KR101778771B1 - Snp 유전자형을 결정하는 방법 - Google Patents

Snp 유전자형을 결정하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단일 뉴클레오타이드 변이에 대한 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide for Single Nucleotide Variation; PTO-SNV)를 이용하여 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 유전자형을 결정하는 신규한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 SNP 유전자형 분석 반응에서 오직 하나의 대립 유전자-특이적 올리고뉴클레오타이드만으로, 분석되는 타겟 핵산 서열이 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 동형접합인지 또는 이형접합인지, 또는 관심 있는 SNP 대립 유전자가 존재하지 않는지를 결정할 수 있는 SNP 유전자형 분석을 위한 신규한 프로토콜을 제공한다.

Description

SNP 유전자형을 결정하는 방법{METHOD FOR DETERMINING SNP GENOTYPE}
본 발명은 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 유전자형을 결정하는 방법에 관한 것이다.
DNA 혼성화(hybridization)는 분자 생물학의 기본적인 과정이며, 이온 강도, 염기 조성, 감소된 핵산 단편의 길이, 미스매칭 정도 및 변성화제의 존재에 의해 영향을 받는다. DNA 혼성화-기반 기술은 특정 핵산 서열 결정에 매우 유용한 도구가 될 것이며, 임상 진단, 유전자 연구 및 법의학적인 실험 분석에 명확하게 도움이 될 것이다.
그러나, 혼성화에만 주로 의존하는 종래 방법 및 과정에서는 프로브와 비-타겟 서열 간의 비-특이적인 혼성화로 인한 위양성 결과가 발생할 가능성이 높다. 따라서, 종래 방법 및 과정은 신뢰도를 개선하여야 하는 문제점이 남아있다.
프로브 혼성화 과정 이외에도 추가적으로 효소 반응을 이용한 몇몇 접근법들, 예컨대, TaqManTM 프로브 방법이 제시되었다.
TaqManTM 프로브 방법에서, 타겟 핵산 서열에 혼성화된 표지 프로브는 업스트림 프라이머-의존적 DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의하여 절단되어, 타겟 서열의 존재를 나타내는 시그널을 발생시킨다(미국 특허 제5,210,015호, 제5,538,848호 및 제6,326,145호). TaqManTM 프로브 방법은 시그널 발생을 위한 두 가지 접근법을 제시한다: 중합-의존적 절단(polymerization-dependent cleavage) 및 중합-독립적 절단(polymerization-independent cleavage). 중합-의존적 절단에서, 업스트림 프라이머의 연장은 반드시 핵산 중합효소가 표지 프로브의 5’-말단에 접촉하기 전에 발생되어야 한다. 연장반응이 진행되면서, 중합효소는 표지 프로브의 5’-말단을 점점 절단한다. 중합-독립적 절단에서, 업스트림 프라이머 및 표지 프로브는 매우 근접하여 타겟 핵산 서열에 혼성화되고, 업스트림 프라이머의 3’-말단과 핵산 중합효소의 결합은 상기 핵산 중합효소를 표지 프로브의 5’-말단에 접촉시켜 표지를 방출한다. 또한, TaqManTM 프로브 방법은, 그의 5’-말단에 타겟 서열과 혼성화되지 않는 5’-테일 영역을 갖는 표지 프로브가 절단되어 5’-테일 영역을 포함하는 단편이 형성되는 것을 개시하고 있다.
타겟 서열에 비-상보적인 5’-테일 영역을 갖는 프로브가 5’뉴클레아제에 의하여 절단되어 5’-테일 영역을 포함하는 단편이 방출되는 몇 가지 방법들이 보고되었다.
예를 들어, 미국 특허 제5,691,142호는 DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의하여 절단되는 절단구조를 개시하고 있다. 템플레이트(template)에 비-상보적인 5’부위 및 템플레이트에 상보적인 3’부위를 포함하는 올리고뉴클레오타이드가 템플레이트에 혼성화되고, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 매우 근접하여 템플레이트에 혼성화되는 절단구조가 예시되어 있다. 상기 절단구조는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 감소된 합성 활성을 갖는 변형 DNA 중합효소에 의하여 절단되어 템플레이트에 비-상보적인 5’부위가 방출된다. 그 후 상기 방출된 5’부위는 헤어핀 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드에 혼성화되어 절단구조를 형성하고, 이에 의해 점진적인 절단반응이 유도되어 타겟 서열이 검출된다.
미국 특허 제7,381,532호는, 3’-말단이 블록킹된 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 갖는 절단구조가 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제에 의하여 절단되어 비-상보적인 5’플랩(flap) 영역이 방출되고, 상기 방출된 5’플랩 영역이 크기 분석 또는 상호작용적 이중 표지에 의하여 검출되는 과정을 개시하고 있다. 미국 특허 제6,893,819호는, 검출가능한 방출된 플랩이 핵산 합성 의존적인, 플랩-매개 연속적 증폭 방법에 의하여 생성됨을 개시하고 있다. 이 방법에서는, 제1절단구조로부터 방출된 플랩이 핵산 합성 의존적인 방식으로 제2절단구조를 절단하여 제2절단구조로부터 플랩을 방출시키고, 상기 방출된 플랩이 검출된다. 미국 특허 제7,309,573호는 핵산 합성에 의해 생성된 방출된 플랩의 형성, 방출된 플랩의 연장, 플랩 연장 동안 올리고뉴클레오타이드의 절단 및 올리고뉴클레오타이드 절단에 의해 생성된 시그널 검출을 포함하는 방법을 개시하고 있다.
액상에서의 형광-표지 프로브의 혼성화에 의하여, 한 종류의 형광 표지를 이용하는 경우에도 멜팅 커브 분석에 의하여 다수의 타겟 핵산 서열을 동시적으로 검출할 수 있다. 그러나, 상호작용적-이중 표지 프로브의 5’뉴클레아제-매개 절단에 의하여 타겟 서열을 검출하는 종래 기술은, 멀티플렉스 타겟 검출에서 서로 상이한 타겟 서열에 대하여 서로 상이한 종류의 형광 표지를 필요로 하며, 이러한 형광 표지 종류 수의 한계 때문에 검출되는 타겟 서열의 수는 제한된다.
미국 출원 공개 제2008-0241838호는 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 5’부위를 갖는 프로브의 절단 및 캡처(capture) 프로브의 혼성화를 이용한 타겟 검출 방법을 개시하고 있다. 표지는 비-상보적인 5’부위에 위치한다. 타겟 서열에 혼성화된 표지 프로브는 절단되어 단편을 방출하며, 이후 상기 단편은 캡처 프로브에 혼성화되어 타겟 서열의 존재가 검출된다. 이 방법에서, 비절단된/온전한(uncleaved/intact) 프로브는 캡처 프로브에 혼성화되지 않는 것이 필수적이다. 이를 위해서는, 짧은 길이를 갖는 캡처 프로브가 고상 기질 상에 고정화되어야 한다. 그러나, 이러한 제한은 고상 기질에서의 혼성화의 효율을 낮추고, 또한 반응 조건의 최적화도 어렵게 한다.
따라서, 보다 편리하고, 신뢰성 및 재현성이 있는 방식으로, 혼성화뿐만 아니라 5’ 핵산절단반응(5’ nucleolytic reaction)과 같은 효소 반응에 의하여 액상 및 고상에서 타겟 서열, 바람직하게는 복수의 타겟 서열을 검출하기 위한 신규한 접근법에 대한 개발 요구가 대두되고 있다. 또한, 당업계에서 표지(특히, 형광 표지) 종류의 수에 제한받지 않는 신규한 타겟 검출 방법이 요구되고 있다.
한편, 뉴클레오타이드 변이는 연구 및 임상 영역에서 중요하다. 이 가운데 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP)은 인간 지놈에서 가장 흔히 발견되며, 질병-관련 유전자좌(loci) 및 약물유전학(pharmacogenetics)에 대한 마커로서 역할을 한다(Landegren 등, 1998; Roses, 2000). SNP는 인간 지놈에서 1,000 bp 당 약 1개의 비율로 발견되며, 이들의 총 숫자는 약 300만개로 추정된다. SNP, 결실, 삽입 및 전좌(translocation)와 같은 뉴클레오타이드 변이를 검출하기 위한 다양한 대립유전자 구별 기술이 보고되고 있다.
대립 유전자-특이적 TaqMan 프로브는 PCR의 연장 단계에서 완벽하게 매칭되는 타겟 서열에만 혼성화되도록 디자인된다. TaqMan 프로브는 리포터 분자 및 상기 리포터 분자로부터의 형광 시그널을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자를 갖는다. 타겟 서열과 혼성화된 TaqMan 프로브는 Taq DNA 중합효소의 5’뉴클레아제 활성에 의해 절단되며, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 분리되어 타겟 시그널을 생성한다. 대립 유전자 구별을 위해 좁은 홈 결합물질(minor groove binder; MGB)과 결합된 13-20 머의 프로브가 사용된다(Livak, 등, Genet. Anal. 14:143-149(1999)). TaqMan 프로브를 이용한 대립 유전자 구별 방법은 혼성화 반응뿐만 아니라 5’ 뉴클레아제 활성의 효소 반응을 이용하기 때문에 특이성이 증가된다. 그러나 상기 방법은 대립 유전자-특이적 프로브 디자인의 어려움과 하나의 미스매치에 의한 차이를 구별할 수 있는 반응 조건의 최적화의 어려움과 같은 심각한 문제점을 가지고 있다. 추가로, MGB와의 결합은 대립 유전자-특이적 TaqMan 프로브에 대한 문제해결 방법 중 하나이다.
SNP를 보유한 핵산 분자를 포함하는 임상 샘플에 대한 SNP 유전자형 분석( genotyping)에서는 대립 유전자에 대해 각각 특이적인 2개의 프로브를 이용하여 개별적으로 2개의 검출반응에서 유전자형 분석을 실시하는 것이 일반적이다(Kostrikis 등, Science (1998) 279: 1228-1229). 그러므로, 각 대립 유전자의 개별적인 검출을 위해서는 2가지 유형의 프로브가 필요하다는 제한이 있다. 또 다른 방법으로서, 대립 유전자에 상이한 Tm 값으로 혼성화되는 한 유형의 프로브를 사용하는 멜팅 피크 분석이 이용되었는데, 이는 유전자형 분석을 위한 상이한 멜팅 피크 패턴을 나타낸다(Frenchet. 등, Molecular and Cellular Probes (2001) 15: 363374). 상기 멜팅 피크 분석은 한 유형의 프로브를 이용한다는 점에서 장점이 있지만, 복수의 SNP에 해당하는 서로 다른 Tm 값을 갖는 멜팅 피크가 생성되기 때문에, 복수의 SNP의 멀티플렉스 검출에는 적용가능성이 낮다.
그러므로, 종래 기술의 단점을 극복하면서 더욱 편리하고 신뢰성 및 재현성이 있는 방식으로, SNP 유전자형을 결정할 수 있는 신규한 접근법에 대한 개발 요구가 당업계에서 계속되고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허들 및 문헌들이 참조되고 그 인용이 괄호로 표시되어 있다. 본 발명 및 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준을 보다 명확하게 설명하기 위하여 이러한 특허들 및 문헌들의 공개는 그 전체로서 본 명세서에 참조로 포함되어 있다.
본 발명자들은 오직 하나의 대립 유전자-특이적 올리고뉴클레오타이드만을 이용하여, 예컨대, SNP 사이트에서 발견되는 SNP 뉴클레오타이드 중 한 유형만을 검출하기 위한 하나의 대립 유전자-특이적 프로브만을 이용하여 SNP 유전자형을 분석하는 신규한 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 SNP 유전자형 분석 반응에서 오직 하나의 대립 유전자-특이적 올리고뉴클레오타이드만으로, 분석되는 타겟 핵산 서열이 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 동형접합(homozygous)인지 또는 이형접합(heterozygous)인지, 또는 관심 있는 SNP 대립 유전자가 존재하지 않는지를 결정할 수 있는 SNP 유전자형 분석을 위한 신규한 프로토콜을 정립하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 유전자형을 결정하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 유전자형을 결정하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 유전자형을 결정하는 방법을 제공한다:
(a) SNP를 포함하는 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 단일 뉴클레오타이드 변이에 대한 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide for Single Nucleotide Variation; PTO-SNV)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 상기 PTO-SNV는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위, (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위, 및 (iii) 상기 타겟 핵산 서열 상의 관심 있는 SNP 대립 유전자의 SNP 사이트에 존재하는 SNP 뉴클레오타이드에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치하는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트(single nucleotide variation discrimination site)를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 프라이머는 상기 PTO-SNV의 업스트림에 위치하며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO-SNV의 절단을 유도하며;
(b) 상기 PTO-SNV의 절단을 위한 조건하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 PTO-SNV가 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 관심 있는 SNP 대립 유전자에 혼성화되면, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 상기 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성하여 제1초기 절단 사이트로부터 절단을 유도하고, 제1단편이 방출되며; 상기 PTO-SNV가 관심 있는 SNP 대립 유전자와는 상이하고 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 SNP 대립 유전자에 혼성화되면, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 상기 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성하지 않아 상기 제1초기 절단 사이트의 다운스트림에 위치하는 제2초기 절단 사이트로부터 절단을 유도하고, 제2단편이 방출되며; 상기 제2단편은 추가적인 3’-말단 부위를 포함하고, 이는 상기 제2단편이 상기 제1단편과 다르도록 하며;
(c) 상기 PTO-SNV로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide; CTO)를 혼성화시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’순서로 (i) 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO-SNV로부터 방출된 상기 제1단편 또는 상기 제2단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 제1단편이 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되면, 상기 제1단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 형성하고; 상기 제2단편이 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되면, 상기 제2단편은 연장되지 않으며;
(e) 상기 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 동형접합(homogygous)인 타겟 핵산 서열은 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 이형접합(heterozygous)인 타겟 핵산 서열보다 더 높은 강도의 시그널을 나타내고, 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자를 갖지 않는 타겟 핵산 서열은 시그널을 제공하지 않으며;
(f) 상기 단계 (e)에서 검출된 시그널의 강도에 의해 타겟 핵산 서열내의 SNP 유전자형을 결정하는 단계.
본 발명자들은 오직 하나의 대립 유전자-특이적 올리고뉴클레오타이드만을 이용하여, 예컨대, SNP 사이트에서 발견되는 SNP 뉴클레오타이드 중 한 유형만을 검출하기 위한 하나의 대립 유전자-특이적 프로브만을 이용하여 SNP 유전자형을 분석하는 신규한 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 SNP 유전자형 분석 반응에서 오직 하나의 대립 유전자-특이적 올리고뉴클레오타이드만으로, 분석되는 타겟 핵산 서열이 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 동형접합인지 또는 이형접합인지, 또는 관심 있는 SNP 대립 유전자가 존재하지 않는지를 결정할 수 있는 SNP 유전자형 분석을 위한 신규한 프로토콜을 정립하였다. SNP 사이트에서 2개의 SNP 뉴클레오타이드가 발견된 경우, 본 발명의 방법은 오직 하나의 대립 유전자-특이적 올리고뉴클레오타이드, 즉, SNP 유전자형 분석 반응에서 오직 하나의 대립 유전자-특이적 PTO-SNV를 이용하여 3개의 SNP 유전자형을 모두 결정할 수 있게 해주며, 이는 본 발명 이전에는 아직까지 달성된 적이 없다. 이러한 기술적 특징은 SNP 유전자형 분석, 특히 멀티플렉스 SNP 유전자형 분석을 더 편리하게 해준다.
지금까지 보고된 종래의 기술들에 따르면, 서로 다른 SNP 대립 유전자는 서로 다른 대립 유전자-특이적 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 검출하는 것이 일반 상식이다. 만약 오직 하나의 대립 유전자-특이적 올리고뉴클레오타이드만을 이용하여 서로 다른 SNP 대립 유전자를 검출할 수 있다면, 편리성 및 멀티플렉스 검출면에서 SNP 유전자형 분석은 대단한 진보를 하는 것이다. 본 발명은 일반 상식을 깨고 훨씬 더 편리하고 고처리(high-throughput) 방식의 신규한 SNP 유전자형 분석 방법을 제공한다.
더욱이, SNP의 맞은편 서열에 인접한 프로브 서열이 프로브 혼성화에 지대한 영향을 미친다는 것은 당업자에게 알려져 있다. 종래의 프로브는 일반적으로 중간 부위에 SNP의 맞은편 서열을 가지고 있다. 이와 관련하여, 종래의 프로브는 혼성화에 관련된 SNP 주위의 주변부 서열(surrounding sequence)을 선택할 수 없었다. 종래의 기술들은 SNP의 주변부 서열로 인한 심각한 제한을 갖는다.
이와 달리, 본 발명에서는, SNP의 맞은편의 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트(nucleotide variation discrimination site)가 프로브의 혼성화-관련 부위의 5’-말단 일부에 위치하며, 이로 인해 SNP 5’-인접 서열에 대한 프로브의 서열을 조절할 수 있게 된다. 본 발명에서는 혼성화에 대한 SNP 주위의의 주변부 서열의 영향을 정확하게 조절할 수 있기 때문에, SNP 주위의 주변부 서열의 영향으로 인해 종래의 기술로는 검출이 안 되거나 거의 불가능했던 SNP를 분석할 수 있게 된다.
본 발명은 PTO-SNV 혼성화; PTO-SNV의 절단 및 연장; 뉴클레오타이드 변이-의존적 연장가닥의 형성; 연장가닥의 검출; 및 SNP 유전자형의 결정이 잇따르는 연속적인 단계들을 이용한다.
단계 (a): 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO-SNV와 타겟 핵산 서열과의 혼성화
본 발명에 따르면, SNP를 포함하는 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 단일 뉴클레오타이드 변이를 위한 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide for Single Nucleotide Variation; PTO-SNV)와 혼성화시킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “타겟 핵산”, “타겟 핵산 서열” 또는 “타겟 서열”은 검출하고자 하는 핵산 서열을 의미하며, 이는 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건하에서 프로브 또는 프라이머와 어닐링 또는 혼성화된다.
SNP 유전자형 분석을 위한 본 발명의 방법에서, 타겟 핵산 서열은 최소 하나의 SNP 사이트를 포함한다. 타겟 핵산 서열은 SNP 사이트에서의 뉴클레오타이드 유형에 따라 야생형 대립 유전자 또는 돌연변이 대립 유전자로 결정된다. 분석되는 이배체 생물 (diploid organism)의 샘플에서, 샘플 내의 SNP를 포함하는 타겟 핵산 서열의 조합은 다음의 유전자형 중 어느 하나일 수 있다: 야생형 동형접합체, 이형접합체 및 돌연변이 동형접합체.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프로브(probe)"는 타겟 핵산 서열에 실질적으로 상보적인 부위 또는 부위들을 포함하는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머(primer)”는 핵산 가닥(템플레이트)에 상보적인 프라이머 연장산물의 합성이 유도되는 조건하에서, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재시, 그리고 적합한 온도와 pH에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
바람직하게는, 프로브 및 프라이머는 단일-가닥 데옥시리보뉴클레오타이드 분자이다. 본 발명에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프로브 또는 프라이머는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재하에서 연장산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 정확한 길이는 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)를 포함한 많은 인자에 따라 달라질 것이다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 템플레이트 핵산에 올리고데옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 템플레이트 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “혼성화(hybridization)”는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 완전히 매칭되거나 일부 미스매치로 실질적으로 매칭되는 2개의 핵산 가닥 사이에서 일어날 수 있다. 혼성화를 위한 상보성은 혼성화 조건, 특히 온도에 따라 달라질 수 있다.
타겟 핵산 서열과 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO-SNV와의 혼성화는 최적화 절차에 의하여 일반적으로 결정되는 적합한 혼성화 조건하에서 실시될 수 있다. 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 횟수, 버퍼 성분, 및 이들의 pH 및 이온세기와 같은 조건은 올리고뉴클레오타이드(업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO-SNV)의 길이와 GC 함량 및 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 상대적으로 짧은 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 경우, 낮은 엄격조건을 선택하는 것이 바람직하다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 문헌[Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)]에서 확인할 수 있다.
용어 “어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용되어 사용될 것이다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 PTO-SNV는 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “상보적(complementary)”은 지정된 어닐링 조건 또는 엄격조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화될 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 용어 “실질적으로 상보적(substantially complementary)” 및 “완전히 상보적(perfectly complementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
PTO-SNV의 5’-태깅 부위는 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide; CTO)의 템플레이팅 부위는 PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “비-상보적(non-complementary)”은 지정된 어닐링 조건 또는 엄격조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화되지 않을 정도로 충분히 비-상보적인 것을 의미하며, 용어 “실질적으로 비-상보적(substantially non-complementary)” 및 “완전히 비-상보적(perfectly noncomplementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 비-상보적인 것을 의미한다.
예를 들어, PTO-SNV의 5’-태깅 부위와 관련하여 사용되는 용어 “비-상보적”은 지정된 어닐링 조건 또는 엄격조건하에서 상기 5’-태깅 부위가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화되지 않을 정도로 충분히 비-상보적인 것을 의미하며, 용어 “실질적으로 비-상보적(substantially non-complementary)” 및 “완전히 비-상보적(perfectly noncomplementary)”인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 비-상보적인 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “단일 뉴클레오타이드 변이를 위한 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide for Single Nucleotide Variation; PTO-SNV)”는 (i) 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위, (ii) 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위, 및 (iii) 타겟 핵산 서열 상의 관심 있는 SNP 대립 유전자의 SNP 사이트에 존재하는 SNP 뉴클레오타이드에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치하는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트(single nucleotide variation discrimination site)를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 상기 PTO-SNV는 도 1에 도식적으로 예시되어 있다.
상기 5’-태깅 부위는 타겟 핵산 서열과 혼성화된 후 핵산절단(nucleolytically) 방식으로 PTO-SNV로부터 방출된다. 상기 PTO-SNV에서 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위는 5’→3’순서로 위치해야 한다.
상기 PTO-SNV는 단일 뉴클레오타이드 변이 검출을 위한 PTO의 하나의 응용 형태로 여겨질 수 있으며, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트를 도입함으로써 제작된다.
상기 PTO-SNV는 타겟 핵산 서열 상의 관심 있는 SNP 대립 유전자의 SNP 사이트에 존재하는 SNP 뉴클레오타이드에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치하는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트를 포함한다.
상기 PTO-SNV가 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 관심 있는 SNP 대립 유전자에 혼성화되는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성한다. 상기 PTO-SNV가 관심 있는 SNP 대립 유전자와는 상이하고 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 SNP 대립 유전자에 혼성화되는 경우, 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성하지 않는다. 관심 있는 뉴클레오타이드 변이에 대한 이러한 구별되는 혼성화 패턴은 PTO-SNV의 절단 사이트에서의 차이를 제공하며, 이에 의해 2가지 유형의 PTO-SNV 단편이 생성되어 관심 있는 SNP 대립 유전자의 존재 여부에 따라 시그널 차이가 발생한다. 또한, 상기 PTO-SNV가 관심 있는 SNP 대립 유전자와는 상이하고 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 SNP 대립 유전자에 혼성화되는 경우, 상기 PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 단일가닥을 형성하는(single strand-forming) PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 부분이라고 표현될 수 있다.
상기 PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치하는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 타겟 핵산 서열 상의 관심 있는 SNP 대립 유전자의 SNP 사이트에 존재하는 SNP 뉴클레오타이드에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단으로부터 10 뉴클레오타이드, 바람직하게는 8 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 6 뉴클레오타이드, 보다 더 바람직하게는 4 뉴클레오타이드, 3 뉴클레오타이드, 2 뉴클레오타이드 또는 1 뉴클레오타이드 이내로 이격되어 위치한다. 바람직하게는 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단에 위치한다.
단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트의 위치는 검출되는 서열, 뉴클레아제의 종류 및 반응 조건을 고려하여 결정될 수 있다.
예시적인 도 2에서, 타겟 핵산 서열은 SNP 사이트에서 “G” 뉴클레오타이드를 갖는 돌연변이 대립 유전자이거나 또는 “A” 뉴클레오타이드를 갖는 야생형 대립 유전자일 수 있다. 상기 PTO-SNV는 그의 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트 내에 SNP 뉴클레오타이드, 즉, 돌연변이 대립 유전자의 SNP 사이트에서 “G” 뉴클레오타이드에 상보적인 “C” 뉴클레오타이드를 갖는다. 이 경우, 검출되는 “관심 있는 SNP 대립 유전자”는 돌연변이 대립 유전자를 의미하며, “관심 있는 SNP 대립 유전자와 상이한 SNP 대립 유전자”는 야생형 대립 유전자를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 “관심 있는 SNP 대립 유전자”는 PTO-SNV에 의해 검출되는 대립 유전자를 의미한다. “관심 있는 SNP 대립 유전자와 상이한 SNP 대립 유전자”는 PTO-SNV에 의해 검출되는 대립 유전자 외의 대립 유전자(들)를 의미한다. 다르게 표시하지 않는 한, “상이한 SNP 대립 유전자”와 “관심 있는 SNP 대립 유전자와 상이한 SNP 대립 유전자”는 혼용되어 사용된다.
본 발명의 방법에서, 용어 “SNP 대립 유전자”는 타겟 핵산 서열 상의 SNP 사이트에서의 뉴클레오타이드의 아이덴티티(identity)(예컨대, SNP 사이트가 G, A, T 또는 C를 갖는지)를 언급하기 위하여 사용될 수 있다.
특히, 상기 단계 (a)에서 혼성화는 3’-타겟팅 부위는 타겟 핵산 서열과 혼성화되고, 5’-태깅 부위는 타겟 핵산 서열과 혼성화되지 않는 엄격조건하에서 실시된다.
상기 PTO-SNV는 어떠한 특정한 길이를 가질 것을 요구하지 않는다. 예를 들어, PTO-SNV의 길이는 15-150 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-150 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 30-150 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드, 30-50 뉴클레오타이드, 35-100 뉴클레오타이드, 35-80 뉴클레오타이드, 35-60 뉴클레오타이드, 또는 35-50 뉴클레오타이드일 수 있다. 상기 PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위는 그것이 타겟 핵산 서열과 특이적으로 혼성화되는 한 어떠한 길이도 가능하다. 예를 들어, PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위는 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-50 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30 뉴클레오타이드의 길이일 수 있다. 상기 5’-태깅 부위는 그것이 CTO의 캡처링(capturing) 부위에 특이적으로 혼성화되어 연장되는 한 어떠한 길이도 가능하다. 예를 들어, 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위는 5-50 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-50 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-50 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이일 수 있다.
상기 PTO-SNV의 3’-말단은 3’-OH 터미널을 가질 수 있다. 바람직하게는, 상기 PTO-SNV의 3’-말단은 그의 연장이 방지되도록 블록킹된다.
블록킹은 종래 방법들에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올과 같은 화학적 모이어티(moiety)를 부가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기를 제거하거나 또는 다이데옥시뉴클레오타이드와 같이 3’-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
택일적으로, 상기 PTO-SNV는 헤어핀 구조를 갖도록 디자인될 수 있다.
PTO-SNV의 5’-태깅 부위와 타겟 핵산서열 간의 비-혼성화는 특정 혼성화 조건하에서 그들 사이에 안정한 이중-가닥이 형성되지 않는 것을 의미한다. 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열과의 혼성화에 관여하지 않는 PTO-SNV의 5’-태깅 부위는 단일-가닥을 형성한다.
상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO-SNV의 업스트림에 위치한다.
또한, 타겟 핵산서열에 혼성화된 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO-SNV의 절단을 유도한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 PTO-SNV 절단의 유도는 두 가지 방식으로 달성될 수 있다: (ⅰ) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-독립적 절단 유도; 및 (ⅱ) 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-의존적 절단 유도.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO-SNV의 절단반응을 유도하는데 충분할 정도로 PTO-SNV에 근접하게 위치하는 경우, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 결합한 상기 효소는 연장반응 없이 PTO-SNV를 절단한다. 반면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO-SNV와 이격되어 위치하는 경우, 중합효소 활성을 갖는 효소(예컨대, 주형-의존적 중합효소)는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 업스트림 프라이머)의 연장을 촉매하고, 연장산물에 결합된 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 PTO-SNV를 절단한다.
따라서, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 두 가지 방식으로 PTO-SNV에 대하여 상대적으로 위치할 수 있다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-독립적인 방식으로 PTO-SNV의 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 PTO-SNV에 근접하게 위치할 수 있다. 택일적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-의존적인 방식으로 PTO-SNV 절단을 유도하는 데 충분할 정도로 PTO-SNV와 이격되어 위치할 수 있다.
본 명세서에서 지점(positions) 또는 위치(locations)를 언급하면서 사용되는 용어“근접(adjacent)”은 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위에 근접하게 위치하여 닉(nick)을 형성하는 것을 의미한다. 또한, 상기 용어는 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위로부터 1-30 뉴클레오타이드, 1-20 뉴클레오타이드 또는 1-15 뉴클레오타이드 이격되어 위치하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 지점 또는 위치를 언급하면서 사용되는 용어“이격(distant)”은 연장반응이 일어나는데 충분한 어떠한 위치 또는 지점을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 연장-의존적인 방식으로 PTO-SNV의 절단을 유도하는데 충분할 정도로 PTO-SNV와 이격되어 위치한다.
일 구현예에 따르면, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브이다. 업스트림 프라이머는 연장-독립적 절단 유도 또는 연장-의존적 절단에 적합하며, 업스트림 프로브는 연장-독립적 절단 유도에 적합하다.
택일적으로, 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위의 5’-일부와 부분적으로 겹치는 서열(partial-overlapped sequence)을 가질 수 있다. 바람직하게는, 겹치는 서열은 1-10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 1-5 뉴클레오타이드, 보다 더욱 바람직하게는 1-3 뉴클레오타이드 길이이다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드가 PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위의 5’-일부와 부분적으로 겹치는 서열을 갖는 경우, 단계 (b)의 절단반응에서 3’-타겟팅 부위는 5’-태깅 부위와 함께 부분적으로 절단된다. 또한, 겹치는 서열은 3’-타겟팅 부위의 원하는 사이트(site)가 절단되도록 한다.
일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥을 통하여 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO-SNV의 절단을 유도한다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드가 타겟 핵산 서열에 혼성화된 PTO-SNV의 절단을 유도하여 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 또는 PTO-SNV의 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편이 방출되는 한, 업스트림 올리고뉴클레오타이드에 의한 절단반응에 관한 종래 기술들이 본 발명에 적용될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호, 제7,381,532호 및 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호가 본 발명에 적용될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재하에서 실시된다. 다운스트림 프라이머는 PTO-SNV와 혼성화하는 타겟 핵산 서열을 추가적으로 생성하여 타겟 검출의 민감도를 향상시킨다.
일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 이용하는 경우, 프라이머의 연장을 위하여 추가적으로 주형-의존적 핵산 중합효소를 사용한다.
일 구현예에 따르면, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브), 다운스트림 프라이머 및/또는 PTO-SNV의 5’-태깅 부위는 본 발명자에 의해 개발된 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(dual priming oligonucleotide; DPO) 구조를 갖는다. 상기 DPO 구조를 갖는 올리고뉴클레오타이드는 종래 프라이머 및 프로브에 비하여 상당히 개선된 타겟 특이성을 나타낸다(참조 WO 2006/095981; Chun 등, Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40(2007)).
일 구현예에 따르면, 상기 PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위는 본 발명자에 의해 개발된 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(modified dual specificity oligonucleotide; mDSO) 구조를 갖는다. 상기 변형 이중 특이성 올리고뉴클레오타이드(mDSO) 구조는 종래 프로브에 비하여 상당히 개선된 타겟 특이성을 나타낸다(참조 WO 2011/028041).
단계 (b): PTO-SNV로부터 단편의 방출
이어, PTO-SNV의 절단을 위한 조건하에서 상기 단계 (a)의 결과물을 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 접촉시킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “PTO-SNV의 절단을 위한 조건”은 5’ 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의해 타겟 핵산 서열에 혼성화된 PTO-SNV가 절단되는데 충분한 조건, 예컨대 온도, pH, 이온세기, 버퍼, 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 서열 그리고 효소를 의미한다. 예를 들어, 5’ 뉴클레아제 활성을 가지는 효소로서 Taq DNA 중합효소가 이용되는 경우, PTO-SNV의 절단을 위한 조건은 Tris-HCl 버퍼, KCl, MgCl2 및 온도를 포함한다.
상기 PTO-SNV가 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 관심 있는 SNP 대립 유전자에 혼성화되는 경우, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성하여 제1초기 절단 사이트로부터 절단을 유도하고, 제1단편이 방출된다(도 2 참조).
상기 PTO-SNV가 관심 있는 SNP 대립 유전자와는 상이하고 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 SNP 대립 유전자에 혼성화되는 경우, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 상기 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성하지 않아 상기 제1초기 절단 사이트의 다운스트림에 위치하는 제2초기 절단 사이트로부터 절단을 유도하고, 제2단편이 방출되며; 상기 제2단편은 추가적인 3’-말단 부위를 포함하고, 이는 상기 제2단편이 상기 제1단편과 다르도록 한다(도 2 참조).
이와 같이, 절단 사이트 및 생성된 PTO-SNV 단편의 형태의 차이는 타겟 핵산 서열상의 관심 있는 단일 뉴클레오타이드 변이(즉, 관심 있는 SNP 대립 유전자)의 존재 여부에 따라 상이한 연장 패턴을 야기하며, 이는 타겟 핵산 서열 상의 단일 뉴클레오타이드 변이를 구별하여 검출할 수 있도록 한다.
상기 PTO-SNV의 초기 절단 사이트는 5’ 뉴클레아제의 종류, 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프로브 또는 업스트림 프라이머)의 유형, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 사이트 및 절단 조건에 의해 영향을 받는다.
상기 업스트림 프라이머의 연장과 함께 5’ 뉴클레아제 활성을 갖는 주형 의존적 중합효소에 의한 초기 절단 사이트는, 일반적으로 5’→3’방향으로 단일 가닥 및 이중 가닥을 포함하는 구조에서 이중 가닥의 초기 뉴클레오타이드(즉, 분기 사이트 (bifurcation site))에 위치하거나 또는 상기 초기 뉴클레오타이드로부터 1-2 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다. 상기 절단 반응에 의해, 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 일부를 포함하는 단편이 생성된다. 업스트림 올리고뉴클레오타이드 연장-독립적 절단 유도에 의해 본 발명이 실시되는 경우, PTO-SNV의 절단 사이트는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(예컨대, 업스트림 프로브) 위치에 의해 조절될 수 있다.
본 명세서에서 PTO-SNV와 관련하여 사용되는 용어 “제1초기 절단 사이트(a first initial cleavage site)”는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 관심 있는 SNP 대립 유전자에 PTO-SNV가 혼성화되는 경우, 첫 번째로 절단되는 PTO-SNV의 절단 사이트를 의미한다. 본 명세서에서 PTO-SNV와 관련하여 사용되는 용어 “제2초기 절단 사이트(a second initial cleavage site)”는 관심 있는 SNP 대립 유전자와는 상이하고 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 SNP 대립 유전자에 PTO-SNV가 혼성화되는 경우, 첫 번째로 절단되는 PTO-SNV의 절단 사이트를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “제1단편(a first fragment)”은 제1초기 절단 사이트에서 절단에 의해 생성된 단편을 의미한다. “제1단편”은 “제1분절(a first segment)” 및 “PTO-SNV 제1단편(a PTO-SNV first fragment)”과 상호교환적으로 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “제2단편(a second fragment)”은 제2초기 절단 사이트에서 절단에 의해 생성된 단편을 의미한다. “제2단편”은 “제2분절(a second segment)” 및 “PTO-SNV 제2단편(a PTO-SNV second fragment)”과 상호교환적으로 사용된다.
바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 제1단편 및 제2단편은 각각 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함한다.
상기 절단은 이용되는 절단 방법에 따라 상기 제1초기 절단 사이트(또는 제2초기 절단 사이트)의 절단 이후에 연속적으로 일어날 수 있다. 예를 들어, 업스트림 프라이머의 연장과 함께 5’뉴클레아제 절단 반응을 이용하는 경우, 초기 절단 사이트 및 이에 연속된 서열이 절단된다. 업스트림 프로브가 이용되고, 절단 반응이 프로브가 위치한 사이트에서 이격된 사이트에서 일어나는 경우, 절단 반응은 상기 사이트에서만 일어나며, 연속적인 사이트에서의 절단은 일어나지 않을 수 있다.
일 구현예에 따르면, 업스트림 프라이머 연장에 의존적인 초기 절단 사이트는 5’→3’방향으로 이중 가닥의 초기 뉴클레오타이드(즉, 분기 사이트)에 위치할 수 있다.
본 발명의 한 예를 나타내는 도 2에서 보는 바와 같이, 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부의 5’-말단에 위치한다. 이런 경우에 제1초기 절단 사이트는 5’→3’방향으로 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 바로 인접하게 위치한다. 즉, 상기 제1초기 절단 사이트는 3’ 방향으로 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 바로 인접하게 위치한다. 제2초기 절단 사이트는 일반적으로 3’ 방향으로 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트로부터 1 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다.
PTO-SNV가 타겟 핵산 서열에 혼성화되는 경우, 그의 3’-타겟팅 부위는 혼성화에 관여하고, 5’-태깅 부위는 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않고 단일-가닥을 형성한다. 이와 같이, 단일-가닥 및 이중-가닥 구조 모두를 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 당업계의 통상의 기술자에 알려진 다양한 기술에 의해 5’뉴클레아제활성을 갖는 효소를 이용하여 절단될 수 있다.
PTO-SNV의 절단 사이트는 업스트림 올리고뉴클레오타이드(업스트림 프로브 또는 업스트림 프라이머)의 유형, 업스트림 올리고뉴클레오타이드의 혼성화 사이트 및 절단 조건에 따라 다양할 수 있다(참조 미국 특허 제5,210,015호, 제5,487,972호, 제5,691,142호, 제5,994,069호 및 제7,381,532호 및 미국 출원 공개번호 제2008-0241838호).
PTO-SNV의 절단 반응을 위하여 다수의 종래 기술을 이용할 수 있으며, 이는 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편을 방출한다.
간략하게, 단계 (b)에서 세 가지 절단 사이트가 존재할 수 있다. 첫 번째 절단 사이트는 PTO-SNV의 혼성화 부위(3’-타겟팅 부위)와 비-혼성화 부위(5’-태깅 부위) 간의 정션 위치(junction site)이다. 두 번째 절단 사이트는 PTO-SNV의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 3’-방향으로 몇 개의 뉴클레오타이드만큼 이격되어 위치하는 사이트이다. 두 번째 절단 사이트는 PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치한다. 세 번째 절단 사이트는 PTO-SNV의 5’-태깅 부위의 3’-말단으로부터 5’-방향으로 몇 개의 뉴클레오타이드만큼 이격되어 위치하는 사이트이다.
절단 방법에 의존적인 절단 사이트를 고려하여, 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트를 PTO-SNV 상에 적절하게 위치하게 하거나 또는 상기 단편에 혼성화되는 CTO 부위의 서열을 적절하게 조절할 수 있다.
이러한 관점에서, 본 명세서에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 PTO-SNV의 절단과 관련하여 사용되는 용어 “PTO-SNV의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편”은 (i) 5’-태깅 부위, (ii) 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부 및 (iii) 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 의미로 사용된다. 또한 본 출원에서 용어 “PTO-SNV의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부를 포함하는 단편”은 “PTO-SNV 단편”으로 표현될 수도 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 PTO-SNV는 블록커로서 5’ 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 절단에 대해 내성을 갖는 최소 1개의 뉴클레오타이드를 포함하는 블록커 부위를 갖고, 상기 블록커 부위는 초기 절단 사이트를 조절하거나 하나의 사이트 또는 사이트들에서의 절단을 방지하도록 위치한다.
예를 들어, 상기 PTO-SNV의 혼성화 부위(3’-타겟팅 부위)와 비-혼성화 부위(5’-태깅 부위) 사이의 정션 위치(junction site)에서 절단을 유도하기 위하여, PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 블록커로 블록킹될 수 있다.
상기 블록커 부위에 포함되는 블록커의 개수는 제한되지 않으며, 바람직하게는 1-10 블록커, 보다 바람직하게는 2-10 블록커, 보다 더욱 바람직하게는 3-8 블록커, 가장 바람직하게는 3-6 블록커이다. PTO-SNV에 존재하는 블록커는 연속적 또는 불연속적인 방식으로 존재할 수 있으며, 바람직하게는 연속적인 방식이다. 블록커로서 5 ’뉴클레아제 활성에 대하여 내성인 백본을 갖는 뉴클레오타이드는 당업자에게 알려진 어떠한 것도 포함한다. 예를 들어, 상기 뉴클레오타이드는 다양한 포스포로티오에이트 연결, 포스포네이트 연결, 포스포로아미데이트 연결 및 2’-카보하이드레이트 변형을 포함한다. 보다 바람직한 일 구현예에 따르면, 5’뉴클레아제에 대하여 내성인 백본을 갖는 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결, 알킬 포스포트리에스테르 연결, 아릴 포스포트리에스테르 연결, 알킬 포스포네이트 연결, 아릴 포스포네이트 연결, 하이드로겐 포스포네이트 연결, 알킬 포스포로아미데이트 연결, 아릴 포스포로아미데이트 연결, 포스포로셀레네이트 연결, 2’-O-아미노프로필 변형, 2’-O-알킬 변형, 2’-O-알릴 변형, 2’-O-부틸 변형, α-아노머릭 올리고데옥시뉴클레오타이드 및 1-(4’-티오-β-D-리보퓨라노실) 변형을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 블록커로서 뉴클레오타이드는 펩타이드 핵산(Peptide nucleic acid; PNA) 및 잠금 핵산(locked nulceic acid; LNA)을 포함한다.
본 명세서에서 PTO-SNV의 5’-태깅 부위의 일부, PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부 및 CTO의 캡처링 부위의 5’-말단 일부와 같이 PTO-SNV 또는 CTO와 관련하여 사용되는 용어 “일부(part)”는 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10 또는 1-5 뉴클레오타이드, 바람직하게는 1, 2, 3 또는 4 뉴클레오타이드로 구성된 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
일 구현예에 따르면, 5’ 뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5’ 뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이며, 보다 바람직하게는 5’ 뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제이다.
본 발명에서 5’ 뉴클레아제 활성을 갖는 적합한 DNA 중합효소는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함하는, 다양한 박테리아 종으로부터 얻은 열안정성 DNA 중합효소이다. 가장 바람직하게는, 열안정성 DNA 중합효소는 Taq 중합효소이다.
택일적으로, 본 발명은 중합효소 활성을 덜 갖도록 변형된, 5’뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소를 사용할 수 있다.
사용되는 FEN(flap endonuclease) 뉴클레아제는 5’플랩-특이적 뉴클레아제(5’flap-specific nuclease)이다.
본 발명에 적합한 FEN 뉴클레아제는 Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix 및 Archaeaglobus veneficus를 포함하는, 다양한 박테리아 종으로부터 얻은 FEN 뉴클레아제를 포함한다.
상기 단계 (a)에서 업스트림 프라이머를 이용하는 경우, PTO-SNV의 절단을 위한 조건은 업스트림 프라이머의 연장반응을 포함하는 것이 바람직하다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)에서 업스트림 프라이머가 사용되고, 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위하여 주형-의존적 중합효소가 사용되며, 상기 주형-의존적 중합효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 동일하다.
택일적으로, 상기 단계 (a)에서 업스트림 프라이머가 사용되고, 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위하여 주형-의존적 중합효소가 사용되며, 상기 주형-의존적 중합효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 상이하다.
단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트를 포함하는 5’-말단 일부는 타겟 핵산 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 포함할 수 있다. 택일적으로, 5’-말단 일부는 부분적으로 비-혼성화 서열을 포함할 수 있다. 상기 PTO-SNV가 관심 있는 SNP 대립 유전자와는 상이하고 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 SNP 대립 유전자에 혼성화되는 경우, 상기 5’-말단 일부에 비-혼성화 서열을 도입하는 것은 상기 5’-말단 일부가 단일 가닥을 형성하는데 매우 유용하다.
일 구현예에 따르면, 상기 PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트로부터 1-10 뉴클레오타이드(더욱 바람직하게는 1-5 뉴클레오타이드) 이내로 이격되어 위치하는 비-염기 쌍 모이어티(non-base pairing moiety)를 포함한다.
상기 PTO-SNV가 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 타겟 핵산 서열과 혼성화되는 경우, 상기 비-염기 쌍 모이어티는 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 타겟 뉴클레오타이드 서열과 이중 가닥을 형성하는 것을 방지한다.
일 구현예에 따르면, 상기 PTO-SNV가 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 타겟 핵산 서열과 혼성화되는 경우, 상기 비-염기 쌍 모이어티는 5’-말단 일부가 타겟 핵산 서열과 이중가닥을 형성하는 것을 억제하지 않는다.
일 구현예에 따르면, 비-염기 쌍 모이어티는 제1초기 절단 사이트와 제2초기 절단 사이트 간의 차이(differentiation)를 증가시킨다. 예를 들어, PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부의 혼성화 패턴이 차이가 없어서, 단일 변이 구별 사이트에서의 차이에 의해 관심 있는 SNP 대립 유전자 및 상이한 SNP 대립 유전자에서 절단 사이트가 차이가 나지 않는 경우, 비-염기 쌍 모이어티의 사용은 혼성화 패턴이 차이가 나도록 만든다. 또한, PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 단일 변이 구별 사이트에서의 차이에 의해 관심 있는 SNP 대립 유전자 및 상이한 SNP 대립 유전자에서 상이한 혼성화 패턴을 나타내는 경우에도, 비-염기 쌍 모이어티의 사용은 제2단편의 3’-말단 부위를 제1단편의 3’-말단 부위보다 더 길게 만들어 CTO 상에서 제2단편의 연장을 완벽하게 방지할 수 있다.
비-염기 쌍 모이어티의 사용은 본 발명의 방법을 개선시킨다.
일 구현예에 따르면, 비-염기 쌍 모이어티(예컨대, 인위적인 미스매치 뉴클레오타이드)의 사용은 SNP 뉴클레오타이드에 대한 PTO-SNV의 구별 가능성을 증가시킨다.
일 구현예에 따르면, 5’ 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 제1초기 절단 사이트와 제2초기 절단 사이트 간의 차이 식별은 비-염기 쌍 모이어티에 의해 부여된 차이에 의해 개선된다. 상기 차이는 비-염기 쌍 모이어티에 의해 야기된 제1초기 절단 사이트와 제2초기 절단 사이트 간의 거리에 의해 증가할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 비-염기 쌍 모이어티는 제1초기 절단 사이트와 제2초기 절단 사이트 간의 거리를 확대시킨다.
일 구현예에 따르면, 비-염기 쌍 모이어티 서열의 도입으로 제2초기 절단 사이트를 조절할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 비-염기 쌍 모이어티는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트의 다운스트림에 위치한다.
예를 들어, 비-염기 쌍 모이어티로서 미스매치 뉴클레오타이드가 3’ 방향으로 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트로부터 2 뉴클레오타이드 이격된 위치로 도입되는 경우, 제2초기 절단 사이트는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트로부터 2 뉴클레오타이드 이격된 위치로 조절된다. 미스매치 뉴클레오타이드를 사용하지 않는 경우, 제2 초기 절단 사이트는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트로부터 1 뉴클레오타이드 이격되어 위치한다. 즉, 비-염기 쌍 모이어티는 제1초기 절단 사이트와 제2초기 절단 사이트 사이의 거리를 확대시킨다.
비-염기 쌍 모이어티는 타겟 핵산 서열 간에 염기 쌍을 형성하지 않는 어떠한 모이어티도 포함한다. 바람직하게는, 비-염기 쌍 모이어티는 (ⅰ) 인위적인 미스매치 염기, 염기 쌍을 형성할 수 없도록 변형된 비-염기 쌍 염기 또는 유니버설 염기를 포함하는 뉴클레오타이드, (ⅱ) 염기 쌍을 형성할 수 없도록 변형된 비-염기 쌍 뉴클레오타이드, 또는 (ⅲ) 비-염기 쌍 형성 화합물이다(non-base pairing chemical compound).
예를 들어, 비-염기 쌍 모이어티는 알킬렌 기, 리보퓨라노실 나프탈렌, 데옥시 리보퓨라노실 나프탈렌, 메타포스페이트, 포스포로티오에이트 연결, 알킬 포스포트리에스테르 연결, 아릴 포스포트리에스테르 연결, 알킬 포스포네이트 연결, 아릴 포스포네이트 연결, 하이드로겐 포스포네이트 연결, 알킬 포스포로아미데이트 연결 및 아릴 포스포로아미데이트 연결을 포함한다. 종래 카본 스페이서 또한 비-염기 쌍 모이어티로 이용된다. 비-염기 쌍 모이어티로서의 유니버설 염기는 PTO-SNV의 절단 사이트를 조절하는데 유용하다.
데옥시이노신, 1-(2’-데옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 및 5’-니트로인돌과 같은 유니버설 염기를 포함하는 염기 쌍은 자연 염기들 간의 결합력보다 낮은 결합력을 가지므로, 유니버설 염기는 특정 혼성화 조건하에서 비-염기 쌍 모이어티로서 이용될 수 있다.
5’-말단 일부에 도입된 비-염기 쌍 모이어티는 특히 1-5개의 모이어티, 보다 특히 1-2개의 모이어티를 갖는다. 5’-말단 일부 내의 다수의 비-염기 쌍 모이어티는 연속적 또는 불연속적 방식으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 비-염기 쌍 모이어티는 2-5개의 연속적인 모이어티를 갖는다.
특히, 비-염기 쌍 모이어티는 비-염기 쌍 형성 화합물이다.
일 구현예에 따르면, 상기 PTO-SNV의 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트 및 비-염기 쌍 모이어티는 3’-타겟팅 부위의 5’-말단으로부터 10 뉴클레오타이드 (보다 특히 8 뉴클레오타이드, 7 뉴클레오타이드, 6 뉴클레오타이드, 5 뉴클레오타이드, 4 뉴클레오타이드, 3 뉴클레오타이드, 2 뉴클레오타이드 또는 1 뉴클레오타이드, 보다 더욱 특히 1 뉴클레오타이드) 이내로 이격되어 위치한다.
택일적으로, 절단 반응은 제2초기 절단 사이트가 아닌 제1초기 절단 사이트에서만 일어날 수 있다. 예를 들어, 업스트림 프로브를 이용하고 절단 반응이 프로브가 위치한 사이트로부터 이격된 어떤 사이트에서 일어나는 경우, PTO-SNV가 관심 있는 SNP 대립 유전자에 혼성화되면, 절단 반응은 제1초기 절단 사이트에서만 일어날 수 있다. PTO-SNV가 상이한 SNP 대립 유전자에 혼성화되는 경우에는, 업스트림 프로브로부터의 먼 거리로 인해 분기 사이트(제2초기 절단 사이트)는 절단되지 않을 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 PTO-SNV가 상이한 SNP 대립 유전자에 혼성화되는 경우, 제2초기 절단 사이트는 단일 가닥 및 이중 가닥을 포함하는 구조에서 이중 가닥의 초기 사이트(즉, 분기 사이트)를 포함한다.
단계 (c): PTO-SNV로부터 방출된 단편과 CTO와의 혼성화
PTO-SNV로부터 방출된 단편은 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide; CTO)와 혼성화된다.
상기 CTO는 3’→ 5’방향으로 (i) PTO-SNV의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함한다.
상기 템플레이팅 부위는, PTO의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다. 또한, 템플레이팅 부위는, PTO로부터 방출된 단편의 연장을 위한 템플레이트로서의 역할을 할 수 있는 한, 어떠한 서열도 포함할 수 있다.
제1단편 및 제2단편은 일반적으로 CTO의 캡처링 부위와 혼성화할 수 있는 서열을 가지며 따라서 제1단편 및 제2단편 중 하나가 CTO와 혼성화된다.
상이한 SNP 대립 유전자에 혼성화될 때 생성되는 제2단편은 관심 있는 SNP 대립 유전자에 혼성화될 때 생성되는 제1단편과 다른 추가적인 3’-말단 부위를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 제2단편이 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화될 때 상기 제2단편이 연장되는 것을 방지하기 위해, 상기 CTO가 상기 제2단편의 추가적인 3’-말단 부위와 혼성화되지 않도록 선택된 서열을 상기 CTO가 갖는다. 예를 들어, CTO의 서열은 제2단편의 추가적인 3’-말단 부위의 맞은편에 CTO가 미스매치 뉴클레오타이드를 갖도록 선택될 수 있다. 택일적으로, 반응 조건에 따라 상기 미스매치 뉴클레오타이드 대신에 유니버설 염기가 사용될 수 있다.
CTO의 3’-말단은 상기 단편과의 혼성화에 관여하지 않는 추가적인 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, CTO가 상기 단편과 안정적으로 혼성화되는 한, CTO의 캡처링 부위는 상기 단편의 일부(예컨대, 단편의 3’-말단 부위를 포함하는 단편의 일부)에만 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위”는 상술한 바와 같이 CTO의 캡처링 부위의 다양한 디자인 및 조성을 포괄하는 것으로 본 명세서에서 설명된다.
CTO는 헤어핀 구조를 갖도록 디자인할 수 있다.
상기 CTO의 길이는 다양할 수 있다. 예를 들어, 상기 CTO는 7-1000 뉴클레오타이드, 7-500 뉴클레오타이드, 7-300 뉴클레오타이드, 7-100 뉴클레오타이드, 7-80 뉴클레오타이드, 7-60 뉴클레오타이드, 7-40 뉴클레오타이드, 15-1000 뉴클레오타이드, 15-500 뉴클레오타이드, 15-300 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 20-1000 뉴클레오타이드, 20-500 뉴클레오타이드, 20-300 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드, 30-1000 뉴클레오타이드, 30-500 뉴클레오타이드, 30-300 뉴클레오타이드, 30-100 뉴클레오타이드, 30-80 뉴클레오타이드, 30-60 뉴클레오타이드 또는 30-40 뉴클레오타이드의 길이이다. 상기 CTO의 캡처링 부위는 PTO로부터 방출된 단편에 특이적으로 혼성화되는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 CTO의 캡처링 부위는 5-100 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-60 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이이다. 상기 CTO의 템플레이팅 부위는 PTO-SNV로부터 방출된 단편의 연장에서 템플레이트로서의 역할을 할 수 있는 한, 어떠한 길이도 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 CTO의 템플레이팅 부위는 1-900 뉴클레오타이드, 1-400 뉴클레오타이드, 1-300 뉴클레오타이드, 1-100 뉴클레오타이드, 1-80 뉴클레오타이드, 1-60 뉴클레오타이드, 1-40 뉴클레오타이드, 1-20 뉴클레오타이드, 2-900 뉴클레오타이드, 2-400 뉴클레오타이드, 2-300 뉴클레오타이드, 2-100 뉴클레오타이드, 2-80 뉴클레오타이드, 2-60 뉴클레오타이드, 2-40 뉴클레오타이드, 2-20 뉴클레오타이드, 5-900 뉴클레오타이드, 5-400 뉴클레오타이드, 5-300 뉴클레오타이드, 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-30 뉴클레오타이드, 10-900 뉴클레오타이드, 10-400 뉴클레오타이드, 10-300 뉴클레오타이드, 15-900 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드 또는 15-20 뉴클레오타이드의 길이이다.
CTO의 3’-말단은 3’-OH 터미널을 가질 수 있다. 바람직하게는, CTO의 3’-말단은 그의 연장이 방지되도록 블록킹된다. CTO의 비-연장 블록킹은 종래 방법들에 따라 달성될 수 있다. 예를 들면, 블록킹은 CTO의 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기에 바이오틴, 표지, 포스페이트기, 알킬기, 비-뉴클레오타이드 링커, 포스포로티오에이트 또는 알칸-디올과 같은 화학적 모이어티(moiety)를 추가하여 실시할 수 있다. 택일적으로, 블록킹은 마지막 뉴클레오타이드의 3’-히드록실기를 제거하거나 또는 다이디옥시뉴클레오타이드와 같이 3’-히드록실기가 없는 뉴클레오타이드를 이용하여 실시할 수 있다.
상기 PTO-SNV로부터 방출된 단편은 CTO와 혼성화되어, 상기 단편의 연장에 적합한 형태를 제공한다. 비절단 PTO-SNV 역시 그의 5’-태깅 부위를 통하여 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되긴 하지만, PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위는 CTO에 혼성화되지 않아, 연장이합체의 형성이 방지된다.
단계 (c)에서의 혼성화는 상기 단계 (a)에서의 설명을 참조하여 상세하게 설명될 수 있다.
제1초기 절단 사이트(또는 제2초기 절단 사이트)는 어떤 조건에서는 고정되어 있지 않고 다수일 수 있다. 예를 들어, 초기 절단 사이트는 5’→3’방향으로 단일 가닥 및 이중 가닥을 포함하는 구조에서 이중 가닥의 초기 뉴클레오타이드(즉, 분기 사이트) 및 상기 초기 뉴클레오타이드로부터 1-2 뉴클레오타이드 이격되어 위치할 수 있다. 이와 같은 경우, 특히, CTO의 서열은 본 발명에서 제1초기 절단에 의해 방출되는 가장 짧은 단편이 선택적으로 연장되어 관심 있는 SNP 대립 유전자의 존재를 나타내는 연장가닥을 생성하도록 선택된다.
단계 (d): 단편의 연장
제1단편이 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되면, 제1단편은 연장되어 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥이 형성된다. 상기 제2단편이 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되는 경우, 제2단편은 연장되지 않는다(도 3 참조).
본 명세서에서 연장가닥과 관련하여 사용되는 용어 “연장서열(extended sequence)”은 새롭게 연장된 서열만을 의미하며, 이는 제1단편을 제외한 연장가닥의 부위이다. 상기 연장가닥은 상기 제1단편 및 상기 연장서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 제1단편의 연장가닥 및 CTO는 단계 (d)에서 연장이합체를 형성한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “연장이합체(extended strand)”는 CTO의 캡처링 부위에 혼성화된 제1단편이 주형-의존적 핵산 중합효소와 CTO의 템플레이팅 부위를 템플레이트로 이용하여 연장되는 연장반응에 의하여 형성된 이합체를 의미한다.
상기 연장이합체는 비절단 PTO-SNV와 CTO 간의 혼성화물(hybrid)의 Tm 값과 상이한 Tm 값을 갖는다. 특히, 상기 연장이합체는 비절단 PTO-SNV와 CTO 간의 혼성화물보다 더 높은 Tm 값을 갖는다.
상기 연장이합체의 Tm 값은 (i) 제1단편의 서열 및/또는 길이, (ii) CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 제1단편의 서열 및/또는 길이와 CTO의 서열 및/또는 길이에 의하여 조절될 수 있다. 단계 (e)에서 연장이합체의 멜팅에 의하여 연장이합체의 존재를 나타내는 타겟 시그널이 제공되도록 연장이합체의 조절가능한 Tm 값을 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “Tm”은 이중가닥 핵산 분자의 집단(population)의 절반이 단일-가닥 분자로 해리되는 멜팅 온도를 의미한다. Tm 값은 혼성화된 뉴클레오타이드의 길이 및 G/C 함량에 의해 결정된다. Tm 값은 Wallace rule(R.B. Wallace 등, Nucleic Acids Research, 6:3543-3547(1979)) 및 nearest-neighbor 방법(SantaLucia J. Jr. 등, Biochemistry, 35:3555-3562(1996)); Sugimoto N. 등, Nucleic Acids Res., 24:4501-4505(1996))과 같은 종래 방법에 의하여 계산할 수 있다.
일 구현예에 따르면, Tm 값은 실제 사용하는 반응 조건하에서의 실제 Tm 값을 의미한다.
단계 (d)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 어떠한 핵산 중합효소, 예컨대, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우(Klenow) 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 중합효소는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus furiosus(Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus 및 Aquifex aeolieus를 포함하는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이다. 가장 바람직하게는, 상기 주형-의존적 핵산 중합효소는 Taq 중합효소이다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (b)에서 이용되는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 단계 (d)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소와 동일하다. 특히, 상기 단계 (b)에서 이용되는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소, 업스트림 프라이이머의 연장을 위하여 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소 및 단계 (d)에서 이용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 서로 동일하다.
일반적으로, 프라이머의 연장은 프라이머의 3’-말단 일부와 템플레이트 간의 혼성화에 의해 조절될 수 있다. 프라이머 서열 및 반응 조건(예컨대, 어닐링 온도)을 조절함으로써 3’-말단 일부에 1-3 미스매치 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머의 연장이 가능할 수 있다. 택일적으로, 프라이머가 타겟 서열에 완전히 상보적인 서열을 갖는 경우에만 프라이머의 연장이 가능할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 CTO의 서열은 제1단편 또는 제2단편 중 어느 하나가 선택적으로 연장되도록 선택된다.
일 구현예에 따르면, 상기 단편의 연장은 단편의 3’-말단 일부에 하나의 미스매치라도 존재하는 경우에는 연장되지 않는 조건 하에서 실시된다.
단계 (e): 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널의 검출
연장가닥의 존재를 나타내는 시그널은 연장반응 후 검출된다.
관심 있는 SNP 대립 유전자가 존재하는 경우, 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널이 검출가능하게 된다. 반면, 관심 있는 SNP 대립 유전자가 존재하지 않는 경우, 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널은 검출되지 않는다. 뿐만 아니라, 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 동형접합인 타겟 핵산 서열은 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 이형접합인 타겟 핵산 서열보다 더 높은 강도의 시그널을 나타낸다. 이론적으로, 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 동형접합인 타겟 핵산 서열은 이형접합인 타겟 핵산 서열보다 두 배의 관심있는 SNP 대립 유전자를 가지며, 이는 시그널의 강도에 반영된다. 본 발명자들은 시그널 강도의 차이가 SNP 유전자형의 차이에 의해 유도된다는 것을 발견하였다. 이러한 결과는 재현가능하며 패턴가능한 것으로 확인된다.
따라서, 본 발명의 방법은 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널의 존재를 검출하는 것뿐만 아니라 강도를 측정함으로써 오직 하나의 대립 유전자-특이적 PTO-SNV를 이용한 SNP 유전자형 분석을 가능하게 한다.
연장이합체의 검출
일 구현예에 따르면, 단계 (e)에서의 검출은 멜팅 분석을 포함하는 PTOCE 분석 또는 연장가닥 또는 연장가닥과 CTO 간의 연장이합체로부터의 시그널을 이용하는 미리 정해진 온도에서의 검출을 포함하는 PTOCE 분석에 따라 실시된다(참조 WO 2012/096523).
일 구현예에 따르면, 제1단편의 연장가닥 및 CTO는 상기 단계 (d)에서 연장이합체를 형성하며; 상기 연장이합체는 (i) 상기 제1단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (iii) 상기 제1단편의 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 서열 및/또는 길이에 의해 조절가능한 Tm 값을 가지며; 상기 연장이합체는 (i) 상기 제1단편 및/또는 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 연장반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지, (iii) 상기 제1단편 및/또는 CTO에 연결된 최소 하나의 표지 및 연장반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 타겟 시그널을 제공하고; 상기 연장가닥의 존재는 상기 연장이합체에 대한 멜팅 분석 또는 혼성화 분석에 따라 상기 연장이합체로부터 타겟 시그널을 측정함으로써 검출된다.
일 구현예에 따르면, 제1단편의 연장가닥 및 CTO는 상기 단계 (d)에서 연장이합체를 형성하며; 상기 연장이합체는 (i) 상기 제1단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (iii) 상기 제1단편의 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 서열 및/또는 길이에 의해 조절가능한 Tm 값을 가지며, 상기 연장이합체는 (i) 상기 제1단편 및/또는 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입되는 하나의 표지, (iii) 상기 제1단편 및/또는 CTO에 연결된 최소 하나의 표지 및 연장 반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입되는 하나의 표지 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지에 의해 타겟 시그널을 제공하며; 상기 연장가닥의 존재는 상기 연장이합체의 이중 가닥을 유지하기에 충분한 미리 정해진 온도에서 상기 연장이합체로부터 타겟 시그널을 측정함으로써 검출된다.
시그널링 올리고뉴클레오타이드를 이용한 검출
일 구현예에 따르면, 제1단편의 연장가닥은 WO 2013/115442에 개시된 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 이용하여 검출될 수 있다.
연장가닥에 혼성화되는 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함한다. 일 구현예에 따르면, 상기 SO는 연장서열에 상보적인 서열을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO의 최소 하나의 부위는 연장서열에 상보적인 서열을 포함한다. 연장서열에 상보적인 서열을 포함하는 SO의 부위는 최소 1, 2, 3, 4, 5 또는 10개 뉴클레오타이드 길이이다.
상기 SO의 일부가 새롭게 합성된 연장서열의 일부에 상보적인 서열을 포함하도록 디자인된 경우, SO와 연장가닥의 혼성화 결과물의 Tm 값은 SO와 비절단 PTO-SNV의 혼성화 결과물의 Tm 값과 달라지게 된다. 상기 Tm 값의 차이는 상기 두 혼성화 결과물로부터의 시그널을 구별할 수 있게 한다. 예를 들어, 실시간 검출에서 Tm 값을 고려하여 검출 온도를 조절함으로써 또는 멜팅 커브 분석에서 멜팅 피크에 의해 비-타겟 시그널을 배제할 수 있다.
상기 SO는 그의 서열 전체적으로 연장서열에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 택일적으로, 상기 SO는 연장서열에 상보적인 서열을 갖는 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 SO의 일부는 연장서열에 상보적인 서열을 포함하고 다른 부위는 단편에 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 SO는 그의 서열 전체적으로 연장서열에 상보적인 서열을 포함한다.
상기 SO는 어떠한 길이, 예를 들어 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 5-10 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-60 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 15-20 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30 뉴클레오타이드의 길이를 가질 수 있다.
상기 SO는 헤어핀 구조를 가질 수 있다.
상기 SO의 3’-말단은 그의 연장이 방지되도록 블록킹된다. 택일적으로, 블록킹되지 않은 3’-OH 말단을 갖는 SO는 연장될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 제1단편의 연장가닥은 시그널링 올리고뉴클레오타이드(SO)를 이용하여 검출되며; 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열 및 최소 하나의 표지를 포함하며; 상기 SO는 연장가닥과의 결합(association) 또는 해리(dissociation)에 의해 검출가능한 시그널을 제공한다.
용어 “연장가닥과의 결합(association) 또는 해리(dissociation)”는 용어 “연장가닥과의 혼성화 또는 변성”과 동일한 의미를 갖는다.
일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 검출가능한 시그널은 (i) SO에 연결된 표지, (ii) SO에 연결된 표지 및 PTO-SNV로부터의 단편에 연결된 표지의 조합, (iii) SO에 연결된 표지 및 상기 단계 (d)의 연장반응 동안 연장가닥에 삽입될 표지의 조합, 또는 (iv) SO에 연결된 표지 및 인터컬레이팅 염료(intercalating dye)의 조합에 의해 제공된다.
본 발명에 유용한 표지 시스템은 상세하게 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) SO에 연결된 단일 표지
본 발명은 단일 표지를 가진 SO를 이용하여 타겟 뉴클레오타이드 변이의 존재를 나타내는 연장가닥의 형성에 대한 시그널을 제공할 수 있다.
(ii) SO에 연결된 가닥 내 상호작용적-이중 표지
일 구현예에 따르면, SO는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지로 표지되며, 단계 (e)에서 상기 SO와 연장가닥 간의 혼성화는 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널 변화를 유도하여 검출가능한 시그널을 제공한다. 상기 SO의 혼성화 이전에, 상기 SO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 구조적으로 근접하여 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다. 혼성화가 되면, 상기 SO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭(unquenching)하고, 이는 상호작용적 이중표지로부터의 시그널 변화를 야기한다.
상호작용적 이중표지를 갖는 SO를 이용하는 본 발명의 일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 혼성화된 PTO-SNV로부터 방출된 제1단편은 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고 연장되어 연장가닥을 형성한다. 상기 연장가닥이 SO에 혼성화되면, SO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 구조적으로 이격되어 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하여, 상호작용적 이중표지로부터의 시그널 변화가 일어나도록 한다(예컨대, 리포터 분자로부터의 시그널 증가). 혼성화에 관여되지 않은 SO 상의 리포터 분자 및 퀀처 분자는 서로 구조적으로 근접하여 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 퀀칭한다.
(iii) 가닥 내 상호작용적-이중 표지
가닥 내 상호작용적-이중 표지를 사용하는 구현예에 따르면, 연장가닥은 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지 중 하나를 가지며, SO는 상호작용적 이중 표지 중 다른 하나를 가진다.
상기 SO에 연결된 표지는 리포터 분자 또는 퀀처 분자 중 하나일 수 있으며, 상기 단편에 연결된 표지는 퀀처 분자 또는 리포터 분자 중 하나일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 SO는 상호작용적 이중 표지의 리포터 분자와 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하고, CTO의 템플레이팅 부위는 제1 비-자연 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하며; 상기 단계 (d)의 연장반응은 상기 제1 비-자연 염기에 특이적 결합 친화성이 있는 제2 비-자연 염기 및 리포터 분자와 퀀처 분자 중 다른 하나를 모두 갖는 뉴클레오타이드의 존재하에서 실시되며, 이에 의해 표지는 연장가닥 내로 삽입되며; 상기 SO와 연장가닥 간의 혼성화는 상호작용적 이중 표지로부터 제공되는 시그널의 변화를 유도하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “비-자연 염기(non-natural base)”는 수소-결합 염기 쌍을 형성할 수 있는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)과 같은 자연 염기의 유도체를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “비-자연 염기”는 모화합물(mother compound)로서 자연 염기와 상이한 염기 쌍 형성 패턴을 갖는 염기를 포함하며, 예컨대, 미국 특허 제5,432,272호, 제5,965,364호, 제6,001,983호 및 제6,037,120호에 기재되어 있다. 비-자연 염기들 간의 염기 쌍 형성은 자연 염기와 유사하게 둘 또는 세 개의 수소결합을 포함한다. 또한, 비-자연 염기들 간의 염기 쌍 형성은 특정한 방식으로도 형성된다. 비-자연 염기의 특정한 예는 염기 쌍 조합에서 다음과 같은 염기들을 포함한다: iso-C/iso-G, iso-dC/iso-dG, K/X, H/J 및 M/N (참조 미국 특허 제7,422,850호).
일 구현예에 따르면, 상기 SO는 상호작용적 이중 표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하며, 상기 단계 (d)의 연장반응은 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 다른 하나를 갖는 뉴클레오타이드의 존재하에서 실시되며, 이에 의해 표지가 연장가닥 내로 삽입되고; 상기 SO와 연장가닥 간의 혼성화는 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
(iv) 2개의 SO를 이용한 상호작용적-이중 표지
2개의 SO를 이용하는 상호작용적-이중 표지의 구현예에서, 본 발명의 방법은 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하는 추가적인 SO를 이용하며, 상기 2개의 SO는 근접한 방식으로 연장가닥에 혼성화되고, 상기 2개의 SO는 각각 상호작용적 이중 표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하며; 상기 2개의 SO와 연장가닥 간의 혼성화는 상호작용적 이중 표지로부터의 시그널의 변화를 유도하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
(v) 인터컬레이팅 염료를 이용한 FRET 표지
일 구현예에 따르면, SO는 FRET의 수용체를 포함하고 단계 (e)에서 혼성화는 인터컬레이팅 염료의 존재하에서 실시되며; 상기 SO와 연장가닥 간의 혼성화는 SO의 상기 수용체로부터의 시그널의 변화를 유도하여 검출가능한 시그널을 제공한다.
본 발명에서 유용한 인터컬레이팅 염료의 예는 SYBRTM Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTOTM43, SYTOTM44, SYTOTM45, SYTOXTMBlue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PROTM1, TO-PROTM1, SYTOTM11, SYTOTM13, SYTOTM15, SYTOTM16, SYTOTM20, SYTOTM23, TOTO™-3, YOYOTM3, GelStarTM 및 싸이아졸 오렌지(thiazole orange)를 포함한다. 인터컬레이팅 염료는 이중-가닥 핵산 분자 내에 특이적으로 삽입되어 시그널을 발생시킨다.
표지는 종래의 방법을 통해 SO 또는 PTO-SNV에 연결될 수 있다. 특히, 상기 표지는 최소 3개의 탄소원자를 포함하는 스페이서(예컨대, 3-카본 스페이서, 6-카본 스페이서 또는 12-카본 스페이서)를 통해 SO 또는 PTO-NV에 연결된다.
본 발명에서 유용한 SO는 혼성화에 의존적인 시그널을 제공할 수 있는 모든 프로브, 예컨대, Molecular beaconTM (미국특허 제5,925,517호), HybeaconsTM (D. J. French, 등., Molecular and Cellular Probes (2001) 13, 363374 및 미국특허 제7,348,141호), 이중-표지된, 자가-퀀칭 프로브 (미국특허 제5,876,930호), LUXTM (I. A. Nazarenko, 등., Nucleic Acids Res 2002, 30:2089-2095. 및 미국특허 제7,537,886호) 및 혼성화 프로브 (Bernard PS, 등., Clin Chem 2000, 46, 147-148 및 Deepti Parashar 등., Indian J Med Res 124, review article October 2006 385-398)를 포함한다.
일 구현예에 따르면, SO를 이용한 검출은 실시간으로 검출가능한 시그널을 제공하는 표지를 사용하여 실시간 방식으로 실시될 수 있다.
택일적으로, 본 발명에서 사용된 표지는 혼성화 결과물의 멜팅 동안 또는 혼성화 결과물의 멜팅 및 혼성화 동안 검출가능한 시그널을 제공할 수 있기 때문에, SO를 이용한 검출은 멜팅 분석 또는 혼성화 분석에 의해 실시될 수 있다.
일 구현예에 따르면, SO를 이용한 검출은 고상 기질에 고정화된 SO를 이용하여 실시될 수 있다.
혼성화 올리고뉴클레오타이드를 이용한 검출
일 구현예에 따르면, 제1단편의 연장가닥은 혼성화 올리고뉴클레오타이드(hybridizing oligonucleotide; HO)를 이용하여 검출되며; 상기 HO는 CTO에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 최소 하나의 표지를 포함하며; 상기 제1단편의 연장은 5’ 뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 HO의 절단을 유도하여 상기 표지로부터 검출가능한 시그널을 발생시킨다.
일 구현예에 따르면, 상기 HO는 CTO 상의 제1단편의 다운스트림에 위치한다.
일 구현예에 따르면, 상기 HO는 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 단편의 연장을 위해 사용되는 주형-의존적 핵산 중합효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는다.
상기 HO의 길이는 다양할 수 있다. 예를 들어, HO는 5-100 뉴클레오타이드, 5-80 뉴클레오타이드, 5-60 뉴클레오타이드, 5-40 뉴클레오타이드, 5-20 뉴클레오타이드, 5-10 뉴클레오타이드, 10-100 뉴클레오타이드, 10-80 뉴클레오타이드, 10-60 뉴클레오타이드, 10-40 뉴클레오타이드, 10-30 뉴클레오타이드, 10-20 뉴클레오타이드, 15-100 뉴클레오타이드, 15-80 뉴클레오타이드, 15-60 뉴클레오타이드, 15-40 뉴클레오타이드, 15-30 뉴클레오타이드, 15-20 뉴클레오타이드, 20-100 뉴클레오타이드, 20-80 뉴클레오타이드, 20-60 뉴클레오타이드, 20-40 뉴클레오타이드 또는 20-30 뉴클레오타이드의 길이이다.
본 발명의 일 구현예에서, HO는 그의 연장이 방지되도록 3’-말단이 블록킹된다.
간략하게, 본 발명에 유용한 표지 시스템은 다음과 같이 설명될 수 있다:
(i) HO에 연결된 단일 표지
본 발명은 단일 표지를 갖는 HO를 이용하여 타겟 뉴클레오타이드 변이의 존재를 나타내는 연장가닥의 형성에 대한 시그널을 제공할 수 있다.
일 구현예에서, 본 명세서에서 사용된 단일 표지는 그 표지가 이중가닥에 존재하는지 또는 단일 가닥(예컨대, HO 및 HO의 단편)에 존재하는지에 따라 상이한 시그널을 제공할 수 있어야 한다.
일 구현예에 따르면, HO와 CTO 간의 혼성화가 가능한 온도에서 시그널을 검출하는 것이 필요하다.
(ii) HO에 연결된 상호작용적 이중 표지
일 구현예에 따르면, 검출가능한 시그널은 HO에 연결된 상호작용적 이중 표지에 의해 제공된다.
PTO-SNV로부터 방출된 제1단편은 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되고, 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지로 표지된 HO는 CTO의 템플레이팅 부위에 혼성화된다. 상기 제1단편의 연장이 상기 HO의 절단을 유도하여 리포터 분자를 퀀처 분자로부터 분리시키고, 이에 의해 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널이 제공된다.
이와 같은 구현예에서, 이중 표지-연결된 뉴클레오타이드가 서로 상대적으로 근접하는 경우, HO 절단 전과 절단 후 사이의 시그널 변화를 시그널 검출을 위해 이용할 수 있다.
이중 표지-연결된 뉴클레오타이드가 서로 상대적으로 이격된 경우, HO와 CTO 간의 혼성화는 상호작용적 이중 표지의 구조적 분리를 유도하여 HO가 절단되지 않는 경우에도 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하며, 이에 의해 시그널의 변화를 발생시킨다. 이러한 경우, HO의 절단된 단편으로부터의 시그널은 HO와 CTO 간의 혼성화를 방지할 수 있는 보다 높은 온도(예컨대, 95℃)에서 검출될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 절단된 HO 및 비절단된 HO가 구별되는 시그널을 제공할 수 있는 한, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 HO 상의 어떠한 사이트에도 위치할 수 있다.
특정 구현예에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 HO의 양 말단에 각각 위치한다.
(iii) HO 및 CTO에 연결된 상호작용적 이중 표지
일 구현예에 따르면, 하나는 HO에 연결되고 다른 하나는 CTO에 연결된 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지에 의해 검출가능한 시그널이 제공된다.
특정 구현예에서, HO가 CTO에 혼성화되는 경우 리포터 분자로부터의 시그널이 퀀처 분자에 의해 퀀칭되도록, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 HO 및 CTO 상에 위치한다. 제1단편의 연장에 의해 유도된 HO의 절단은 CTO로부터 HO를 방출시키고 리포터 분자를 퀀처 분자로부터 이격시켜, 퀀처 분자가 리포터 분자로부터의 시그널을 언퀀칭하게 하며, 이에 의해 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널을 제공한다.
일 구현예에 따르면, HO와 CTO간의 혼성화가 가능한 온도에서 시그널을 검출하는 것이 필요하다.
일 구현예에서, 상기 HO는 헤어핀 구조를 갖도록 디자인될 수 있다.
특정 구현예에서, 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나는 HO의 3’-말단에 연결되고 다른 하나는 CTO의 5’-말단에 연결된다.
일 구현예에 따르면, 2개의 HO를 사용한 상호작용적-이중 표지와 같은 표지 시스템을 HO를 이용하는 본 발명의 방법에 이용할 수 있다. 절단된 HO 및 비절단된 HO가 구별되는 시그널을 제공할 수 있는 한, 상호작용적-이중 표지는 2개의 HO 상의 어떠한 사이트에도 위치할 수 있다. 표지의 종류 및 위치는 상기 SO의 설명을 참고하여 설명될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 인터컬레이팅 염료를 사용한 FRET와 같은 표지 시스템을 HO를 이용하는 본 발명의 방법에 이용할 수 있다. 절단된 HO 및 비절단된 HO가 인터컬레이팅 염료의 존재하에서 구별되는 시그널을 제공할 수 있는 한, FRET 표지는 HO 상의 어떠한 사이트에도 위치할 수 있다. 표지의 종류 및 위치는 상기 SO의 설명을 참고하여 설명될 수 있다.
택일적으로, 일 구현예에 따르면, HO가 절단되지 않는 경우에도 HO와 CTO의 혼성화의 억제를 이용함으로써 제1단편의 연장가닥이 검출된다. 제1단편의 연장에 의해 형성된 연장이합체는 HO와 CTO의 혼성화를 억제할 수 있다. HO와 CTO의 혼성화 또는 비-혼성화에 따른 시그널 변화는 연장가닥의 존재를 결정할 수 있게 한다. 일 구현예에 따르면, 시그널은 (i) HO에 연결된 표지, (ii) CTO에 연결된 표지, (iii) HO에 연결된 표지 및 CTO에 연결된 표지, 또는 (iv) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 제공된다. 상기 시그널은 HO와 CTO간 혼성화의 발생 또는 비-발생에 의해 변화하며, HO 및 CTO 상의 표지 위치는 상기 SO의 설명을 참고하여 설명될 수 있다.
연장가닥의 크기 또는 서열에 의한 검출
일 구현예에 따르면, 제1단편의 연장가닥은 연장가닥의 크기 또는 서열에 기초하여 검출될 수 있다. 예를 들어, 상기 연장가닥은 전기영동 또는 질량분석(예컨대, 전자 충격(electron impact; EI), 화학적 이온화(chemical ionization; CI), 장 탈착(Field Desorption; FD), 252Cf-플라즈마 탈착(252Cf-Plasma desorption; PD), 탈착 화학적 이온화(desorption chemical ionization; DCI), 이차 이온 질량 분석(secondary ion mass spectrometry; SIMS), 고속 원자 충격(fast atom bombardment; FAB), 전자 분무 이온화(electrospray ionization; ESI), 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화(matrix-assisted laser desorption ionization; MALDI) 및 이중 질량 분석(Tandem Mass Spectrometry))을 이용하여 검출될 수 있다.
고상에서의 검출
일 구현예에 따르면, 본 발명은 고상에서 실시되며 올리고뉴클레오타이드(예컨대, CTO, SO, HO 또는 IO)는 그의 5’-말단 또는 3’-말단을 통하여 고상 기질 상에 고정화된다. 고상에서는, 고상 기질 상에서 제공되는 타겟 시그널을 측정한다.
타겟 시그널을 고상에서 검출하는 경우, 상기 SO 대신 표지가 없는 고정화 올리고뉴클레오타이드(Immobilized Oligonucleotide; IO)를 사용할 수 있다. SO에 대한 설명은 상기 SO에 직접 연결된 표지에 대한 설명을 제외하고, 표지가 없는 SO에 상응하는 IO에 적용될 수 있다.
IO를 이용하는 경우, 상기 연장가닥은 시그널 생성 및 검출을 위한 표지를 가질 수 있다. 일 구현예에 따르면, 상기 연장가닥에 포함된 표지는 (i) PTO-SNV로부터 방출된 단편에 연결된 단일 표지, (ii) 연장반응 동안 연장가닥 내에 삽입될 표지, 또는 (iii) 상기 단편에 연결된 단일 표지 및 연장반응 동안 연장가닥 내에 삽입될 표지의 조합이다. 택일적으로, 연장가닥 및 IO가 모두 표지를 갖지 않는 경우, SYBRTM GreenI과 같은 인터컬레이팅 염료가 이용될 수 있다.
상기 CTO, SO, HO 또는 IO의 고정화는 2가지 방법으로 이루어질 수 있다.
제1방법에서는, 고상 기질 상에 이미 고정화된 CTO, SO, HO 또는 IO가 반응 단계에 관여한다. 제2방법에서는, CTO, SO, HO 또는 IO가 비-고정화된 형태로 관여한 다음, 반응 단계 동안 고상 기질 상에 고정화된다.
일 구현예에 따르면, 고상 반응에서는, 단일 표지를 갖는 핵산 서열이 단일 가닥 내에 있는지 또는 이중 가닥 내에 있는지에 따라 단일 표지가 상이한 강도의 시그널을 제공할 수 있는 능력을 가질 것을 요구하지 않는다. 단일 표지는 화학 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 알카라인 포스파타아제, 퍼록시다제, β-갈락토시다제 및 β- 글루코시다제), 방사성 동위원소 표지(예컨대, I125 및 C14), 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 및 금속 표지(예컨대, 금)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
고상 반응을 위하여, 상기 CTO, SO, HO 또는 IO는 그의 5’-말단 또는 3’-말단(바람직하게는, 3’-말단)을 통하여 고상 기질의 표면 상에 직접적 또는 간접적으로(바람직하게는 간접적) 고정화된다. 또한, 상기 CTO, SO, HO 또는 IO는 공유 또는 비공유결합 방식으로 고상 기질 표면 상에 고정화될 수 있다. 고정화된 올리고뉴클레오타이드가 고상 기질 표면 상에 간접적으로 고정화되는 경우, 적합한 링커를 이용한다. 본 발명에서 유용한 링커는 고상 기질 표면 상의 프로브 고정화에 이용되는 어떠한 링커도 포함할 수 있다. 예를 들어, 아민 관능성을 갖는 알킬 또는 아릴 화합물, 또는 티올 관능성을 갖는 알킬 또는 아릴 화합물이 고정화를 위한 링커로 사용될 수 있다. 또한, poly (T) 테일 또는 poly (A) 테일이 링커로 사용될 수 있으며, 이는 효소 작용(예컨대, 효소의 절단 반응)의 억제 인자인 공간 방해요인을 현저하게 감소시켜 혼성화 효율을 증가시키는데 기여한다. 링커로서 poly (T) 테일 또는 poly (A) 테일은 프로브의 서열로 고려되지 않는다.
일 구현예에 따르면, 상기 CTO, SO, HO 또는 IO는 결합 파트너(예컨대, 바이오틴/스트렙타아비딘) 간의 상호작용을 통하여 고상 기질 상에 고정화될 수 있다. 예를 들어, 결합 파트너(바이오틴 및 스트렙타아비딘) 중 하나를 갖는 CTO, SO, HO 또는 IO는 표면이 다른 결합 파트너로 변형된 고상 기질 상에 고정화될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 CTO, SO, HO 또는 IO는 고정화를 위한 뉴클레오타이드 서열에 의해 고상 기질 상에 고정화될 수 있다. 예를 들어, 고정화를 위한 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 추가 서열을 갖는 CTO, SO, HO 또는 IO를 고정화하기 위하여, 표면이 고정화를 위한 뉴클레오타이드 서열로 변형된 고상 기질이 사용될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 고상 기질은 마이크로어레이이다. 본 발명의 반응 환경을 제공하는 마이크로어레이는 당업자에게 공지된 어떠한 것도 포함할 수 있다. 본 발명의 모든 과정, 즉, 타겟 핵산 서열과의 혼성화, 절단, 연장, 멜팅 및 형광 검출은 마이크로어레이 상에서 실시된다. 마이크로어레이 상에 고정화된 올리고뉴클레오타이드는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용된다. 마이크로어레이를 제작하기 위한 고상 기질은, 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미늄), 금속 옥사이드, 유리, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 및 콜로이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 고상 기질은 딥스틱, 플레이트, 파티클(예컨대, 비드), 친화성 컬럼 및 막(membrane)의 형태일 수 있다. 본 발명의 다수의 고정화된 올리고뉴클레오타이드는, 고상 기질 상의 하나의 어드레서블(addressable) 영역 또는 둘 이상의 어드레서블 영역에 고정화될 수 있으며, 고상 기질은 2-1,000,000 개의 어드레서블 영역을 포함할 수 있다. 포토리토그래피, 잉크-젯팅, 기계적 마이크로스팟팅 및 이의 유사방법과 같은 종래 제작 기술에 의해, 어레이 또는 특정 응용을 위한 어레이를 생산하기 위하여 고정화된 올리고뉴클레오타이드가 제작될 수 있다.
고정화된 올리고뉴클레오타이드 상의 표지가 물리적으로 분리되어 있기 때문에, 고상에서 실시하는 본 발명은 한 종류의 표지를 이용하더라도 다수의 타겟 핵산 서열을 동시적으로 검출할 수 있다. 이와 관련하여, 고상에서 본 발명에 의하여 검출가능한 타겟 핵산 서열의 수는 제한되지 않는다.
공초점 검출 기기를 이용하여, 액상에 현탁된 표지의 영향 없이 고상 기질 상의 시그널만을 검출할 수 있다.
시그널의 유형 및 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널 강도의 수치적 특징들은 표지의 종류 및 검출방법에 따라 다양할 수 있다.
본 발명의 방법은 형광 표지, 발광 표지(예컨대, 생물발광, 화학발광, 전기화학발광), 전기화학적 표지, 금속 표지, 화학적 표지(예컨대, 바이오틴) 및 효소적 표지(예컨대, 알카라인 포스파타아제, 퍼록시다제, β-갈락토시다제 및 β- 글루코시다제)와 같은 다양한 표지를 이용할 수 있다.
시그널의 검출은 엔드-포인트 방식 또는 실시간-방식으로 실시될 수 있다. 상기 시그널은 추가적인 처리 없이 또는 특정 처리(예컨대, 멜팅 분석)하여 사용될 수 있다.
예를 들어, 형광 표지를 이용하는 본 발명의 방법은 상기 표지로부터 형광 시그널을 검출할 수 있으며 반응 후 형광 시그널의 강도를 측정할 수 있다. 이러한 경우, 시그널의 유형은 형광이며 시그널의 강도는 형광 강도이다.
형광 표지를 이용하는 본 발명의 방법이 실시간 PCR 분석으로 Ct 값을 이용하는 경우, 시그널의 유형은 Ct 또는 형광이며 시그널의 강도는 Ct 값이다.
또한, 형광 표지를 이용하는 본 발명의 방법은 상기 표지로부터 형광 시그널을 검출하고 형광 시그널을 처리(processing)한 후 멜팅 피크를 생성할 수 있다. 이러한 경우, 시그널의 유형은 멜팅 피크이며 시그널의 강도는 멜팅 피크의 높이 또는 면적이다.
일 구현예에 따르면, 시그널은 형광 표지로부터 제공되는 형광 시그널이며 시그널의 강도는 형광 표지의 형광 강도이다. 형광 시그널의 강도는 실시간 방식 또는 엔드-포인트 방식으로 검출될 수 있다.
상기 상호작용적 표지 시스템의 대표적 예로서, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 시스템은 형광 리포터 분자(공여체 분자) 및 퀀처 분자(수용체 분자)를 포함한다. FRET에서 에너지 공여체는 형광성이나, 에너지 수용체는 형광성 또는 비-형광성일 수 있다. 상호작용적 표지 시스템의 다른 형태에서, 에너지 공여체는 비-형광성, 예컨대, 발색단(chromophore)이고 에너지 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템의 또 다른 형태에서, 에너지 공여체는 발광성(luminescent), 예컨대, 생물발광성, 화학발광성, 전기화학발광성이며 수용체는 형광성이다. 상호작용적 표지 시스템은 “접촉-매개 퀀칭(on contact-mediated quenching)”에 기반한 이중 표지를 포함한다(Salvatore 등, Nucleic Acids Research, 2002 (30) no.21 e122 및 Johansson 등, J. AM. CHEM. SOC 2002 (124) pp 6950-6956). 상호작용적 표지 시스템은 시그널 변화가 최소 2개 분자들(예컨대, 염료) 간의 상호작용에 의해 유도되는 어떠한 표지 시스템도 포함한다.
본 발명에서 유용한 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 알려진 어떠한 분자도 포함할 수 있다. 그 예는 다음과 같다: Cy2™(506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™(525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™(576), Pyronin Y(580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), Rphycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™(670), Thiadicarbocyanine (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluorescein (520), Fluorescein-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) 및 Quasar 705 (610). 괄호 안의 숫자는 나노미터 단위의 최대 발광 파장이다. 바람직하게는, 리포터 분자 및 퀀처 분자는 JOE, FAM, TAMRA, ROX 및 플루오레세인-기반 표지를 포함한다.
적합한 형광 분자 및 적합한 리포터-퀀처 쌍은 다음과 같이 다양한 문헌에 개시되어 있다: Pesce 등, editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White 등, Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996); 미국 특허 제3,996,345호 및 제4,351,760호.
다양한 범위의 파장 또는 특정한 파장의 형광을 퀀칭할 수 있는 비-형광 퀀처 분자(예컨대, 블랙 퀀처 또는 다크 퀀처)가 본 발명에서 이용될 수 있다는 것은 주목할 만하다.
리포터 및 퀀처 분자를 포함하는 시그널링 시스템에서, 리포터는 FRET의 공여체를 포함하고 퀀처는 FRET의 나머지 파트너(수용체)를 포함한다. 예를 들어, 플루오레세인 염료(fluorescein dye)는 리포터로 이용되며, 로다민 염료(rhodamine dye)는 퀀처로 이용된다.
상호작용적 이중 표지는 이합체 중 한 가닥에 연결될 수 있다. 상호작용적 이중 표지를 포함하는 가닥이 단일 가닥 상태로 남아있는 경우, 그것은 헤어핀 또는 랜텀 코일 구조를 형성하여 상호작용적 이중 표지 간의 퀀칭을 유도한다. 상기 가닥이 이합체를 형성하는 경우, 퀀칭은 없어진다. 택일적으로, 상호작용적 이중 표지가 상기 가닥 상에 근접하게 위치한 뉴클레오타이드에 연결되는 경우, 상호작용적 이중 표지 간의 퀀칭이 발생한다. 상기 가닥이 이합체를 형성한 다음 절단되면, 퀀칭이 없어진다.
상호작용적 이중 표지 각각은 이합체의 두 가닥의 각각에 연결될 수 있다. 상기 이합체의 형성은 퀀칭을 유도하며, 상기 이합체의 변성은 언퀀칭을 유도한다. 택일적으로, 두 가닥 중 하나가 절단되면, 언퀀칭이 유도된다.
본 발명에서 유용한 인터컬레이팅 염료의 예는 SYBRTM Green I, PO-PRO™-1, BO-PRO™-1, SYTOTM43, SYTOTM44, SYTOTM45, SYTOXTMBlue, POPO™-1, POPO™-3, BOBO™-1, BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, YO-PROTM1, TO-PROTM1, SYTOTM11, SYTOTM13, SYTOTM15, SYTOTM16, SYTOTM20, SYTOTM23, TOTO™-3, YOYOTM3, GelStarTM 및 싸이아졸 오렌지(thiazole orange)를 포함한다. 인터컬레이팅 염료는 이중-가닥 핵산 분자 내에 특이적으로 삽입되어 시그널을 발생시킨다.
단계 (f): SNP 유전자형의 결정
최종적으로, 상기 단계 (e)에서 검출된 시그널의 존재 또는 부존재 뿐만 아니라 시그널의 강도에 의해 타겟 핵산 서열의 SNP 유전자형이 결정된다.
시그널이 가장 높은 강도를 나타내는 경우, 타겟 핵산 서열은 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 동형접합인 것으로 결정된다. 시그널이 검출되지 않는 경우, 타겟 핵산 서열은 관심 있는 SNP 대립 유전자를 갖지 않는 것으로 결정된다. 시그널의 강도가 관심 있는 대립 유전자에 대해 동형접합인 타겟 핵산 서열의 시그널 강도보다 낮은 경우, 타겟 핵산 서열은 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 이형접합인 것으로 결정된다(도 4 참조).
예를 들어, SNP 사이트에서 2개의 SNP 뉴클레오타이드, G 및 A가 발견되는 경우, 본 발명의 방법은 SNP 유전자형 분석 반응에서 오직 하나의 대립 유전자-특이적 PTO-SNV를 이용하여 3개의 SNP 유전자형(즉, GG, GA 및 AA) 모두를 결정할 수 있다. PTO-SNV가 타겟 핵산 상의 관심 있는 SNP 대립 유전자의 SNP 사이트에 존재하는 SNP 뉴클레오타이드(예컨대, G)에 상보적인 뉴클레오타이드(예컨대, C)를 포함하는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트를 포함하는 경우, 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 동형접합인 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 강도가 가장 높게 검출된다. 따라서, 분석되는 타겟 핵산 서열은 “GG” 유전자형을 갖는 것으로 결정된다. 시그널의 강도가 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 동형접합인 타겟 핵산 서열의 시그널 강도보다 낮게 검출되는 경우, 타겟 핵산 서열은 “GA” 유전자형을 갖는 것으로 결정된다. 시그널이 검출되지 않는 경우, 타겟 핵산 서열은 “AA” 유전자형을 갖는 것으로 결정된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, SNP 유전자형 분석을 위한 샘플은 3개의 SNP 유전자형 가운데 하나의 유전자형을 갖는다. 샘플로부터 준비된 핵산 분자를 첫 번째 대립 유전자 및 두 번째 대립 유전자를 포함하는 2 유형의 대립 유전자들 가운데 첫 번째 대립 유전자에 특이적으로 혼성화되는 프로브를 이용하여 분석하고, 시그널 강도를 측정하는 경우, 첫 번째 대립유전자의 동형접합체로부터의 강도가 이형접합체로부터의 강도보다 약 두 배 더 높으며, 두 번째 대립유전자의 동형접합체로부터의 강도는 영(0)이라는 것을 이론적으로 이해할 수 있다.
상기 예시한 경우의 일 구현예에 따르면, 첫 번째 대립 유전자의 동형접합체로부터의 강도는 이형접합체로부터의 강도보다 최소 1.3-배, 1.4-배, 1.5-배, 1.6-배, 1.7-배 또는 1.8-배 더 높으며, 첫 번째 대립 유전자의 동형접합체로부터의 강도는 이형접합체로부터의 강도보다 최대 2.7-배, 2.6-배, 2.5-배, 2.4-배, 2.3-배 또는 2.2-배 더 낮다.
상기 예시한 경우의 일 구현예에 따르면, 두 번째 대립 유전자의 동형접합체로부터의 강도는 이형접합체로부터의 강도보다 최소 0.4-배, 0.3-배, 0.2-배 또는 0.1-배 더 낮다.
상기 예시한 경우의 일 구현예에 따르면, 샘플로부터의 강도는 3 영역(높은 강도 영역, 중간 강도 영역 및 낮은 강도 영역)으로 분류될 수 있으며, SNP 유전자형 분석은 3 영역 중 어떤 영역에서 시그널이 검출되는지 결정하는 것에 의해 이루어질 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명의 방법은 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널의 존재뿐만 아니라 강도를 측정함으로써, 하나의 SNP 유전자형 분석 반응에서 오직 하나의 대립 유전자-특이적 PTO-SNV를 이용하는 SNP 유전자형 분석을 가능하게 한다.
종래의 SNP 유전자형 분석 방법들은 각 대립 유전자를 나타내는 시그널(형광 또는 특정 Tm 값에서의 멜팅 피크)의 존재 또는 부존재만을 분석하기 위해 제공되었다. 이러한 방법들은 시그널의 강도를 이용하는 SNP 유전자형 분석 접근법을 제시하거나 교시하지 않았다. 본 발명은 한 유형의 대립 유전자에 대한 시그널의 존재 또는 부존재뿐만 아니라 시그널 강도를 측정함으로써 모든 대립 유전자들에 대해 독특하고 실시가능한 SNP 유전자형 분석을 제시한다.
본 발명자들이 아는 한, 본 발명의 방법은 하나의 SNP 유전자형 분석 반응에서 오직 하나의 대립 유전자-특이적 올리고뉴클레오타이드(즉, PTO-SNV)만을 이용하는 SNP 유전자형 분석 방법을 최초로 제안한 것이다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 SNP에서 발견된 복수의 SNP 뉴클레오타이드 중 단일 SNP 뉴클레오타이드를 검출하기 위하여 실시된다.
일 구현예에 따르면, SNP 유전자형을 결정하기 위한 참조 값 또는 범위로서 역치(threshold) 값 또는 범위를 본 발명의 실시 전에 미리 정할 수 있다. 역치 값의 유형은 형광 시그널 강도, Ct 값, 및 멜팅 분석 또는 혼성화 분석에서 피크의 높이 또는 면적을 포함한다. 역치 값들의 제공은 시약 농도, 반응 시간 및 반응 온도와 같은 반응 조건에 관한 정보를 동반할 수 있다.
일 구현예에 따르면, SNP 유전자형을 결정하기 위한 참조 값을 제공하기 위해 유전자형이 미리 결정된 핵산 분자들에 대한 반응을 실시할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 특정 조건하에서 표준 샘플들을 이용하여 각 SNP 유전자형에 대한 시그널 강도 값 또는 범위(역치 값 또는 범위)를 결정한다. 그 다음, 표준 샘플들의 각 SNP 유전자형에 관한 시그널 강도 값 또는 범위를 참조하여 상기 조건하에서 얻어진 미지의 샘플들의 시그널 강도로부터 SNP 유전자형 분석을 실시한다. 표준 샘플들의 시그널 강도 값 또는 범위를 결정하기 위한 조건들은 “표준 조건”으로 표현될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열의 초기 양이 다른 경우에도 SNP 유전자형에 따른 시그널 강도의 차이가 유지될 수 있다. 예를 들어, 타겟 핵산 서열의 초기 양이 다른 것만을 제외하고 배치(batch)에서의 반응 조건이 동일하다. 이러한 특징은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방식으로 SNP 유전자형을 분석할 수 있게 한다.
일 구현예에 따르면, 연장가닥은 PTO-SNV 단편과 프라이머 쌍을 형성하는 프라이머를 이용하여 추가적으로 증폭될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 최소 2종의 SNP를 검출하기 위해 실시되고; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하며 PTO-SNV는 최소 2종의 PTO-SNV를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재하에서 실시된다.
PTO-SNV 및 CTO는 자연(naturally occurring) dNMPs를 포함할 수 있다. 택일적으로, PTO-SNV 및 CTO는 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드, 예컨대, PNA(Peptide Nucleic Acid, PCT 출원 제WO 92/20702호 참조) 및 LNA(Locked Nucleic Acid, PCT 출원 제WO 98/22489호, 제WO 98/39352호 및 제WO 99/14226호 참조)를 포함할 수 있다. PTO-SNV 및 CTO는 데옥시이노신, 이노신, 1-(2’-데옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 및 5-니트로인돌과 같은 유니버설 염기를 포함할 수 있다. 용어 “유니버설 염기(universal base)”는 각각의 자연 DNA/RNA 염기들과 거의 구별 없이 염기 쌍을 형성할 수 있는 것을 의미한다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(e)의 전부 또는 일부를 반복하는 단계를 추가적으로 포함한다. 상기 반응 반복은 타겟 핵산 서열의 증폭을 동반한다. 바람직하게는, 상기 증폭은 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시한다.
상기 변성은 가열, 알칼리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법 (예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하는 종래의 기술에 의해 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 멜팅은 80-105℃의 온도 범위에서 가열하여 달성될 수 있다. 이러한 처리를 달성하기 위한 일반적인 방법은 문헌[Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)]에 개시되어 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)-(e)는 하나의 반응 용기 또는 개별 반응 용기들에서 실시된다. 예를 들면, 상기 단계 (a)-(b), (c)-(d) 또는 (e)는 서로 다른 용기에서 실시될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)-(e)는 반응 조건(특히, 온도)에 따라 하나의 반응 용기에서도 동시적 또는 개별적으로 진행될 수 있다. 예를 들어, 상기 단계 (a)-(b) 및 (c)-(e)는 반응 조건(특히, 온도)에 따라 하나의 반응 용기에서도 동시적 또는 개별적으로 진행될 수 있다.
본 발명은 검출 및/또는 증폭되는 타겟 핵산 서열이 어떠한 특정 서열 또는 길이를 가질 것을 요구하지 않으며, 상기 타겟 핵산 서열은 모든 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포함한다.
검출 및/또는 증폭되는 타겟 핵산 서열은 모든 자연(naturally occurring) 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산 또는 바이러스(예컨대, 인간 포미 바이러스, 인간 T-림프친화 바이러스, 및 HIV 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다.
본 발명에 의하여 검출되는 타겟 핵산 서열은 다양한 핵산 서열, 예컨대, 지놈 내 서열을 포함한다.
SNP 유전자형 분석을 위한 샘플은 배수성 세포, 바람직하게는 이배체 세포(diploid cell)를 포함한다.
본 발명은 타겟 핵산 서열을 합성할 수 있는 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머로 구성된 프라이머 쌍을 이용하는 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 동시에 실시될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 유전자형을 결정하는 방법을 제공한다:
(a) SNP를 포함하는 타겟 핵산 서열을 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍 및 단일 뉴클레오타이드 변이에 대한 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide for Single Nucleotide Variation; PTO-SNV)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 업스트림 프라이머 및 상기 다운스트림 프라이머는 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 상기 PTO-SNV는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위, (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위, 및 (iii) 상기 타겟 핵산 서열 상의 관심 있는 SNP 대립 유전자의 SNP 사이트에 존재하는 SNP 뉴클레오타이드에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치하는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며; 상기 PTO-SNV는 상기 업스트림 프라이머 및 상기 다운스트림 프라이머 사이에 위치하며; 상기 PTO-SNV는 그의 연장이 방지되도록 3’-말단이 블록킹되며;
(b) 상기 프라이머의 연장 및 상기 PTO-SNV의 절단을 위한 조건하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 PTO-SNV가 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 관심 있는 SNP 대립 유전자에 혼성화되면, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 상기 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성하여 제1초기 절단 사이트로부터 절단을 유도하고, 제1단편이 방출되며; 상기 PTO-SNV가 관심 있는 SNP 대립 유전자와는 상이하고 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 SNP 대립 유전자에 혼성화되면, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 상기 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성하지 않아 상기 제1초기 절단 사이트의 다운스트림에 위치하는 제2초기 절단 사이트로부터 절단을 유도하고, 제2단편이 방출되며; 상기 제2단편은 추가적인 3’-말단 부위를 포함하고, 이는 상기 제2단편이 상기 제1단편과 다르도록 하며;
(c) 상기 PTO-SNV로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide; CTO)를 혼성화시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’순서로 (i) 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO-SNV로부터 방출된 상기 제1단편 또는 상기 제2단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 제1단편이 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되면, 상기 제1단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 형성하고; 상기 제2단편이 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되면, 상기 제2단편은 연장되지 않으며;
(e) 상기 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 동형접합(homogygous)인 타겟 핵산 서열은 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 이형접합(heterozygous)인 타겟 핵산 서열보다 더 높은 강도의 시그널을 나타내고, 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자를 갖지 않는 타겟 핵산 서열은 시그널을 제공하지 않으며;
(f) 상기 단계 (e)에서 검출된 시그널의 강도에 의해 타겟 핵산 서열 내의 SNP 유전자형을 결정하는 단계.
본 발명은 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 동시에 상술한 본 발명의 단계들을 따르므로, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(e)의 전부 또는 일부를 반복하는 단계를 추가적으로 포함한다. 상기 반응 반복은 타겟 핵산 서열의 증폭을 동반한다. 바람직하게는, 상기 증폭은 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시한다.
일 구현예에 따르면, 본 발명은 업스트림 뉴클레오타이드의 도움 없이 실시될 수 있다. 이러한 경우, 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 갖는 종래의 효소들을 이용할 수 있다. 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 중합효소 가운데, 업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성을 갖는 몇몇의 효소들이 있으며, 예컨대, Taq DNA 중합효소가 있다.
타겟 핵산 서열의 증폭, 반응 조건 및 5’뉴클레아제 활성을 고려하면, 본 발명은 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 실시하는 것이 더 유리하다.
업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성에 기초한 SNP 유전자형 결정방법은 다음을 포함한다:
(a) SNP를 포함하는 타겟 핵산 서열을 단일 뉴클레오타이드 변이에 대한 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide for Single Nucleotide Variation; PTO-SNV)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 PTO-SNV는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위, (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위, 및 (iii) 상기 타겟 핵산 서열 상의 관심 있는 SNP 대립 유전자의 SNP 사이트에 존재하는 SNP 뉴클레오타이드에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치하는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며;
(b) 상기 PTO-SNV의 절단을 위한 조건하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 PTO-SNV가 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 관심 있는 SNP 대립 유전자에 혼성화되면, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 상기 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성하여 제1초기 절단 사이트로부터 절단을 유도하고, 제1단편이 방출되며; 상기 PTO-SNV가 관심 있는 SNP 대립 유전자와는 상이하고 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 SNP 대립 유전자에 혼성화되면, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 상기 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성하지 않아 상기 제1초기 절단 사이트의 다운스트림에 위치하는 제2초기 절단 사이트로부터 절단을 유도하고, 제2단편이 방출되며; 상기 제2단편은 추가적인 3’-말단 부위를 포함하고, 이는 상기 제2단편이 상기 제1단편과 다르도록 하며;
(c) 상기 PTO-SNV로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide; CTO)를 혼성화시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’순서로 (i) 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO-SNV로부터 방출된 상기 제1단편 또는 상기 제2단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 제1단편이 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되면, 상기 제1단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 형성하고; 상기 제2단편이 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되면, 상기 제2단편은 연장되지 않고;
(e) 상기 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 동형접합(homogygous)인 타겟 핵산 서열은 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 이형접합(heterozygous)인 타겟 핵산 서열보다 더 높은 강도의 시그널을 나타내고, 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자를 갖지 않는 타겟 핵산 서열은 시그널을 제공하지 않으며;
(f) 상기 단계 (e)에서 검출된 시그널의 강도에 의해 타겟 핵산 서열 내의 SNP 유전자형을 결정하는 단계.
업스트림 올리고뉴클레오타이드-독립적 5’뉴클레아제 활성에 기초한 본 발명의 방법은 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 이용하지 않는 것 외에는 업스트림 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 방법과 동일하기 때문에, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 다음을 포함하는 SNP 유전자형을 결정하기 위한 키트를 제공한다:
(a) 단일 뉴클레오타이드 변이에 대한 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide for Single Nucleotide Variation; PTO-SNV); 상기 PTO-SNV는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위, (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위, 및 (iii) 상기 타겟 핵산 서열 상의 관심 있는 SNP 대립 유전자의 SNP 사이트에 존재하는 SNP 뉴클레오타이드에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치하는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며;
(b) 업스트림 올리고뉴클레오타이드; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO-SNV의 업스트림에 위치하며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO-SNV의 절단을 유도하며;
(c) 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide; CTO); 상기 CTO는 3’→5’순서로 (i) 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO-SNV로부터 방출된 상기 제1단편 또는 상기 제2단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
(d) 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항의 방법을 기재한 설명서.
본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 실시하기 위해 제작되므로, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
일 구현예에 따르면, 상기 키트는 상기 5’ 뉴클레아제 활성을 갖는 효소, 주형-의존적 핵산 중합효소 또는 이들의 조합을 추가적으로 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 키트는 SO, HO, IO 또는 삽입되는 표지를 추가적으로 포함한다.
선택적으로, 상술한 키트는 버퍼, DNA 중합효소 보조인자 및 데옥시리보뉴클레오타이드-5-트리포스페이트와 같은 타겟 증폭 PCR 반응(예컨대, PCR 반응)을 실시하는데 필요한 시약들을 선택적으로 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 키트는 또한 다양한 폴리뉴클레오타이드 분자, 역전사효소, 다양한 버퍼 및 시약, 및 DNA 중합효소 활성을 억제하는 항체를 포함할 수 있다. 또한 상기 키트는 양성 대조군 및 음성 대조군 반응을 실시하는 데 필요한 시약을 포함할 수 있다. 특정 반응에서 사용되는 시약의 최적량은 본 개시사항의 이점을 알고 있는 당업자에 의해서 용이하게 결정될 수 있다. 상기 키트의 구성성분들은 개별 용기 내에 존재하거나 복수의 구성성분들이 단일 용기 내에 존재할 수 있다.
본 발명의 방법을 기술하거나 실시하기 위한 상기 설명서는 적합한 기록 매체에 기록될 수 있다. 예를 들어, 설명서는 종이 및 플라스틱과 같은 기질에 인쇄될 수 있다. 다른 구현예에서, 설명서는 CD-ROM 및 디스켓과 같은 적합한 컴퓨터 기록저장 매체상의 전자 저장 데이터파일로 존재할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 키트 내에 실질적인 설명서는 포함되지 않으며, 다만 원격 소스로부터 설명서를 얻는 수단, 예컨대 인터넷을 통한 수단이 제공된다. 상기 구현예의 한 예는 설명서를 볼 수 있는 웹 주소 및/또는 설명서를 다운로드할 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 샘플 내의 복수의 SNP에 대한 SNP 유전자형 분석이 동시에 실시되는 경우(즉, 멀티플렉스 SNP 유전자형 분석), 종래의 기술은 모든 SNP에 대한 모든 대립 유전자들에 대해 구별되는 시그널을 생성해야만 한다. 따라서, 종래의 방법은 멀티플렉스 SNP 유전자형 분석을 위한 SNP의 수에 있어 한계에 봉착할 가능성이 매우 높다. 반면, 본 발명의 방법은 오직 하나의 대립 유전자를 검출하여 SNP 유전자형을 결정할 수 있기 때문에, 상대적으로 많은 수의 SNP에 대한 멀티플렉스 SNP 유전자형 분석을 가능하게 한다.
(b) 본 발명은 복수의 표지 시스템을 이용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, PTO-SNV, CTO, SO, 및/또는 HO의 어떤 사이트에 연결된 표지도 연장가닥을 나타내는 타겟 시그널을 제공하기 위해 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에서는 연장반응 동안 연장이합체에 삽입된 표지가 이용될 수 있다. 이에 추가하여, 이러한 표지들의 조합이 이용될 수도 있다. 본 발명에 적용 가능한 다양한 표지 시스템은 실험 조건 또는 목적에 따라 적절한 표지 시스템을 선택할 수 있게 해준다.
(c) PTO-SNV의 5’-태깅 부위 서열 및 CTO의 서열을 타겟 핵산 서열을 고려하지 않고 선택할 수 있다는 것은 주목할 만하다. 이는 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 및 CTO를 위한 서열 풀(pool)을 미리-디자인하는 것을 가능하게 한다. PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위는 타겟 핵산 서열을 고려하여 준비되어야 하지만, CTO는 타겟 핵산 서열에 대한 고려나 지식 없이 미리-제작된 방법으로 준비될 수 있다. 이러한 특징은 특히, 고상 기질 상에 고정화된 CTO를 이용하는 마이크로 어레이 상에서의 복수의 타겟 검출에 현저한 이점을 제공한다.
도 1은 본 발명에 이용되는 단일 뉴클레오타이드 변이를 위한 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide for Single Nucleotide Variation; PTO-SNV) 및 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide; CTO)의 도식적인 구조를 보여준다. 바람직하게는, PTO-SNV 및 CTO의 3’-말단은 그의 연장이 방지되도록 블록킹된다.
도 2 및 3은 단일 뉴클레오타이드 변이(single nucleotide polymorphism; SNP) 유전자형을 결정하는 본 발명의 방법을 도식적으로 보여준다.
도 4는 본 발명의 방법에 의한 메틸렌사수소 엽산 환원효소(Methylenetetrahydrofolate reductase; MTHFR) 유전자에서 SNP의 대립 유전자 구별 결과를 보여준다.
실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 첨부된 청구항에 제시된 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.
실시예
실시예 1: 한 유형의 PTO-SNV를 이용한 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)의 대립 유전자 구별에 대한 평가
본 발명자들은 한 유형의 PTO-SNV를 이용한 방법으로 타겟 핵산 서열의 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 유전자형 분석이 가능한지를 실험하였다.
본 발명의 SNP 유전자형 분석(genotyping) 방법은 하나의 대립 유전자만을 검출함으로써 두 개 또는 그 이상의 대립 유전자의 SNP 유전자형 분석을 가능하게 한다. 예를 들어, 돌연변이 대립 유전자에 특이적인 PTO-SNV를 이용하는 경우, 본 발명의 방법은 돌연변이 대립 유전자에 대해 동형접합 또는 이형접합인 핵산 서열에 대한 시그널을 최종적으로 제공한다. 돌연변이 대립 유전자에 대해 동형접합인 핵산 서열은 돌연변이 대립 유전자에 대해 이형접합인 핵산 서열과는 상이한 돌연변이 대립 유전자 비율을 가지기 때문에, 생성된 연장가닥의 양이 서로 상이하다. 최종 검출된 시그널의 강도는 연장가닥의 양에 비례하며, 따라서 돌연변이 동형접합체는 돌연변이 이형접합체보다 더 높은 시그널 강도를 나타낸다. 상기 시그널 강도의 차이가 돌연변이 동형접합체와 돌연변이 이형접합체의 구별을 가능하게 한다. 야생형 동형접합체는 시그널을 제공하지 않는다.
업스트림 프라이머와 다운스트림 프라이머의 연장, PTO-SNV의 절단 및 PTO-SNV 단편의 연장을 위해 5’뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 사용하였다. PTO-SNV 및 CTO는 그의 3’-말단이 카본 스페이서(carbon spacer)로 블록킹되어 있다. MTHFR C677T 야생형 동형접합(CC), 이형접합(CT) 및 돌연변이 동형접합(TT)인 인간 지노믹 DNA를 타겟 DNA로 사용하였다.
PTO-SNV는 표지를 갖지 않는다. PTO-SNV의 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 MTHFR C677T의 돌연변이 대립 유전자의 SNP 뉴클레오타이드(T)에 상보적인 뉴클레오타이드(A)를 갖는다(서열번호: 3).
본 실시예에서, MTHFR C677T의 돌연변이(T) 대립 유전자의 존재에 따라 생성된 연장가닥의 존재를 연장가닥과 CTO로 형성된 연장이합체의 멜팅분석에 의해 검출하였다. 타겟 DNA에서 MTHFR C677T의 대립 유전자의 조성(즉, 야생형 동형접합체(CC); 이형접합체(CT); 및 돌연변이 동형접합체(TT))에 따라 서로 다른 멜팅 피크 높이가 얻어질 것이다.
CTO는 그의 템플레이팅 부위를 퀀처 분자(BHQ-2) 및 형광 리포터 분자(Cal Fluor Red 610)로 표지한다(서열번호: 4).
본 실시예에서 사용한 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO-SNV 및 CTO의 서열은 다음과 같다:
MTHFR-F 5’- GCAGGGAGCTTTGAGGCTGIIIIIAAGCACTTGA-3’ (서열번호: 1)
MTHFR-R 5’- CCTCACCTGGATGGGAAAGATIIIIIGGACGATGG-3’ (서열번호: 2)
MTHFR-PTO-SNV 5’- CTCCTGCTCGCGT ACTCCCGCAGACACCTTCTCCTTCAAG[Spacer C3]-3’ (서열번호: 3)
MTHFR-CTO 5’- [BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[T(Cal Fluor Red 610)]
CTTATACGCGAGCAGGAG[Spacer C3]-3’ (서열번호: 4)
(I: 데옥시이노신)
(밑줄친 문자는 PTO-SNV의 5’-태깅 부위를 가리킨다)
(굵은 문자는 뉴클레오타이드 구별 사이트를 가리킨다)
MTHFR C677T 야생형 동형접합(CC), 이형접합(CT) 또는 돌연변이 동형접합(TT)인 인간 지노믹 DNA 100 ng, 업스트림 프라이머(서열번호: 2) 10 pmole, 다운스트림 프라이머(서열번호: 1) 10 pmole, PTO-SNV(서열번호: 3) 2 pmole, CTO(서열번호: 4) 1 pmole, 및 2X 마스터 믹스(2.5 mM MgCl2, 200 μM dNTPs, 1.6 unit의 Taq DNA 중합효소)(Solgent, Korea) 10 ㎕를 함유한 20 ㎕의 최종 부피로 반응을 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하고 있는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96, Bio-Rad)에 위치시켰다. 상기 반응 혼합물을 95℃에서 15 분간 변성시키고 95℃에서 30 초, 60℃에서 60 초, 72℃에서 30 초 과정을 50 사이클 반복하였다. 반응 후, 상기 반응 혼합물을 55℃로 냉각시키고, 55℃에서 30 초간 유지시킨 다음, 55℃에서 85℃로 천천히 가열함으로써 멜팅 커브를 얻었다. 온도가 상승하는 동안 형광을 연속적으로 측정하여 이중-가닥 DNA의 해리를 모니터링하였다. 멜팅 피크는 멜팅 커브 데이터로부터 얻었다.
도 4에서 보여주는 바와 같이, 돌연변이 동형접합(TT) 및 이형접합(CT)인 DNA가 존재하는 경우, 연장이합체의 예상 Tm 값에 해당하는 피크가 검출되었다. 이형접합(CT)인 DNA의 피크 높이는 돌연변이 동형접합(TT)인 DNA의 거의 절반이었다. 야생형 동형접합(CC)인 DNA가 존재하는 경우, 어떠한 피크도 검출되지 않았다. 타겟 DNA가 존재하지 않는 경우에는 어떠한 피크도 검출되지 않았다.
이러한 결과들은 한 유형의 PTO-SNV를 사용한 상기 방법에서, 서로 다른 SNP 유전자형들이 구별 가능한 시그널 강도(예컨대, 멜팅 피크 높이)를 제공한다는 것을 보여주며, 이는 SNP의 대립 유전자 구별을 가능하게 한다.
본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 기술하였는바, 본 발명의 원리를 따르는 변형 및 수정이 가능함은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의해 정의된다고 할 것이다.
<110> SEEGENE, INC. <120> METHOD FOR DETERMINING SNP GENOTYPE <130> PI150045 <150> US 61/860,294 <151> 2013-07-31 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MTHFR-F <220> <221> misc_feature <222> (19)..(24) <223> n denotes deoxyinosine <400> 1 gcagggagct ttgaggctgn nnnnaagcac ttga 34 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MTHFR-R <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 2 cctcacctgg atgggaaaga tnnnnnggac gatgg 35 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MTHFR-PTO-SNV <400> 3 ctcctgctcg cgtactcccg cagacacctt ctccttcaag 40 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MTHFR-CTO <400> 4 tttttttttt tttttttttt tcttatacgc gagcaggag 39

Claims (27)

  1. 다음 단계를 포함하는 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 유전자형을 결정하는 방법:
    (a) SNP를 포함하는 타겟 핵산 서열을 업스트림 올리고뉴클레오타이드 및 단일 뉴클레오타이드 변이에 대한 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide for Single Nucleotide Variation; PTO-SNV)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 상기 PTO-SNV는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위, (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위, 및 (iii) 상기 타겟 핵산 서열 상의 관심 있는 SNP 대립 유전자의 SNP 사이트에 존재하는 SNP 뉴클레오타이드에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치하는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트(single nucleotide variation discrimination site)를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO-SNV의 업스트림에 위치하며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO-SNV의 절단을 유도하며;
    (b) 상기 PTO-SNV의 절단을 위한 조건하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 PTO-SNV가 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 관심 있는 SNP 대립 유전자에 혼성화되면, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 상기 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성하여 제1초기 절단 사이트로부터 절단을 유도하고, 제1단편이 방출되며; 상기 PTO-SNV가 관심 있는 SNP 대립 유전자와는 상이하고 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 SNP 대립 유전자에 혼성화되면, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 상기 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성하지 않아 상기 제1초기 절단 사이트의 다운스트림에 위치하는 제2초기 절단 사이트로부터 절단을 유도하고, 제2단편이 방출되며; 상기 제2단편은 추가적인 3’-말단 부위를 포함하고, 이는 상기 제2단편이 상기 제1단편과 다르도록 하며;
    (c) 상기 PTO-SNV로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide; CTO)를 혼성화시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’순서로 (i) 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO-SNV로부터 방출된 상기 제1단편 또는 상기 제2단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
    (d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 제1단편이 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되면, 상기 제1단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 형성하고; 상기 제2단편이 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되면, 상기 제2단편은 연장되지 않으며;
    (e) 상기 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 동형접합(homogygous)인 타겟 핵산 서열은 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 이형접합(heterozygous)인 타겟 핵산 서열보다 더 높은 강도의 시그널을 나타내고, 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자를 갖지 않는 타겟 핵산 서열은 시그널을 제공하지 않으며;
    (f) 상기 단계 (e)에서 검출된 시그널의 강도에 의해 타겟 핵산 서열 내의 SNP 유전자형을 결정하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제2단편이 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화될 때 상기 제2단편이 연장되는 것을 방지하기 위해, 상기 CTO가 상기 제2단편의 추가적인 3’-말단 부위와 혼성화되지 않도록 선택된 서열을 상기 CTO가 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트는 상기 PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단으로부터 10 뉴클레오타이드 이내로 이격되어 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 PTO-SNV의 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부는 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트로부터 1 내지 5 뉴클레오타이드 이내로 이격되어 위치하는 비-염기 쌍 모이어티(moiety)를 포함하고, 상기 비-염기 쌍 모이어티는 상기 제1초기 절단 사이트 및 상기 제2초기 절단 사이트 간 차이(differentiation)를 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 비-염기 쌍 모이어티는 (ⅰ) 인위적인 미스매치 염기, 염기 쌍을 형성할 수 없도록 변형된 비-염기 쌍 염기 또는 유니버설 염기를 포함하는 뉴클레오타이드, (ⅱ) 염기 쌍을 형성할 수 없도록 변형된 비-염기 쌍 뉴클레오타이드, 또는 (ⅲ) 비-염기 쌍 형성 화합물(non-base pairing chemical compound)인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 제1단편의 연장가닥과 상기 CTO는 상기 단계 (d)에서 연장이합체를 형성하며; 상기 연장이합체는 (i) 상기 제1단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 상기 제1단편의 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 서열 및/또는 길이에 의하여 조절가능한 Tm 값을 가지며; 상기 연장이합체는 (i) 상기 제1단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 제1단편 및/또는 상기 CTO에 연결된 최소 하나의 표지 및 상기 연장반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지 또는 (ⅳ) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 시그널을 제공하고; 상기 연장가닥의 존재는 상기 연장이합체에 대한 멜팅 분석 또는 혼성화 분석에 따라 상기 연장이합체로부터 상기 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 제1단편의 연장가닥과 상기 CTO는 상기 단계 (d)에서 연장이합체를 형성하며; 상기 연장이합체는 (i) 상기 제1단편의 서열 및/또는 길이, (ii) 상기 CTO의 서열 및/또는 길이 또는 (ⅲ) 상기 제1단편의 서열 및/또는 길이와 상기 CTO의 서열 및/또는 길이에 의하여 조절가능한 Tm 값을 가지며; 상기 연장이합체는 (i) 상기 제1단편 및/또는 CTO에 연결된 최소 하나의 표지, (ii) 상기 연장반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지, (ⅲ) 상기 제1단편 및/또는 CTO에 연결된 최소 하나의 표지 및 상기 연장반응 동안 상기 연장이합체 내에 삽입된 표지 또는 (ⅳ) 인터컬레이팅 표지(intercalating label)에 의해 시그널을 제공하고; 상기 연장가닥의 존재는 상기 연장이합체의 이중가닥을 유지하는데 충분한 미리 정해진 온도에서 상기 연장이합체로부터 시그널을 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 제1단편의 연장가닥은 시그널링 올리고뉴클레오타이드(Signaling Oligonucleotide; SO)를 이용하여 검출되며; 상기 SO는 상기 연장가닥에 상보적인 서열 및 최소 하나의 표지를 포함하며; 상기 SO는 상기 연장가닥과의 결합(association) 또는 해리(dissociation)에 의해 시그널을 제공하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 시그널은 (i) 상기 SO에 연결된 표지, (ii) 상기 SO에 연결된 표지 및 상기 제1단편에 연결된 표지의 조합, (iii) 상기 SO에 연결된 표지 및 상기 단계 (d)의 연장반응 동안 연장가닥 내에 삽입될 표지의 조합, 또는 (iv) 상기 SO에 연결된 표지 및 인터컬레이팅 염료(intercalating dye)의 조합에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항에 있어서, 상기 방법은 상기 연장가닥에 상보적인 서열을 포함하는 추가적인 SO를 하나 더 이용하며, 상기 2개의 SO는 상기 연장가닥에 근접하여 혼성화되고, 상기 2개의 SO는 각각 상호작용적 이중 표지의 리포터 분자 및 퀀처 분자 중 하나의 표지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 시그널은 형광 표지로부터 제공되는 형광 시그널이며, 상기 시그널의 강도는 상기 형광 표지의 형광 강도인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 시그널은 상기 연장가닥을 이용한 멜팅 분석 또는 혼성화 분석으로부터 제공되는 피크이며, 상기 시그널의 강도는 상기 피크의 높이 또는 면적인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 PTO-SNV 및/또는 CTO는 그의 연장이 방지되도록 3’-말단이 블록킹되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머 또는 업스트림 프로브인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO-SNV의 절단을 유도할 정도로 상기 PTO-SNV에 근접하게 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 업스트림 프라이머는 그의 연장가닥을 통해 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO-SNV의 절단을 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(e)의 모두 또는 일부를 반복하는 것을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 최소 2종의 SNP를 검출하기 위해 실시되며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 최소 2종의 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 PTO-SNV는 최소 2종의 PTO-SNV를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머이고, 상기 단계 (b)는 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위해 주형-의존적 핵산 중합효소를 사용하며; 상기 주형-의존적 핵산 중합효소는 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 동일한 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 업스트림 프라이머이고, 상기 단계 (b)는 상기 업스트림 프라이머의 연장을 위해 주형-의존적 핵산 중합효소를 사용하며; 상기 주형-의존적 핵산 중합효소는 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소와 상이한 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 상기 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소는 5’뉴클레아제 활성을 갖는 열안정성 DNA 중합효소 또는 FEN 뉴클레아제인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 상기 SNP에서 발견되는 복수의 SNP 뉴클레오타이드 중에 단일 SNP 뉴클레오타이드를 검출하기 위해 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 다운스트림 프라이머의 존재하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 다음 단계를 포함하는 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 유전자형을 결정하는 방법:
    (a) SNP를 포함하는 타겟 핵산 서열을 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍 및 단일 뉴클레오타이드 변이에 대한 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide for Single Nucleotide Variation; PTO-SNV)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 업스트림 프라이머 및 상기 다운스트림 프라이머는 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 상기 PTO-SNV는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위, (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위, 및 (iii) 상기 타겟 핵산 서열 상의 관심 있는 SNP 대립 유전자의 SNP 사이트에 존재하는 SNP 뉴클레오타이드에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치하는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며; 상기 PTO-SNV는 상기 업스트림 프라이머 및 상기 다운스트림 프라이머 사이에 위치하며; 상기 PTO-SNV는 그의 연장이 방지되도록 3’-말단이 블록킹되며;
    (b) 상기 프라이머의 연장 및 상기 PTO-SNV의 절단을 위한 조건하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 PTO-SNV가 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 관심 있는 SNP 대립 유전자에 혼성화되면, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 상기 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성하여 제1초기 절단 사이트로부터 절단을 유도하고, 제1단편이 방출되며; 상기 PTO-SNV가 관심 있는 SNP 대립 유전자와는 상이하고 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 SNP 대립 유전자에 혼성화되면, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 상기 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성하지 않아 상기 제1초기 절단 사이트의 다운스트림에 위치하는 제2초기 절단 사이트로부터 절단을 유도하고, 제2단편이 방출되며; 상기 제2단편은 추가적인 3’-말단 부위를 포함하고, 이는 상기 제2단편이 상기 제1단편과 다르도록 하며;
    (c) 상기 PTO-SNV로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide; CTO)를 혼성화시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’순서로 (i) 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO-SNV로부터 방출된 상기 제1단편 또는 상기 제2단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
    (d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 제1단편이 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되면, 상기 제1단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 형성하고; 상기 제2단편이 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되면, 상기 제2단편은 연장되지 않으며;
    (e) 상기 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 동형접합(homogygous)인 타겟 핵산 서열은 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 이형접합(heterozygous)인 타겟 핵산 서열보다 더 높은 강도의 시그널을 나타내고, 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자를 갖지 않는 타겟 핵산 서열은 시그널을 제공하지 않으며;
    (f) 상기 단계 (e)에서 검출된 시그널의 강도에 의해 타겟 핵산 서열 내의 SNP 유전자형을 결정하는 단계.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 방법은 반복 사이클 사이에 변성을 포함하여 상기 단계 (a)-(e)의 모두 또는 일부를 반복하는 것을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 다음 단계를 포함하는 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP) 유전자형을 결정하는 방법:
    (a) SNP를 포함하는 타겟 핵산 서열을 단일 뉴클레오타이드 변이에 대한 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide for Single Nucleotide Variation; PTO-SNV)와 혼성화시키는 단계로서; 상기 PTO-SNV는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위, (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위, 및 (iii) 상기 타겟 핵산 서열 상의 관심 있는 SNP 대립 유전자의 SNP 사이트에 존재하는 SNP 뉴클레오타이드에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치하는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며;
    (b) 상기 PTO-SNV의 절단을 위한 조건하에서 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 상기 단계 (a)의 결과물을 접촉시키는 단계로서; 상기 PTO-SNV가 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 관심 있는 SNP 대립 유전자에 혼성화되면, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 상기 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성하여 제1초기 절단 사이트로부터 절단을 유도하고, 제1단편이 방출되며; 상기 PTO-SNV가 관심 있는 SNP 대립 유전자와는 상이하고 상기 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트에 대하여 비-상보적인 SNP 뉴클레오타이드를 갖는 SNP 대립 유전자에 혼성화되면, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부가 상기 타겟 핵산 서열과 이중 가닥을 형성하지 않아 상기 제1초기 절단 사이트의 다운스트림에 위치하는 제2초기 절단 사이트로부터 절단을 유도하고, 제2단편이 방출되며; 상기 제2단편은 추가적인 3’-말단 부위를 포함하고, 이는 상기 제2단편이 상기 제1단편과 다르도록 하며;
    (c) 상기 PTO-SNV로부터 방출된 상기 단편과 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide; CTO)를 혼성화시키는 단계로서; 상기 CTO는 3’→5’순서로 (i) 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO-SNV로부터 방출된 상기 제1단편 또는 상기 제2단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
    (d) 상기 단계 (c)의 결과물 및 주형-의존적 핵산 중합효소를 이용하여 연장반응을 실시하는 단계로서; 상기 제1단편이 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되면, 상기 제1단편은 연장되어 상기 CTO의 템플레이팅 부위에 상보적인 연장서열을 포함하는 연장가닥을 형성하고; 상기 제2단편이 상기 CTO의 캡처링 부위에 혼성화되면, 상기 제2단편은 연장되지 않고;
    (e) 상기 연장가닥의 존재를 나타내는 시그널을 검출하는 단계로서; 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 동형접합(homogygous)인 타겟 핵산 서열은 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자에 대해 이형접합(heterozygous)인 타겟 핵산 서열보다 더 높은 강도의 시그널을 나타내고, 상기 관심 있는 SNP 대립 유전자를 갖지 않는 타겟 핵산 서열은 시그널을 제공하지 않으며;
    (f) 상기 단계 (e)에서 검출된 시그널의 강도에 의해 타겟 핵산 서열 내의 SNP 유전자형을 결정하는 단계.
  27. 다음을 포함하는 샘플의 SNP 유전자형을 결정하기 위한 키트:
    (a) 단일 뉴클레오타이드 변이에 대한 프로빙 앤드 태깅 올리고뉴클레오타이드(Probing and Tagging Oligonucleotide for Single Nucleotide Variation; PTO-SNV); 상기 PTO-SNV는 (i) 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3’-타겟팅 부위, (ii) 상기 타겟 핵산 서열에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5’-태깅 부위, 및 (iii) 상기 타겟 핵산 서열 상의 관심 있는 SNP 대립 유전자의 SNP 사이트에 존재하는 SNP 뉴클레오타이드에 대하여 상보적인 뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 3’-타겟팅 부위의 5’-말단 일부에 위치하는 단일 뉴클레오타이드 변이 구별 사이트를 포함하며; 상기 3’-타겟팅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되고 상기 5’-태깅 부위는 상기 타겟 핵산 서열에 혼성화되지 않으며;
    (b) 업스트림 올리고뉴클레오타이드; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드는 상기 PTO-SNV의 업스트림에 위치하며; 상기 업스트림 올리고뉴클레오타이드 또는 그의 연장가닥은 5’뉴클레아제 활성을 갖는 효소에 의한 상기 PTO-SNV의 절단을 유도하며;
    (c) 캡처링 앤드 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드(Capturing and Templating Oligonucleotide; CTO); 상기 CTO는 3’→5’순서로 (i) 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 또는 5’-태깅 부위의 일부에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) 상기 PTO-SNV의 5’-태깅 부위 및 3’-타겟팅 부위에 비-상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함하며; 상기 PTO-SNV로부터 방출된 상기 제1단편 또는 상기 제2단편은 상기 CTO의 캡처링 부위와 혼성화되고;
    (d) 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항의 방법을 기재한 설명서.
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