷酸被切割，来放出包含具有报道分子及猝灭分子的5’-标记部位的片段。上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交。
在步骤(d)中形成延伸二聚物的情况下，片段的报道分子及猝灭分子在结构上隔开，使得猝灭分子不对来自报道分子的信号进行猝灭；在步骤(e)中延伸二聚物被解链的情况下，报道分子及猝灭分子在结构上相互接近，使得猝灭分子对来自报道分子的信号进行猝灭，由此提供靶信号，并在步骤(e)中表示延伸二聚物的存在。
根据优选一实例，只要根据延伸二聚物的解链对来自报道分子的信号进行猝灭和不对来自报道分子的信号进行猝灭，那么报道分子及猝灭分子可以位于片段的任何位置。
根据优选一实例，片段的报道分子及猝灭分子中的一个位于其5’-末端或从其5’-末端隔开1-5核苷酸的位置，另一个位于根据片段的形态(conformation)对来自报道分子的信号进行猝灭和不对来自报道分子的信号进行猝灭的位置。
根据优选一实例，报道分子及猝灭分子相互最大隔开50核苷酸，更优选为最大40核苷酸，尤其优选为最大30核苷酸，最优选为最大20核苷酸。根据优选一实例，报道分子及猝灭分子隔开最少4核苷酸，更优选为最少6核苷酸，尤其优选为最少10核苷酸，最优选为最少15核苷酸。
如图6所示，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物在解链步骤中提供非-靶信号。这种情况下，可根据延伸二聚物及杂交物的Tm值的差异来区别延伸二聚物的靶信号和杂交物的非-靶信号。
【实例2(链间相互作用性-双重标记)】
在相互作用性标记系统的实例2中，片段具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记中的一个，捕捉和模板化寡核苷酸具有相互作用性双重标记的另一个；在上述步骤(e)中的延伸二聚物的解链诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化，并在步骤(e)中提供靶信号。
参照图8，对例示的实例进行说明。
在步骤(d)中形成延伸二聚物的情况下，借助与探测和标记寡核苷酸相连接的猝灭分子对与捕捉和模板化寡核苷酸相连接的来自报道分子的信号进行猝灭。在步骤(e)中延伸二聚物被解链的情况下，报道分子及猝灭分子相互隔开，使得猝灭分子不对来自报道分子的信号进行猝灭，由此提供靶信号，并在步骤(e)中表示延伸二聚物的存在。
优选地，在步骤(e)中提供的靶信号包含测定来自相互作用性双重标记的荧光信号的变化来得到的解链曲线、解链模式或Tm值。
只要借助延伸二聚物的猝灭分子对来自报道分子的信号进行猝灭，那么报道分子及猝灭分子可以位于探测和标记寡核苷酸片段及捕捉和模板化寡核苷酸的任何位置。
根据优选一实例，探测和标记寡核苷酸的报道分子或猝灭分子位于5’-标记部位的5’-末端。
根据优选一实例，捕捉和模板化寡核苷酸的报道分子或猝灭分子位于其3’-末端。
如图8所示，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物在解链步骤中提供非-靶信号。这种情况下，可根据延伸二聚物及杂交物的Tm值的差异来区别延伸二聚物的靶信号和杂交物的非-靶信号。
在本发明中有用的报道分子及猝灭分子可包含在本发明所属技术领域中公知的任何分子。具体例如下：Cy2TM(506)、YO-PROTM-1(509)、YOYOTM-1(509)、Calcein(517)、FITC(518)、FluorXTM(519)、AlexaTM(520)、Rhodamine110(520)、Oregon GreenTM500(522)、Oregon GreenTM488(524)、RiboGreenTM(525)、Rhodamine GreenTM(527)、Rhodamine123(529)、Magnesium GreenTM(531)、Calcium GreenTM(533)、TO-PROTM-1(533)、TOTO1(533)、JOE(548)、BODIPY530/550(550)、Dil(565)、BODIPY TMR(568)、BODIPY558/568(568)、BODIPY564/570(570)、Cy3TM(570)、AlexaTM546(570)、TRITC(572)、Magnesium OrangeTM(575)、Phycoerythrin R&B(575)、Rhodamine Phalloidin(575)、Calcium OrangeTM(576)、Pyronin Y(580)、Rhodamine B(580)、TAMRA(582)、Rhodamine RedTM(590)、Cy3.5TM(596)、ROX(608)、Calcium CrimsonTM(615)、AlexaTM594(615)、Texas Red(615)、Nile Red(628)、YO-PROTM-3(631)、YOYOTM-3(631)、R-phycocyanin(642)、C-Phycocyanin(648)、TO-PROTM-3(660)、TOTO3(660)、DiD DilC(5)(665)、Cy5TM(670)、Thiadicarbocyanine(671)、Cy5.5(694)、HEX(556)、TET(536)、Biosearch Blue(447)、CAL Fluor Gold540(544)、CAL FluorOrange560(559)、CAL Fluor Red590(591)、CAL Fluor Red610(610)、CAL Fluor Red635(637)、FAM(520)、Fluorescein(520)、Fluorescein-C3(520)、Pulsar650(566)、Quasar570(667)、Quasar670(705)及Quasar705(610)。括号内的数字为以纳米为单位表示的最大的发光波长。优选地，报道分子及猝灭分子包含JOE、FAM、TAMRA、ROX及基于荧光素的标记。
适合的一对报道分子-猝灭分子公开在许多文献中：Pesce等，editors，Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker，New York，1971)；White等，FluorescenceAnalysis：A Practical Approach(Marcel Dekker，New York，1970)；Berlman，Handbookof Fluorescence Spectra ofAromatic Molecules，2nd Edition(Academic Press，NewYork，1971)；Griffiths，Color AND Constitution of Organic Molecules(AcademicPress，New York，1976)；Bishop，editor，Indicators(Pergamon Press，Oxford，1972)；Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals(MolecularProbes，Eugene，1992)；Pringsheim，Fluorescence and Phosphorescence(IntersciencePublishers，New York，1949)；Haugland，R。P.，Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals，6th Edition(Molecular Probes，Eugene，Oreg.，1996)；美国专利第3996345号及第4351760号。
在本发明中，值得关注的是，可以利用能够对广范围波长或特定波长的荧光进行猝灭的非-荧光黑猝灭分子。作为非-荧光黑猝灭分子的例，有BHQ及DABCYL。
在适用于捕捉和模板化寡核苷酸的FRET标记中，报道分子包含FRET的供体，猝灭分子包含FRET的另一伙伴(受体)。例如，荧光素染料(fluorescein dye)用作报道分子，罗丹明染料(rhodamine dye)用作猝灭分子。
上述标记可通过现有的方法与捕捉和模板化寡核苷酸或探测和标记寡核苷酸相连接。优选地，通过包含碳原子的间隔区(例如，3-碳间隔区、6-碳间隔区或12-碳间隔区)与捕捉和模板化寡核苷酸或探测和标记寡核苷酸相连接。
【(i-2)单一标记】
并且，本发明利用提供表示靶核酸序列的存在的信号的单一标记系统来优秀地被实施。
根据优选一实例，片段或捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记，在步骤(e)中的延伸二聚物的解链诱导来自单一标记的信号的变化，并在步骤(e)中提供靶信号。
【图3中的实例1(单一标记系统)】
参照图3，对例示的实例进行说明。捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位具有单一荧光标记。与靶核酸序列杂交的探测和标记寡核苷酸被切割，来放出片段。上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交并被延伸，来形成延伸二聚物。延伸二聚物的形成使来自单一荧光标记的荧光强度增加。延伸二聚物在步骤(e)中被解链的情况下，来自单一荧光标记的荧光强度减少，由此提供靶信号，并在步骤(e)中表示延伸二聚物的存在。
根据优选一实例，只要根据延伸二聚物的解链使来自单一标记的信号的水平发生变化，那么单一标记就可以位于捕捉和模板化寡核苷酸的任何位置。
根据优选一实例，单一标记与捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位或捕捉部位相连接。
如图3所示，捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位由单一标记标记的情况下，不诱导来自非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的标记的信号的变化。因此，杂交物不提供非-靶信号。
捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位由单一标记标记的情况下，在解链步骤中，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物提供非-靶信号。这种情况下，可根据延伸二聚物及杂交物的Tm值的差异来区别延伸二聚物的靶信号和杂交物的非-靶信号。
【图7中的实例2(单一标记系统)】
参照图7，对例示的实例进行说明。探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位具有单一荧光标记。与靶核酸序列杂交的探测和标记寡核苷酸被切割，来放出包含具有单一荧光标记的5’-标记部位的片段。借助杂交使来自5’-标记部位的单一荧光标记的荧光强度增加。延伸二聚物在步骤(e)中被解链的情况下，来自单一荧光标记的信号强度减少，由此提供靶信号，并在步骤(e)中表示延伸二聚物的存在。
根据优选一实例，只要根据延伸二聚物的解链使来自单一标记的信号的水平发生变化，那么单一标记就可以位于探测和标记寡核苷酸片段的任何位置。
如图7所示，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物在解链步骤中提供非-靶信号。这种情况下，可根据延伸二聚物及杂交物的Tm值的差异来区别延伸二聚物的靶信号和杂交物的非-靶信号。
在本说明书中使用的单一标记应根据存在于双链上或单链上来提供不同的信号。单一标记包括荧光标记、发光标记、化学发光标记、电化学标记及金属标记。优选地，单一标记包括荧光标记。
在本发明中使用的单一荧光标记的种类及优选结合位置公开在美国专利第7537886号及第7348141号中，且相关教导事项包括在本说明书作为参照。优选地，单一荧光标记包含JOE、FAM、TAMRA、ROX以及基于荧光素的标记。优选地，被标记的核苷酸残基位于寡核苷酸内的内部核苷酸残基，而不是5’-末端或3’-末端。
参照如上所述的报道分子及猝灭分子的说明，对在本发明中有用的单一荧光标记进行说明。
尤其，在固相中利用单一标记来实施本发明的情况下，可以利用通常的荧光标记，不需要可根据存在于双链上或单链上提供具有不同的强度的荧光信号的特定的荧光标记。测定在固相底物中提供的靶信号。在图12中图式性地示出了使用实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸的单一标记系统的实例。
利用在固相底物实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸的情况下，可以利用化学标记(例如，生物素)或酶标记(例如，碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶以及β-葡萄糖苷酶)。
在利用“与片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记”的标记系统中，形成非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的情况下，标记位于上述杂交物在步骤(e)中不提供非-靶信号的范围内。择一性地，形成非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的情况下，标记可以位于上述杂交物在步骤(e)中提供非-靶信号的范围内，上述延伸二聚物的Tm值高于非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的Tm值。
尤其，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物位于不提供非-靶信号的范围内的情况下，包含上述杂交物的Tm值的区间可以利用于选择用于检测靶核酸序列的延伸二聚物的Tm值。
【(ii)向延伸二聚物内插入的标记】
本发明为了提供表示延伸二聚物的存在的靶信号，可以利用在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的标记。
即使探测和标记寡核苷酸片段或捕捉和模板化寡核苷酸不具有标记，也利用在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的标记来成功标记延伸二聚物。图10及图11图式性地示出了单一标记核苷酸在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的实例(参照图10及图11的C及D)。并且，本实例也可适用于利用解链分析的其他实例。
根据优选一实例，靶信号借助在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的单一标记提供；上述插入的单一标记与在延伸反应期间插入的核苷酸相连接；在步骤(e)中的上述延伸二聚物的解链诱导来自单一标记的信号的变化，并在步骤(e)中提供靶信号。
参照图10，对例示的实例进行说明。与靶核酸序列杂交的探测和标记寡核苷酸被切割来放出片段。上述片段与在固相底物实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，并在由单一荧光标记标记的核苷酸存在的条件下被延伸，来形成延伸二聚物。将捕捉和模板化寡核苷酸固定化的固相底物的点可以检测来自延伸二聚物的荧光信号。延伸二聚物被解链的情况下，放出具有荧光标记的链，而在点上再也检测不到荧光信号(在图10中，未图示)。因此，能够借助延伸二聚物的解链在点上提供信号的变化。即，提供靶信号，并在步骤(e)中表示延伸二聚物的存在。
在步骤(e)中提供的靶信号包括在捕捉和模板化寡核苷酸-固定化点上测定荧光强度的变化来得到的解链曲线、解链模式或Tm值。
根据优选一实例，在延伸反应期间插入(incorporated)的核苷酸为ddNTP。
根据优选一实例，如图11中图式性地示出，在延伸反应期间插入的核苷酸具有第一非-天然碱基(non-natural base)，捕捉和模板化寡核苷酸具有对上述第一非-天然碱基具有特异性结合亲和性的第二非-天然碱基。优选地，具有第二非-天然碱基的核苷酸位于捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位的任何位置。
在本说明书中使用的术语“非-天然碱基”意味着如能够形成氢键碱基对的腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)之类的天然碱基的衍生物。在本说明书中使用的术语“非-天然碱基”包含具有与作为母体化合物(mother compound)的天然碱基不同的碱基对模式的碱基，例如，在美国专利第5432272号、第5965364号、第6001983号及第6037120号中记载。非-天然碱基之间的碱基对与天然碱基类似地包含两个或三个氢键。并且，非-天然碱基之间的碱基对也以特定的方式形成。
作为非-天然碱基的特定的例，包含以下碱基的碱基对组合：iso-C/iso-G、iso-dC/iso-dG、K/X、H/J及M/N(参照美国专利第7422850号)。
参照图11，对例示的实例进行说明。包含具有第二非-天然碱基(例如，iso-dC)的核苷酸的捕捉和模板化寡核苷酸与片段杂交，上述第二非-天然碱基对第一非-天然碱基(例如，iso-dG)具有特异性结合亲和性。具有由单一荧光标记标记的第一非-天然碱基的核苷酸存在的条件下，实施延伸来形成延伸二聚物。在延伸反应中，具有第一非-天然碱基的核苷酸插入于具有第二非-天然碱基的核苷酸的对面位置。
在实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸存在的固相底物的点上可检测来自延伸二聚物的荧光信号。延伸二聚物被解链的情况下，放出具有荧光标记的链，而在点上再也检测不到荧光信号(在图11中，未图示)。因此，可借助延伸二聚物的解链在点上提供信号的变化。即，提供靶信号，并在步骤(e)中表示延伸二聚物的存在。
利用在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的标记的情况下，标记不包含于非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物内。这是因为杂交物不被延伸。因此，杂交物不提供非-靶信号。
可参照在本说明书中所述的利用“与片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记”的标记系统的说明，对所使用的单一标记的种类及特征进行说明。
【(iii)向延伸二聚物内插入的标记和与片段或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记】
如在图4及图5中图式性地示出，本发明可使用利用在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的标记和与片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记的组合的标记系统。
根据优选一实例，根据在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的标记和与片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记提供靶信号，插入的标记与在上述延伸反应期间插入的核苷酸相连接，上述两个标记为报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记；在上述步骤(e)中的延伸二聚物的解链诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化，并在步骤(e)中提供靶信号。
更优选地，在延伸反应期间插入的核苷酸具有第一非-天然碱基，捕捉和模板化寡核苷酸具有对第一非-天然碱基存在特异性结合亲和性的第二非-天然碱基。
参照图4，对例示的实例进行说明。包含具有第二非-天然碱基(例如，iso-dC)的核苷酸的捕捉和模板化寡核苷酸与片段杂交，上述第二非-天然碱基对报道分子或猝灭分子及第一非-天然碱基(例如，iso-dG)存在特异性结合亲和性。具有由猝灭分子或报道分子标记的第一非-天然碱基的核苷酸存在的条件下，实施延伸来形成延伸二聚物，并借助猝灭分子来对来自报道分子的信号进行猝灭。在延伸反应中，具有第一非-天然碱基的核苷酸插入于具有第二非-天然碱基的核苷酸的对面位置。
在步骤(e)中延伸二聚物被解链的情况下，报道分子及猝灭分子相互隔开，猝灭分子不对来自报道分子的信号进行猝灭，由此提供靶信号，并在步骤(e)中表示延伸二聚物的存在。
优选地，在步骤(e)中提供的靶信号包括测定来自相互作用性双重标记的信号的变化来得到的解链曲线、解链模式或Tm值。
在解链步骤中，捕捉和模板化寡核苷酸上的标记位置及所插入的标记的插入位置在上述两个标记起到诱导信号的变化的相互作用性双重标记作用的范围内决定。
更优选地，捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位具有核苷酸，上述核苷酸具有报道分子或猝灭分子及第二非-天然碱基。在步骤(d)中的延伸反应在具有第一非-天然碱基的核苷酸存在的条件下实施，上述第一非-天然碱基对猝灭分子或报道分子及捕捉和模板化寡核苷酸内的第二非-天然碱基存在特异性结合亲和性。步骤(d)的延伸二聚物的两个非-天然碱基形成碱基对，并借助猝灭分子对来自报道分子的信号进行猝灭，并诱导信号的变化，由此提供靶信号。选择性地，片段具有报道分子或猝灭分子，捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位具有核苷酸，上述核苷酸具有第二非-天然碱基。在步骤(d)中的延伸反应在具有第一非-天然碱基的核苷酸存在的条件下实施，上述第一非-天然碱基对猝灭分子或报道分子及捕捉和模板化寡核苷酸内的第二非-天然碱基存在特异性结合亲和性。步骤(d)的延伸二聚物的两个非-天然碱基形成碱基对，并借助猝灭分子诱导来自报道分子的信号的变化，由此提供靶信号。
参照图5，对再一例示的实例进行说明。在本实例中，包含报道分子或猝灭分子的片段与包含具有第二非-天然碱基(例如，iso-dC)的核苷酸的捕捉和模板化寡核苷酸杂交，上述第二非-天然碱基对第一非-天然碱基(例如，iso-dG)具有特异性结合亲和性。在具有由猝灭分子或报道分子标记的第一非-天然碱基的核苷酸存在的条件下实施延伸，来形成延伸二聚物，并借助猝灭分子对来自报道分子的信号进行猝灭。在延伸反应中，具有第一非-天然碱基的核苷酸插入于具有第二非-天然碱基的核苷酸的对面位置。
在步骤(d)中形成延伸二聚物的情况下，报道分子及猝灭分子在结构上相互隔开，使得猝灭分子不对来自报道分子的信号进行猝灭；在上述步骤(e)中延伸二聚物被解链的情况下，报道分子及猝灭分子在结构上相互接近，使得猝灭分子对来自报道分子的信号进行猝灭，由此提供靶信号，并在步骤(e)中表示延伸二聚物的存在。
优选地，在步骤(e)中提供的靶信号包括测定来自相互作用性双重标记的信号的变化来得到的解链曲线、解链模式或Tm值。
在解链步骤中，探测和标记寡核苷酸的标记位置及插入的标记的插入位置在两个标记起到诱导信号的变化的相互作用性双重标记作用的范围内决定。
利用在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的标记的情况下，标记不包含于非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物内。这是因为杂交物不被延伸。因此，杂交物在解链步骤中不提供非-靶信号。
【(iv)嵌入标记(intercalating label)】
本发明可以使用提供表示延伸二聚物的存在的靶信号的嵌入标记。由于在试样内，双链核酸分子可产生信号，因此在利用实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸的固相反应中嵌入标记更有用。
在本发明中有用的嵌入染料的例包含：SYBRTM Green I、PO-PROTM-1、BO-PROTM-1、SYTOTM43、SYTOTM44、SYTOTM45、SYTOXTMBlue、POPOTM-1、POPOTM-3、BOBOTM-1、BOBOTM-3、LO-PROTM-1、JO-PROTM-1、YO-PROTM1、TO-PROTM1、SYTOTM11、SYTOTM13、SYTOTM15、SYTOTM16、SYTOTM20、SYTOTM23、TOTOTM-3、YOYOTM3、GelStarTM以及噻唑橙(thiazole orange)。嵌入染料特异性地插入于双链核酸分子内来产生信号。
在图13中图式性地示出向延伸二聚物的碱基对之间插入嵌入染料的实例(图13的C及D)。并且，本实例也可以适用于利用解链分析的其他实例。
参照图13，对例示的实例进行说明。在固相底物实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位与片段杂交。在嵌入染料(例如，SYBRTM Green)存在的条件下实施延伸，来生成包含嵌入染料的延伸二聚物。可利用嵌入荧光染料来检测从具有实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸的固相底物的点上的延伸二聚物出来的荧光信号。延伸二聚物被解链的情况下，放出嵌入荧光染料，而在点上再也检测不到荧光信号(在图13中，未图示)。因此，提供靶信号，并在步骤(e)中表示延伸二聚物的存在。
非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物在解链步骤中提供非-靶信号。这种情况下，可根据延伸二聚物及杂交物的Tm值的差异来区别延伸二聚物的靶信号和杂交物的非-靶信号(在图13中，未图示)。
优选地，在步骤(e)中提供的靶信号包括测定在步骤(e)中产生的荧光信号的变化来得到的解链曲线、解链模式或Tm值。
【步骤(f)：靶信号的检测】
最终，测定在步骤(e)中提供的靶信号来检测延伸二聚物，由此延伸二聚物的存在表示靶核酸序列的存在。
根据靶信号的种类，能够以各种方法实施检测。
根据优选一实例，利用解链分析来实施靶信号的检测。
在本说明书中使用的术语“解链分析”意味着通过延伸二聚物的解链得到表示延伸二聚物的存在的靶信号的方法，包括在两个不同的温度条件下测定信号的方法、解链曲线分析、解链模式分析及解链峰分析。优选地，解链分析为解链曲线分析。
根据优选一实例，在步骤(e)中通过解链分析检测延伸链的存在，延伸二聚物在提供表示延伸二聚物的存在的靶信号的规定范围的温度下被解链。
择一性地，在步骤(e)中通过杂交分析检测延伸链的存在。优选地，在步骤(e)中通过杂交分析检测延伸链的存在，且延伸二聚物被解链，由此得到的结果物在提供表示延伸二聚物的存在的靶信号的规定范围的温度下杂交。
在本说明书中，根据优选一实例，在步骤(e)的解链之后实施杂交，来提供表示上述延伸二聚物的存在的靶信号。这种情况下，借助杂交曲线分析检测延伸二聚物的存在。
解链曲线或杂交曲线可如现有技术，例如，美国专利第6174670号及第5789167号、Drobyshev等、Gene188：45(1997)；Kochinsky and Mirzabekov Human Mutation19:343(2002)；Livehits等，J。Biomol。Structure Dynam。11:783(1994)；以及Howell等，NatureBiotechnology17:87(1999)中说明的方法来得到。例如，解链曲线或杂交曲线可由对于杂交严格度(stringency)的参数的输出信号(output signal)变化的图表绘制(graphicplot)或显示(display)构成。输出信号能够直接对杂交参数进行绘图。典型地，例如，解链曲线或杂交曲线在Y-轴具有表示二聚物结构的程度(即，杂交程度)的荧光，在X-轴具有绘图(plotting)有杂交参数的输出信号。
荧光vs.温度的一阶导数(derivative)的绘图，即在荧光vs.温度(dF/dT vs。T)或(-dF/dT vs。T)的变化率绘图提供解链峰。
探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸可由天然(naturallyoccurring)dNMPs组成。择一性地，探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸可包含变形核苷酸或非-天然核苷酸，例如肽核酸(PNA，Peptide Nucleic Acid，参照PCT申请第WO92/20702号)以及锁核酸(LNA，Locked Nucleic Acid，参照PCT申请第WO98/22489号、第WO98/39352号以及第WO99/14226号)。探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸可包含如脱氧肌苷(deoxyinosine)、肌苷(inosine)、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯(1-(2’-deoxybeta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrole)以及5-硝基吲哚(5-nitroindole)之类的通用碱基。术语“通用碱基”意味着分别对天然DNA/RNA碱基能够几乎没有区别地形成碱基对。
如上所述，探测和标记寡核苷酸能够在从探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的3’-末端沿着3’-方向隔开的位置被切割。切割位置能够位于探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端一部分。在探测和标记寡核苷酸片段包含探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端一部分的情况下，与3’-靶向部位的5’-末端一部分杂交的捕捉和模板化寡核苷酸的位置能够包含通用碱基、简并序列(degenerate sequence)或它们的组合。例如，若探测和标记寡核苷酸在从探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的3’-末端沿着3’-方向隔开一个核苷酸的位置被切割，则为了与上述核苷酸的杂交，有利地，捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位的5’-末端一部分包含通用碱基。如果探测和标记寡核苷酸在从探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的3’-末端沿着3’-方向隔开两个核苷酸的位置被切割，那么有利地，捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位的5’-末端包含简并序列，而沿着其3’-方向相邻的核苷酸包含通用碱基。像这样，在3’-靶向部位的5’-末端一部分的各种位置上发生探测和标记寡核苷酸的切割的情况下，对捕捉和模板化寡核苷酸利用通用碱基以及简并序列，将有用。并且，在诱导上游引物延伸-依赖性切割的情况下，当将具有相同的5’-标记部位的探测和标记寡核苷酸利用于多个靶核酸序列筛选时，3’-靶向部位的5’-末端一部分能够生成相互不同的探测和标记寡核苷酸片段。这种情况下，通用碱基以及简并序列有用地使用于捕捉和模板化寡核苷酸。为了实现多个靶核酸序列的筛选，在对捕捉和模板化寡核苷酸利用通用碱基以及简并序列的战略中，使用一个类型的捕捉和模板化寡核苷酸或最少数量的类型的捕捉和模板化寡核苷酸。
根据优选一实例，本发明的方法在反复循环之间还包括变性过程，来反复实施步骤(a)～步骤(e)的全部或一部分。
根据优选一实例，本发明的方法在上述反复循环之间还包括变性过程，来反复实施上述步骤(a)～步骤(b)、步骤(a)～步骤(d)或步骤(a)～步骤(f)，优选地，与下游引物一同利用。这种反复使靶核酸序列和/或靶信号扩增。
可通过包含热、碱、甲酰胺、尿素及乙二醛处理、酶方法(如解旋酶作用)及结合蛋白质的公知的技术实施变性，但并不局限于此。例如，变性可在80～105℃温度范围内进行热处理来达成。在Joseph Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)中公开了用于达成这种处理的常规方法。
根据优选一实例，本发明能够实施一系列解链分析来定性或定量检测靶核酸序列。
更优选地，本发明包括：(i)为了生成延伸二聚物，反复在反复循环之间包括变性过程的步骤(a)～步骤(d)的步骤；(ii)实施解链分析的步骤；以及(iii)最少反复两次上述步骤(i)和步骤(ii)的步骤。这种情况下，解链分析具有一定间距(a certain interval)，并最少反复两次来实施。
根据优选一实例，上述步骤(a)～步骤(d)的反复次数可以随意调节。在实施一系列解链分析的过程中，为了一个解链分析而实施的步骤(a)～步骤(d)的反复次数可与为了另一个解链分析而实施的步骤(a)～步骤(d)的反复次数相同或不同。
本发明所属技术领域的普通技术人员能够明确的是，上述步骤(a)～步骤(d)的反复为生成延伸二聚物的一例。例如，在本发明中，可以在反复步骤(a)～步骤(b)，并实施步骤(c)及步骤(d)来生成延伸二聚物之后，执行解链分析。
根据优选一实例，步骤(a)～步骤(f)在一个反应容器或单独的反应容器中实施。例如，步骤(a)～步骤(b)、步骤(c)～步骤(d)或步骤(e)～步骤(f)可在单独的反应容器中实施。
根据优选一实例，步骤(a)～步骤(b)及步骤(c)～步骤(f)能够根据反应条件(尤其，温度)在一个反应容器中同时或单独实施。
根据优选一实例，在本发明中，能够通过最少两次的解链分析来进行靶核酸序列的定量分析。
通过解链分析得到的解链峰的面积及高度受延伸二聚物的量的影响，这提供靶核酸序列的最初量相关信息。
根据优选一实例，本发明包括：(i)在反复循环之间包括变性过程，来反复步骤(a)～步骤(d)，从而增加延伸二聚物的数量的步骤；(ii)实施解链分析的步骤；以及(iii)最少反复两次上述步骤(i)和步骤(ii)的步骤。测定达到预定阈值(threshold)以上的解链峰面积和/或高度的解链分析的循环数，由此能够决定靶核酸序列的量。
择一性地，对用于增加延伸二聚物的量的反复循环数相关解链分析信息(例如，峰面积或高度)进行绘图，来达到靶核酸序列的定量。
在本发明中所要检测和/或扩增的靶核酸序列包含所有DNA(gDNA及cDNA)分子以及RNA分子，并均不要求具有任何特定序列或长度。
当将mRNA用作初期物质时，在实施退火步骤之前必需进行反转录步骤，其相关详细内容公开在Joseph Sambrook等、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、ColdSpring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(2001)；以及Noonan、K。F等，Nucleic Acids Res。16:10366(1988)。为了实现反转录反应，可利用与随机六聚体或mRNA杂交的寡核苷酸dT引物。
可检测和/或扩增的靶核酸序列还都包含任何天然(naturally occurring)原核细胞核酸、真核细胞(例如，原生动物和寄生动物、菌类、酵母、高等植物、低等动物及包含哺乳动物和人类的高等动物)核酸、病毒(例如，疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV，HumanImmunodeficiency Virus)、流感病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus)、肝炎病毒以及脊髓灰质炎病毒等)核酸或类病毒核酸。
能够通过本发明来检测的靶核酸序列包含各种核酸序列，例如，基因组内序列、人为分离或片段化的序列及合成序列(例如，cDNA序列及条形码序列)。例如，靶核酸序列包含用于免疫PCR(IPCR，Immuno-PCR)的核酸标记序列。IPCR与PCR一同使用核酸标记序列及抗体间的接合体，这广泛适用于检测包含蛋白质的各种靶(Sano等，Science 258pp：120-122(1992)，美国专利第5665539号、Niemeyer等，Trends in Biotechnology23pp：208-216(2005)、美国申请公开号第2005/0239108号及Ye等，Journal of EnvironmentalScience22pp：796-800(2010))。
并且，本发明对核苷酸变异的检测有用。优选地，靶核酸序列包含核苷酸变异。在本说明书中使用的术语“核苷酸变异”意味着在连续的DNA片段或序列类似的DNA片段中存在于特定位置的DNA序列中的所有单一或多个核苷酸置换、缺失或插入。这种连续的DNA片段包含一个基因或一个染色体的任意其他部位。这种核苷酸变异可以为突变(mutant)或多态性等位基因变异(polymorphic allele variations)。例如，在本发明中检测的核苷酸变异包括：单核苷酸多态性(SNP，single nucleotide polymorphism)、突变(mutation)、缺失、插入、置换以及移位。核苷酸变异的例子包括：人类基因组的各种变异(例如，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR，methylenetetrahydrofolate reductase)基因的变异)、病原体的药物耐性相关的变异以及癌产生-相关的变异。所使用的上述术语“核苷酸变异”包含位于核酸序列的特定位置的任何变异。即，术语“核苷酸变异”包含野生型及位于核酸序列的特定位置的任何突变型。
在检测靶核酸序列的核苷酸变异的本发明中，所使用的引物或探针具有对靶核酸序列的上述核苷酸变异互补的序列的情况下，包含上述核苷酸变异的靶核酸序列在本说明书中被记载为匹配模板(matching template)。在所使用的引物或探针具有对靶核酸序列的核苷酸变异非-互补的序列的情况下，包含核苷酸变异的靶核酸序列在本说明书中被记载为错配模板(mismatching template)。
为了检测核苷酸变异，可将上游引物的3’-末端设计成位于靶核酸序列的核苷酸变异位置的对面。根据优选一实例，上游引物的3’-末端具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列。具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列的上游引物的3’-末端通过被匹配模板退火并被延伸来诱导探测和标记寡核苷酸切割。作为结果物，探测和标记寡核苷酸片段通过与捕捉和模板化寡核苷酸杂交来提供靶信号。相反，上游引物的3’-末端在错配模板中与核苷酸变异错配的情况下，即使上游引物与错配模板杂交，为了实现延伸反应，在需要对引物的3’-末端进行退火的条件下也不会被延伸，由此不会产生靶信号。
择一性地，可利用对探测和标记寡核苷酸的杂交有着依赖性的探测和标记寡核苷酸切割，上述探测和标记寡核苷酸具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列。例如，在已调节的条件下，具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列的探测和标记寡核苷酸在与匹配模板杂交之后被切割。作为结果物，探测和标记寡核苷酸片段通过与捕捉和模板化寡核苷酸杂交来提供靶信号。相反，在已调节的条件下，探测和标记寡核苷酸不会与具有对核苷酸变异位置非-互补的序列的错配模板杂交，也不会被切割。这种情况下，优选地，对探测和标记寡核苷酸的核苷酸变异互补的序列位于探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的中间。
根据一实例，使用人为错配核苷酸能够提高对核苷酸变异的探测和标记寡核苷酸的区别可能性。
择一性地，为了检测核苷酸变异，优选地，使探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端一部分位于靶核酸序列的核苷酸变异，使探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端一部分具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列。
为了改善核苷酸变异的检测效率，本发明可通过聚合酶链式反应箝术来实施。在Henrik et al.，Nucleic Acid Research21:5332-5336(1993)及Luo et al.，NucleicAcid Research Vol。34,No.2e12(2006)中公开了使用肽核酸的代表性的聚合酶链式反应箝术。例如，在使用肽核酸的聚合酶链式反应箝术中，虽然扩增具有突变型(mutant type)核苷酸变异的核酸序列，但不扩增具有野生型(wild type)核苷酸变异的核酸序列。若在实施聚合酶链式反应箝术之后实施PTOCE试验，则能够更加有效地检测核苷酸变异。尤其，在聚合酶链式反应箝术中，只扩增具有特异型核苷酸变异的核酸序列，因此若将聚合酶链式反应箝术与本发明的方法相结合，则能够以更有效的方式检测少数-变异体(minority-variant)。
在5’-末端部位具有核苷酸变异区别部位的探针与错配模板杂交的情况下，5’-末端部位在特定条件下能够形成单链。上述探针可相当于探测和标记寡核苷酸。可利用本发明的探测和标记寡核苷酸试验来生成上述信号。这种接近能够有用于检测具有对探针的核苷酸变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列。
根据优选一实例，在本发明中利用的靶核酸序列为预-扩增的(pre-amplified)核酸序列。预-扩增的核酸序列的利用能够明显提高本发明的靶检测的灵敏度及特异性。
根据优选一实例，上述方法在下游引物存在的条件下实施。
同时检测最少2种靶核酸序列(多重)，这使本发明的优点更加突出。
根据优选一实例，上述方法为了检测最少2种(更优选为最少3种，尤其优选为最少5种)靶核酸序列而实施。
根据优选一实例，上述方法为了检测最少2种(更优选为最少3种，尤其优选为最少5种)靶核酸序列而实施；上述上游寡核苷酸包含最少2种(更优选为最少3种，尤其优选为最少5种)寡核苷酸，探测和标记寡核苷酸包含最少2种(更优选为最少3种，尤其优选为最少5种)探测和标记寡核苷酸，捕捉和模板化寡核苷酸包含最少1种(更优选为最少2种，尤其优选为最少3种，最优选为最少5种)捕捉和模板化寡核苷酸，在上述最少2种靶核酸序列存在的情况下，上述方法提供相当于最少2种靶核酸序列的最少2种靶信号。
最少2种探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位能够具有相同的序列。例如，本发明为了靶核酸序列的筛选而实施的情况下，探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位可以具有相同的序列。
进而，一种捕捉和模板化寡核苷酸能够用于检测多个靶核酸序列。例如，将在5’-标记部位具有相同的序列的探测和标记寡核苷酸利用于靶核酸序列的筛选的情况下，可利用一种捕捉和模板化寡核苷酸。
根据优选一实例，相当于最少2种靶核酸序列的延伸二聚物具有相互不同的Tm值。
根据优选一实例，相当于最少2种靶核酸序列的最少2种靶信号提供自相互不同的种类的标记。
根据优选一实例，相当于最少2种靶核酸序列的最少2种靶信号提供自相同的种类的标记。
根据优选一实例，相当于最少2种靶核酸序列的最少2种靶信号提供自相同的种类的标记，相当于最少2种靶核酸序列的上述延伸二聚物具有相互不同的Tm值。
在本说明书中使用的术语“不同种类的标记”意味着能够检测的信号具有不同的特征的标记。例如，将作为荧光报道标记的FAM及TAMRA考虑为不同种类的标记，这是因为它们的激发(excitation)及放出波长不同。
为了借助解链曲线分析同时检测最少2种靶核酸序列，实施本发明，使得相当于最少2种靶核酸序列的延伸二聚物具有相互不同的Tm值的情况下，即使使用一种标记(例如，FAM)也能够检测最少2种靶核酸序列。
【利用在固相实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸的靶检测】
本发明的突出优点在于，在如微阵列之类的固相也能够有效检测靶核酸序列。
根据优选一实例，本发明在固相中实施，捕捉和模板化寡核苷酸通过其5’-末端或3’-末端在固相底物实现固定化。在固相中，测定提供自固相底物上的靶信号。
利用实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸的情况下，利用如上所述的标记系统的解链分析可以适用于本发明的固相反应。
根据优选一实例，靶信号借助与片段相连接的单一标记或在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的单一标记提供。尤其，在固相中利用单一标记来实施本发明的情况下，可以利用通常的荧光标记，不需要特定的荧光标记，上述特定的荧光标记可根据存在于双链上或单链上来提供具有不同的强度的荧光信号。
利用在固相底物实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸的情况下，可以利用化学标记(例如，生物素)或酶标记(例如，碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶及β-葡萄糖苷酶)。
为了实现固相反应，捕捉和模板化寡核苷酸通过其5’-末端或3’-末端(优选为3’-末端)在固相底物的表面直接或间接(优选为间接)实现固定化。并且，捕捉和模板化寡核苷酸能够以共价键或非共价键方式在固相底物的表面实现固定化。实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸在固相底物的表面间接性地实现固定化的情况下，利用合适的连接肽。在本发明中有用的连接肽可包含利用于固相底物的表面的探针固定化的任何连接肽。例如，具有胺基的烷基或芳基化合物或具有硫醇基的烷基或芳基化合物可作为连接肽利用于捕捉和模板化寡核苷酸的固定化。并且，可将聚胸腺嘧啶尾(poly T tail)或聚腺苷酸尾(poly Atail)使用为连接肽。
根据优选一实例，在本发明中利用的固相底物为微阵列。在本发明中提供反应环境的微阵列可以使用本发明所属的技术领域中公知的任何微阵列。本发明的所有过程，即与靶核酸序列的杂交、切割、延伸、解链以及荧光的检测在微阵列实施。在微阵列实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸利用为杂交阵列因素(hybridizable array element)。用于制备微阵列的固相底物包括金属(例如，金、金与铜的合金、铝)、金属氧化物、玻璃、陶瓷、石英、硅、半导体、Si/SiO2晶圆、锗、砷化镓、碳、碳纳米管、聚合物(例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯以及聚丙烯酰胺)、琼脂糖凝胶(sepharose)、琼脂糖(agarose)及胶体(colloids)，但并不局限于此。本发明的多个实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸可在固相底物的一个寻址(addressable)部位或多个寻址部位实现固定化，固相底物可包括2～1000000个寻址部位。可借助如光刻法、喷墨打印法、机械点样法及与其类似的方法之类的现有制备技术，构建(fabricate)为了生产阵列或用于特定应用的阵列而实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸。
当在固相中实施本发明时，实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸的标记以物理方式相互隔开，因此即使利用一种标记也能够同时检测多个靶核酸序列。因此，在固相中，根据本发明能够检测的靶核酸序列的数量不受限制。
在本发明中，探测和标记寡核苷酸片段通过与靶核酸杂交的探测和标记寡核苷酸切割来生成，在退火后，在捕捉和模板化寡核苷酸被延伸，其结果，生成延伸链。
为了增加延伸链的数量，可借助利用追加的探测和标记寡核苷酸的追加的5’核酸酶切割反应来提供在捕捉和模板化寡核苷酸能够延伸的追加的片段。上述追加的探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与延伸链互补的杂交核苷酸序列；以及(ii)5’-标记部位，包含与延伸链非-互补，但与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位互补的核苷酸序列。优选地，使用包含与延伸链互补的杂交核苷酸，且为了5’核酸酶切割反应而使追加的探测和标记寡核苷酸位于上游的追加的上游寡核苷酸。
上述优选一实例表示追加的片段形成对延伸链形成具有依赖性的特征。
择一性地，上述追加的片段能够使用以下追加的探测和标记寡核苷酸来提供。上述追加的探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的杂交核苷酸序列；以及(ii)5’-标记部位，包含与捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位非-互补的核苷酸序列，并包含与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位互补的序列。
根据优选一实例，追加的延伸二聚物借助延伸链的追加的生成而生成，并能够在固相底物中扩增靶信号。
【II.伴随靶核酸序列扩增的优选实例】
优选地，本发明利用由能够合成靶核酸序列的上游引物以及下游引物组成的一对引物，来扩增靶核酸序列。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO Cleavage and Extension)试验来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法，上述利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与包含上游引物及下游引物的一对引物以及探测和标记寡核苷酸(PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide)进行杂交；上述上游引物及下游引物分别包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及(ii)5’-标记部位，其包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；上述探测和标记寡核苷酸位于上述上游引物及下游引物之间；上述探测和标记寡核苷酸的3’-末端被阻断，用于防止延伸；
步骤(b)，在用于上述引物的延伸及上述探测和标记寡核苷酸切割的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶相接触；若上述探测和标记寡核苷酸与上述靶核酸序列杂交，则上述上游引物被延伸，且上述延伸链诱导基于具有上述5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的上述探测和标记寡核苷酸切割，这种上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的上述5’-标记部位或上述5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide)进行杂交；上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含与上述探测和标记寡核苷酸的上述5’-标记部位或上述5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，其包含与上述5’-标记部位以及上述3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的上述捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用上述步骤(c)的结果物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应；与上述捕捉和模板化寡核苷酸的上述捕捉部位杂交的上述片段被延伸，来形成延伸二聚物，上述延伸二聚物具有能够基于如下长度而调节的Tm值：(i)上述片段的序列和/或长度，(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度或(iii)上述片段的上述序列和/或长度及上述捕捉和模板化寡核苷酸的上述序列和/或长度；
步骤(e)，在规定范围的温度下，使上述延伸二聚物解链(melting)来提供表示上述延伸二聚物的存在的靶信号；上述靶信号基于(i)与上述第一片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的最少1个标记、(ii)在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记、(iii)与在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记和上述片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记及或(iv)嵌入标记(intercalating label)提供；以及
步骤(f)，测定上述靶信号来检测上述延伸二聚物；上述延伸二聚物的存在表示上述靶核酸序列的存在。
由于本发明的优选一实例实施如上所述的本发明的步骤，因此为了避免本说明书过于复杂，省略它们之间共同的内容。
根据优选一实例，上述方法在反复循环之间还包括变性过程，来反复实施上述步骤(a)～步骤(b)、步骤(a)～步骤(d)或步骤(a)～步骤(f)。反应的反复伴随靶核酸序列的扩增。优选地，上述扩增根据在美国专利第4683195号、第4683202号以及第4800159号中记载的聚合酶链式反应(PCR，polymerase chain reaction)来实施。
根据优选一实例，上述方法为了检测最少2种靶核酸序列而实施。
根据优选一实例，相当于最少2种靶核酸序列的最少2种靶信号提供自相同的种类的标记，相当于最少2种靶核酸序列的上述延伸二聚物具有相互不同的Tm值。
【III.基于包括指定温度下的检测过程的PTOCE的靶检测方法】
本发明为了利用与延伸二聚物的形成相关地产生的靶信号而发生变形。
根据本发明的另一实施方式，本发明提供利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO Cleavage and Extension)试验来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法，上述利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及探测和标记寡核苷酸(PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide)进行杂交；上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及(ii)5’-标记部位，其包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游；
步骤(b)，在用于上述探测和标记寡核苷酸切割的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；上述上游寡核苷酸或其延伸链诱导基于上述具有5’核酸酶活性的酶的上述探测和标记寡核苷酸切割，这种上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的上述5’-标记部位或上述5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide)进行杂交；上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含与上述探测和标记寡核苷酸的上述5’-标记部位或上述5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，其包含与上述探测和标记寡核苷酸的上述5’-标记部位以及上述3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的上述捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用上述步骤(c)的结果物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应；与上述捕捉和模板化寡核苷酸的上述捕捉部位杂交的上述片段被延伸，来形成延伸二聚物，上述延伸二聚物具有能够基于如下长度而调节的Tm值：(i)上述片段的序列和/或长度，(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度或(iii)上述片段的上述序列和/或长度及上述捕捉和模板化寡核苷酸的上述序列和/或长度；上述延伸二聚物提供基于如下标记的靶信号：(i)与上述片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的最少1个标记，(ii)在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记，(iii)与上述片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的最少1个标记及在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记或(iv)嵌入标记(intercalating label)；以及
步骤(e)，在上述延伸二聚物维持其双链形态的指定温度下，测定上述靶信号，来检测上述延伸二聚物；上述延伸二聚物的存在表示上述靶核酸序列的存在。
由于优选一实例除了解链步骤之外实施如上所述的本发明的步骤，因此为了避免本说明书过于复杂，省略它们之间共同的内容。
测定在延伸二聚物的解链中提供的信号变化来提供靶信号，因此利用上述解链分析的本发明需要在最少2个不同的温度下检测来自标记的信号。
与此不同，在本发明的一实施方式中，延伸二聚物本身提供区别形成或不形成延伸二聚物的情况的信号，且在延伸二聚物维持双链形态的指定温度(predeterminedtemperature)下检测上述信号，由此决定靶核酸序列的存在。
本发明为了检测靶核酸序列的存在，测定与延伸二聚物的形成相关的靶信号。
在本发明中，延伸二聚物具有标记，由此延伸二聚物提供靶信号。
优选地，靶信号包括在指定温度下来自延伸二聚物的标记的信号(信号产生或信号消灭)。
能够以与利用如上所述的解链分析的方法相同的方式实施本发明的标记。图2至图13能够说明为了指定温度下的检测而稍微发生变形的本发明的一实施方式。
基于来自延伸二聚物的靶信号的工作原理如下。(i)片段的延伸诱导来自标记的信号的变化来提供靶信号，或
(ii)片段及捕捉和模板化寡核苷酸的杂交诱导来自标记的信号的变化来提供靶信号，上述延伸二聚物维持靶信号。
可参照图9，对工作原理(i)的实例进行说明。利用实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸的情况下，本发明能够以更加有效的方式检测多个靶核酸序列。实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位具有报道分子及猝灭分子。报道分子及猝灭分子在结构上相互接近，使得猝灭分子对来自报道分子的信号进行猝灭。片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位进行杂交的情况下，猝灭分子对来自报道分子的信号进行猝灭。形成上述延伸二聚物，来使报道分子及猝灭分子在结构上相互隔开，使得猝灭分子不对来自报道分子的信号进行猝灭。在延伸步骤中提供靶信号(图9的C及D)。
在图9中，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物(hybrid)不形成延伸二聚物。因此，猝灭分子仍然对来自报道分子的信号进行猝灭。杂交物不提供非-靶信号。
可参照图6，对工作原理(ii)的实例进行说明。附图示出利用解链分析的方法及本发明的实施方式。探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位具有报道分子及猝灭分子。报道分子及猝灭分子在结构上相互接近，使得猝灭分子对来自报道分子的信号进行猝灭。与靶核酸序列杂交的探测和标记寡核苷酸被切割，来放出包含具有报道分子及猝灭分子的5’-标记部位的片段，上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交。借助上述杂交，报道分子及猝灭分子在结构上相互隔开，使得猝灭分子不对来自报道分子的信号进行猝灭。在片段的杂交步骤中提供靶信号，且延伸二聚物维持靶信号(图6的C及D)。
在图6中，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物提供非-靶信号(图6的C及D)，为了去除非-靶信号，需要使杂交物解离。因此，测定靶信号的温度决定为使杂交物解离的温度。根据优选一实例，还考虑杂交物的Tm值，来决定上述温度。
根据优选一实例，可在一部分杂交物解离的温度下，检测延伸二聚物。
指定温度高于从杂交物的Tm值减去10℃的温度，优选地，高于从杂交物的Tm值减去5℃的温度，更优选地，高于杂交物的Tm值，尤其优选地，高于在杂交物的Tm值加上5℃的温度。
根据优选一实例，在步骤(d)的延伸期间提供借助延伸二聚物提供的靶信号，如图2至图4及图9至图11所示，上述非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物不提供非-靶信号。
根据一实例，在上述步骤(c)中借助上述片段和捕捉和模板化寡核苷酸的杂交提供借助延伸二聚物提供的靶信号，延伸二聚物的生成在步骤(d)中维持靶信号。上述非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物提供非-靶信号，上述指定温度使杂交物分离，来充分去除非-靶信号。
根据优选一实例，借助步骤(c)中的片段和捕捉和模板化寡核苷酸的杂交提供借助延伸二聚物提供的靶信号，在步骤(d)中延伸二聚物的形成维持靶信号；非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的上述杂交物提供非-靶信号，如图5至图8及图12至图13所示，上述指定温度高于杂交物的Tm值。
非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物提供非-靶信号的情况下(图6的D)，为了去除非-靶信号，需要使杂交物解离。因此，测定靶信号的温度决定为使杂交物解离的温度。
以下，可对在本发明中有用的标记系统进行说明。
【(i)与片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记】
【(i-1)相互作用性双重标记】
在相互作用性双重标记系统的实例中，捕捉和模板化寡核苷酸具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记，步骤(d)中的上述片段的延伸诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来提供靶信号。图2图式性地示出了相互作用性双重标记系统的实例1。靶信号以延伸-同步化(extension-synchronized)信号产生提供。
根据优选一实例，报道分子及猝灭分子可以位于捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位。
根据优选一实例，捕捉和模板化寡核苷酸的报道分子及猝灭分子中的一个位于其5’-末端或从其5’-末端隔开1-5核苷酸的位置，另一个根据捕捉和模板化寡核苷酸的形态位于对来自报道分子的信号进行猝灭或不对来自报道分子的信号进行猝灭的位置。
在相互作用性双重标记系统的实例中，捕捉和模板化寡核苷酸具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记，在步骤(c)中的片段及捕捉和模板化寡核苷酸的杂交诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来提供靶信号，上述延伸二聚物维持靶信号。
根据优选一实例，报道分子及猝灭分子可以位于捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位。
根据优选一实例，捕捉和模板化寡核苷酸的报道分子及猝灭分子中的一个位于其3’-末端或从其3’-末端隔开1-5核苷酸的位置，另一个根据捕捉和模板化寡核苷酸的形态位于对来自报道分子的信号进行猝灭或不对来自报道分子的信号进行猝灭的位置。
在一实例中，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物提供非-靶信号，考虑杂交物的Tm值来决定测定上述靶信号的温度。
在相互作用性双重标记系统的实例中，片段具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记，在步骤(c)中的上述片段及捕捉和模板化寡核苷酸的杂交诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来提供靶信号。上述延伸二聚物维持靶信号。图6图式性地示出相互作用性双重标记系统的实例1。
根据优选一实例，片段的报道分子及猝灭分子中的一个位于其5’-末端或从其5’-末端隔开1-5核苷酸的位置，另一个根据片段的形态位于对来自报道分子的信号进行猝灭的位置。
在一实例中，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物提供非-靶信号，考虑杂交物的Tm值来决定测定上述靶信号的温度。
在相互作用性双重标记系统的实例中，上述片段具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记，捕捉和模板化寡核苷酸具有上述相互作用性双重标记中的另一个，在步骤(c)中的上述片段及捕捉和模板化寡核苷酸的杂交诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来提供靶信号。上述延伸二聚物维持靶信号。图8图式性地示出相互作用性双重标记系统的实例。
只要来自报道分子的信号借助猝灭分子进行猝灭，那么报道分子及猝灭分子可以位于探测和标记寡核苷酸片段及捕捉和模板化寡核苷酸的任何位置。
根据优选一实例，优选地，探测和标记寡核苷酸片段的报道分子或猝灭分子位于探测和标记寡核苷酸的5’-末端。
根据优选一实例，优选地，捕捉和模板化寡核苷酸的报道分子或猝灭分子位于捕捉和模板化寡核苷酸的5’-末端。
在本实例中，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物提供非-靶信号，考虑杂交物的Tm值来决定测定上述靶信号的温度。
【(i-2)单一标记】
在单一标记系统的实例中，捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记，在步骤(d)中的片段的延伸诱导来自单一标记的信号的变化来提供靶信号。图3图式性地示出单一标记系统的实例。靶信号以延伸-同步化(extension-synchronized)信号产生提供。
根据优选一实例，捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位由单一标记标记。
在单一标记系统的实例中，捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记，在步骤(c)中的片段及捕捉和模板化寡核苷酸的杂交诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来提供靶信号，上述延伸二聚物维持靶信号。
根据优选一实例，捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位由单一标记标记。
在本实例中，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物提供非-靶信号，考虑杂交物的Tm值来决定测定上述靶信号的温度。
在单一标记系统的实例中，片段具有单一标记，在步骤(c)中的片段及捕捉和模板化寡核苷酸的杂交诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来提供靶信号，上述延伸二聚物维持靶信号。图12图式性地示出单一标记系统的实例。
在本实例中，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物提供非-靶信号，考虑杂交物的Tm值来决定测定上述靶信号的温度。
在本说明书中使用的单一标记应根据存在于双链上或单链上来能够提供不同的信号。单一标记包括荧光标记、发光标记、化学发光标记、电化学标记及金属标记。优选地，单一标记包括荧光标记。在本发明中使用的单一荧光标记的种类及优选结合位置公开在美国专利号第7537886号及第7348141号中，而这些包括在本说明书全文中作为参照。优选地，单一荧光标记包含JOE、FAM、TAMRA、ROX以及基于荧光素的标记。优选地，被标记的核苷酸残基位于寡核苷酸内的内部核苷酸残基，而不是5’-末端或3’-末端。
如上所述，参照对报道分子及猝灭分子的说明来对在本发明中有用的单一荧光标记进行说明。
尤其，在固相中利用单一标记来实施本发明的情况下，可以利用通常的荧光标记，不需要可根据存在于双链上或单链上提供具有不同的强度的荧光信号的特定的荧光标记。
利用在固相底物实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸的情况下，可以利用化学标记(例如，生物素)或酶标记(例如，碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶及β-葡萄糖苷酶)。
根据优选一实例，形成非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的情况下，如图2、图3及图9所示，与片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记位于上述杂交物在步骤(d)中不提供非-靶信号的范围内。
选择性地，如图6至图8及图12所示，形成非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的情况下，标记可以位于上述杂交物在步骤(d)中提供非-靶信号的范围内，上述延伸二聚物的Tm值高于非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的Tm值。
【(ii)向延伸二聚物内插入的标记】
尤其，利用实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸来在固相中实施本发明的情况下，如图10及图11图式性地示出，本标记系统更有用于提供靶信号。
根据优选一实例，借助在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的单一标记来提供靶信号，插入的单一标记与在延伸反应期间插入的核苷酸相连接，在步骤(d)中的片段的延伸诱导来自单一标记的信号的变化来提供在步骤(d)中的靶信号。
根据优选一实例，在延伸反应期间插入(incorporated)的核苷酸为ddNTP。
根据优选一实例，如图11图式性地示出，在延伸反应期间插入的核苷酸具有第一非-天然碱基，捕捉和模板化寡核苷酸包含具有第二非-天然碱基的核苷酸，上述第二非-天然碱基对第一非-天然碱基具有特异性结合亲和性。优选地，具有第二非-天然碱基的核苷酸可以位于捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位的任何位置。
利用在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的标记的情况下，标记不包含于非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物。这是因为杂交物不被延伸。因此，杂交物不提供非-靶信号。
【(iii)向延伸二聚物内插入的标记和与片段或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记】
如图4及图5图式性地示出，本发明可以利用标记系统，上述标记系统利用在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的标记和与片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记的组合。
根据优选一实例，借助在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的标记和与片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记提供靶信号，上述插入的标记与在延伸反应期间插入的核苷酸相连接，上述两个标记为报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记；在上述步骤(d)中的片段的延伸诱导来自相互作用性双重标记的信号的变化来提供靶信号。
更优选地，在延伸反应期间插入的核苷酸具有第一非-天然碱基，捕捉和模板化寡核苷酸具有对第一非-天然碱基存在特异性结合亲和性的第二非-天然碱基。
优选地，在步骤(e)中提供的靶信号为步骤(d)的来自相互作用性双重标记的信号。
利用在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的标记的情况下，标记不包含于非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物内。这是因为杂交物不被延伸。因此，杂交物不提供非-靶信号。
【(iv)嵌入标记(intercalating label)】
本发明可以使用提供表示延伸二聚物的存在的靶信号的嵌入标记。由于在试样内双链核酸分子可产生信号，因此在利用实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸的固相反应中，嵌入标记更有用。
参照图13，对例示的实例进行说明。与靶核酸序列杂交的探测和标记寡核苷酸被切割来放出片段。上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸杂交。在嵌入染料(例如，SYBRTMGreen)存在的条件下，实施延伸来生成包含嵌入染料的延伸二聚物。
在图13中，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物提供非-靶信号(图13的C及D)，为了去除非-靶信号，需要使杂交物解离，因此，考虑杂交物的Tm值来决定测定靶信号的温度。
优选地，在步骤(e)中提供的靶信号为来自嵌入染料的信号。
根据优选一实例，探测和标记寡核苷酸和/或捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端被阻断，用于防止延伸。
根据优选一实例，上游寡核苷酸为上游引物或上游探针。
根据优选一实例，上游寡核苷酸位于与探测和标记寡核苷酸接近的位置，用于能够诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的探测和标记寡核苷酸切割。
根据优选一实例，上游引物通过其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的探测和标记寡核苷酸切割。
根据优选一实例，上述方法在反复循环之间还包括变性过程，来反复实施步骤(a)～步骤(b)、步骤(a)～步骤(d)或步骤(a)～步骤(e)。
根据优选一实例，步骤(a)～步骤(b)或步骤(c)～步骤(d)在一个反应容器或单独的反应容器中实施。
根据优选一实例，上述方法用于检测最少2种靶核酸序列，上述上游寡核苷酸包含最少2种寡核苷酸，探测和标记寡核苷酸包含最少2种探测和标记寡核苷酸，捕捉和模板化寡核苷酸包含最少1种捕捉和模板化寡核苷酸，上述最少2种靶核酸序列存在的情况下，上述方法提供相当于最少2种靶核酸序列的最少2种靶信号。
根据优选一实例，上游寡核苷酸为上游引物，为了上述上游引物的延伸，在步骤(b)中利用模板-依赖性核酸聚合酶。
根据优选一实例，捕捉和模板化寡核苷酸通过其5’-末端或3’-末端在固相底物实现固定化，并测定提供自上述固相底物的靶信号。
根据优选一实例，靶信号借助与片段相连接的单一标记或在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的单一标记提供。
根据优选一实例，上述方法在下游引物存在的条件下实施。
步骤(e)的检测能够以实时方式、终点方式或指定时间间隔方式实施。本发明还包括反复实施步骤(a)～步骤(b)、步骤(a)～步骤(d)或步骤(a)～步骤(e)的步骤的情况下，优选地，在指定温度下的上述反复的各循环中(即，实时方式)，在指定温度下的上述反复的结束时刻(即，终点方式)或在指定温度下的上述反复期间的指定时间间隔中，分别实施信号检测。优选地，能够以实时方式在上述反复的各循环中实施上述检测来改善检测的准确性和定量化。
【IV.基于上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的PTOCE试验的靶检测过程】
根据本发明的另一实施方式，本发明提供利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO Cleavage and Extension)试验来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法，上述利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与探测和标记寡核苷酸(Probing and TaggingOligonucleotide)进行杂交；上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；
步骤(b)，在用于上述探测和标记寡核苷酸切割的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触，上述探测和标记寡核苷酸借助上述具有5’核酸酶活性的酶被切割，这种上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide)进行杂交；上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，其包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的上述捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用上述步骤(c)的结果物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应；与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段被延伸，来生成延伸二聚物，上述延伸二聚物具有能够基于如下长度而调节的Tm值：(i)上述片段的序列和/或长度，(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度或(iii)上述片段的序列和/或长度及上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度；
步骤(e)，在规定范围的温度下，使上述延伸二聚物解链(melting)来提供表示上述延伸二聚物的存在的靶信号；上述靶信号基于(i)与上述片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的最少1个标记、(ii)在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记、(iii)在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记和与上述片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入标记(intercalating label)提供；以及
步骤(f)，测定上述靶信号来检测上述延伸二聚物；上述延伸二聚物的存在表示上述靶核酸序列的存在。
根据本发明的还一实施方式，本发明提供利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO Cleavage and Extension)试验来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法，上述利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与探测和标记寡核苷酸(PTO，Probing and TaggingOligonucleotide)进行杂交；上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；
步骤(b)，在用于上述探测和标记寡核苷酸切割的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；上述探测和标记寡核苷酸借助上述具有5’核酸酶活性的酶被切割，这种上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide)进行杂交；上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，其包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的上述捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用上述步骤(c)的结果物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应；与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段被延伸，来生成延伸二聚物，上述延伸二聚物具有能够基于如下长度而调节的Tm值：(i)上述片段的序列和/或长度，(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度或(iii)上述片段的序列和/或长度及上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度；上述延伸二聚物提供基于如下标记的靶信号：(i)与上述片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的最少1个标记，(ii)在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物插入的1个标记，(iii)与上述片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的最少1个标记及在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物插入的1个标记或(iv)嵌入标记；以及
步骤(e)，在上述延伸二聚物维持双链形态的指定温度下，测定上述靶信号来检测上述延伸二聚物；上述延伸二聚物的存在表示上述靶核酸序列的存在。
基于上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的本发明的方法除了不使用上游寡核苷酸之外，与利用上游寡核苷酸的PTOCE试验相同，因此，为了避免本说明书过于复杂，省略它们之间共同的内容。
有趣的是，基于上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的本发明的方法实际上不使用上游寡核苷酸，也通过PTOCE试验提供靶信号(参照图35A及图35B)。
为了本发明的方法，可以使用具有上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活的现有的酶。具有5’核酸酶活性的模板-依赖性聚合酶中的几种酶具有上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性(例如，Taq DNA聚合酶)。
考虑到靶核酸序列的扩增以及探测和标记寡核苷酸切割效率，优选地，本发明的PTOCE试验利用上游寡核苷酸来实施。
【V.基于PTOCE试验的核苷酸变异检测过程】
根据本发明的又一实施方式，本发明提供利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO Cleavage and Extension)试验来从靶核酸序列检测核苷酸变异的方法，上述利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验来从靶核酸序列检测核苷酸变异的方法包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异(PTO-NV，Probingand Tagging Oligonucleotide for Nucleotide Variation)进行杂交；上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列、(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，以及(iii)核苷酸变异区别位点(nucleotide variation discrimination site)，包含与上述靶核酸的核苷酸变异互补的序列，并位于上述3’-靶向部位的5’-末端一部分；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的上游；上述上游寡核苷酸或其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异切割；
步骤(b)，在用于上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的切割的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述核苷酸变异区别位点互补的核苷酸变异的上述靶核酸序列进行杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分与上述靶核酸序列形成双链，来从第一初期切割位置诱导切割，则放出第一片段；若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述核苷酸变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列进行杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分不与上述靶核酸序列形成双链，来从位于上述第一初期切割位置的下游的第二初期切割位置诱导切割，则放出第二片段；上述第二片段包含追加的3’-末端部位，用于使上述第二片段与上述第一片段不同；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide)进行杂交；上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异放出的上述第一片段或上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用模板-依赖性核酸聚合酶及上述步骤(c)的结果物来实施延伸反应；若上述第一片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则上述第一片段被延伸，来生成包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸序列的延伸链，若上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则上述第二片段不被延伸；以及
步骤(e)，检测上述延伸链，上述延伸链的存在表示与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的核苷酸区别位点互补的核苷酸变异的存在。
本发明人为了开发具有更加得到改善的准确性以及便利性，尤其以多重方式检测核苷酸变异的新颖的接近法而锐意研究努力。其结果，本发明人定立了用于检测核苷酸变异的新颖的方案，根据该新颖的方案，核苷酸变异的检测借助探针杂交、酶探针切割、延伸及延伸链的检测来达成。尤其，有趣的是，本发明人设计成可根据受关注的核苷酸变异的存在或不存在来调节上述探针切割位置，且从相互不同的位置被切割而放出的片段借助在人为的模板上的延伸可能性来区别。本发明的方案不仅能够很好地适用于固相反应，还能够很好地适用于液相反应，能够以更加得到改善的准确性以及便利性检测多个核苷酸变异。
本发明利用探针杂交、探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异(PTO-NV，Probing andTagging Oligonucleotide for Nucleotide Variation)的切割及延伸、核苷酸变异-依赖性延伸链的生成以及延伸链检测的连续的步骤。因此，本发明被命名为基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的变异检测(VD-PTOCE，Variation Detection PTO Cleavage andExtension)试验。
根据优选一实例，根据本发明检测的核苷酸变异为置换变异、缺失变异或插入变异，更优选为基于如单核苷酸多态性之类的单一核苷酸的变异。
在本发明中，具有对探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的核苷酸变异区别位点互补的核苷酸变异的靶核酸序列记载为“匹配模板(matching template)”。具有对探测和标记寡核苷酸的核苷酸变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列记载为“错配模板(mismatching template)”。
根据优选一实例，与对核苷酸变异区别位点非-互补的核苷酸变异相关的术语“非-互补的”包括基于插入或缺失的非-互补性。
本发明的VD-PTOCE试验为了对于特定核苷酸变异的探测和标记寡核苷酸的选择性，使用具有位于3’-靶向部位的5’-末端一部分的核苷酸变异区别位点的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异。若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对核苷酸变异区别位点互补的核苷酸变异的靶核酸序列(即，匹配模板)杂交，则3’-靶向部位的5’-末端一部分与匹配模板形成双链。相反，上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对核苷酸变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列(即，错配模板)杂交，则3’-靶向部位的5’-末端一部分不与错配模板形成双链。
像这样，对于受关注的核苷酸变异的区别的杂交模式提供探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的初期切割位置的差异，由此生成2种探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异片段，来根据受关注的核苷酸变异的存在与否产生信号差异，这是值得瞩目的。
第一片段借助探测和标记寡核苷酸以及匹配模板杂交物的切割生成，第二片段借助探测和标记寡核苷酸以及错配模板杂交物的切割生成。与第一片段相比，上述第二片段在3’-末端部位还包括追加的核苷酸。
能够借助捕捉和模板化寡核苷酸的延伸反应准确地检测第一片段或第二片段的生成。
通常，在严格条件下，引物的3’-末端一部分及模板的杂交对引物延伸很重要。在本发明中，第一片段及第二片段分别与捕捉和模板化寡核苷酸的相同位置杂交。如上所述，与第一片段相比，第二片段包括追加的3’-末端部位。能够调节杂交条件及第二片段的追加的3’-末端部位的对面捕捉和模板化寡核苷酸序列，来仅使上述第一片段延伸。
根据优选一实例，上述第二片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的情况下，捕捉和模板化寡核苷酸不与上述第二片段的上述追加的3’-末端部位杂交，因此选择捕捉和模板化寡核苷酸的序列，以防止上述第二片段的延伸。
根据优选一实例，第二片段的追加的3’-末端部位的对面捕捉和模板化寡核苷酸的序列与上述追加的3’-末端部位非-互补。
基于上述第一片段的延伸的延伸链的生成能够使用各种方法来检测。
根据为了检测核苷酸变异而利用5’核酸酶活性的现有技术，所使用的探针的杂交受探针整个序列的影响或由探针整个序列决定。在这种现有技术中，探针设计、制作及反应条件的最优化不容易，这是因为依赖于核苷酸变异的存在的探针的杂交主要根据单一核苷酸差异而决定。
根据VD-PTOCE试验，核苷酸变异区别位点位于探针的杂交-参与部位的5’-末端一部分，这便于将杂交条件最优化。并且，VD-PTOCE试验通过探针的一部分部位区别并检测核苷酸变异，而不是通过探针的整个序列，并能够准确检测基于如单核苷酸多态性之类的单一核苷酸的差异。
在本发明所属技术领域中，已知与单核苷酸多态性的对面序列相邻的探针序列对探针杂交的影响很大。通常，现有的探针在其中央部位具有单核苷酸多态性的对面序列。由此来看，现有的探针不能选择参与杂交的单核苷酸多态性的周边序列。现有技术因单核苷酸多态性周边序列而具有严重的限制。
与此不同，在本发明中，单核苷酸多态性对面的核苷酸变异区别位点位于探针的杂交-参与部位的5’-末端一部分，且能够调节对单核苷酸多态性5’-相邻序列的探针序列。在本发明中，能够准确调节对杂交的单核苷酸多态性周边序列的影响，因而能够进行在现有方法中因单核苷酸多态性周边序列的影响而不能检测或几乎不能检测的单核苷酸多态性的分析。
对本发明的VD-PTOCE试验进行详细说明。
本发明的VD-PTOCE试验作为如上所述的PTOCE试验，基于探测和标记寡核苷酸切割及捕捉和模板化寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸片段延伸，因此为了避免本说明书过于复杂，省略它们之间共同的内容。
【步骤(a)：靶核酸序列和上游寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的杂交】
根据本发明的方法，首先，使靶核酸序列与上游寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异(PTO-NV，Probing and Tagging Oligonucleotide for NucleotideVariation)杂交。
所使用的术语“探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异(PTO-NV，Probing and TaggingOligonucleotide for Nucleotide Variation)”意味着包含：(i)起到探针作用的3’-靶向部位；(ii)5’-标记部位，其包含与靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；以及(iii)核苷酸变异区别位点，其包含与靶核酸的核苷酸变异互补的序列，并位于3’-靶向部位的5’-末端一部分。5’-标记部位与靶核酸序列杂交后，以核切割(nucleolytically)方式从探测和标记寡核苷酸解离。在上述探测和标记寡核苷酸中，5’-标记部位及3’-靶向部位必须以5’→3’方向定位。图25中图示性地例示了探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异。探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异可以视为用于检测核苷酸变异的探测和标记寡核苷酸的一适用形态，向3’-靶向部位的5’-末端一部分导入核苷酸变异区别位点来制作。
探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异包含核苷酸变异区别位点，上述核苷酸变异区别位点包含与核苷酸变异互补的序列，上述核苷酸变异区别位点位于3’-靶向部位的5’-末端一部分。
在探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对变异区别位点互补的核苷酸变异的靶核酸序列杂交的情况下，3’-靶向部位的5’-末端一部分与靶核酸序列形成双链。探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列杂交的情况下，3’-靶向部位的5’-末端一部分不与靶核酸序列形成双链。像这样，对于受关注的核苷酸变异的区别的杂交模式提供在探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的切割位置的差异，由此生成2种探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异片段，来根据受关注的核苷酸变异的存在与否产生信号差异。并且，与具有对变异区别位点非-互补的核苷酸的靶核酸序列杂交的情况下，上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端一部分可以被记载为形成单链(single strand-forming)的上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端一部分。
位于上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端一部分的核苷酸变异区别位点包含与核苷酸变异互补的序列。例如，检测的核苷酸变异为单核苷酸多态性的情况下，核苷酸变异区别位点包含与上述单核苷酸多态性互补的核苷酸。
根据优选一实例，上述核苷酸变异区别位点位于从探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端隔开10核苷酸，更优选为8核苷酸，尤其优选为6核苷酸，进而优选为4核苷酸、3核苷酸、2核苷酸或1核苷酸的位置以内。优选地，核苷酸变异区别位点位于探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端。
能够考虑检测的序列、核酸酶类型及反应条件来决定核苷酸变异区别位点的位置。
揭示探针的核苷酸变异区别位点或靶序列的核苷酸变异位点而使用的术语“位点(site)”不仅包含单一核苷酸，还包含多个核苷酸。
优选地，在步骤(a)中，杂交是在3’-靶向部位与靶核酸序列杂交，而5’-标记部位不与靶核酸序列杂交的严格条件下实施。
根据优选一实例，探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异和/或捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端被阻断，用于防止延伸。
根据优选一实例，上游寡核苷酸为上游引物或上游探针。
根据优选一实例，上游寡核苷酸位于与探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异接近的位置，以能够基于具有5’核酸酶活性的酶诱导探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异切割。
根据优选一实例，上游引物通过其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的上述酶的上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的切割反应。
【步骤(b)：从探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异放出片段】
接着，在用于探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的切割的条件下，使步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触。
若探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述变异区别位点互补的核苷酸变异的靶核酸序列(即，匹配模板)杂交，且3’-靶向部位的5’-末端一部分与靶核酸序列形成双链，来从第一初期切割位置诱导切割，则放出第一片段(参照图25)。
若探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列(即，错配模板)杂交，且3’-靶向部位的5’-末端一部分不与靶核酸序列形成双链，来从位于第一初期切割位置的下游的第二初期切割位置诱导切割，则放出第二片段。上述第二片段包含追加的3’-末端部位，这使第二片段与第一片段不同(参照图25)。
在试样内不存在靶核酸序列的情况下，不发生探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异切割。
像这样，基于靶核酸序列的受关注的核苷酸变异的存在与否的切割位置差异及生成的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异片段的差异表示不同的延伸模式，且能够区别靶核酸序列中的核苷酸变异来检测。
探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的初期切割位置受5’核酸酶的种类、上游寡核苷酸(上游探针或上游引物)的种类、上游寡核苷酸的杂交位置以及切割条件的影响。
通常，与上游引物的延伸一同，基于具有5’核酸酶活性的模板依赖性聚合酶的初期切割位置沿着5’→3’方向位于包含单链及双链的结构中的双链的起始核苷酸(即，分叉位点(bifurcation site))或从起始核苷酸隔开1-2核苷酸的方位。借助切割反应生成包含5’-标记部位及3’-靶向部位的一部分的片段。若借助上游寡核苷酸延伸-独立性切割诱导来实施本发明，则根据上游寡核苷酸(例如，上游探针)的位置来调节探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的切割位置。
揭示探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异而使用的术语“第一初期切割位置(afirst initial cleavage site)”意味着具有对变异区别位点互补的核苷酸变异的靶核酸序列与探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异杂交的情况下，首先被切割的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的切割位置。揭示探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异而使用的术语“第二初期切割位置(a2nd initial cleavage site)”意味着具有对变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列与探测和标记寡核苷酸杂交的情况下，首先被切割的探测和标记寡核苷酸切割位置。
在本发明中使用的术语“第一片段(a first fragment)”意味着在第一初期切割位置借助切割生成的片段。“第一片段”可更换为“第一分段(a first segment)”及“探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异第一片段(a PTO-NV first fragment)”来使用。术语“第二片段(a2nd fragment)”意味着在第二初期切割位置借助切割生成的片段。“第二片段”可更换为“第二分段(a2nd segment)”及“探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异第二片段(a PTO-NV2ndfragment)”来使用。
优选地，上述第一片段及第二片段分别包含5’-标记部位或5’-标记部位的一部分。
可根据所利用的切割方法，在上述第一初期切割位置(或第二初期切割位置)的切割之后也能够连续进行上述切割。例如，与上游引物的延伸一同利用5’核酸酶切割反应的情况下，初期切割位置及与其连续的序列被切割。在使用上游探针，且在从上述探针所处的方位隔开的特定位置发生切割反应的情况下，上述切割反应只在上述位置发生，且不发生连续的切割。
根据优选一实例，依赖于上游引物延伸的初期切割位置可沿着5’→3’方向位于双链的起始核苷酸(即，分叉位点)。
作为本发明的一例，如图25所示，上述核苷酸变异区别位点位于3’-靶向部位的5’-末端一部分的5’-末端。这种情况下，第一初期切割位置沿着5’→3’方向正好与3’-靶向部位的5’-末端一部分相邻。即，上述第一初期切割位置沿着3’方向正好与核苷酸变异区别位点相邻。通常，第二初期切割位置位于从核苷酸变异区别位点沿着3’方向隔开1核苷酸的位置。
作为本发明的另一例，如图26所示，核苷酸变异区别位点位于从3’-靶向部位的5’-末端一部分的5’-末端隔开1核苷酸的位置。这种情况下，第一初期切割位置沿着5’方向正好与核苷酸变异区别位点相邻。通常，第二初期切割位置位于从核苷酸变异区别位点沿着3’方向隔开1核苷酸的位置。
包含核苷酸变异区别位点的5’-末端一部分能够包含可与靶核酸序列杂交的序列。择一性地，一部分5’-末端一部分可以包含非-杂交序列(参照图27)。上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对核苷酸变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列杂交的情况下，向上述5’-末端一部分导入非-杂交序列，这对上述5’-末端一部分形成单链很有用。
根据优选一实例，上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端一部分包含位于从核苷酸变异区别位点隔开1-10核苷酸(更优选为1-5核苷酸)的位置以内的非-碱基对部分(non-base pairing moiety)。
探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列杂交的情况下，上述非-碱基对部分防止3’-靶向部位的5’-末端一部分与靶核苷酸序列形成双链。
根据优选一实例，具有对核苷酸变异区别位点互补的核苷酸变异的靶核酸序列与探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异杂交的情况下，非-碱基对部分不抑制5’-末端一部分与靶核酸序列形成双链。
根据一实例，非-碱基对部分扩大第一初期切割位置及第二初期切割位置之间的差异(differentiation)。例如，探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端一部分的杂交模式没有差异，因而变异区别位点的差异引起的匹配模板及错配模板的切割位置没有差异的情况下，非-碱基对部分的使用对杂交模式产生差异。并且，探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端一部分在变异区别位点的差异引起的匹配模板及错配模板的杂交模式存在差异的情况下，非-碱基对部分的使用能够使第一片段的3’-末端部位短于第二片段的3’-末端部位，由此在捕捉和模板化寡核苷酸完全防止第二片段的延伸。
非-碱基对部分的使用改善VD-PTOCE试验。
根据优选一实例，非-碱基对部分(例如，人为错配核苷酸)增加对于核苷酸变异的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的区别可能性。
根据一实例，基于具有5’核酸酶活性的酶的第一初期切割位置及第二初期切割位置之间的差异识别根据由非-碱基对部分赋予的差异得到改善。上述差异可根据基于非-碱基对部分的第一初期切割位置及第二初期切割位置之间的距离扩大。根据优选一实例，非-碱基对部分扩大第一初期切割位置及第二初期切割位置之间的距离。
根据优选一实例，非-碱基对部分序列的导入能够调节第二初期切割位置。
优选地，非-碱基对部分位于核苷酸变异区别位点的下游。
例如，作为非-碱基对部分的错配核苷酸向沿着3’方向从核苷酸变异区别位点隔开2核苷酸的部位导入的情况下，第二初期切割位置调整为从核苷酸变异区别位点隔开2核苷酸的位置(参照图27)。不使用错配核苷酸的情况下，第二初期切割位置位于从核苷酸变异区别位点隔开1核苷酸的位置。即，非-碱基对部分扩大第一初期切割位置及第二初期切割位置之间的距离。
非-碱基对部分包含在靶核酸序列之间不形成碱基对的任何部分。优选地，非-碱基对部分是以下内容：(i)包含人为错配碱基、变形为无法碱基配对的非-碱基对碱基或通用碱基的核苷酸，(ii)变形为无法碱基配对的非-碱基对核苷酸或(iii)非-碱基配对化合物(non-base pairing chemical compound)。
例如，非-碱基对部分包含亚烷基(alkylene group)、呋喃核糖萘(ribofuranosylnaphthalene)、脱氧呋喃核糖萘(deoxy ribofuranosyl naphthalene)、偏磷酸盐(metaphosphate)、硫代磷酸酯连接、烷基磷酸三酯连接、芳基磷酸三酯连接、膦酸烷基酯连接、膦酸芳基酯连接、氢膦酸酯连接、烷基磷酰胺酯连接及芳基磷酰胺酯连接。现有的碳间隔区也被利用为非-碱基对部分。作为非-碱基对部分的通用碱基对调节探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的切割位置有用。
包含如脱氧肌苷(deoxyinosine)、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯(1-(2’-deoxybeta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrole)以及5-硝基吲哚(5-nitroindole)之类的通用碱基的碱基对的结合力低于天然碱基间的结合力，通用碱基在特定杂交条件下可利用为非-碱基对部分。
导入5’-末端一部分的非-碱基对部分优选地具有1～5个部分，更优选地具有1～2个部分。5’-末端一部分的多个非-碱基对部分能够连续或不连续地存在。优选地，非-碱基对部分具有2～5个连续的部分。
优选地，非-碱基对部分为非-碱基对形成化合物。
根据优选一实例，探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的核苷酸变异区别位点及非-碱基对部分位于从3’-靶向部位的5’-末端隔开10核苷酸(更优选为8核苷酸、7核苷酸、6核苷酸、5核苷酸、4核苷酸、3核苷酸、2核苷酸或1核苷酸，尤其优选为1核苷酸)的位置以内。
择一性地，切割反应能够仅在上述第一初期切割位置实施，而不在上述第二初期切割位置实施。例如，使用上游探针，上述切割反应在从上述探针所处的方位隔开的特定位置发生的情况下，当探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与匹配模板杂交时，能够仅在第一初期切割位置发生切割反应。探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与错配模板杂交的情况下，由于分叉位点(第二初期切割位置)远离上游探针，因此不能被切割。
根据优选一实例，探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与错配模板杂交的情况下，第二初期切割位置在包含单链及双链的结构中包含双链的起始位置(即，分叉位点)。
根据一实例，探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异具有阻断剂部位，该阻断剂部位包含对具有5’核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的最少1个核苷酸作为阻断剂(blocker)，上述阻断剂部分调节初期切割位置或在一个位置或多个位置防止切割。
【步骤(c)：从探测和标记寡核苷酸放出的片段与捕捉和模板化寡核苷酸的杂交】
从探测和标记寡核苷酸放出的片段与捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturingand Templating Oligonucleotide)杂交。
通常，第一片段及第二片段包含能够与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的序列，由此第一片段及第二片段中的一个与捕捉和模板化寡核苷酸杂交。
与错配模板杂交而生成的第二片段与杂交于匹配模板而生成的第一片段不同地包含追加的3’-末端部位。
根据优选一实例，上述第二片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的情况下，捕捉和模板化寡核苷酸不与上述第二片段的上述追加的3’-末端部位杂交，因此选择捕捉和模板化寡核苷酸的序列，以防止上述第二片段的延伸。例如，捕捉和模板化寡核苷酸的序列能够以在第二片段的追加的3’-末端部位的对面具有错配核苷酸的方式被选择。择一性地，通用碱基能够根据反应条件替代错配核苷酸。
在某种条件下，第一初期切割位置(或第二初期切割位置)可以不固定，并且是多个。例如，初期切割位置可沿着5’→3’方向位于包含单链及双链的结构中的双链的起始核苷酸(即，分叉位点)及从起始核苷酸隔开1-2核苷酸的位置。这种情况下，优选地，在本发明中，选择捕捉和模板化寡核苷酸的序列，来使借助第一初期切割放出的片段中的最短的片段选择性地被延伸，从而生成表示核苷酸变异的存在的延伸链。
【步骤(d)：片段的延伸】
若捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位与第一片段杂交，则上述片段被延伸，来生成包含与捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸序列的延伸链。第二片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的情况下，上述第二片段不被延伸。
通常，引物的延伸能够借助引物的3’-末端一部分与模板的杂交调节。能够调节引物序列及反应条件(例如，退火温度)，由此进行在3’-末端一部分具有1-3错配核苷酸的引物的延伸。择一性地，能够仅在引物具有与靶序列完全互补的序列时使引物延伸。
根据优选一实例，选择捕捉和模板化寡核苷酸的序列，来使第一片段或第二片段中的某一个选择性地被延伸。
根据优选一实例，在一个错配存在于片段的3’-末端一部分的情况下，在不被延伸的条件下实施片段的延伸。
【步骤(e)：延伸链的检测】
延伸链在延伸反应之后被检测。延伸链的存在表示与探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的核苷酸区别位点互补的核苷酸变异的存在。
根据优选一实例，步骤(e)的检测根据包括解链分析的PTOCE试验或包括利用延伸链及捕捉和模板化寡核苷酸间延伸二聚物的信号的指定温度下的检测的PTOCE来实施。
根据优选一实例，第一片段及捕捉和模板化寡核苷酸的延伸链在步骤(d)中形成延伸二聚物，上述延伸二聚物具有能够基于如下长度而调节的Tm值：(i)上述第一片段的序列和/或长度，(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度或(iii)上述第一片段的序列和/或长度及上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度；上述延伸二聚物提供基于如下标记的靶信号：(i)与第一片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相结合的最少1个标记，(ii)在延伸反应期间向上述延伸二聚物插入的1个标记，(iii)与第一片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相结合的最少1个标记及在延伸反应期间向上述延伸二聚物插入的1个标记或(iv)嵌入标记；根据对于延伸二聚物的解链分析或杂交分析，从延伸二聚物测定靶信号，来检测上述延伸链的存在。
根据优选一实例，第一片段及捕捉和模板化寡核苷酸的延伸链在步骤(d)中形成延伸二聚物，上述延伸二聚物具有能够基于如下长度而调节的Tm值：(i)上述第一片段的序列和/或长度，(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度或(iii)上述第一片段的序列和/或长度及上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度；上述延伸二聚物提供基于如下标记的靶信号：(i)与第一片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相结合的最少1个标记，(ii)在延伸反应期间向上述延伸二聚物插入的1个标记，(iii)与第一片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相结合的最少1个标记及在延伸反应期间向上述延伸二聚物插入的1个标记或(iv)嵌入标记；在充分维持延伸二聚物的双链的指定温度下从延伸二聚物测定靶信号，来检测上述延伸链的存在。
根据优选一实例，能够测定在第一片段的延伸中从与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的标记的探针的切割产生的信号，来检测第一片段的延伸链。
根据优选一实例，可以基于延伸链的大小或序列检测第一片段的延伸链。例如，延伸链可以利用电泳或质量分析(例如，电子轰击(EI，electron impact)、化学电离(CI，chemical ionization)、场解吸(FD，Field Desoption)、252Cf-等离子解吸(PD，252Cf-Plasma desoprtion)、解吸化学电离(DCI，desoprtion chemical ionization)、二次离子质谱(SIMS，secondary ion mass spectrometry)、快原子轰击(FAB，fast atombombardment)、电喷射离子化(ESI，electrospray ionization)、基质辅助激光解吸电离(MALDI，matrix-assisted laser desoprtion ionization)以及串联质谱(Tandem MassSpectrometry)来测定。
根据优选一实例，本发明的方法在反复循环(repeating cycle)之间包括变性过程，来反复实施步骤(a)～步骤(e)的全部或一部分。
根据优选一实例，上述方法用于检测最少2种核苷酸变异，上述上游寡核苷酸包含最少2种寡核苷酸，上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异包含最少2种探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异。
根据优选一实例，上述上游寡核苷酸为上游引物，上述步骤(b)为了上游引物的延伸而使用模板-依赖性核酸聚合酶，上述模板-依赖性核酸聚合酶与上述具有5’核酸酶活性的酶相同。
根据优选一实例，上游寡核苷酸为上游引物，上述步骤(b)为了上游引物的延伸而使用模板-依赖性核酸聚合酶，上述模板-依赖性核酸聚合酶为与上述具有5’核酸酶活性的酶相互不同的酶。
根据优选一实例，上述具有5’核酸酶活性的酶为具有5’核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶或瓣状核酸内切酶。
根据优选一实例，上述方法在下游引物存在的条件下实施。
本发明的方法能够以利用肽核酸的聚合酶链式反应箝术实施。在上述方法中使用的肽核酸以及探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异能够设计成与DNA双链的相同链或不同链杂交。
根据一实例，本发明可以不使用上游寡核苷酸而实施。这种情况下，可以利用具有上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的现有的酶。有具有5’核酸酶活性的模板-依赖性聚合酶中的具有上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的几种酶，例如，Taq DNA聚合酶。
考虑靶核酸序列的扩增、反应条件及5’核酸酶活性，本发明优选使用上游寡核苷酸，更优选使用上游引物来实施。
利用基于上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的PTOCE试验的核苷酸变异检测方法包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异(PTO-NV，Probing and Tagging Oligonucleotide for Nucleotide Variation)进行杂交；上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，以及(iii)核苷酸变异区别位点(nucleotide variation discrimination site)，包含与上述靶核酸的核苷酸变异互补的序列，并位于上述3’-靶向部位的5’-末端一部分，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；
步骤(b)，在上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的切割的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述核苷酸变异区别位点互补的核苷酸变异的上述靶核酸序列杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分与上述靶核酸序列形成双链，来从第一初期切割位置诱导切割，则放出第一片段；若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述核苷酸变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分不与上述靶核酸序列形成双链，来从位于上述第一初期切割位置的下游的第二初期切割位置诱导切割，则放出第二片段；上述第二片段包含追加的3’-末端部位，这使上述第二片段与上述第一片段不同；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide)进行杂交；上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异放出的上述第一片段或上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用模板-依赖性核酸聚合酶及上述步骤(c)的结果物来实施延伸反应；若上述第一片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则上述第一片段被延伸，来生成包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸序列的延伸链，若上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则上述第二片段不被延伸；以及
步骤(e)，检测上述延伸链，上述延伸链的存在表示与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的核苷酸区别位点互补的核苷酸变异的存在。
基于上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的本发明的方法除了不使用上游寡核苷酸之外，与利用上游核苷酸的PTOCE试验相同，因此为了避免本说明书过于复杂，省略它们之间共同的内容。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO Cleavage and Extension)试验来从靶核酸序列检测核苷酸变异的试剂盒，包含：
(a)探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异(PTO-NV，Probing and TaggingOligonucleotide for Nucleotide Variation)，上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，以及(iii)核苷酸变异区别位点，包含与上述靶核酸的核苷酸变异互补的序列，并位于上述3’-靶向部位的5’-末端一部分，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交，
(b)上游寡核苷酸(upstream oligonucleotide)，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的上游，上述上游寡核苷酸或其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的切割，以及
(c)捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturing and TemplatingOligonucleotide)，上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；
若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述变异区别位点互补的核苷酸变异的上述靶核酸序列杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分与上述靶核酸序列形成双链，来从第一初期切割位置诱导切割，则放出第一片段；
若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分不与上述靶核酸序列形成双链，来从位于上述第一初期切割位置的下游的第二初期切割位置诱导切割，则放出第二片段；上述第二片段包含追加的3’-末端部位，这使上述第二片段与上述第一片段不同；从上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异放出的上述第一片段或上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位进行杂交。
根据本发明的又一实施方式，本发明提供利用基于上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO Cleavage and Extension)试验来从靶核酸序列检测核苷酸变异的试剂盒，包含：
(a)探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异(PTO-NV，Probing and TaggingOligonucleotide for Nucleotide Variation)，上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，以及(iii)核苷酸变异区别位点，包含与上述靶核酸的核苷酸变异互补的序列，并位于上述3’-靶向部位的5’-末端一部分，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交，以及
(b)捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturing and TemplatingOligonucleotide)，上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；
若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述核苷酸变异区别位点互补的核苷酸变异的上述靶核酸序列杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分与上述靶核酸序列形成双链，来从第一初期切割位置诱导切割，则放出第一片段；
若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述核苷酸变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分不与上述靶核酸序列形成双链，来从位于上述第一初期切割位置的下游的第二初期切割位置诱导切割，则放出第二片段；上述第二片段包含追加的3’-末端部位，这使上述第二片段与上述第一片段不同；从上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异放出的上述第一片段或上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位进行杂交。
本发明的试剂盒为了实施上述本发明的检测方法而制备，因此为了避免本说明书过于复杂，省略它们之间共同的内容。
简要说明本发明的特征及优点如下：
(a)本发明提供靶-依赖性延伸二聚物。在本发明中，与靶核酸序列杂交的探测和标记寡核苷酸(PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide)被切割来放出片段，上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide)杂交来形成延伸二聚物。上述延伸二聚物提供表示靶核酸序列的存在的信号(信号产生或消灭)或信号变化(信号增加或减少)。
(b)延伸二聚物的存在借助如解链曲线分析以及在指定温度下的检测(例如，实时方式及终点方式)之类的各种方法或过程来决定。
(c)本发明即使只利用一种标记(例如，FAM)，也能够借助解链曲线分析来同时检测最少2种靶核酸序列。相反，在液相中实施的现有的多重实时方式因与能够检测的荧光标记的数量相关的限制而存在严重的问题。本发明成功克服了这种缺点，并扩大了多重实时检测的应用。
(d)本发明能够利用多个标记系统来实施。例如，与探测和标记寡核苷酸和/或捕捉和模板化寡核苷酸的任何位置相连接的标记可用于提供表示延伸二聚物的靶信号。并且，可将在延伸反应期间向延伸二聚物内插入的标记利用于本发明。不仅如此，可以利用这种标记的组合。在本发明中能够适用的多目的的标记系统根据实验条件或目的选择适当的标记系统。
(e)本发明提供具有能够基于(i)上述片段的序列和/或长度、(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度或(iii)上述片段的上述序列和/或长度和上述捕捉和模板化寡核苷酸的上述序列和/或长度调节的指定Tm值的靶-依赖性延伸二聚物。
(f)利用扩增产物的现有的解链曲线分析依赖于扩增产物的序列，由此难以获得扩增产物所需的Tm值。相反，本发明依赖于延伸二聚物的序列，而不是扩增产物的序列，从而能够选择延伸二聚物所需的Tm值。因此，本发明能够容易适用于多个靶序列的检测。
(g)利用标记探针及靶核酸序列之间的直接的杂交的现有的解链曲线分析因探针的非-特异性杂交而使假阳性信号产生的可能性变高。相反，本发明不仅利用探测和标记寡核苷酸杂交，而且利用酶切割及延伸，来完全克服假阳性信号的问题。
(h)现有的解链曲线分析的Tm值受靶核酸序列的序列变异的影响。但是，本发明的延伸二聚物与靶核酸序列的序列变异无关地提供规定的Tm值，从而在解链曲线分析中确保卓越的准确性。
(i)探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的序列及捕捉和模板化寡核苷酸的序列可无需考虑靶核酸序列而选择，这是值得关注的。由此可预先设计对探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及捕捉和模板化寡核苷酸的序列的库(pool)。探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位需考虑靶核酸序列而制备，但捕捉和模板化寡核苷酸无需考虑靶核酸序列的信息或靶核酸序列，能够以现成的方式(ready-made fashion)制备。这种特征在多重靶检测，尤其，利用在固相底物实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸的微阵列提供突出的优点。
(j)根据用于靶核酸序列中的核苷酸变异检测的本发明(即，VD-PTOCE试验)，上述探针(探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异)根据受关注的核苷酸变异的存在与否来表示完全区分的杂交模式。
(k)对于受关注的核苷酸变异的这种杂交模式提供探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的初期切割位置中的差异，由此生成2种探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异片段，从而根据受关注的核苷酸变异的存在与否来发生信号的差异。
以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。这些实施例仅用于更加具体地说明本发明，根据本发明的要旨，本发明的范围不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
【实施例】
【实施例1：对探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，Probing and TaggingOligonucleotide Cleavage & Extension)试验的评价】
对延伸二聚物是否能够提供用于靶核酸序列的检测的靶信号进行实验，来评价作为本发明的新的试验的探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO Cleavage andExtension)试验。
为了该评价，实施了借助解链分析检测延伸二聚物的存在的PTOCE试验(包括解链分析的PTOCE试验)。本发明人为了上游引物的延伸、探测和标记寡核苷酸的切割以及探测和标记寡核苷酸片段的延伸而利用了具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶。
设计成使在实施试验的过程中形成的延伸二聚物具有相互作用性双重标记。延伸二聚物的相互作用性双重标记根据(i)由报道分子及猝灭分子标记的捕捉和模板化寡核苷酸(双重标记捕捉和模板化寡核苷酸)或(ii)具有猝灭分子的探测和标记寡核苷酸以及具有报道分子的捕捉和模板化寡核苷酸(猝灭-标记探测和标记寡核苷酸以及报道-标记捕捉和模板化寡核苷酸)来提供。探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端由碳间隔区(carbon spacer)阻断。将对淋病奈瑟菌基因的合成寡核苷酸利用为靶模板。
【1-1.利用双重标记捕捉和模板化寡核苷酸的PTOCE试验】
探测和标记寡核苷酸不具有标记。捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化(templating)部位具有猝灭分子(BHQ-1)及荧光报道分子(FAM)。在本实施例中利用的合成模板、上游引物、探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。
NG-T
5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3’(SEQ ID NO:1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’(SEQ ID NO:2)
NG-PTO-1
5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:3)
NG-CTO-1
5’-[BHQ-1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’(SEQ ID NO:4)
(标有下划线的文字指探测和标记寡核苷酸的5’-标记(tagging)部位)
用含有对于NG基因的合成模板(SEQ ID NO：1)2pmole(皮摩尔)、上游引物(SEQ IDNO：2)10pmole、探测和标记寡核苷酸(SEQ ID NO：3)5pmole、捕捉和模板化寡核苷酸(SEQID NO：4)2pmole以及2X主混合液(2.5mM MgCl2、200μM的dNTPs、1.6unit的H-Taq DNA聚合酶)((韩国索尔杰恩特公司(Solgent，Korea))10μl的20μl的最终体积来实施反应；使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，Bio-Rad)；使上述反应混合物在95℃温度下进行15分钟变性后，在95℃温度下30秒钟、在60℃温度下60秒钟过程反复了30次。反应之后，使反应混合物冷却至35℃，并在35℃维持30秒钟后，从35℃慢慢加热至90℃，由此得到解链曲线。在温度上升的过程中，连续测定荧光来监测双链DNA的解离。解链峰来源于解链曲线数据。
如图14所示，存在模板的情况下，在相当于延伸二聚物的预计Tm值(76.5℃)检测到峰。不存在模板的情况下，没有检测到任何峰。在本标记方法中，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物(hybrid)不提供任何信号，因此没有检测到相当于非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的峰。不存在探测和标记寡核苷酸或不存在捕捉和模板化寡核苷酸的情况下，没有观察到任何峰。
【1-2.利用猝灭-标记探测和标记寡核苷酸以及报道-标记捕捉和模板化寡核苷酸的PTOCE试验】
探测和标记寡核苷酸的5’-末端由猝灭分子(BHQ-1)标记。捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端由荧光报道分子(FAM)标记。
在本实施例中利用的合成模板、上游引物、探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。
NG-T
5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3’(SEQ ID NO:1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’(SEQ ID NO:2)
NG-PTO-2
5’-[BHQ-1]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’(SEQID NO:5)
NG-CTO-2
5’-CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[FAM]-3’(SEQ ID NO:6)
(标有下划线的文字指探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位)
用含有对于NG基因的合成模板(SEQ ID NO：1)2pmole、上游引物(SEQ ID NO：2)10pmole、探测和标记寡核苷酸(SEQ ID NO：5)5pmole、捕捉和模板化寡核苷酸(SEQ ID NO：6)2pmole以及2X主混合液(2.5mM MgCl2、200μM的dNTPs、1.6unit的H-Taq DNA聚合酶)((韩国索尔杰恩特公司(Solgent，Korea))10μl的20μl的最终体积来实施反应；使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，Bio-Rad)；使上述反应混合物在95℃温度下进行15分钟变性后，在95℃温度下30秒钟、在60℃温度下60秒钟以及在72℃温度下30秒钟过程反复了30次。反应之后，使反应混合物冷却至35℃，并在35℃维持30秒钟后，从35℃慢慢加热至90℃，由此得到解链曲线。在温度上升的过程中，连续测定荧光来监测双链DNA的解离。解链峰来源于解链曲线数据。
如图15所示，存在模板的情况下，在相当于延伸二聚物的预计Tm值的77℃检测到峰。在本标记方法中，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物不提供非-靶信号，因此在相当于非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的预计Tm值的64.0℃～64.5℃出现峰。不存在探测和标记寡核苷酸或不存在捕捉和模板化寡核苷酸的情况下，没有观察到任何峰。
这种结果表示生成靶-依赖性的延伸二聚物，且上述延伸二聚物提供表示靶核酸序列的存在的靶信号。
【实施例2：延伸二聚物的Tm值的调节】
本发明人还进行实验来得到在PTOCE试验中是否能够根据捕捉和模板化寡核苷酸的序列来调节延伸二聚物的Tm值。
为了本实验，本发明人利用了在模板化(templating)部位具有相互不同的序列的三种捕捉和模板化寡核苷酸。探测和标记寡核苷酸不具有标记。三种捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化部位具有猝灭分子(BHQ-1)及荧光报道分子(FAM)。探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端由碳间隔区(carbon spacer)阻断。
分别利用三种捕捉和模板化寡核苷酸来实施了包括解链分析的PTOCE试验。
在本实施例中利用的合成模板、上游引物、探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。
NG-T
5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’(SEQ ID NO:1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’(SEQ ID NO:2)
NG-PTO-3
5’-ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:7)
NG-CTO-1
5’-[BHQ-1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3(SEQ ID NO:4)
NG-CTO-3
5’-[BHQ-1]TTTTTTTTTTCCTCCTCCAG[T(FAM)]AAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’(SEQ ID NO:8)
NG-CTO-4
5’-[BHQ-1]TTTTTTTTTTTTTTTTTTAG[T(FAM)]AAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’(SEQ ID NO:9)
(标有下划线的文字指探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位)
用含有对于NG基因的合成模板(SEQ ID NO：1)2pmole、上游引物(SEQ ID NO：2)10pmole、探测和标记寡核苷酸(SEQ ID NO：7)5pmole、捕捉和模板化寡核苷酸(SEQ ID NO：4、8或9)2pmole以及2X主混合液(2.5mM MgCl2、200μM的dNTPs、1.6unit的H-TaqDNA聚合酶)((韩国索尔杰恩特公司(Solgent，Korea))10μl的20μl的最终体积来实施反应；使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，Bio-Rad)；使上述反应混合物在95℃温度下进行15分钟变性后，在95℃温度下30秒钟、在60℃温度下60秒钟的过程反复了30次。反应之后，使反应混合物冷却至35℃，并在35℃维持30秒钟后，从35℃慢慢加热至90℃，由此得到解链曲线。在温度上升的过程中，连续测定荧光来监测双链DNA的解离。解链峰来源于解链曲线数据。
如图16所示，存在模板的情况下，在76.0℃、69.0℃或64.5℃检测到峰。各个峰相当于基于实验对象的捕捉和模板化寡核苷酸的延伸二聚物的预计Tm值。不存在模板的情况下，没有观察到任何峰。
这种结果表示能够根据捕捉和模板化寡核苷酸的序列来调节延伸二聚物的Tm值。
【实施例3：利用包括实时检测或解链分析的PTOCE的靶核酸序列的检测】
本发明人进行实验来得到PTOCE试验是否能够以实时聚合酶链式反应方式(i)或聚合酶链式反应后的解链分析方式(ii)检测靶核酸序列。(i)探测和标记寡核苷酸切割以及探测和标记寡核苷酸片段的延伸借助聚合酶链式反应过程伴随靶核酸的扩增，且在各循环的指定温度下检测了延伸二聚物的存在(包括在指定温度下的实时检测的PTOCE试验)；或者(ii)探测和标记寡核苷酸切割以及探测和标记寡核苷酸片段的延伸借助聚合酶链式反应过程伴随靶核酸的扩增，并借助聚合酶链式反应后的解链分析检测了延伸二聚物的存在(包括解链分析的PTOCE试验)。
上游引物参与基于具有5’核酸酶活性的酶的探测和标记寡核苷酸切割，并且，与下游引物一同也参与基于聚合酶链式反应过程的靶核酸序列扩增。在上游引物和下游引物的延伸、探测和标记寡核苷酸切割以及探测和标记寡核苷酸片段的延伸中利用了具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶。
延伸二聚物设计成具有相互作用性双重标记。延伸二聚物的相互作用性双重标记基于(i)由报道分子及猝灭分子标记的捕捉和模板化寡核苷酸、(ii)具有在延伸反应期间插入的猝灭-iso-dGTP及报道分子和iso-dC残基的捕捉和模板化寡核苷酸或(iii)具有猝灭分子的探测和标记寡核苷酸以及具有报道分子的捕捉和模板化寡核苷酸来提供。探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端由碳间隔区(carbon spacer)阻断。
将淋病奈瑟菌(NG)的基因组DNA利用为靶核酸。
【3-1.利用双重标记捕捉和模板化寡核苷酸的PTOCE试验】
探测和标记寡核苷酸不具有标记，捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化(templating)部位具有猝灭分子(BHQ-1)及荧光报道分子(FAM)。
在本实施例中利用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。
NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’(SEQ ID NO:10)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’(SEQ ID NO:2)
NG-PTO-3
5’-ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:7)
NG-CTO-1
5’-[BHQ-1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’(SEQ ID NO:4)
(标有下划线的文字指探测和标记寡核苷酸的5’-标记(tagging)部位)
【3-1-1.包括在指定温度下的实时检测的PTOCE试验】
用含有NG的基因组DNA100pg、下游引物(SEQ ID NO：10)10pmole、上游引物(SEQID NO：2)10pmole、探测和标记寡核苷酸(SEQ ID NO：7)5pmole、捕捉和模板化寡核苷酸(SEQ ID NO：4)2pmole以及2X主混合液(2.5mM MgCl2、200μM的dNTPs、1.6unit的H-Taq DNA聚合酶)((韩国索尔杰恩特公司(Solgent，Korea))10μl的20μl的最终体积来实施反应；使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，Bio-Rad)；使上述反应混合物在95℃温度下进行15分钟变性后，在95℃温度下30秒钟、在60℃温度下60秒钟、在72℃温度下30秒钟的过程反复了60次。在各循环的60℃检测了信号。在延伸二聚物维持双链形态的范围内决定了检测温度。
如图17A所示，存在模板的情况下，检测到靶信号(Ct31.36)。不存在模板的情况下，没有检测到任何信号。
【3-1-2.包括解链分析的PTOCE试验】
实施例3-1-1的反应之后，使反应混合物冷却至35℃，并在35℃维持30秒钟后，从35℃慢慢加热至90℃，由此得到解链曲线。在温度上升的过程中，连续测定荧光来监测双链DNA的解离。解链峰来源于解链曲线数据。
如图17B所示，存在模板的情况下，在相当于延伸二聚物的预计Tm值的76.0℃检测到峰。不存在模板的情况下，没有检测到任何峰。在本标记方法中，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物不提供任何信号，因此没有检测到相当于非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的峰。
【3-2.利用具有猝灭-iso-dGTP及iso-dC残基的报道-标记捕捉和模板化寡核苷酸的PTOCE试验】
探测和标记寡核苷酸不具有标记.捕捉和模板化寡核苷酸在其5’-末端具有报道分子(FAM)及iso-dC残基。在探测和标记寡核苷酸片段的延伸反应期间，由猝灭分子(dabcyl)标记的iso-dGTP插入于对iso-dC残基互补的位置。
在本实施例中利用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。
NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’(SEQ ID NO:10)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’(SEQ ID NO:2)
NG-PTO-1
5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3space r]-3’(SEQ ID NO:3)
NG-CTO-5
5’-[FAM][Iso-dC]CTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:11)
(标有下划线的文字指探测和标记寡核苷酸的5’-标记(tagging)部位)
【3-2-1.包括在指定温度下的实时检测的PTOCE试验】
用含有NG的基因组DNA100pg、下游引物(SEQ ID NO：10)10pmole、上游引物(SEQID NO：2)10pmole、探测和标记寡核苷酸(SEQ ID NO：3)5pmole、捕捉和模板化寡核苷酸(SEQ ID NO：11)2pmole以及2X主混合液(Cat。No.A4100，美国普洛麦格公司(Promega，USA))10μl的20μl的最终体积来实施反应；使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，Bio-Rad)；使上述反应混合物在95℃温度下进行15分钟变性后，在95℃温度下30秒钟、在60℃温度下60秒钟、在72℃温度下30秒钟的过程反复了60次，并且，在72℃温度下30秒钟、在55℃温度下30秒钟的过程反复了5次。在各循环的60℃检测了信号。在延伸二聚物维持双链形态的范围内决定了检测温度。
具有主混合液内的5’核酸酶活性的DNA聚合酶利用于上游引物和下游引物的延伸、探测和标记寡核苷酸切割以及探测和标记寡核苷酸片段的延伸。
如图18A所示，存在模板的情况下，检测到靶信号(Ct33.03)。不存在模板的情况下，没有检测到任何信号。
【3-2-2.包括解链分析的PTOCE试验】
实施例3-2-1的反应之后，使反应混合物冷却至35℃，并在35℃维持30秒钟后，从35℃慢慢加热至90℃，由此得到解链曲线。在温度上升的过程中，连续测定荧光来监测双链DNA的解离。解链峰来源于解链曲线数据。
如图18B所示，存在模板的情况下，在相当于延伸二聚物的预计Tm值的70.0℃检测到峰。不存在模板的情况下，没有检测到任何峰。在本标记方法中，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物不提供任何信号，因此没有检测到相当于非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的峰。
【3-3.利用猝灭-标记探测和标记寡核苷酸以及报道-标记捕捉和模板化寡核苷酸的PTOCE试验】
探测和标记寡核苷酸的5’-末端由猝灭分子(BHQ-1)标记。捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端由荧光报道分子(FAM)标记。
在本实施例中利用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。
NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’(SEQ ID NO:10)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’(SEQ ID NO:2)
NG-PTO-4
5’-[BHQ-1]ACGACGGCTTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spa cer]-3’(SEQ ID NO:12)
NG-CTO-2
5’-CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[FAM]-3’(SEQ ID NO:6)
(标有下划线的文字指探测和标记寡核苷酸的5’-标记(tagging)部位)
【3-3-1.包括在指定温度下的实时检测的PTOCE试验】
用含有NG的基因组DNA100pg、下游引物(SEQ ID NO：10)10pmole、上游引物(SEQID NO：2)10pmole、探测和标记寡核苷酸(SEQ ID NO：12)5pmole、捕捉和模板化寡核苷酸(SEQ ID NO：6)2pmole以及2X主混合液(2.5mM MgCl2、200μM的dNTPs、1.6unit的H-Taq DNA聚合酶)((韩国索尔杰恩特公司(Solgent，Korea))10μl的20μl的最终体积来实施反应；使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，Bio-Rad)；使上述反应混合物在95℃温度下进行15分钟变性后，在95℃温度下30秒钟、在60℃温度下60秒钟、在72℃温度下30秒钟的过程反复了60次。在各循环的60℃检测了信号。在延伸二聚物维持双链形态的范围内决定了检测温度，上述温度高于非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的Tm值。
如图19A所示，存在模板的情况下，检测到靶信号(Ct29.79)。不存在模板的情况下，没有检测到任何信号。
【3-3-2.包括解链分析的PTOCE试验】
实施例3-3-1的反应之后，使反应混合物冷却至35℃，并在35℃维持30秒钟后，从35℃慢慢加热至90℃，由此得到解链曲线。在温度上升的过程中，连续测定荧光来监测双链DNA的解离。解链峰来源于解链曲线数据。
如图19B所示，存在模板的情况下，在相当于延伸二聚物的预计Tm值的76.5℃检测到峰。在本标记方法中，非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物提供非-靶信号，因此不存在模板的情况下，在相当于非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的Tm值的48.0℃检测到峰。
这种结果表示能够根据包括实时检测或解链分析的PTOCE来检测靶核酸序列。
【实施例4：基于包括解链分析的PTOCE试验的多个靶核酸序列的检测】
并且，本发明人进行了实验来得到包括解链分析的PTOCE试验是否能够利用相同的种类的报道分子来检测多个靶核酸序列。
探测和标记寡核苷酸切割以及探测和标记寡核苷酸片段的延伸伴随基于聚合酶链式反应过程的靶核酸的扩增，借助聚合酶链式反应后的解链分析(包括解链分析的PTOCE试验)来检测延伸二聚物的存在。
在试验期间形成的延伸二聚物设计成具有相互作用性双重标记。延伸二聚物的相互作用性双重标记借助由其模板化部位的报道分子及猝灭分子标记的捕捉和模板化寡核苷酸提供。捕捉和模板化寡核苷酸虽然具有相同种类的荧光报道分子(FAM)，但因具有不同的序列而生成Tm值不同的延伸二聚物。探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端由碳间隔区阻断。
将淋病奈瑟菌(NG)及金黄色葡萄球菌(SA)的基因组DNA利用为靶核酸。
在本实施例中利用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。
NG-F5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’(SEQ ID NO:10)
NG-R5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’(SEQ ID NO:2)
NG-PTO-3
5’-ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:7)
NG-CTO-1
5’-[BHQ-1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’(SEQ ID NO:4)
SA-F 5’-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAATC-3’(SEQ ID NO:13)
SA-R 5’-GATAAGTTTAAAGCTTGACCGTCTG-3’(SEQ ID NO:14)
SA-PTO-1
5’-AATCCGACCACGCATTCCGTGGTCAATCATTCGGTTTACG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:15)
SA-CTO-1
5’-[BHQ-1]TTTTTTTTTTTTTTTTTGCA[T(FAM)]AGCGTGGTCGGATT[C3spacer]-3’(SEQID NO:16)
(标有下划线的文字指探测和标记寡核苷酸的5’-标记(tagging)部位)
用含有NG的基因组DNA100pg、SA的基因组DNA100pg、各个下游引物(SEQ ID NO：10及13)10pmole、各个上游引物(SEQ ID NO：2及14)10pmole、各个探测和标记寡核苷酸(SEQID NO：7及15)5pmole、各个捕捉和模板化寡核苷酸(SEQ ID NO：4及16)2pmole以及2X主混合液(2.5mM MgCl2，200μM dNTPs，1.6unit的H-TaqDNA聚合酶)((韩国索尔杰恩特公司(Solgent，Korea))10μl的20μl的最终体积来实施反应；使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，Bio-Rad)；使上述反应混合物在95℃温度下进行15分钟变性后，在95℃温度下30秒钟、在60℃温度下60秒钟、在72℃温度下30秒钟的过程反复了60次。反应之后，使反应混合物冷却至35℃，并在35℃维持30秒钟后，从35℃慢慢加热至90℃，由此得到解链曲线。在温度上升的过程中，连续测定荧光来监测双链DNA的解离。解链峰来源于解链曲线数据。
如图20所示，存在模板的情况下，检测到多个靶信号(NG的Tm：75.5℃及SA的Tm：63.5℃)。不存在模板的情况下，没有检测到任何信号。
这种结果表示包括解链分析的PTOCE试验中，相当于靶核酸的延伸二聚物能够在具有不同的Tm值的条件下利用相同种类的报道分子(例如，FAM)来检测多个靶核酸。
【实施例5：微阵列中的包括解链分析的PTOCE试验的评价】
本发明人还对微阵列中的包括解链分析的PTOCE试验进行了实验。在单独的容器中实施了探测和标记寡核苷酸切割，并将上述反应结果物的一部分移到捕捉和模板化寡核苷酸实现固定化的微阵列。在延伸反应之后，借助解链分析来检测延伸二聚物的存在。
具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶利用于上游引物的延伸、探测和标记寡核苷酸切割以及探测和标记寡核苷酸片段的延伸。在试验期间形成的延伸二聚物设计成具有单一标记。延伸二聚物的单一标记的5’-末端借助由作为荧光报道分子的Quasar570标记的探测和标记寡核苷酸提供。探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端由碳间隔区阻断。捕捉和模板化寡核苷酸具有聚(T)5作为连接肽，并利用位于其5’-末端的氨基(AminnoC7)来固定于载玻片的表面。在其5’-末端具有荧光报道分子(Quasar570)的标记探针利用在其3’-末端的氨基来固定于载玻片的表面。
在本实施例中利用的合成模板、上游引物、探测和标记寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸以及标记的序列如下。
NG-T
5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3’(SEQ ID NO:1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’(SEQ ID NO:2)
NG-PTO-5
5’-[Quasar570]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:17)
NG-CTO-S1
5’-[AminoC7]TTTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’(SEQ ID NO:18)
Marker 5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO:19)
(标有下划线的文字指探测和标记寡核苷酸的5’-标记(tagging)部位)
将NSB9NHS载玻片(韩国NSB浦项科技有限公司(NSBPOSTECH，Korea))利用于捕捉和模板化寡核苷酸及标记(SEQ ID NO：18及19)的制备。利用PersonalArrayerTM16微阵列测定点位器(Microarray Spotter，中国博奥生物(CapitalBio，China))来将用NSB测定点位缓冲液(NSB spotting buffer)来溶解成最终浓度为10μM的捕捉和模板化寡核苷酸及标记印刷在NSB9NHS载玻片。使捕捉和模板化寡核苷酸及标记以2×1格式(双重点(duplicatespots))并排测定点位(spotting)，并将由此制备的微阵列放在湿度约为85％的腔室培养了一宿。为了去除以非-特异性结合的捕捉和模板化寡核苷酸及标记，用含有2×SSPE(0.3M的氯化钠(sodium chloride)、0.02M的碳酸氢二钠(sodium hydrogen phosphate)及2.0mM的乙二胺四乙酸(EDTA，Ethylenediaminetetraacetic acid))、pH7.4及7.0mM的十二烷基硫酸钠(SDS，Sodium dodecyl sulfate)的缓冲液溶液，在37℃清洗上述载玻片30分钟，并用蒸馏水清洗。之后，利用载玻片离心分离器来将上述DNA-功能化的(DNA-functionalized)载玻片进行干燥，并保管在4℃温度的暗室内以备后用。
用含有对NG基因的合成模板(SEQ ID NO：1)2pmole、上游引物(SEQ ID NO：2)10pmole、探测和标记寡核苷酸(SEQ ID NO：17)1pmole及2X主混合液(2.5mM MgCl2、200μMdNTPs、4unit的H-Taq DNA聚合酶)((韩国索尔杰恩特公司(Solgent，Korea))25μl的50μl的最终体积来实施切割反应；使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，Bio-Rad)；使上述反应混合物在95℃温度下进行15分钟变性后，在95℃温度下30秒钟、在63℃温度下60秒钟的过程反复了30次。
将作为上述结果物的混合物30μl适用于组装在交联(cross-linked)了捕捉和模板化寡核苷酸(SEQ ID NO：18)的NSB载玻片的表面的腔室。使载玻片以原位(in situ)块方式位于热循环仪(中国基因宝(Genepro B4I，China))。为了解链分析，制备了六个相同的载玻片。在55℃温度下实施了20分钟的延伸反应。之后，使由此制备的载玻片在室温条件下潜伏1分钟。最终，在44℃、52℃、60℃、68℃、76℃或84℃温度下用蒸馏水清洗了各载玻片1分钟。利用共聚焦激光扫描仪Axon GenePix4100A(美国分子器件(molecular Device，US))，以5-μm像素分辨率的扫描来获得图像。利用定量的微阵列分析软件、GenePix pro6.0软件(美国分子器件(molecular Device，US))来分析了荧光强度。在去除周边本底后用点-中央值(spot-medians)来表示荧光强度。为了调查再现性，每按两个，对各点进行了测定点位。用反复的点的平均值来表示了荧光强度。
如图21A及图21B所示，测定从根据不同的清洗温度制备的点的荧光强度来得到解链曲线。从上述解链曲线数据决定了延伸二聚物的存在。
【实施例6：微阵列中的包括实时检测的PTOCE试验的评价】
本发明人对微阵列中的包括指定温度下的实时检测的PTOCE试验进行了实验。
在捕捉和模板化寡核苷酸实现固定化的微阵列中，反复了探测和标记寡核苷酸切割以及探测和标记寡核苷酸片段的延伸。在每次预定的循环中，在指定温度下检测了延伸二聚物的存在。
具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶利用于上游引物的延伸、探测和标记寡核苷酸切割以及探测和标记寡核苷酸片段的延伸。
在试验期间形成的延伸二聚物设计成具有单一标记或相互作用性双重标记。延伸二聚物的单一标记借助由报道分子标记的探测和标记寡核苷酸(报道-标记探测和标记寡核苷酸)提供。延伸二聚物的相互作用性双重标记借助由报道分子及猝灭分子标记的捕捉和模板化寡核苷酸(双重标记捕捉和模板化寡核苷酸)提供。探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端由碳间隔区阻断。
捕捉和模板化寡核苷酸具有聚(T)作为连接肽。捕捉和模板化寡核苷酸利用位于其5’-末端或3’-末端的氨基(AminnoC7)来固定于载玻片。在其5’-末端具有荧光报道分子(Quasar570)的标记探针利用位于其3’-末端的氨基来固定于载玻片。在指定温度下测定了载玻片的荧光强度。在延伸二聚物维持双链形态的范围内决定了检测温度。将对于淋病奈瑟菌(NG)的合成寡核苷酸利用为模板。
【6-1.利用报道-标记探测和标记寡核苷酸的PTOCE试验】
探测和标记寡核苷酸的5’-末端具有Quasar570作为荧光报道分子。捕捉和模板化寡核苷酸通过其5’-末端实现固定化。在本标记方法中，在延伸二聚物维持双链形态的范围内决定了检测温度，上述温度高于非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的Tm值。
在本实施例中利用的合成模板、上游引物、探测和标记寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸以及标记的序列如下。
NG-T
5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’(SEQ ID NO:1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’(SEQ ID NO:2)
NG-PTO-5
5’-[Quasar570]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:17)
NG-CTO-S1
5’-[AminoC7]TTTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’(SEQ ID NO:18)
Marker 5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO:19)
(标有下划线的文字指探测和标记寡核苷酸的5’-标记(tagging)部位)
以在实施例5中利用的方案相同的方案制备了载玻片。
用含有对NG基因的合成模板(SEQ ID NO：1)2pmole、上游引物(SEQ ID NO：2)10pmole、探测和标记寡核苷酸(SEQ ID NO：17)1pmole及2X主混合液(2.5mM MgCl2、200μMdNTPs、2.4unit的H-Taq DNA聚合酶)((韩国索尔杰恩特公司(Solgent，Korea))15μl的30μl的最终体积来实施PTOCE反应；将上述整个混合物适用于组装在交联(cross-linked)了捕捉和模板化寡核苷酸(SEQ ID NO：18)的NSB载玻片的表面的腔室。使载玻片以原位(insitu)块方式位于热循环仪(中国基因宝(Genepro B4I，China))。为了循环分析，制备了五个相同的载玻片。以如下方式实施了PTOCE反应。使上述反应混合物在95℃温度下进行15分钟变性后，在95℃温度下30秒钟、在60℃温度下60秒钟以及在55℃温度下60秒钟的过程实施了0、5、10、20或30循环。在根据各循环数的反应之后，在64℃温度下用蒸馏水清洗了各载玻片1分钟。在分别清洗之后，利用共聚焦激光扫描仪Axon GenePix4100A(美国分子器件(molecular Device，US))，以5-μm像素分辨率的扫描来获得图像。利用定量的微阵列分析软件、GenePix pro6.0软件(美国分子器件(molecular Device，US))来分析了荧光强度。在去除周边本底后用点-中央值(spot-medians)来表示荧光强度。为了调查再现性，每按两个，对各点进行测定点位。用反复的点的平均值来表示了荧光强度。
如图22A及图22B所示，存在模板的情况下，根据循环数来增加对于靶核酸序列的荧光强度(0循环_RFU：1304±0.7；5循环_RFU：18939±1342.1；10循环_RFU：30619±285.0；20循环_RFU：56248±2208.3；以及30循环_RFU：64645±1110.2)。不存在模板的情况下，没有根据循环数的荧光强度的变化。
【6-2.利用双重标记捕捉和模板化寡核苷酸的PTOCE试验】
捕捉和模板化寡核苷酸通过其3’-末端实现固定化，在模板化部位具有猝灭分子(BHQ-2)及荧光报道分子(Quasar570)。
在本实施例中利用的合成模板、上游引物、探测和标记寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸以及标记的序列如下。
NG-T
5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3’(SEQ ID NO:1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’(SEQ ID NO:2)
NG-PTO-6
5’-ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:20)
NG-CTO-S2
5’-[BHQ-2]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(Quasar570)]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGTTTTTTTTTTT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO:21)
Marker 5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO:19)
(标有下划线的文字指探测和标记寡核苷酸的5’-标记(tagging)部位)
以在实施例5中利用的方案相同的方案制备了载玻片。
用含有对NG基因的合成模板(SEQ ID NO：1)2pmole、上游引物(SEQ ID NO：2)10pmole、探测和标记寡核苷酸(SEQ ID NO：20)1pmole及2X主混合液(2.5mM MgCl2、200μMdNTPs、2.4unit的H-Taq DNA聚合酶)((韩国索尔杰恩特公司(Solgent，Korea))15μl的30μl的最终体积来实施PTOCE反应；将上述整个混合物适用于组装在交联(cross-linked)了捕捉和模板化寡核苷酸(SEQ ID NO：21)的NSB载玻片的表面的腔室。使载玻片以原位(insitu)块方式位于热循环仪(中国基因宝(Genepro B4I，China))。为了循环分析，制备了五个相同的载玻片。以如下方式实施PTOCE反应。使上述反应混合物在95℃温度下进行15分钟变性后，在95℃温度下30秒钟、在60℃温度下60秒钟以及在50℃温度下60秒钟的过程实施了0、5、10、20或30循环。在根据各循环数的反应之后，利用共聚焦激光扫描仪AxonGenePix4100A(美国分子器件(molecular Device，US))，以5-μm像素分辨率的扫描来获得图像。利用定量的微阵列分析软件、GenePix pro6.0软件(美国分子器件(molecularDevice，US))来分析了荧光强度。在去除周边本底后用点-中央值(spot-medians)来表示荧光强度。为了调查再现性，每按两个，对各点进行了测定点位。用反复的点的平均值来表示了荧光强度。
如图23A及图23B所示，存在模板的情况下，根据循环数来增加对于靶核酸序列的荧光强度(0循环_RFU：28078±460.3；5循环_RFU：35967±555.1；10循环_RFU：44674±186.0；20循环_RFU：65423±2.1及30循环_RFU：65426±2.8)。不存在模板的情况下，没有根据循环数的荧光强度的变化。
【实施例7：利用微阵列中的包括指定温度下的终点检测的PTOCE试验的多个靶核酸序列的检测】
本发明人利用微阵列中的包括指定温度下的终点检测的PTOCE试验来追加对多个靶检测进行实验。
在单独的容器中利用聚合酶链式反应过程来实施探测和标记寡核苷酸切割，将适当量的上述结果物移到捕捉和模板化寡核苷酸实现固定化的微阵列。在延伸反应之后，借助指定温度下的终点检测来检测延伸二聚物的存在。
具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶利用于上游引物和下游引物的延伸、探测和标记寡核苷酸切割以及探测和标记寡核苷酸片段的延伸。
在试验期间形成的延伸二聚物设计成具有单一标记。延伸二聚物的单一标记的5’-末端借助由作为荧光报道分子的Quasar570标记的探测和标记寡核苷酸提供。探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端由碳间隔区阻断。
捕捉和模板化寡核苷酸具有聚(T)5作为连接肽，并利用位于其5’-末端的氨基(AminnoC7)来固定于载玻片。在其5’-末端具有荧光报道分子(Quasar570)的标记探针利用在其3’-末端的氨基来固定于载玻片。
在指定温度下测定了载玻片的荧光强度。在延伸二聚物维持双链形态的范围内决定检测温度，上述温度高于非切割探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的Tm值。利用了金黄色葡萄球菌(SA)及淋病奈瑟菌(NG)的基因组DNA。
在本实施例中利用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸以及标记的序列如下。
NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’(SEQ ID NO:10)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’(SEQ ID NO:2)
NG-PTO-5
5’-[Quasar570]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:17)
NG-CTO-S1
5’-[AminoC7]TTTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’(SEQ ID NO:18)
SA-F 5’-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAATC-3’(SEQID NO：13)
SA-R2 5’-TTAGCTCCTGCTCCTAAACCA-3’(SEQ ID NO：22)
SA-PTO-2 5’-[Quasar570]AATCCGACCACGCTATGCTCATTCCGTGGTCAATCATTCGGTTTACG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:23)
SA_CTO-S1
5’-[AminoC7]TTTTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCCCCAGCATAGCGTGGTCGGATT[C3Spacer]-3’(SEQ ID NO:24)
Marker 5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO:19)
(标有下划线的文字指探测和标记寡核苷酸的5’-标记(tagging)部位)
以与在实施例5中利用的方案相同的方案制备了载玻片。
用含有各个SA和/或NG的基因组DNA100pg、各个下游引物(SEQ ID NO：10和/或13)10pmole、各个上游引物(SEQ ID NO：2和/或22)10pmole、各个探测和标记寡核苷酸(SEQ IDNO：17和/或23)1pmole及2X主混合液(2.5mM MgCl2，200μM dNTPs，4unit的H-Taq DNA聚合酶)((韩国索尔杰恩特公司(Solgent，Korea))25μl的50μl的最终体积来实施切割反应；使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，Bio-Rad)，使上述反应混合物在95℃温度下进行15分钟变性后，在95℃温度下30秒钟、在63℃温度下60秒钟的过程反复了60次。将作为上述结果物的混合物30μl适用于组装在交联(cross-linked)了捕捉和模板化寡核苷酸(SEQ ID NO：18及24)的NSB载玻片的表面的腔室。使玻片片以原位(in situ)块方式位于热循环仪(中国基因宝(Genepro B4I，China))。在55℃温度下实施20分钟的延伸反应。之后，在64℃温度下用蒸馏水清洗了由此制备的载玻片1分钟。在分别清洗之后，利用共聚焦激光扫描仪Axon GenePix4100A(美国分子器件(molecular Device，US))，以10-μm像素分辨率的扫描来获得图像。利用定量的微阵列分析软件、GenePix pro6.0软件(美国分子器件(molecular Device，US))来分析了荧光强度。在去除周边本底后用点-中央值来表示荧光强度。为了调查再现性，每按两个，对各点进行测定点位。用反复的点的平均值来表示了荧光强度。
如图24所示，存在SA模板的情况下，检测到对于SA的靶信号(RFU：65192±198.7)。存在NG模板的情况下，检测到对于NG的靶信号(RFU：65332±1.4)。SA及NG的模板都存在的情况下，检测到对于SA的靶信号(RFU：65302±0.7)及对于NG(RFU：65302±0.7)的靶信号。
【实施例8：利用PTOCE(Probing and Tagging Oligonucleotide Cleavage &Extension)试验的靶核酸序列的单一核苷酸变异检测】
本发明人评价了是否能够基于利用探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异(PTO forNucleotide Variation)的PTOCE试验区别靶核酸序列的单一核苷酸变异。
探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异切割以及探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异片段的延伸伴随基于聚合酶链式反应过程的靶核酸扩增，借助聚合酶链式反应后的解链分析(解链分析)来检测延伸二聚物的存在。上游引物参与基于具有5’核酸酶活性的酶的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异切割，并且，与基于聚合酶链式反应过程的下游引物一同，参与靶核酸序列的扩增。具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶使用于上游引物及下游引物延伸、探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的切割以及探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异片段的延伸。
探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异及捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端由碳间隔区阻断。将BRAF(V600E)野生型(wild-type)(T)及突变型(mutant-type)(A)人类基因组(human genomic)DNA使用为模板。
探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异不具有标记，在3’-靶向部位的5’-末端一部分的单一核苷酸变异区别位点具有与突变型(A)模板互补的核苷酸。对四种探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异进行了试验，上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异在3’-靶向部位的5’-末端一部分的单一核苷酸变异区别位点的位置存在差异。单一核苷酸变异区别位点分别位于从3’-靶向部位的5’-末端的第一核苷酸(SEQ ID NO：27)、第二核苷酸(SEQ ID NO：28)、第三核苷酸(SEQ ID NO：29)及第四核苷酸(SEQ ID NO：30)。
捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化部位由猝灭分子(BHQ-2)及荧光报道分子(CALFluor Red 610)标记。上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异及捕捉和模板化寡核苷酸的组合如下。(i)SEQ ID NO：27的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异及SEQ ID NO：31的捕捉和模板化寡核苷酸、(ii)SEQ ID NO：28的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异及SEQ ID NO：32的捕捉和模板化寡核苷酸、(iii)SEQ ID NO：29的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异及SEQID NO：31的捕捉和模板化寡核苷酸、(iv)SEQ ID NO：30的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异及SEQ ID NO：33的捕捉和模板化寡核苷酸。
在本实施例中利用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。
BRAF-F
5’-CTTCATAATGCTTGCTCTGATAGGIIIIIGAGATCTACT-3’(SEQ ID NO:25)
BRAF-R
5’-ATAGCCTCAATTCTTACCATCCAIIIIITGGATCCAGA-3’(SEQ ID NO:26)
BRAF-PTO-NV-1
5’-CACAAGGGTGGGTAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:27)
BRAF-PTO-NV-2
5’-CACAAGGGTGGGTGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAG[C3spacer]-3’(SEQ IDNO:28)
BRAF-PTO-NV-3
5’-CACAAGGGTGGGTAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAG[C3spacer]-3’(SEQ IDNO:29)
BRAF-PTO-NV-4
5’-CACAAGGGTGGGTCAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAG[C3spacer]-3’(SEQ IDNO:30)
BRAF-CTO-1 5’-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[T(CAL Fluor Red610)]CTCCGAGTTACCCACCCTTGTG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:31)
BRAF-CTO-2 5’-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[T(CAL Fluor Red610)]GCTGAGTACACCCACCCTTGTG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:32)
BRAF-CTO-3 5’-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[T(CAL Fluor Red610)]CGAGTAGAGACCCACCCTTGTG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:33)
(I：脱氧肌苷(Deoxyinosine))
(标有下划线的文字指探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记(tagging)部位)
(粗体字指核苷酸变异区别位点)
用含有BRAF(V600E)野生(T)或突变(A)型人类基因组DNA10ng、上游引物(SEQ IDNO：25)10pmole、下游引物(SEQ ID NO：26)10pmole、探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异(SEQIDs NO：27、28、29或30)5pmole、捕捉和模板化寡核苷酸(SEQ IDs NO：31、32、31或33)1pmole以及2X主混合液(2.5mM MgCl2，200μM dNTPs，1.6unit的H-Taq DNA聚合酶)((韩国索尔杰恩特公司(Solgent，Korea))10μl的20μl的最终体积来实施反应；使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，Bio-Rad)；使上述反应混合物在95℃温度下进行15分钟变性后，在95℃温度下30秒钟、在55℃温度下60秒钟以及在72℃温度下30秒钟的过程反复了50次。在反应之后，使反应混合物冷却至55℃，并在55℃维持30秒钟后，从55℃慢慢加热至85℃，由此得到解链曲线。在温度上升的过程中，连续测定荧光来监测双链DNA的解离。解链峰来源于解链曲线数据。
如图33A及图33B所示，存在突变型(A)模板的情况下，在所有探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异(SEQ ID NOs：27、28、29、及30)中检测到相当于对于延伸二聚物的预计Tm值的峰。
存在野生型(T)模板的情况下，对SEQ ID NOs：27、28及29的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异没有检测到峰。在SEQ ID NO：30的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异中检测到高度低的峰，但这会与在野生型(T)模板存在的情况下得到的峰区别。
这种结果表示利用探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的PTOCE试验(即，VD-PTOCE试验)能够区别单一核苷酸变异。
【实施例9：基于利用具有非-碱基对部分的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的PTOCE试验的靶核酸序列的单一核苷酸变异检测】
本发明人评价了在探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异中非-碱基对部分的使用是否改善VD-PTOCE试验。
具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶用于上游引物及下游引物延伸、探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的切割以及探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异片段的延伸。
延伸二聚物设计成具有相互作用性双重标记。在延伸二聚物中，相互作用性双重标记借助由报道分子及猝灭分子标记的捕捉和模板化寡核苷酸提供。探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异及捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端由碳间隔区阻断。
将BRAF(V600E)野生型(T)及突变型(A)人类基因组DNA使用为模板。
探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异不具有标记，在3’-靶向部位的5’-末端一部分的单一核苷酸变异区别位点具有与突变型(A)模板互补的核苷酸。单一核苷酸变异区别位点位于从3’-靶向部位的5’-末端一部分的第四核苷酸。
三种探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异分别在从单一核苷酸变异区别位点沿着3’方向的第二核苷酸(SEQ ID NO：34)、第三核苷酸(SEQ ID NO：35)及第四核苷酸(SEQ IDNO：36)具有作为非-碱基对部分的人为错配核苷酸。
捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化部位由猝灭分子(BHQ-2)及荧光报道分子(CALFluor Red610)标记(SEQ ID NO：33)。
为了比较，使用了不具有非-碱基对部分的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异(SEQID NO：30)。
在本实施例中利用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异、捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。
BRAF-F
5’-CTTCATAATGCTTGCTCTGATAGGIIIIIGAGATCTACT-3’(SEQ ID NO:25)
BRAF-R
5’-ATAGCCTCAATTCTTACCATCCAIIIIITGGATCCAGA-3’(SEQ ID NO:26)
BRAF-PTO-NV-4
5’-CACAAGGGTGGGTCAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAG[C3spacer]-3’(SEQ IDNO:30)
BRAF-PTO-NV-5
5’-CACAAGGGTGGGTCAGAGTAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAG[C3spacer]-3’(SEQ IDNO:34)
BRAF-PTO-NV-6
5’-CACAAGGGTGGGTCAGAGATATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAG[C3spacer]-3’(SEQ IDNO:35)
BRAF-PTO-NV-7
5’-CACAAGGGTGGGTCAGAGAATTCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAG[C3spacer]-3’(SEQ IDNO:36)
BRAF-CTO-3 5’-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[T(CAL Fluor Red610)]CGAGTAGAGACCCACCCTTGTG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:33)
(I：脱氧肌苷(Deoxyinosine))
(标有下划线的文字指探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记(tagging)部位)
(粗体字指核苷酸变异区别位点)
(框内文字指起到非-碱基对部分功能的人为错配核苷酸)
用含有BRAF(V600E)野生(T)或突变(A)型人类基因组DNA10ng、上游引物(SEQ IDNO：25)10pmole、下游引物(SEQ ID NO：26)10pmole、探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异(SEQIDs NO：30、34、35或36)5pmole、捕捉和模板化寡核苷酸(SEQ IDs NO：33)1pmole以及2X主混合液(2.5mM MgCl2，200μM dNTPs，1.6unit的H-Taq DNA聚合酶)((韩国索尔杰恩特公司(Solgent，Korea))10μl的20μl的最终体积来实施反应；使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，Bio-Rad)；使上述反应混合物在95℃温度下进行15分钟变性后，在95℃温度下30秒钟、在55℃温度下60秒钟以及在72℃温度下30秒钟的过程反复了50次。在反应之后，使反应混合物冷却至55℃，并在55℃维持30秒钟后，从55℃慢慢加热至85℃，由此得到解链曲线。在温度上升的过程中，连续测定荧光来监测双链DNA的解离。解链峰来源于解链曲线数据。
如图34A及图34B所示，检测到相当于对于延伸二聚物的预计Tm值的峰，存在突变型(A)的情况下，与非-碱基对部分的位置及存在无关地，上述峰在所有探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异(SEQ ID NOs：30、34、35及36)中表现相似的高度。
存在野生型(T)模板的情况下检测到峰，但是具有非-碱基对部分的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异(SEQ ID NOs：34、35及36)的峰与不具有非-碱基对部分的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异(SEQ ID NO：30)的高度相比减少。不存在模板的情况下，没有检测到峰。
这种结果表示非-碱基对部分的使用提高了探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的区别能力。
【实施例10：利用探测和标记寡核苷酸的上游寡核苷酸-独立性切割的PTOCE试验的评价】
还利用PTOCE试验来评价了是否不使用上游寡核苷酸也能(i)在指定温度下以实时检测或(ii)解链分析方式检测靶核酸序列。
具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶用于探测和标记寡核苷酸切割以及探测和标记寡核苷酸片段的延伸。
在试验期间生成的延伸二聚物设计成具有相互作用性双重标记。探测和标记寡核苷酸不具有标记。捕捉和模板化寡核苷酸在其模板化部位具有猝灭分子(BHQ-1)及荧光报道分子(FAM)。探测和标记寡核苷酸以及捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端由碳间隔区阻断。对于淋病奈瑟菌(NG)基因的合成寡核苷酸使用为靶模板。
在本实施例中利用的合成模板、探测和标记寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下。
NG-T
5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3’(SEQ ID NO:1)
NG-PTO-1
5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:3)
NG-CTO-1
5’-[BHQ-1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’(SEQ ID NO:4)
(标有下划线的文字指探测和标记寡核苷酸的5’-标记(tagging)部位)
【10-1.指定温度下的实时检测】
用含有对2pmole的NG基因的合成模板(SEQ ID NO：1)、5pmole的探测和标记寡核苷酸(SEQ ID NO：3)、2pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(SEQ ID NO：4)及2X主混合液(2.5mMMgCl2，200μM dNTPs，1.6unit的H-Taq DNA聚合酶)((韩国索尔杰恩特公司(Solgent，Korea))10μl的20μl的最终体积来实施反应；使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，Bio-Rad)；使上述反应混合物在95℃温度下进行15分钟变性后，在95℃温度下30秒钟、在60℃温度下60秒钟的过程反复了30次。每次循环，在60℃温度下检测所产生的信号。在延伸二聚物可维持双链形态的范围决定了检测温度。
如图35A所示，存在模板的情况下，检测到荧光信号(Ct 1.15)。不存在模板的情况下，没有检测到信号。
【10-2.解链分析】
在实施例10-1的反应之后，使反应混合物冷却至55℃，并在55℃维持30秒钟后，从55℃慢慢加热至90℃，由此得到解链曲线。在温度上升的过程中，连续测定荧光来监测双链DNA的解离。解链峰来源于解链曲线数据。
如图35B所示，存在模板的情况下，在相当于延伸二聚物的预计Tm值的76.0℃检测到峰。不存在模板的情况下，没有观察到峰。
以上，详细记述了优选一实例，能够进行根据本发明的原理的变形及修改，且本发明的范围根据所附的发明要求保护范围及与其等同的技术方案来定义，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

Claims (39)

1.一种利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验来从靶核酸序列检测核苷酸变异的方法，其包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游引物以及探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异进行杂交；
上述上游引物包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；
上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异包含：
(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，
(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，以及
(iii)核苷酸变异区别位点，包含与上述靶核酸上的核苷酸变异互补的序列，并位于上述3’-靶向部位的5’-末端一部分，其中所述核苷酸变异区别位点位于离上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端10个核苷酸以内的位置；
上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；
上述上游引物位于上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的上游；
上述上游引物的延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异切割；
步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶相接触；若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述核苷酸变异区别位点互补的核苷酸变异的上述靶核酸序列进行杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分与上述靶核酸序列形成双链，从第一初期切割位置诱导切割，则放出第一片段；若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述核苷酸变异区别位点非互补的核苷酸变异的靶核酸序列进行杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分不与上述靶核酸序列形成双链，而从位于上述第一初期切割位置的下游的第二初期切割位置诱导切割，则放出第二片段；上述第二片段包含追加的3’-末端部位，用于使上述第二片段与上述第一片段不同；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交；
上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：
(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及
(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；
从上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异放出的上述第一片段或上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用模板-依赖性核酸聚合酶及上述步骤(c)的结果物来实施延伸反应；若上述第一片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则上述第一片段被延伸，来生成包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸序列的延伸链，若上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则上述第二片段不被延伸；以及
步骤(e)，检测上述延伸链的存在，上述延伸链的存在表示与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的核苷酸区别位点互补的核苷酸变异的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位进行杂交的情况下，上述捕捉和模板化寡核苷酸不与上述第二片段的上述追加的3’-末端部位进行杂交，上述捕捉和模板化寡核苷酸具有为了防止上述第二片段的延伸而被选择的序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端一部分包含位于离上述核苷酸变异区别位点1至5个核苷酸以内的位置的非-碱基对部分，上述非-碱基对部分增加上述第一初期切割位置及上述第二初期切割位置之间的差异。
4.根据权利要求3所述的方法，其中上述非-碱基对部分扩大上述第一初期切割位置及上述第二初期切割位置之间的距离。
5.根据权利要求3所述的方法，其中上述非-碱基对部分是以下内容：
(i)包含人为错配碱基、变形为无法碱基配对的非-碱基对碱基或通用碱基的核苷酸，或
(ii)变形为无法碱基配对的非-碱基对核苷酸。
6.根据权利要求3所述的方法，其中上述非-碱基对部分是非-碱基配对化合物。
7.根据权利要求3所述的方法，其中上述非-碱基对部分具有1至5个部分。
8.根据权利要求7所述的方法，其中上述非-碱基对部分具有2至5个连续的部分。
9.根据权利要求3所述的方法，其中上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的核苷酸变异区别位点及非-碱基对部分位于离上述3’-靶向部位的5’-末端10个核苷酸以内的位置。
10.根据权利要求9所述的方法，其中上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的核苷酸变异区别位点及非-碱基对部分位于离上述3’-靶向部位的5’-末端7个核苷酸以内的位置。
11.根据权利要求9所述的方法，其中上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的核苷酸变异区别位点及非-碱基对部分位于离上述3’-靶向部位的5’-末端5个核苷酸以内的位置。
12.根据权利要求1所述的方法，其中上述核苷酸变异为置换变异、缺失变异或插入变异。
13.根据权利要求1所述的方法，其中
上述第一片段和上述捕捉和模板化寡核苷酸的延伸链在上述步骤(d)中形成延伸二聚物；
上述延伸二聚物具有能够基于如下序列和/或长度而调节的Tm值：
(i)上述第一片段的序列和/或长度，
(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度或
(iii)上述第一片段的序列和/或长度及上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度；
上述延伸二聚物提供基于如下标记的靶信号：
(i)与上述第一片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的最少1个标记，
(ii)在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记，
(iii)与上述第一片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的最少1个标记及在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记，或
(iv)嵌入标记；
根据对于上述延伸二聚物的解链分析或杂交分析，从上述延伸二聚物测定上述靶信号，来检测上述延伸链的存在。
14.根据权利要求1所述的方法，其中
上述第一片段和上述捕捉和模板化寡核苷酸的上述延伸链在上述步骤(d)形成延伸二聚物；
上述延伸二聚物具有能够基于如下序列和/或长度而调节的Tm值：
(i)上述第一片段的序列和/或长度，
(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度，或
(iii)上述第一片段的序列和/或长度和上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度；
上述延伸二聚物提供基于如下标记的靶信号：
(i)与上述第一片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的最少1个标记，
(ii)在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记，
(iii)与上述第一片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的最少1个标记及在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记，或(iv)嵌入标记；
在上述延伸二聚物维持双链的指定温度下，从上述延伸二聚物测定靶信号，来检测上述延伸链的存在。
15.根据权利要求1所述的方法，其中上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异和/或捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端被阻断，用于防止延伸。
16.根据权利要求1所述的方法，其中上述方法在反复循环之间包括变性过程，来反复实施步骤(a)～步骤(e)的全部或一部分。
17.根据权利要求1所述的方法，其中上述方法用于检测最少2种核苷酸变异，上述上游引物包含最少2种上游引物，上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异包含最少2种探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异。
18.根据权利要求1所述的方法，其中具有上述5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶为具有5’核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中上述方法在下游引物的存在下实施。
20.一种利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验来从靶核酸序列检测核苷酸变异的方法，其包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异进行杂交；上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，以及(iii)核苷酸变异区别位点，包含与上述靶核酸上的核苷酸变异互补的序列，并位于上述3’-靶向部位的5’-末端一部分，其中所述核苷酸变异区别位点位于离上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端10个核苷酸以内的位置；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；
步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶相接触；若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述核苷酸变异区别位点互补的核苷酸变异的上述靶核酸序列进行杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分与上述靶核酸序列形成双链，从第一初期切割位置诱导切割，则放出第一片段；若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述核苷酸变异区别位点非互补的核苷酸变异的靶核酸序列进行杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分不与上述靶核酸序列形成双链，而从位于上述第一初期切割位置的下游的第二初期切割位置诱导切割，则放出第二片段；上述第二片段包含追加的3’-末端部位，用于使上述第二片段与上述第一片段不同；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交；上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异放出的上述第一片段或上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用模板-依赖性核酸聚合酶及上述步骤(c)的结果物来实施延伸反应；若上述第一片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则上述第一片段被延伸，来生成包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸序列的延伸链，若上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则上述第二片段不被延伸；以及
步骤(e)，检测上述延伸链的存在，上述延伸链的存在表示与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的核苷酸区别位点互补的核苷酸变异的存在。
21.用于实施权利要求1～19之任一项的方法的一种利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验来从靶核酸序列检测核苷酸变异的试剂盒，其包含：
(a)探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异，上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，以及(iii)核苷酸变异区别位点，包含与上述靶核酸上的核苷酸变异互补的序列，并位于上述3’-靶向部位的5’-末端一部分，其中所述核苷酸变异区别位点位于离上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端10个核苷酸以内的位置；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交，
(b)上游引物，上述上游引物包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，上述上游引物位于上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的上游，上述上游引物的延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的切割，以及
(c)捕捉和模板化寡核苷酸，上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；
若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述变异区别位点互补的核苷酸变异的上述靶核酸序列进行杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分与上述靶核酸序列形成双链，从第一初期切割位置诱导切割，则放出第一片段；
若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列进行杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分不与上述靶核酸序列形成双链，从位于上述第一初期切割位置的下游的第二初期切割位置诱导切割，则放出第二片段；
上述第二片段包含追加的3’-末端部位，用于使上述第二片段与上述第一片段不同；从上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异放出的上述第一片段或上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位进行杂交。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其中上述试剂盒还包含具有5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶，若上述第一片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则被延伸并形成包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸序列的延伸链，若上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则不被延伸。
23.根据权利要求21所述的试剂盒，其中上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位进行杂交的情况下，上述捕捉和模板化寡核苷酸不与上述第二片段的上述追加的3’-末端部位进行杂交，上述捕捉和模板化寡核苷酸具有为了防止上述第二片段的延伸而被选择的序列。
24.根据权利要求21所述的试剂盒，其中上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端一部分包含位于离上述核苷酸变异区别位点1至5个核苷酸以内的位置的非-碱基对部分，上述非-碱基对部分增加上述第一初期切割位置及上述第二初期切割位置之间的差异。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中上述非-碱基对部分扩大上述第一初期切割位置及上述第二初期切割位置之间的距离。
26.根据权利要求24所述的试剂盒，其中上述非-碱基对部分是以下内容：
(i)包含人为错配碱基、变形为无法碱基配对的非-碱基对碱基或通用碱基的核苷酸，或
(ii)变形为无法碱基配对的非-碱基对核苷酸。
27.根据权利要求24所述的试剂盒，其中上述非-碱基对部分是非-碱基配对化合物。
28.根据权利要求24所述的试剂盒，其中上述非-碱基对部分具有1至5个部分。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中上述非-碱基对部分具有2至5个连续的部分。
30.根据权利要求24所述的试剂盒，其中上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的核苷酸变异区别位点及非-碱基对部分位于离上述3’-靶向部位的5’-末端10个核苷酸以内的位置。
31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的核苷酸变异区别位点及非-碱基对部分位于离上述3’-靶向部位的5’-末端7个核苷酸以内的位置。
32.根据权利要求30所述的试剂盒，其中上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的核苷酸变异区别位点及非-碱基对部分位于离上述3’-靶向部位的5’-末端5个核苷酸以内的位置。
33.根据权利要求21所述的试剂盒，其中上述核苷酸变异为置换变异、缺失变异或插入变异。
34.根据权利要求21所述的试剂盒，其中
上述第一片段和上述捕捉和模板化寡核苷酸的延伸链形成延伸二聚物；
上述延伸二聚物具有能够基于如下序列和/或长度而调节的Tm值：
(i)上述第一片段的序列和/或长度，
(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度，或
(iii)上述第一片段的序列和/或长度及上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度；
上述延伸二聚物提供基于如下标记的靶信号：
(i)与上述第一片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的最少1个标记，
(ii)在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记，
(iii)与上述第一片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的最少1个标记及在上述延伸反应期间向上述延伸二聚物内插入的标记，或
(iv)嵌入标记。
35.根据权利要求21所述的试剂盒，其中上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异和/或捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端被阻断，用于防止延伸。
36.根据权利要求21所述的试剂盒，其中上述试剂盒用于检测最少2种核苷酸变异，上述上游引物包含最少2种上游引物，上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异包含最少2种探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异。
37.根据权利要求22所述的试剂盒，其中上述具有5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶为具有5’核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶。
38.根据权利要求21至37中任一项所述的利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸来从靶核酸序列检测核苷酸变异的试剂盒，其中上述试剂盒还包含下游引物。
39.用于实施权利要求20的方法的一种利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验来从靶核酸序列检测核苷酸变异的试剂盒，其包含：
(a)探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异，上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，以及(iii)核苷酸变异区别位点，包含与上述靶核酸上的核苷酸变异互补的序列，并位于上述3’-靶向部位的5’-末端一部分，其中所述核苷酸变异区别位点位于离上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端10个核苷酸以内的位置；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交，以及
(b)捕捉和模板化寡核苷酸，上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；
若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述变异区别位点互补的核苷酸变异的上述靶核酸序列进行杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分与上述靶核酸序列形成双链，从第一初期切割位置诱导切割，则放出第一片段；
若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列进行杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分不与上述靶核酸序列形成双链，从位于上述第一初期切割位置的下游的第二初期切割位置诱导切割，则放出第二片段；
上述第二片段包含追加的3’-末端部位，用于使上述第二片段与上述第一片段不同；从上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异放出的上述第一片段或上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位进行杂交。
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