BR112014021993B1

BR112014021993B1 - Métodos e kits para detecção de uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico alvo através de um ensaio de ptoce

Info

Publication number: BR112014021993B1
Application number: BR112014021993-1A
Authority: BR
Inventors: Jong Yoon Chun; Young Jo Lee
Original assignee: Seegene, Inc
Priority date: 2012-03-05
Filing date: 2013-02-25
Publication date: 2022-01-11
Also published as: JP2015520603A; WO2013133561A1; CN104245959A; ZA201405894B; EP2823061A1; BR112014021993A2; AU2013228226A1; CN104245959B; EP2823061B1; US9650665B2; KR20140123561A; CA2864523A1; ES2669244T3; CA2864523C; MX354465B; BR112014021993B8; JP5976849B2; US20150167061A1; RU2620955C2; KR101794981B1

Abstract

detecção da variação de nucleotídeo em sequência de ácido nucleico alvo através de ensaio de clivagem e extensão de pto. a presente invenção refere-se em geral a um novo método e um kit para detecção de variações de nucleotídeo através de um ensaio de ptoce (clivagem e extensão de pto) com pto-nv. ainda, a presente invenção refere-se a um novo método e um kit para detecção de variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico alvo através de um ensaio de ptoce com pto-nv tendo uma porção de não pareamento de base.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se à detecção de uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico-alvo através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO).

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

[002] A hibridização do DNA é um processo fundamental na bio logia molecular e é afetada pela resistência iônica, a composição da base, o comprimento do fragmento ao qual o ácido nucleico foi reduzido, o grau de incompatibilidade e a presença de agentes desnaturan- tes. As tecnologias baseadas na hibridização do DNA seriam uma ferramenta muito útil na determinação de sequência de ácidos nucleicos específica e claramente seriam valiosas no diagnóstico clínico, na pesquisa genética e na análise de laboratório forense.

[003] Entretanto, os métodos e os processos convencionais que dependem principalmente da hibridização muito provavelmente produzem resultados falsos positivos devido à hibridização não específica entre as sondas e sequências que não são alvo. Portanto, permanecem problemas que devem ser resolvidos para aprimorar sua confiabilidade.

[004] Além dos processos de hibridização de sonda, várias abor dagens utilizando reações enzimáticas adicionais, por exemplo, o método de sonda TaqMan®, foram sugeridas.

[005] No método de sonda de TaqMan®, a sonda marcada hibri- dizada com uma sequência de ácido nucleico-alvo é clivada por uma atividade de 5’ nuclease de uma polimerase de DNA dependente de iniciador a montante, gerando um sinal que indica a presença de uma sequência-alvo (Pat. U.S. Nos. 5.210.015, 5.538.848 e 6.326.145). O método de sonda de TaqMan® sugere duas abordagens para a produção de sinal: clivagem dependente de polimerização e clivagem independente de polimerização. Na clivagem dependente de polimeriza- ção, a extensão do iniciador a montante tem que ocorrer antes de uma polimerase do ácido nucleico encontrar a extremidade 5’ da sonda marcada. À medida que a reação de extensão continua, a polimerase progressivamente cliva a extremidade 5’ da sonda marcada. Na clivagem independente de polimerização, o iniciador a montante e a sonda marcada são hibridizados com uma sequência de ácido nucleico-alvo em proximidade grande de forma que a ligação da ácido nucleico po- limerase à extremidade 3’ do iniciador a montante a coloca em contato com a com a extremidade 5’ da sonda marcada para liberar o marcador. Em adição, o método de sonda de TaqMan® revela que a sonda marcada em sua extremidade 5’ que possui uma região de fita 5’ que não pode ser hibridizada com uma sequência-alvo é também clivada para formar um fragmento que compreende a região de fita 5’.

[006] Foram relatados alguns métodos em que uma sonda que possui uma região de fita 5’ não complementar a uma sequência-alvo é clivada por nuclease 5’ para liberar um fragmento que compreende a região de fita 5’.

[007] Por exemplo, a Pat. U.S. No. 5.691.142 revela uma estrutu ra de clivagem que será digerida pela atividade de nuclease 5’ da po- limerase de DNA. É exemplificada uma estrutura de clivagem em que um oligonucleotídeo que compreende uma porção 5’ não complementar a e uma porção 3’ não complementar a um modelo é hibridizada com o modelo e um oligonucleotídeo a montante é hibridizado com o modelo em proximidade grande. A estrutura de clivagem é clivada por polimerase de DNA que possui atividade de nuclease 5’ ou polimerase de DNA modificada com atividade de síntese reduzida para liberar a porção 5’ não complementar ao modelo. A porção 5’ liberada é então hibridizada com um oligonucleotídeo que possui uma estrutura grampo de cabelo para formar uma estrutura de clivagem, induzindo assim reações de clivagem progressiva para detectar uma sequência-alvo.

[008] A Pat. U.S. No. 7.381.532 revela um processo em que a estrutura de clivagem que possui o oligonucleotídeo a montante com extremidade 3’ bloqueada é clivada por polimerase de DNA que possui atividade de nuclease 5’ ou nuclease FEN para liberar a região flap 5’ não complementar e a região flap 5’ liberada é detectada através da análise de tamanho ou de marcador duplo interativo. A Pat. U.S. No. 6.893.819 revela que flaps liberados detectáveis são produzidos por um método de amplificação sequencial mediado por flap, dependente da síntese de ácido nucleico. Neste método, um flap liberado partindo de uma primeira estrutura de clivagem cliva, de uma maneira dependente da síntese de ácido nucleico, uma segunda estrutura de clivagem para liberar um flap da segunda estrutura de clivagem e os flaps liberados, são detectados. A Pat. U.S. No. 7.309.573 revela um método incluindo formação de um flap liberado produzido através da síntese de um ácido nucleico; extensão do flap liberado; clivagem de um oligonucleotídeo durante extensão do flap e detecção de um sinal gerado através da clivagem do oligonucleotídeo.

[009] Através da hibridização de sondas marcadas com fluores cência em uma fase líquida, um grande número de sequências de ácido nucleico-alvo pode ser simultaneamente detectado utilizando até mesmo um único tipo de uma marcação fluorescente através da análise de curva de fusão. Entretanto, as tecnologias convencionais para a detecção de sequências-alvo através da clivagem mediada por nuclease 5’ de sondas duplas interativas marcadas requerem tipos diferentes de marcadores fluorescentes para sequências-alvo diferentes na detecção de alvo multiplex, o que limita o número de sequências- alvo que será detectado devido à limitação do número de tipos de marcadores fluorescentes.

[0010] A Pub. de Pedido de Patente U.S. 2008-0241838 revela um método de detecção de alvo utilizando a clivagem de uma sonda que possui uma porção 5’ não complementar a uma sequência de ácido nucleico-alvo e a hibridização de uma sonda de captura. Um marcador fica posicionado na porção 5’ não complementar. A sonda marcada hibridizada com a sequência-alvo é clivada para liberar um fragmento, após o que o fragmento é então hibridizado com a sonda de captura para detectar a presença da sequência-alvo. Neste método, é necessário que uma sonda não clivada/intacta não seja hibridizada com a sonda de captura. Para isto, a sonda de captura que possui um comprimento menor tem que ser imobilizada sobre um substrato sólido. Entretanto, tal limitação resulta em uma menor eficiência de hibridiza- ção sobre um substrato sólido e também em dificuldades na otimização de condições de reação.

[0011] Portanto, permanecem necessidades sentidas há muito tempo na arte de desenvolver novas abordagens para a detecção de uma sequência-alvo, preferencialmente várias sequências-alvo, em uma fase líquida e em uma fase sólida não somente através da hibridi- zação, mas também reações enzimáticas tal como uma reação nucleo- lítica 5’ de uma maneira mais conveniente, confiável e reproduzível. Além disso, um novo método de detecção de alvo não limitado pelo número de tipos de marcadores (particularmente, marcadores fluorescentes) também é necessário na arte.

[0012] Ao mesmo tempo, variações de nucleotídeo são importan tes nos campos de pesquisa e clínico. Delas, polimorfismos de nucleo- tídeo único (SNPs) (Single Nucleotide Polymorhisms) são encontrados com mais frequência em um genoma humano e servem como marca- dores para loci relacionados à doença e farmacogenéticos (Landegren e outros, 1998; Roses, 2000). SNPs são encontrados em uma taxa de aproximadamente 1 por 1000 pb em um genoma humano e seu número total é estimado ser cerca de três milhões. Para a detecção de variações de nucleotídeo tais como SNP, deleção, inserção e transloca- ção, várias tecnologias de discriminação alélica foram relatadas.

[0013] A sonda TaqMan específica de alelo é projetada de manei ra que ela é hibridizada apenas com sequências alvo perfeitamente compatíveis na etapa de extensão de PCR. A sonda TaqMan tem uma molécula repórter e uma molécula de extinção capaz de extinguir o sinal fluorescentes da molécula repórter. A sonda TaqMan hibridizada com as sequências alvo é digerida pela atividade de nuclease 5’ de Taq DNA polimerase e a molécula repórter e a molécula de extinção são separadas para gerar um sinal-alvo. Para discriminação alélica, sondas de 13-20 mer conjugadas com ligante de ranhura pequeno (MGB) (Minor Groove Binder) são usadas (Livak e outros, Genet. Anal. 14:143-149 (1999)). Uma vez que o método de discriminação alélica usando a sonda TaqMan emprega não apenas reação de hibridização, mas também reações enzimáticas de atividade de nuclease 5’, sua especificidade é aumentada. No entanto, o método tem sérios inconvenientes tais como dificuldades em projeto de sonda específica de alelo e condições de reação otimizadas que têm que discriminar diferença por uma incompatibilidade. Ainda, o conjugado com MGB é uma das soluções do problema na sonda TaqMan específica de alelo.

[0014] Desta maneira persistem as necessidades há muito tempo sentidas na técnica de desenvolver novas abordagens para detecção de uma variação de nucleotídeo de uma maneira mais conveniente, confiável e reproduzível, que seja capaz de ser livre dos inconvenientes das tecnologias convencionais.

[0015] Ao longo de todo o presente pedido de patente, várias pa- tentes e publicações são referidas e citações são fornecidas entre parênteses. A descrição destas patentes e publicações em suas totalidades é incorporada a título de referência no presente pedido de patente com a finalidade de descrever de forma mais completa a presente invenção e o estado da técnica ao qual a presente invenção pertence.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0016] Os presentes inventores realizaram pesquisas intensivas para o desenvolvimento de novas abordagens para detectar sequências-alvo com acurácia e conveniência melhoradas, inter alia, de uma maneira multiplex. Como um resultado, os presentes inventores estabeleceram novos protocolos para a detecção de sequências-alvo, em que a detecção do alvo é realizada através da hibridização de sonda, da clivagem enzimática da sonda, da extensão e da detecção de um duplex estendido. Os presentes protocolos são bem adotados às reações em fase líquida bem como às reações em fase sólida e garantem a detecção de várias sequências-alvo com acurácia e conveniência aprimoradas.

[0017] Ainda, os presentes inventores fizeram pesquisas intensi vas para desenvolver novas abordagens para detectar variações de nucleotídeo com precisão e conveniência aperfeiçoadas, inter alia, de uma maneira multiplex. Como resultado, a requerente estabeleceu novos protocolos para detecção de variações de nucleotídeo, em que detecção de variação de nucleotídeo é acompanhada pela hibridização da sonda, clivagem de sonda enzimática, extensão e detecção de uma fita estendida. Particularmente, a requerente intrigantemente fez com que o sítio de clivagem da sonda fosse ajustável dependendo da presença e da ausência de variações de nucleotídeo de interesse e os fragmentos liberados por clivagem em sítios diferentes são distinguidos por suas capacidades de extensão em um modelo artificial. Os presentes protocolos são bem adotados para reações de fase líquida bem como reações de fase sólida e asseguram detecção de variações de nucleotídeo múltiplas com precisão e conveniência aperfeiçoadas.

[0018] Portanto, é um objetivo desta invenção fornecer um método para a detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo partindo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO).

[0019] É outro objetivo da presente invenção prover um método para detecção de uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico alvo através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO).

[0020] É ainda outro objetivo da presente invenção prover um kit para detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO).

[0021] É um objetivo adicional da presente invenção prover um kit para detecção de uma variação de ácido nucleico em uma sequência de ácido nucleico-alvo através de um ensaio de PTOCE (Clivagem de Extensão de PTO).

[0022] Outros objetivos e vantagens da presente invenção se tor narão evidentes partindo da descrição detalhada a seguir tomadas juntas com as reivindicações e os desenhos em anexo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0023] A Fig. 1 mostra as estruturas esquemáticas de PTO (Oligo- nucleotídeo de Sondagem e Marcação) (Probing and Tagging Oligo-nucleotide) e CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelo) (Capturing and Templating Oligonucleotide) utilizados no ensaio de Clivagem e Extensão de PTO (ensaio de PTOCE). Preferencialmente, as extremidades 3’ do PTO e do CTO são bloqueadas para proibir sua extensão.

[0024] A Fig. 2 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende análise de fusão. O CTO possui uma molécula repór- ter e uma molécula de extinção em sua porção de modelagem.

[0025] A Fig. 3 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão. O CTO possui uma molécula repórter em sua porção de modelagem. A molécula repórter é requerida para exibir intensidade de sinal diferente dependendo de sua presença em uma forma de fita simples ou uma forma de fita dupla.

[0026] A Fig. 4 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão. O CTO possui um resíduo iso-dC e uma molécula repórter em sua porção de modelagem. O extintor-iso- dGTP é incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão.

[0027] A Fig. 5 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão. O PTO possui uma molécula repórter em sua porção de marcação 5’ e o CTO possui um resíduo isodC em sua porção de modelagem. O extintor-iso-dGTP é incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão.

[0028] A Fig. 6 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende análise de fusão. O PTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de marcação 5’.

[0029] A Fig. 7 representa esquematicamente o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão. O PTO possui uma molécula repórter em sua porção de marcação 5’. A molécula repórter é requerida para exibir intensidade de sinal diferente dependendo de sua presença em uma forma de fita simples ou uma forma de fita dupla.

[0030] A Fig. 8 representa esquematicamente ensaio de PTOCE que compreende análise de fusão. O PTO possui uma molécula de extinção em sua porção de marcação 5’ e o CTO possui uma molécula repórter em sua porção de captura.

[0031] A Fig. 9 representa esquematicamente ensaio de PTOCE que compreende detecção em uma temperatura predeterminada. O CTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de modelagem. O CTO é imobilizado sobre um substrato sólido através de sua extremidade 3’.

[0032] A Fig. 10 representa esquematicamente ensaio de PTOCE que compreende detecção em uma temperatura predeterminada. Um dATP marcado com repórter é incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão. O CTO é imobilizado sobre um substrato sólido através de sua extremidade 3’.

[0033] A Fig. 11 representa esquematicamente ensaio de PTOCE que compreende detecção em uma temperatura predeterminada. O CTO possui um resíduo iso-dC em sua porção de modelagem e um repórter-iso-dGTP é incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão. O CTO é imobilizado sobre um substrato sólido através de sua extremidade 3’.

[0034] A Fig. 12 representa esquematicamente ensaio de PTOCE que compreende detecção em uma temperatura predeterminada. O PTO possui uma molécula repórter em sua porção de marcação 5’. O CTO é imobilizado sobre um substrato sólido através de sua extremidade 5’.

[0035] A Fig. 13 representa esquematicamente ensaio de PTOCE que compreende a detecção em uma temperatura predeterminada com um corante intercalante. O CTO é imobilizado sobre um substrato sólido através de sua extremidade 5’.

[0036] A Fig. 14 mostra os resultados da detecção do gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE que compreende análise de fusão. O CTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de modelagem.

[0037] A Fig. 15 mostra os resultados da detecção do gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE que compreende análise de fusão. O PTO possui uma molécula de extinção em sua ex- tremidade 5’ e o CTO possui uma molécula repórter em sua extremidade 3’.

[0038] A Fig. 16 mostra os resultados em que os valores de Tm de dúplices estendidos são ajustados por sequências de CTO.

[0039] A Fig. 17 mostra os resultados da detecção do gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE com amplificação através da PCR. O CTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de modelagem. A Fig. 17A mostra os resultados do ensaio de PTOCE que compreende a detecção com PCR em tempo real e a Fig. 17B mostra os resultados do ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão pós-PCR.

[0040] A Fig. 18 mostra os resultados da detecção do gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE com amplificação através da PCR. O CTO possui um resíduo iso-dC e uma molécula repórter em sua extremidade 5’. O extintor-iso-dGTP é incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão. A Fig. 18A mostra os resultados do ensaio de PTOCE que compreende a detecção com PCR em tempo real e a Fig. 18B mostra os resultados do ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão pós-PCR.

[0041] A Fig. 19 mostra os resultados da detecção do gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE com amplificação através da PCR. O PTO possui uma molécula de extinção em sua ex-tremidade 5’ e CTO possui uma molécula repórter em sua extremidade 3’. A Fig. 19A mostra os resultados do ensaio de PTOCE que compreende a detecção com PCR em tempo real e a Fig. 19B mostra os resultados do ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão pós-PCR.

[0042] A Fig. 20 mostra os resultados da detecção simultânea do gene de Neisseria gonorrhoeae (NG) e do gene de Staphylococcus aureus (SA) através do ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão pós-PCR. O CTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de modelagem.

[0043] A Fig. 21 mostra os resultados da detecção do gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão sobre microdisposição. O CTO é imobilizado através de sua extremidade 5’. O PTO possui uma molécula repórter em sua porção de marcação 5’.

[0044] A Fig. 22 mostra os resultados da detecção do gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real em uma temperatura predeterminada sobre microdisposição. O CTO é imobilizado através de sua extremidade 5’. O PTO possui uma molécula repórter em sua porção de marcação 5’.

[0045] A Fig. 23 mostra os resultados da detecção do gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real em uma temperatura predeterminada sobre microdisposição. O CTO é imobilizado através de sua extremidade 3’ e possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de modelagem.

[0046] A Fig. 24 mostra os resultados da detecção com alvo único ou múltiplo através do ensaio de PTOCE que compreende a detecção no ponto final em uma temperatura predeterminada sobre microdispo- sição. O CTO é imobilizado através de sua extremidade 5’. O PTO possui uma molécula repórter em sua porção de marcação 5’. O gene de Neisseria gonorrhoeae (NG) e o gene de Staphylococcus aureus (SA) foram utilizados como as sequência de ácidos nucleico-alvo.

[0047] A Figura 25 representa esquematicamente um ensaio de PTOCE para detecção de variações de nucleotídeo. Esta aplicação é chamada ensaio VD-PTOCE (Detecção de Variação por Clivagem e Extensão de PTO) (Variation Detection by PTO Cleavage and Extension). O sítio de discriminação de variação de nucleotídeo é posicionado na extremidade 5’ da parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’. A determinação da presença da variação de nucleotídeo é feita detectando a presença da fita estendida. Os sítios de clivagem são diferentes dependendo da presença e da ausência da variação de nucleotídeo de interesse.

[0048] A Fig. 26 representa esquematicamente um exemplo do ensaio VD-PTOCE. O sítio de discriminação de variação de nucleotí- deo está posicionado 1 nucleotídeo distante da extremidade 5’ da parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’.

[0049] A Fig. 27 representa esquematicamente um exemplo do ensaio VD-PTOCE. O nucleotídeo de incompatibilidade artificial como uma porção de não pareamento de base é introduzido na parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’. A porção de não parea- mento de base aumenta a distância entre o primeiro sítio de clivagem inicial e o segundo sítio de clivagem inicial.

[0050] A Fig. 28 representa esquematicamente um exemplo do ensaio VD-PTOCE. O sítio de discriminação de variação de nucleotí- deo está posicionado na extremidade 5’ da parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’. O CTO tem uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de modelagem para geração de sinais.

[0051] A Fig. 29 representa esquematicamente um exemplo do ensaio VD-PTOCE compreendendo uma análise de fusão. O sítio de discriminação de variação de nucleotídeo está posicionado 1 nucleotí- deo distante da extremidade 5’ da parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’. O CTO tem uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de modelagem para geração de sinais.

[0052] A Fig. 30 representa esquematicamente um exemplo do ensaio VD-PTOCE compreendendo uma análise de fusão. O nucleotí- deo de incompatibilidade artificial como porção de não pareamento de base é introduzido na parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’. O CTO tem uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de modelagem para geração de sinais.

[0053] A Fig. 31 representa esquematicamente um exemplo do ensaio VD-PTOCE compreendendo detecção em uma temperatura predeterminada em uma microdisposição. O sinal de um marcador flu-orescente único é detectado em uma temperatura predeterminada.

[0054] A Fig. 32 representa esquematicamente um exemplo do ensaio VD-PTOCE compreendendo detecção em uma temperatura predeterminada em uma microdisposição. Um ddUTP marcado com repórter é incorporado à fita estendida durante a reação de extensão. O sinal do repórter é detectado em uma temperatura predeterminada.

[0055] A Fig. 33 mostra os resultados da detecção da mutação V600E do gene BRAF através do ensaio VD-PTOCE. Quatro tipos di-ferentes de PTO-NVs foram examinados com variação de local do sítio de discriminação de variação de nucleotídeo simples na parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’.

[0056] A Fig. 34 mostra os resultados da detecção da mutação V600E do gene BRAF através do ensaio VD-PTOCE com PTO-NV tendo um nucleotídeo de incompatibilidade artificial como uma porção de não pareamento de base. O conjunto de discriminação de variação de nucleotídeo simples está localizado no quarto nucleotídeo a partir da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’. Um PTO-NV não tendo nenhuma incompatibilidade artificial e três tipos de PTO-NVs tendo um nucleotídeo de incompatibilidade artificial como uma porção de não pareamento de base foram examinados.

[0057] A Fig. 35 mostra os resultados da detecção de gene de Neisseria gonorrhoeae através do ensaio de PTOCE usando atividade de nuclease 5’ independente de oligonucleotídeo a montante. A Fig. 35A mostra os resultados do ensaio de PTOCE compreendendo detecção em tempo real em uma temperatura predeterminada sem uso de um oligonucleotídeo a montante e a Fig. 35B mostra os resultados de ensaio de PTOCE compreendendo análise de fusão sem uso de um oligonucleotídeo a montante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO

[0058] A presente invenção refere-se em geral a um novo método para detecção de uma sequência de ácido nucleico através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO). Em particular, a presente invenção refere-se a um novo método para detecção de uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico-alvo através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO) e um kit para detecção de uma variação de nucleotídeo através de um ensaio de PTOCE.

[0059] A presente invenção para detecção de uma variação de nu- cleotídeo é baseada na clivagem do PTO e extensão do fragmento de PTO no CTO como o ensaio de PTOCE; desta maneira, sua descrição detalhada será feita após descrições do ensaio de PTOCE. Para melhor compreensão, o ensaio de PTOCE será descrito como segue: (i) Processo de Detecção de Alvo através de PTOCE Compreendendo Análise de Fusão

[0060] Em um aspecto da presente invenção, é provido um méto do para a detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo partindo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO) que compreende:

[0061] (a) a hibridização da sequência de ácido nucleico-alvo com um oligonucleotídeo a montante e um PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação); em que o oligonucleotídeo a montante compreende uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico-alvo; o PTO compreende (i) uma porção de direcionamento 3’ que compreende uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico-alvo e (ii) uma porção de marcação 5’ que compreende uma sequência de nu- cleotídeo não complementar à sequência de ácido nucleico-alvo; em que a porção de direcionamento 3’ é hibridizada com a sequência de ácido nucleico-alvo e a porção de marcação 5’ não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico-alvo; o oligonucleotídeo a montante fica localizado a montante do PTO;

[0062] (b) o contato do resultado da etapa (a) com uma enzima que possui a atividade de nuclease 5’ sob condições para a clivagem do PTO; em que o oligonucleotídeo a montante ou sua fita estendida induz a clivagem do PTO através da enzima que possui a atividade de nuclease 5’ de forma que a clivagem libera um fragmento que compreende a porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO;

[0063] (c) a hibridização do fragmento liberado do PTO com um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelo); em que o CTO compreende em uma direção 3’ para 5’ (i) uma porção de captura que compreende uma sequência de nucleotídeo complementar à porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO e (ii) uma porção de modelagem que compreende uma sequência de nu- cleotídeo não complementar à porção de marcação 5’ e a porção de direcionamento 3’ do PTO; em que o fragmento liberado do PTO é hi- bridizado com a porção de captura do CTO;

[0064] (d) a realização de uma reação de extensão utilizando o resultado da etapa (c) e uma polimerase do ácido nucleico dependente do modelo; em que o fragmento hibridizado com a porção de captura do CTO é estendido e um duplex estendido é formado; em que o duplex estendido possui um valor de Tm que pode ser ajustado por (i) uma sequência e/ou comprimento do fragmento, (ii) uma sequência e/ou um comprimento do CTO ou (iii) a sequência e/ou o comprimento do fragmento e a sequência e/ou o comprimento do CTO;

[0065] (e) a fusão do duplex estendido ao longo de uma faixa de temperaturas para fornecer um sinal-alvo indicativo da presença do duplex estendido; em que o sinal-alvo é fornecido por (i) pelo menos um marcador ligado ao fragmento e/ou ao CTO, (ii) um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão, (iii) um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão e um marcador ligado ao fragmento e/ou ao CTO ou (iv) um marcador intercalante; e

[0066] (f) a detecção do duplex estendido através da medida do sinal-alvo; em que a presença do duplex estendido indica a presença da sequência de ácido nucleico-alvo.

[0067] Os presentes inventores realizaram pesquisas intensivas para o desenvolvimento de novas abordagens para detectar sequências-alvo com acurácia e conveniência aprimoradas, inter alia, de uma maneira multiplex. Como um resultado, os presentes inventores estabeleceram novos protocolos para detecção de sequências-alvo, em que a detecção do alvo é realizada através da hibridização de sonda, da clivagem enzimática da sonda, da extensão e da detecção de um duplex estendido. Os presentes protocolos são bem adotados às reações em fase líquida assim como às reações em fase sólida e garantem a detecção de várias sequências-alvo com acurácia e conveniência aprimoradas.

[0068] A presente invenção emprega eventos sucessivos seguidos pela da hibridização de sonda; clivagem de PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação) e extensão; formação de um duplex estendido dependente do alvo; e detecção do duplex estendido. Portanto, ele é chamado um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO).

[0069] Na presente invenção, o duplex estendido é caracterizado como possuindo um marcador(es) fornecendo um sinal que indica a presença do duplex estendido através da análise de fusão ou através da detecção em uma temperatura predeterminada. Além disso, o duplex estendido é caracterizado como possuindo um valor de Tm que pode ser ajustado, que desempenha uma função crítica na detecção múltipla do alvo ou na discriminação do sinal que não é alvo.

[0070] Uma vez que o duplex estendido é produzido apenas se existir o ácido nucleico-alvo, a presença do duplex estendido indica a presença do ácido nucleico-alvo.

[0071] O ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão será descrito em maiores detalhes a seguir: Etapa (a): Hibridização de um oligonucleotídeo a montante e um PTO com uma sequência de ácido nucleico-alvo

[0072] De acordo com a presente invenção, uma sequência de ácido nucleico-alvo é primeiramente hibridizada com um oligonucleotí- deo a montante e um PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação).

[0073] O termo utilizado aqui “ácido nucleico-alvo”, “sequência de ácido nucleico-alvo” ou “sequência-alvo” refere-se a uma sequência de ácido nucleico de interesse para a detecção, que é anelada com ou hibridizada com uma sonda ou iniciador sob condições de hibridização, anelamento ou amplificação.

[0074] O termo utilizado aqui “sonda” refere-se a uma molécula de ácido nucleico de fita simples que compreende uma porção ou porções que são substancialmente complementares a uma sequência de ácido nucleico-alvo.

[0075] O termo “iniciador” como utilizado aqui se refere a um oli- gonucleotídeo, que é capaz de atuar como um ponto de início de síntese quando colocado sob condições em que a síntese do produto da extensão do iniciador que é complementar a uma fita de ácido nucleico (modelo) é induzida, isto é, na presença de nucleotídeos e um agente para polimerização, tal como a polimerase de DNA e em uma temperatura e um pH adequado.

[0076] Preferencialmente, a sonda e o iniciador são moléculas de desoxirribonucleotídeo de fita simples. As sondas ou os iniciadores utilizados nesta invenção podem ser compreendidos de dNMP que ocorre naturalmente (isto é, dAMP, dGM, dCMP e dTMP), nucleotídeo modificado ou nucleotídeo não natural. As sondas ou os iniciadores também podem incluir ribonucleotídeos.

[0077] O iniciador tem que ser suficientemente longo para iniciar a síntese de produtos da extensão na presença do agente para polimeri- zação. O comprimento exato dos iniciadores dependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, aplicação e fonte do iniciador. O termo “anelamento” ou “priming” como utilizado aqui se refere à justaposição de um oligodessoxinucleotídeo ou ácido nucleico a um ácido nucleico de modelo, em que a justaposição possibilita que a polimerase polime- rize nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico que é complementar ao ácido nucleico modelo ou uma porção do mesmo.

[0078] O termo “hibridização” utilizado aqui se refere à formação de um ácido nucleico de fita dupla partindo de ácidos nucleicos de fita simples complementares. A hibridização pode ocorrer entre duas fitas de ácidos nucleicos perfeitamente compatíveis ou substancialmente compatíveis com algumas incompatibilidades. A complementaridade para a hibridização pode depender das condições de hibridização, particularmente da temperatura.

[0079] A hibridização de uma sequência de ácido nucleico-alvo com o oligonucleotídeo a montante e o PTO pode ser realizada sob condições de hibridização adequadas determinadas de forma rotineira através de procedimentos de otimização. Condições tais como temperatura, concentração de componentes, tempos de hibridização e lava- gem, componentes tamponantes e seu pH e resistência iônica podem ser variadas dependendo de vários fatores, incluindo o comprimento e o conteúdo de GC do oligonucleotídeo (oligonucleotídeo a montante e PTO) e da sequência de nucleotídeo-alvo. Por exemplo, quando um oligonucleotídeo relativamente curto for utilizado, é preferível que condições de baixa adstringência sejam adotadas. As condições detalhadas para hibridização podem ser encontradas em Joseph Sambrook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); e M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag Nova York Inc. N.Y.(1999).

[0080] Não há distinção pretendida entre os termos “anelamento” e “hibridização” e estes termos serão utilizados de forma intercambiável.

[0081] O oligonucleotídeo a montante e o PTO possuem sequên cias de nucleotídeos hibridização complementares à sequência do ácido nucleico-alvo. O termo “complementar” é utilizado aqui para significar que iniciadores ou sondas são suficientemente complementares para hibridizar de forma seletiva com uma sequência de ácido nuclei- co-alvo sob as condições de anelamento ou as condições adstringentes determinadas, abrangendo os termos “substancialmente complementar” e “perfeitamente complementar”, preferencialmente perfeitamente complementar.

[0082] A porção de marcação 5’ do PTO possui uma sequência de nucleotídeos não complementar à sequência de ácido nucleico-alvo. A porção de modelagem do CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelo) possui uma sequência de nucleotídeos não complementar à porção de marcação 5’ e a porção de direcionamento 3’ do PTO. O termo “não complementar” é utilizado aqui para significar que os iniciadores ou as sondas são suficientemente não complementares para não hibridizar de forma seletiva para uma sequência de ácido nucleico-alvo sob as condições de anelamento ou as condições adstringentes determina- das, abrangendo os termos “substancialmente não complementar” e “perfeitamente não complementar”, preferencialmente perfeitamente não complementar.

[0083] Por exemplo, o termo “não complementar” em conjunto com a porção de marcação 5’ do PTO significa que a porção de marcação 5’ é suficientemente não complementar para não hibridizar seletivamente para uma sequência de ácido nucleico alvo sob as condições de anelamento ou condições adstringentes determinadas, compreendendo os termos “substancialmente não complementar” e “perfeitamente não complementar”, preferivelmente perfeitamente não complementar.

[0084] O termo utilizado aqui “PTO (Oligonucleotídeo de Sonda gem e Marcação)” significa um oligonucleotídeo que compreende (i) uma porção de direcionamento 3’ que serve como uma sonda e (ii) uma porção de marcação 5’ com uma sequência de nucleotídeos não complementar à sequência de ácido nucleico-alvo, que é nucleolitica- mente liberada do PTO após a hibridização com a sequência de ácido nucleico-alvo. A porção de marcação 5’ e a porção de direcionamento 3’ no PTO têm que estar posicionadas em uma ordem 5’ para 3’. O PTO é esquematicamente ilustrado na Fig. 1.

[0085] Preferencialmente, a hibridização na etapa (a) é realizada sob condições adstringentes em que a porção de direcionamento 3’ é hibridizada com a sequência de ácido nucleico-alvo e a porção de marcação 5’ não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico- alvo.

[0086] O PTO não requer quaisquer comprimentos específicos. Por exemplo, o comprimento do PTO pode ser de 15 a 150 nucleotí- deos, 15 a 100 nucleotídeos, 15 a 80 nucleotídeos, 15 a 60 nucleotí- deos, 15 a 40 nucleotídeos, 20 a 150 nucleotídeos, 20 a 100 nucleo- tídeos, 20 a 80 nucleotídeos, 20 a 60 nucleotídeos, 20 a 50 nucleotí- deos, 30 a 150 nucleotídeos, 30 a 100 nucleotídeos, 30 a 80 nucleo- tídeos, 30 a 60 nucleotídeos, 30 a 50 nucleotídeos, 35 a 100 nucleo- tídeos, 35 a 80 nucleotídeos, 35 a 60 nucleotídeos ou 35 a 50 nucleo- tídeos. A porção de direcionamento 3’ do PTO pode ter quaisquer comprimentos contanto que esta seja especificamente hibridizada com as sequência de ácidos nucleico-alvo. Por exemplo, a porção de direcionamento 3’ do PTO pode ser de 10 a 100 nucleotídeos, 10 a 80 nucleotídeos, 10 a 50 nucleotídeos, 10 a 40 nucleotídeos, 10 a 30 nucleotídeos, 15 a 100 nucleotídeos, 15 a 80 nucleotídeos, 15 a 50 nucleotídeos, 15 a 40 nucleotídeos, 15 a 30 nucleotídeos, 20 a 100 nucleotídeos, 20 a 80 nucleotídeos, 20 a 50 nucleotídeos, 20 a 40 nucleotídeos ou 20 a 30 nucleotídeos de comprimento. A porção de marcação 5’ pode ter quaisquer comprimentos contanto que esta seja especificamente hibridizada com a porção de modelagem do CTO e então estendida. Por exemplo, a porção de marcação 5’ do PTO pode ter de 5 a 50 nucleotídeos, 5 a 40 nucleotídeos, 5 a 30 nucleotídeos, 5 a 20 nucleotídeos, 10 a 50 nucleotídeos, 10 a 40 nucleotídeos, 10 a 30 nucleotídeos, 10 a 20 nucleotídeos, 15 a 50 nucleotídeos, 15 a 40 nucleotídeos, 15 a 30 nucleotídeos ou 15 a 20 nucleotídeos de comprimento.

[0087] A extremidade 3’ do PTO pode ter uma 3’-OH terminal. Pre ferencialmente, a extremidade 3’ do PTO é “bloqueada” para proibir sua extensão.

[0088] O bloqueio pode ser obtido de acordo com métodos con vencionais. Por exemplo, o bloqueio pode ser realizado através da adição ao grupo 3’-hidroxila do último nucleotídeo de um grupamento químico tal como biotina, marcadores, um grupo fosfato, um grupo alquila, ligante sem ser nucleotídeo, fosforotioato ou alcano-diol. Alternativamente, o bloqueio pode ser realizado através da remoção do grupo 3’-hidroxila do último nucleotídeo ou utilizando um nucleotídeo com nenhum grupo 3’-hidroxila tal como didesoxinucleotídeo.

[0089] Alternativamente, o PTO pode ser projetado para ter uma estrutura em grampo de cabelo.

[0090] A não hibridização entre a porção de marcação 5’ do PTO e a sequência de ácido nucleico-alvo refere-se à não formação de uma fita dupla estável entre as mesmas sob certas condições de hibridiza- ção. De acordo com uma modalidade preferida, a porção de marcação 5’ do PTO não envolvida na hibridização com a sequência de ácido nucleico-alvo forma uma fita simples.

[0091] O oligonucleotídeo a montante fica localizado a montante do PTO.

[0092] Em adição, o oligonucleotídeo a montante ou sua fita es tendida hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo induz a clivagem do PTO por uma enzima que possui uma atividade de nuclease 5’.

[0093] A indução da clivagem de PTO pelo oligonucleotídeo a montante pode ser realizada de duas maneiras: (i) indução de clivagem independente da extensão do oligonucleotídeo a montante; e (ii) indução de clivagem dependente da extensão do oligonucleotídeo a montante.

[0094] Quando o oligonucleotídeo a montante é posicionado de forma adjacente ao PTO de maneira suficiente para induzir a clivagem de PTO por uma enzima que possui a atividade de nuclease 5’, a enzima ligada ao oligonucleotídeo a montante digere o PTO sem reação de extensão. Em contraste, em que o oligonucleotídeo a montante é posicionado de forma distante do PTO, uma enzima que possui uma atividade de polimerase (por exemplo, polimerase dependente do modelo) catalisa a extensão do oligonucleotídeo a montante (por exemplo, iniciador a montante) e uma enzima que possui uma atividade de nuclease 5’ ligada ao produto estendido digere o PTO.

[0095] Portanto, o oligonucleotídeo a montante pode estar locali zado relativamente ao PTO de duas maneiras. O oligonucleotídeo a montante pode estar localizado de forma adjacente ao PTO suficiente para induzir a clivagem de PTO de uma maneira independente da extensão. Alternativamente, o oligonucleotídeo a montante pode estar localizado distantemente do PTO suficiente para induzir a clivagem de PTO de uma maneira dependente da extensão.

[0096] O termo utilizado aqui “adjacente” com referência a posi ções ou localizações significa que o oligonucleotídeo a montante é lo-calizado de forma adjacente à porção de direcionamento 3’ do PTO para formar um pequeno corte. Ainda, o termo significa que o oligonu- cleotídeo a montante fica localizado 1 a 30 nucleotídeos, 1 a 20 nucle- otídeos ou 1 a 15 nucleotídeos distante da porção de direcionamento 3’ do PTO.

[0097] O termo utilizado aqui “distante” com referência a posições ou localizações inclui quaisquer posições ou localizações suficientes para garantir as reações de extensão.

[0098] De acordo com uma modalidade preferida, o oligonucleotí- deo a montante fica localizado distantemente do PTO suficiente para induzir a clivagem de PTO de uma maneira dependente da extensão.

[0099] De acordo com uma modalidade preferida, o oligonucleotí- deo a montante é um iniciador a montante ou uma sonda a montante. O iniciador a montante é adequado em uma indução de clivagem in-dependente da extensão ou uma clivagem dependente da extensão e a sonda a montante é adequada em uma indução de clivagem independente da extensão.

[00100] Alternativamente, o oligonucleotídeo a montante pode ter uma sequência sobreposta parcial com a parte 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO. Preferencialmente, a sequência sobreposta possui 1 a 10 nucleotídeos, mais preferencialmente 1 a 5 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 1 a 3 nucleotídeos de comprimento. Quando o oligonucleotídeo a montante possuir uma sequência sobreposta parcial com a parte 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO, a porção de direcionamento 3’ é parcialmente digerida junto com a porção de marcação 5’ na reação de clivagem da etapa (b). Em adição, a sequência sobreposta permite clivar um sítio desejado da porção de direcionamento 3’.

[00101] De acordo com uma modalidade preferida, o iniciador a montante induz através de sua fita estendida a clivagem do PTO através da enzima que possui a atividade de nuclease 5’.

[00102] As tecnologias convencionais para as reações de clivagem pelos oligonucleotídeos a montante podem ser aplicadas na presente invenção, contanto que o oligonucleotídeo a montante induza a clivagem do PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo para liberar um fragmento que compreende a porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO. Por exemplo, as Pat. U.S. Nos. 5.210.015, 5.487.972, 5.691.142, 5.994.069 e 7.381.532 e a Pub. de Pedido de Patente U.S. No. 2008-0241838 podem ser aplicadas à presente invenção.

[00103] De acordo com uma modalidade preferida, o método é realizado na presença de um iniciador a jusante. O iniciador a jusante gera adicionalmente uma sequência de ácido nucleico-alvo que será hi- bridizada com o PTO, aumentando a sensibilidade em uma detecção de alvo.

[00104] De acordo com uma modalidade preferida, quando o iniciador a montante e o iniciador a jusante são utilizados, uma polimerase de ácido nucleico dependente do modelo é adicionalmente empregada para extensão dos iniciadores.

[00105] De acordo com uma modalidade preferida, o oligonucleotí- deo a montante (iniciador a montante ou sonda a montante), o inicia- dor a jusante e/ou a porção de marcação 5’ do PTO possuem uma estrutura de oligonucleotídeo de iniciação dupla (DPO) (Dual Priming Oligonucleotide) desenvolvida pelo presente inventor. Os oligonucleo- tídeos que possuem a estrutura de DPO exibem especificidade para o alvo significativamente aprimorada comparado com os com iniciadores e sondas convencionais (vide WO 2006/095981; Chun e outros, “Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene”, Nucleic Acid Research, 35:6e40(2007)).

[00106] De acordo com uma modalidade preferida, a porção de di-recionamento 3’ do PTO possui uma estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dupla modificada (mDSO) (modified Dual Specificity Oligonucleotideo) desenvolvida pelo presente inventor. A estrutura de oligonucleotídeo de especificidade dupla modificada (mDSO) mostra especificidade ao alvo significativamente aprimorada comparado com as sondas convencionais (ver a WO 2011/028041). Etapa (b): Liberação do fragmento do PTO

[00107] Posteriormente, o resultado da etapa (a) é colocado em contato com uma enzima que possui uma atividade de nuclease 5’ sob condições para a clivagem do PTO. O PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo é digerido pela enzima que possui a atividade de nuclease 5’ para liberar um fragmento que compreende a porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO.

[00108] O termo utilizado aqui “condições para a clivagem do PTO” significa condições suficientes para digerir o PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo através da enzima que possui a atividade de nuclease 5’, tais como temperatura, pH, resistência iônica, tampão, comprimento e sequência de oligonucleotídeos e enzimas. Por exemplo, quando a Taq DNA polimerase é utilizada como a enzima que possui a atividade de nuclease 5’, as condições para a cliva- gem do PTO incluem tampão Tris-HCl, KCl, MgCl2 e temperatura.

[00109] Quando o PTO é hibridizado com a sequência de ácido nu- cleico-alvo, sua porção de direcionamento 3’ é envolvida na hibridiza- ção e a porção de marcação 5’ forma uma fita simples sem hibridiza- ção com a sequência de ácido nucleico-alvo (vide Fig. 2). Deste modo, um oligonucleotídeo que compreende tanto estruturas de fita simples quanto de fita dupla pode ser digerido utilizando uma enzima que possui a atividade de nuclease 5’ através de uma variedade de tecnologias conhecidas por um versado na técnica.

[00110] Os sítios de clivagem do PTO são variados dependendo do tipo de oligonucleotídeos a montante (sonda a montante ou iniciador a montante), sítios de hibridização de oligonucleotídeos a montante e condições de clivagem (vide Pat. U.S. Nos. 5.210.015, 5.487.972, 5.691.142, 5.994.069 e 7.381.532 e a Pub. de Pedido de Patente U.S. No. 2008-0241838).

[00111] Um grande número de tecnologias convencionais pode ser empregado para a reação de clivagem do PTO, liberando um fragmento que compreende a porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’.

[00112] Sucintamente, pode haver três sítios de clivagem na etapa (b). Primeiramente, o sítio de clivagem é um sítio de junção entre uma porção de hibridização do PTO (porção de direcionamento 3’) e uma porção sem ser de hibridização (porção de marcação 5’). O segundo sítio de clivagem é um sítio localizado vários nucleotídeos em uma direção 3’ distante da extremidade 3’ da porção de marcação 5’ do PTO. O segundo sítio de clivagem fica localizado na parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO. O terceiro sítio de clivagem é um sítio localizado vários nucleotídeos em uma direção 5’ distante da extremidade 3’ da porção de marcação 5’ do PTO.

[00113] De acordo com uma modalidade preferida, o sítio inicial pa ra a clivagem do PTO pela polimerase dependente do modelo que possui a atividade de nuclease 5’ quando da extensão do iniciador a montante é um ponto de partida da fita dupla entre o PTO e a sequência de ácido nucleico-alvo ou um sítio 1-3 nucleotídeos distante do ponto de partida.

[00114] Sob este aspecto, o termo utilizado aqui “um fragmento que compreende a porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO” em associação com a clivagem do PTO pela enzima que possui a atividade de nuclease 5’ é utilizado para abranger (i) a porção de marcação 5’, (ii) a porção de marcação 5’ e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ e (iii) uma parte da porção de marcação 5’. Neste pedido de patente, o termo “um fragmento que compreende a porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO” também pode ser descrito como “fragmento de PTO”.

[00115] De acordo com uma modalidade, o PTO tem uma porção bloqueadora contendo um bloqueador resistente à clivagem pela enzima tendo atividade de nuclease 5’ e a porção bloqueadora é usada para controlar um sítio de clivagem inicial e/ou clivagens sucessivas.

[00116] De acordo com uma modalidade, o PTO tem uma porção bloqueadora contendo como um bloqueador pelo menos um nucleotí- deo resistente à clivagem pela enzima tendo atividade de nuclease 5’.

[00117] Por exemplo, para induzir clivagem no sítio de junção entre uma porção de hibridização do PTO (porção de direcionamento 3’) e uma porção de não hibridização (porção de marcação 5’), a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ de PTO pode ser bloqueada com bloqueadores.

[00118] O número de bloqueadores contido na porção bloqueadora pode ser não limitado, preferivelmente 1 a 10, mais preferivelmente 2 a 10, ainda mais preferivelmente 3 a 8, sobretudo preferivelmente 3 a 6 bloqueadores. Os bloqueadores presentes no PTO podem estar de uma maneira contínua ou intermitente, preferivelmente de uma maneira contínua. Os nucleotídeos como bloqueadores com uma estrutura principal resistente à atividade de exonuclease 5’ a 3’ incluem qualquer um conhecido de um versado na técnica. Por exemplo, ele inclui várias ligações fosforotioato, ligações fosfonato, ligações fosforoamidato e modificações 2’-carboidrato. De acordo com uma modalidade mais preferida, nucleotídeos tendo uma estrutura principal resistente à exonuclease 5’ a 3’ incluem ligação fosforotioato, ligação alquil fosfotriés- ter, ligação aril fosfotriéster, ligação alquil fosfonato, ligação aril fosfo- nato, ligação hidrogeno fosfonato, ligação alquil fosforoamidato, ligação aril fosforoamidato, ligação fosforosselenato, modificação 2’-O- aminopopila, modificação 2’-O-alquila, modificação 2’-O-alila, modificação 2’-O-butila, modificação oligodesoxinucleotídeo a-anomérico e 1-(4’-tio-β-ribofuranosila).

[00119] De acordo com uma modalidade, um nucleotídeo como um bloqueador inclui LNA (ácido nucleico bloqueado) (Locked Nucleic Acid).

[00120] O termo “parte” utilizado em associação com o PTO ou CTO tal como a parte da porção de marcação 5’ do PTO, a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO e a parte da extremidade 5’ da porção de captura do CTO refere-se a uma sequência de nucleotídeos composta de 1 a 40, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10 ou 1-5 nucleotídeos, preferencialmente 1, 2, 3 ou 4 nucleotídeos.

[00121] De acordo com uma modalidade preferida, a enzima que possui a atividade de nuclease 5’ é a polimerase de DNA que possui a atividade de nuclease 5’ ou FEN nuclease, mais preferencialmente uma polimerase de DNA termostável que possui uma atividade de nuclease 5’ ou FEN nuclease.

[00122] Uma polimerase de DNA adequada que possui a atividade de uma nuclease 5’ nesta invenção é uma polimerase de DNA termos- tável obtida de uma variedade de espécies bacterianas, incluindo Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus fili- formis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Ther- mus rubens, Thermus scotoductus, Thermus silvanus, Espécie de Thermus Z05, Espécie de Thermus sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africa-nus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermo- siphoafricanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus e Aquifex aeolieus. Mais preferencialmente, a polimerase de DNA termostável é Taq poli- merase.

[00123] Alternativamente, a presente invenção pode empregar po- limerase de DNAs que possuem a atividade de nuclease 5’ modificada para ter menos atividades de polimerase.

[00124] A FEN (flap endonuclease) nuclease utilizada é uma nuclease específica de flap 5’.

[00125] A FEN nuclease adequada na presente invenção compreende FEN nucleases obtidas de uma variedade de espécies bacteria- nas, incluindo Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi, Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonarius, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Me- thanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii, Aeropyrum pernix e Ar- chaeaglobus veneficus.

[00126] Onde o iniciador a montante é utilizado na etapa (a), é pre- ferível que as condições para a clivagem do PTO compreendam a reação de extensão do iniciador a montante.

[00127] De acordo com uma modalidade preferida, o iniciador a montante é utilizado na etapa (a), uma polimerase dependente do modelo é utilizada para a extensão do iniciador a montante e a polimera- se dependente do modelo é idêntica à enzima que possui a atividade de nuclease 5’.

[00128] Opcionalmente, o iniciador a montante é utilizado na etapa (a), uma polimerase dependente do modelo é utilizada para a extensão do iniciador a montante e a polimerase dependente do modelo é diferente da enzima que possui a atividade de nuclease 5’. Etapa (c): Hibridização do fragmento liberado do PTO com CTO

[00129] O fragmento liberado do PTO é hibridizado com um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelo).

[00130] O CTO compreende em uma direção 3’ até 5’ (i) uma porção de captura que compreende uma sequência de nucleotídeos complementar à porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO e (ii) uma porção de modelagem que compreende uma sequência de nucleotídeos não complementar à porção de marcação 5’ e a porção de direcionamento 3’ do PTO.

[00131] O CTO atua como um modelo for extensão do fragmento liberado partindo do PTO. O fragmento que serve como um iniciador é hibridizado com o CTO e estendido para formar um duplex estendido.

[00132] A porção de modelagem pode compreender qualquer sequência contanto que não seja complementar à porção de marcação 5’ e à porção de direcionamento 3’ do PTO. Além disso, a porção de modelagem pode compreender qualquer sequência contanto que esta possa atuar como um modelo para a extensão do fragmento liberado partindo do PTO.

[00133] Como descrito anteriormente, quando o fragmento que possui a porção de marcação 5’ do PTO é liberado, é preferido que a porção de captura do CTO seja planejada para compreender uma sequência de nucleotídeos complementar à porção de marcação 5’. Quando o fragmento que possui a porção de marcação 5’ e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ for liberado, é preferido que a porção de captura do CTO seja planejada para compreender uma sequência de nucleotídeos complementar à porção de marcação 5’ e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’. Quando o fragmento que possui uma parte da porção de marcação 5’ do PTO é liberado, é preferido que a porção de captura do CTO seja planejada para compreender uma sequência de nucleotídeos complementar à parte da porção de marcação 5’.

[00134] Além disso, é possível planejar a porção de captura do CTO com sítios de clivagem de antecipação do PTO. Por exemplo, quando a porção de captura do CTO é planejada para compreender uma sequência de nucleotídeos complementar à porção de marcação 5’, ou fragmento que possui uma parte da porção de marcação 5’ ou o fragmento que possui a porção de marcação 5’ pode ser hibridizado com a porção de captura e então estendido. Quando o fragmento que compreende a porção de marcação 5’ e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ for liberado, este pode ser hibridizado com a porção de captura do CTO planejada para compreender uma sequência de nucleotídeo complementar à porção de marcação 5’ e então estendido de forma bem sucedida embora nucleotídeos incompatíveis estejam presentes na porção da extremidade 3’ do fragmento. Isto é devido ao fato que os iniciadores podem ser estendidos dependendo das condições de reação embora sua extremidade 3’ contenha alguns nucleotídeos incompatíveis (por exemplo 1-3 nucleotídeos in-compatíveis).

[00135] Quando o fragmento que compreende a porção de marca- ção 5’ e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ é liberado, a parte da extremidade 5’ da porção de captura do CTO pode ser planejada para ter uma sequência de nucleotídeos complementar à parte clivada da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’, resolvendo os problemas associados com os nucleotídeos incompatíveis (ver a Fig. 1).

[00136] Preferencialmente, a sequência de nucleotídeos da parte da extremidade 5’ da porção de captura do CTO complementar à parte clivada da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ pode ser selecionada dependendo dos sítios de clivagem antecipados na porção de direcionamento 3’ do PTO. É preferível que a sequência de nu- cleotídeos da parte da extremidade 5’ da porção de captura do CTO complementar à parte clivada da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ tenha 1 a 10 nucleotídeos, mais preferencialmente 1 a 5 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente 1 a 3 nucleotídeos.

[00137] A extremidade 3’ do CTO pode compreender nucleotídeos adicionais não envolvidos na hibridização com o fragmento. Além disso, a porção de captura do CTO pode compreender uma sequência de nucleotídeos complementar apenas a uma parte do fragmento (por exemplo, uma parte do fragmento que contém sua porção da extremidade 3’) contanto que esteja estavelmente hibridizada com o fragmento.

[00138] O termo utilizado “porção de captura que compreende uma sequência de nucleotídeos complementar à porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’” é descrito aqui abranger vários planejamentos e composições da porção de captura do CTO como discutido anteriormente.

[00139] O CTO pode ser planejado para possuir uma estrutura em grampo de cabelo.

[00140] O comprimento do CTO pode ser amplamente variado. Por exemplo, o CTO tem 7 a 1000 nucleotídeos, 7 a 500 nucleotídeos, 7 a 300 nucleotídeos, 7 a 100 nucleotídeos, 7 a 80 nucleotídeos, 7 a 60 nucleotídeos, 7 a 40 nucleotídeos, 15 a 1000 nucleotídeos, 15 a 500 nucleotídeos, 15 a 300 nucleotídeos, 15 a 100 nucleotídeos, 15 a 80 nucleotídeos, 15 a 60 nucleotídeos, 15 a 40 nucleotídeos, 20 a 1000 nucleotídeos, 20 a 500 nucleotídeos, 20 a 300 nucleotídeos, 20 a 100 nucleotídeos, 20 a 80 nucleotídeos, 20 a 60 nucleotídeos, 20 a 40 nu- cleotídeos, 30 a 1000 nucleotídeos, 30 a 500 nucleotídeos, 30 a 300 nucleotídeos, 30 a 100 nucleotídeos, 30 a 80 nucleotídeos, 30 a 60 nucleotídeos ou 30 a 40 nucleotídeos de comprimento. A porção de captura do CTO pode ter qualquer comprimento contanto que seja especificamente hibridizada com o fragmento liberado partindo do PTO. Por exemplo, a porção de captura do CTO tem 5 a 100 nucleotídeos, 5 a 60 nucleotídeos, 5 a 40 nucleotídeos, 5 a 30 nucleotídeos, 5 a 20 nucleotídeos, 10 a 100 nucleotídeos, 10 a 60 nucleotídeos, 10 a 40 nucleotídeos, 10 a 30 nucleotídeos, 10 a 20 nucleotídeos, 15 a 100 nucleotídeos, 15 a 60 nucleotídeos, 15 a 40 nucleotídeos, 15 a 30 nu- cleotídeos ou 15 a 20 nucleotídeos de comprimento. A porção de modelagem do CTO pode ter qualquer comprimento contanto que possa atuar como um modelo na extensão do fragmento liberado partindo do PTO. Por exemplo, a porção de modelagem do CTO tem 1 a 900 nu- cleotídeos, 1 a 400 nucleotídeos, 1 a 300 nucleotídeos, 1 a 100 nucle- otídeos, 1 a 80 nucleotídeos, 1 a 60 nucleotídeos, 1 a 40 nucleotídeos, 1 a 20 nucleotídeos, 2 a 900 nucleotídeos, 2 a 400 nucleotídeos, 2 a 300 nucleotídeos, 2 a 100 nucleotídeos, 2 a 80 nucleotídeos, 2 a 60 nucleotídeos, 2 a 40 nucleotídeos, 2 a 20 nucleotídeos, 5 a 900 nucle- otídeos, 5 a 400 nucleotídeos, 5 a 300 nucleotídeos, 5 a 100 nucleotí- deos, 5 a 80 nucleotídeos, 5 a 60 nucleotídeos, 5 a 40 nucleotídeos, 5 a 30 nucleotídeos, 10 a 900 nucleotídeos, 10 a 400 nucleotídeos, 10 a 300 nucleotídeos, 15 a 900 nucleotídeos, 15 a 100 nucleotídeos, 15 a 80 nucleotídeos, 15 a 60 nucleotídeos, 15 a 40 nucleotídeos ou 15 a 20 nucleotídeos de comprimento.

[00141] A extremidade 3’ do CTO pode ter um terminal 3’-OH. Pre-ferencialmente, a extremidade 3’ do CTO é bloqueada para proibir sua extensão. O bloqueio do CTO que não pode ser estendido pode ser conseguido de acordo com métodos convencionais. Por exemplo, o bloqueio pode ser realizado através da adição ao grupo 3’-hidroxila do último nucleotídeo do CTO de um grupamento químico tal como biotina, marcadores, um grupo fosfato, grupo alquila, ligante sem ser nu- cleotídeo, fosforotioato ou alcano-diol. Alternativamente, o bloqueio pode ser realizado através da remoção do grupo 3’-hidroxila do último nucleotídeo ou utilizando um nucleotídeo sem grupo 3’-hidroxila tal como didessoxinucleotídeo.

[00142] O fragmento liberado do PTO é hibridizado com o CTO, fornecendo uma forma adequada na extensão do fragmento. Embora um PTO não digerido também seja hibridizado com a porção de captura do CTO através de sua porção de marcação 5’, sua porção de direcionamento 3’ não é hibridizada ao CTO que proíbe a formação de um duplex estendido.

[00143] A hibridização na etapa (c) pode ser descrita em detalhes com referência às descrições na etapa (a). Etapa (d): Extensão do fragmento

[00144] A reação de extensão é realizada utilizando o resultado da etapa (c) e uma polimerase de ácido nucleico dependente do modelo. O fragmento hibridizado com a porção de captura do CTO é estendido para formar um duplex estendido. Em contraste, o PTO hibridizado não clivado com a porção de captura do CTO não é estendido de forma que nenhum duplex estendido é formado.

[00145] O termo utilizado aqui “duplex estendido” significa um duplex formado através da reação de extensão em que o fragmento hi- bridizado com a porção de captura do CTO é estendido utilizando a porção de modelagem do CTO como um modelo e a polimerase de ácido nucleico dependente de modelo.

[00146] O duplex estendido possui valor de Tm diferente daquele do híbrido entre o PTO não clivado e o CTO.

[00147] Preferencialmente, o duplex estendido possui valor de Tm maior que o híbrido entre o PTO não clivado e o CTO.

[00148] O valor de Tm do duplex estendido é ajustável por (i) uma sequência e/ou um comprimento do fragmento, (ii) uma sequência e/ou um comprimento do CTO ou (iii) a sequência e/ou o comprimento do fragmento e a sequência e/ou o comprimento do CTO.

[00149] É uma característica notável da presente invenção que o valor de Tm ajustável do duplex estendido é empregado para fornecer um sinal-alvo indicativo da presença do duplex estendido através da fusão do duplex estendido na etapa (e).

[00150] O termo utilizado aqui “Tm” refere-se a uma temperatura de fusão em que metade da população de molécula de ácido nucleicos de fita dupla é dissociada em moléculas de fita simples. O valor de Tm é determinado pelo comprimento e teor de G/C de nucleotídeos hibridi- zados. O valor de Tm pode ser calculado através de métodos convencionais tal como a regra de Wallace (R.B. Wallace e outros, Nucleic Acids Research, 6:3543-3547(1979)) e o método do vizinho mais próximo (SantaLucia J. Jr. e outros, Biochemistry, 35:3555-3562(1996)); Sugimoto N. e outros, Nucleic Acids Res., 24:4501-4505(1996)).

[00151] De acordo com uma modalidade preferida, o valor de Tm refere-se a valores reais de Tm sob condições de reação praticadas atualmente.

[00152] A polimerase de ácido nucleico dependente de modelo utilizada na etapa (d) pode incluir quaisquer polimerases de ácido nuclei- co, por exemplo, fragmento de Klenow da polimerase de DNA I de E. coli, uma polimerase de DNA termostável e polimerase de DNA de bacteriófago T7. Preferencialmente, a polimerase é uma polimerase de DNA termostável que pode ser obtida de uma variedade de espécies bacterianas, incluindo Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Ther- mus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Ther- mus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus sil- vanus, Espécie de Thermus Z05, Espécie de Thermus sps 17, Ther- mus thermophilus, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga maritima, Thermotoga neapo- litana, Thermosiphoafricanus, Pyrococcus furiosus(Pfu), Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii, Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occul- tum, Aquifex pyrophilus e Aquifex aeolieus. Mais preferencialmente, a polimerase de ácido nucleico dependente de modelo é Taq polimerase.

[00153] De acordo com uma modalidade preferida, a enzima que possui a atividade de nuclease 5’ utilizada na etapa (b) é idêntica à po- limerase de ácido nucleico dependente de modelo utilizada na etapa (d). Mais preferencialmente, a enzima que possui a atividade de nuclease 5’ utilizada na etapa (b), a polimerase de ácido nucleico dependente de modelo utilizada para a extensão do iniciador a montante e a polimerase de ácido nucleico dependente de modelo utilizada na etapa (d) são idênticas uma à outra.

[00154] O duplex estendido possui um marcador originado de (i) pelo menos um marcador ligado ao fragmento de PTO e/ou CTO, (ii) um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão, (iii) um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão e um marcador ligado ao fragmento de PTO e/ou CTO ou (iv) um marcador intercalante.

[00155] A presença do duplex estendido pode indicar a presença da sequência de ácido nucleico-alvo porque o duplex estendido é formado quando a sequência de ácido nucleico-alvo está presente. Para a detecção da presença do duplex estendido de uma maneira direta, um duplex estendido que possui uma marcação fornecendo um sinal detectado é formado na etapa (d). Um marcador utilizado no duplex estendido fornece uma alteração de sinal dependendo do fato do duplex estendido estar em uma fita dupla ou uma fita simples, finalmente fornecendo o sinal-alvo indicativo da presença do duplex estendido através da fusão do duplex estendido. Etapa (e): Fusão do duplex estendido

[00156] Após a reação de extensão, o duplex estendido é fundido em uma faixa de temperaturas para fornecer um sinal-alvo indicativo da presença do duplex estendido.

[00157] O sinal-alvo é fornecido por (i) pelo menos um marcador ligado ao fragmento e/ou ao CTO, (ii) um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão, (iii) um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão e um marcador ligado ao fragmento e/ou ao CTO ou (iv) um marcador interca- lante.

[00158] O termo utilizado aqui “sinal-alvo” significa qualquer sinal capaz de indicar a presença do duplex estendido. Por exemplo, o sinal-alvo inclui um sinal das marcadores (geração ou extinção de sinal), uma alteração de sinal de marcadores (aumento ou diminuição de sinal), uma curva de fusão, um padrão de fusão e uma temperatura de fusão (ou valor de Tm).

[00159] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo é uma alteração de sinal partindo de um marcador no duplex estendido na etapa de fusão. A alteração de sinal pode ser obtida através da medida dos sinais em não menos que duas temperaturas diferentes. Al- ternativamente, o sinal-alvo é uma curva de fusão, um padrão de fusão e uma temperatura de fusão (ou valor de Tm) obtida através da medida dos sinais do marcador no duplex em uma faixa de temperaturas. Pre-ferencialmente, a faixa de temperaturas é uma faixa de temperaturas for uma análise da curva de fusão ou temperaturas em torno do valor de Tm do duplex estendido.

[00160] O duplex estendido possui valor de Tm maior que o híbrido entre os PTO não clivado e o CTO. Portanto, o duplex estendido e o híbrido exibem padrões de fusão diferentes um do outro. Tais padrões de fusão diferentes permitem discriminar um sinal-alvo de sinais que não são alvo. O padrão de fusão ou a temperatura de fusão diferente gera o sinal-alvo junto com um sistema de marcação adequado.

[00161] Os sistemas de marcação adequados utilizados na presente invenção são vários em termos de seus tipos, localizações e maneira de produção de sinal.

[00162] Os sistemas de marcação úteis nesta invenção serão descritos em detalhes a seguir: (ii) Marcador ligado ao fragmento e/ou ao CTO

[00163] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo é fornecido por pelo menos um marcador ligado ao fragmento e/ou ao CTO. À medida que o duplex estendido é formado entre o fragmento de PTO e CTO, ou o marcador no fragmento de PTO ou no CTO fica presente no duplex estendido, fornecendo o sinal-alvo na etapa de fusão.

[00164] O marcador inclui um marcador duplo interativo e um marcador único. (i-1) Marcador duplo interativo

[00165] O sistema de marcador interativo é um sistema de geração de sinal em que a energia é passada de forma não radioativa entre uma molécula doadora e uma molécula receptora. Como uma repre- sentação do sistema de marcador interativo, o sistema de marcador FRET (transferência de energia por ressonância fluorescente) (Fluorescence Resonance Energy Transfer) inclui uma molécula repórter fluorescente (molécula doadora) e uma molécula de extinção (molécula receptora). No FRET, o doador de energia é fluorescente, mas o receptor de energia pode ser fluorescente ou não fluorescente. Em outra forma de sistemas de marcador interativo, o doador de energia não é fluorescente, por exemplo, um cromóforo e o receptor de energia é fluorescente. Ainda em outra forma de sistemas de marcador interativo, o doador de energia é luminescente, por exemplo, bioluminescente, quimioluminescente, eletroquimioluminescente e o receptor é fluorescente. A molécula doadora e a molécula receptora podem ser descritas como uma molécula repórter e uma molécula de extinção na presente invenção, respectivamente.

[00166] Preferencialmente, o sinal indicativo da presença do duplex estendido (isto é, a presença da sequência de ácido nucleico- alvo) é gerado por sistemas de marcador interativo, mais preferencialmente o sistema de marcador FRET (isto é, sistema de marcador duplo interativo). Primeira Modalidade (Marcador duplo interativo intrafita)

[00167] Em uma primeira modalidade de um sistema de marcador duplo interativo, o fragmento ou o CTO possui um marcador duplo interativo que compreende uma molécula repórter e uma molécula de extinção; em que a fusão do duplex estendido na etapa (e) induz alteração de um sinal proveniente do marcador duplo interativo para fornecer o sinal-alvo na etapa (e). A primeira modalidade do sistema de marcador duplo interativo é ilustrada nas Figs. 2, 6 e 9. A primeira modalidade é chamada de um marcador duplo interativo intrafita. Primeira Modalidade na Fig. 2 (Marcador duplo interativo intrafita)

[00168] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Fig. 2. A porção de modelagem do CTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção. O PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo é digerido para liberar o fragmento e o fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO e estendido para formar o duplex estendido.

[00169] Quando o duplex estendido é formado na etapa (d), a molécula repórter e a molécula de extinção no CTO são conformacional- mente separadas para permitir que a molécula de extinção não elimine o sinal da molécula repórter; em que quando o duplex estendido é fundido na etapa (e), a molécula repórter e a molécula de extinção são conformacionalmente adjacentes uma à outra para permitir que a molécula de extinção elimine o sinal da molécula repórter, de forma que o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença do duplex estendido na etapa (e).

[00170] A expressão utilizada aqui “a molécula repórter e a molécula de extinção são conformacionalmente adjacentes” significa que a molécula repórter e a molécula de extinção estão de forma tridimensional adjacentes uma à outra através de uma estrutura conformacional do fragmento ou CTO tal como mola aleatória e estrutura grampo de cabelo.

[00171] A expressão utilizada aqui “a molécula repórter e a molécula de extinção estão conformacionalmente separadas” significa que a molécula repórter e a molécula de extinção são tridimensionalmente separadas através da alteração da estrutura conformacional do fragmento ou CTO quando da formação de uma fita dupla.

[00172] Preferencialmente, o sinal-alvo fornecido na etapa (e) inclui curva de fusão, um padrão de fusão ou um valor de Tm que é obtido através da medida da alteração do sinal fluorescente gerado na etapa (d).

[00173] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula re- pórter e a molécula de extinção podem ser localizadas em qualquer sítio no CTO, contanto que o sinal da molécula repórter seja extinto e não extinto dependendo da fusão do duplex estendido.

[00174] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção estão ambas ligadas à porção de modelagem ou à porção de captura do CTO.

[00175] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção estão posicionadas na extremidade 5’ e na extremidade 3’ de CTO.

[00176] De acordo com uma modalidade preferida, uma da molécula repórter e da molécula de extinção no CTO fica localizada em sua extremidade 5’ ou 1 a 5 nucleotídeos de distância da sua extremidade 5’ e a outra fica localizada para extinguir e não extinguir o sinal da molécula repórter dependendo da conformação de CTO.

[00177] De acordo com a modalidade preferida, uma da molécula repórter e da molécula de extinção no CTO fica localizada em sua extremidade 3’ ou 1 a 5 nucleotídeos distante da sua extremidade 3’ e a outra fica localizada para extinguir e não extinguir o sinal da molécula repórter dependendo da conformação de CTO.

[00178] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula re pórter e a molécula de extinção estão posicionadas não mais que 80 nucleotídeos, mais preferencialmente não mais que 60 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente não mais que 30 nucleotídeos, ainda muito mais preferencialmente não mais que 25 nucleotídeos de distância uma da outra. De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção são separadas por pelo menos 4 nucleotídeos, mais preferencialmente pelo menos 6 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente pelo menos 10 nucleotídeos, ainda muito mais preferencialmente pelo menos 15 nucleotídeos.

[00179] Na presente invenção, um híbrido entre o PTO não clivado e o CTO pode ser formado.

[00180] Quando a porção de modelagem do CTO for marcada com um marcador duplo interativo que é mostrada na Fig. 2, uma alteração de sinal partindo de um marcador no híbrido entre o PTO não clivado e o CTO não é induzida. Portanto, o híbrido não fornece um sinal que não é alvo.

[00181] Em que a porção de captura do CTO for marcada com um marcador duplo interativo, o híbrido entre o PTO não clivado e o CTO fornece um sinal que não é alvo na etapa de fusão. Neste caso, a diferença nos valores de Tm do duplex estendido e o híbrido permite discriminar o sinal-alvo do duplex estendido do sinal que não é alvo do híbrido. Primeira Modalidade na Fig. 6 (Marcador duplo interativo intrafita)

[00182] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Fig. 6. A porção de marcação 5’ do PTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção. O PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo é digerido para liberar o fragmento que compreende a porção de marcação 5’ com a molécula repórter e a molécula de extinção. O fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO.

[00183] Quando o duplex estendido é formado na etapa (d), a molécula repórter e a molécula de extinção no fragmento são conformaci- onalmente separadas para permitir que a molécula de extinção não elimine o sinal da molécula repórter; em que quando o duplex estendido é fundido na etapa (e), a molécula repórter e a molécula de extinção são conformacionalmente adjacentes a uma à outra para permitir que a molécula de extinção elimine o sinal da molécula repórter, de forma que o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença do duplex estendido na etapa (e).

[00184] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção podem estar localizadas em qualquer sítio no fragmento, contanto que o sinal da molécula repórter seja extinto e não extinto dependendo da fusão do duplex estendido.

[00185] De acordo com uma modalidade preferida, uma da molécula repórter e da molécula de extinção no fragmento está localizada em sua extremidade 5’ ou 1 a 5 nucleotídeos de distância da sua extremidade 5’ e a outra está localizada para extinguir e não extinguir o sinal da molécula repórter dependendo de conformação do fragmento.

[00186] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção estão posicionadas não mais do que 50 nucleotídeos, mais preferencialmente não mais que 40 nucleotí- deos, ainda mais preferencialmente não mais que 30 nucleotídeos, ainda muito mais preferencialmente não mais que 20 nucleotídeos uma da outra. De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção são separadas por pelo menos 4 nu- cleotídeos, mais preferencialmente pelo menos 6 nucleotídeos, ainda mais preferencialmente pelo menos 10 nucleotídeos, ainda muito mais preferencialmente pelo menos 15 nucleotídeos.

[00187] Como representado na Fig. 6, o híbrido entre o PTO não clivado e o CTO fornece um sinal que não é alvo na etapa de fusão. Neste caso, a diferença em valores de Tm do duplex estendido e o híbrido permite discriminar o sinal-alvo do duplex estendido do sinal que não é alvo do híbrido. Segunda Modalidade (Marcador duplo interativo intrafita)

[00188] Na segunda modalidade do sistema de marcador interativo, o fragmento possui um de um marcador duplo interativo que compreende uma molécula repórter e uma molécula de extinção e o CTO possui o outro do marcador duplo interativo; em que a fusão do duplex estendido na etapa (e) induz alteração de um sinal proveniente do marcador duplo interativo para fornecer o sinal-alvo na etapa (e).

[00189] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Fig. 8.

[00190] Quando o duplex estendido é formado na etapa (d), o sinal da molécula repórter ligada ao CTO é extinto pela molécula de extinção ligada ao PTO. Quando o duplex estendido é fundido na etapa (e), a molécula repórter e a molécula de extinção são separadas para permitir que a molécula de extinção não elimine o sinal da molécula repórter, de forma que o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença do duplex estendido na etapa (e).

[00191] Preferencialmente, o sinal-alvo fornecido na etapa (e) inclui uma curva de fusão, um padrão de fusão ou um valor de Tm que é obtido através da medida da alteração do sinal fluorescente proveniente do marcador duplo interativo.

[00192] A molécula repórter e a molécula de extinção podem estar localizadas em qualquer sítio do fragmento de PTO e do CTO, contanto que o sinal da molécula repórter seja extinto pela molécula de extinção no duplex estendido.

[00193] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter ou a molécula de extinção no fragmento de PTO está localizada na extremidade 5’ da porção de marcação 5’.

[00194] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter ou a molécula de extinção no CTO fica localizada em sua extremidade 3’.

[00195] Como representado na Fig. 8, o híbrido entre o PTO não clivado e o CTO fornece um sinal que não é alvo na etapa de fusão. Neste caso, a diferença nos valores de Tm do duplex estendido e do híbrido permite discriminar o sinal-alvo do duplex estendido do sinal que não é alvo do híbrido.

[00196] A molécula repórter e a molécula de extinção úteis na presente invenção podem incluir quaisquer moléculas conhecidas na arte. Os exemplos destas são: Cy2® (506), YO-PRO®-1 (509), YOYO®-1 (509), Calceína (517), FITC (518), FluorX® (519), Alexa® (520), Rhodamine 110 (520), Oregon Green® 500 (522), Oregon Green® 488 (524), RiboGreen® (525), Rhodamine Green® (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green® (531), Calcium Green® (533), TO-PRO®-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3® (570), Alexa® 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange® (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange® (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red® (590), Cy3.5® (596), ROX (608), Calcium Crimson® (615), Alexa® 594 (615), Texas Red (615), Nile Red (628), YO-PRO®- 3 (631), YOYO®-3 (631), R-ficocianina (642), C-Ficocianina (648), TO- PRO®-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5® (670), Tiadicar- bocianina (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluoresceína (520), Fluoresceína-C3 (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) e Quasar 705 (610). O número entre parênteses é um comprimento de ondas de emissão máximo em nanometros. Preferencialmente, a molécula repórter e a molécula de extinção incluem JOE, FAM, TAMRA, ROX e marcador à base de fluoresceína.

[00197] Os pares adequados de repórter-extintor são revelados em uma variedade de publicações como a seguir: Pesce e outros, editores, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, Nova York, 1971); White e outros, Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, Nova York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2a Edição (Academic Press, Nova York, 1971); Griffiths, Color AND Constitution of Organic Molecules (Academic Press, Nova York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Fosforescence (Interscience Publishers, Nova York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6a Edição (Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996) Pat. U.S. Nos. 3.996.345 e 4.351.760.

[00198] É digno de nota que uma molécula de extinção negra não fluorescente capaz de extinguir uma fluorescência de uma faixa ampla de comprimentos de onda ou um comprimento de onda específico pode ser utilizada na presente invenção. Os exemplos destas são BHQ e DABCYL.

[00199] No marcador FRET adotado para o CTO, o repórter abrange um doador de FRET e o extintor abrange o outro parceiro (receptor) de FRET. Por exemplo, um corante de fluoresceína é utilizado como o repórter e um corante de rodamina como o extintor.

[00200] Os marcadores podem ser ligados ao CTO ou PTO através de métodos convencionais. Preferivelmente, ele é ligado ao CTO ou PTO através de um espaçador contendo átomos de carbono (por exemplo, espaçador de 3 carbonos, espaçador de 6 carbonos ou es- paçador de 12 carbonos). (i-2) Marcador Único

[00201] A presente invenção é também excelentemente executada utilizando sistemas de marcador único para fornecer sinais que indicam a presença de sequência de ácidos nucleico-alvo.

[00202] De acordo com uma modalidade preferida, o fragmento ou o CTO possui um marcador único e a fusão do duplex estendido na etapa (e) induz a alteração de um sinal do marcador único para fornecer o sinal-alvo na etapa (e). Primeira Modalidade na Fig. 3 (Sistema de marcador único)

[00203] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Fig. 3. A porção de modelagem do CTO possui um marcador fluorescente único. O PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico- alvo é digerido para liberar o fragmento. O fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO e estendido para formar o duplex estendido. Através da formação do duplex estendido, a intensidade fluorescente proveniente do marcador fluorescente único se torna maior. Quando o duplex estendido é fundido na etapa (e), a intensidade fluorescente proveniente do marcador fluorescente único se torna menor, de forma que o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença do duplex estendido na etapa (e).

[00204] De acordo com uma modalidade preferida, o marcador único pode estar localizado em qualquer sítio no CTO, contanto que o nível de sinal proveniente do marcador único seja alterado dependendo da fusão do duplex estendido.

[00205] De acordo com uma modalidade preferida, o marcador único é ligado à porção de modelagem ou à porção de captura do CTO.

[00206] Onde a porção de modelagem do CTO for marcada com um marcador único como mostrado na Fig. 3, uma alteração de sinal do marcador único no híbrido entre o PTO não clivado e o CTO não é induzida. Portanto, o híbrido não fornece um sinal que não é alvo.

[00207] Onde a porção de captura do CTO é marcada com um marcador único, o híbrido entre o PTO não clivado e o CTO fornece um sinal que não é alvo na etapa de fusão. Neste caso, a diferença nos valores de Tm do duplex estendido e o híbrido permite discriminar o sinal-alvo do duplex estendido do sinal que não é alvo do híbrido. Segunda Modalidade na Fig. 7 (Sistema de marcador único)

[00208] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Fig. 7. A porção de marcação 5’ do PTO possui um marcador fluorescente único. O PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico- alvo é digerido para liberar o fragmento que compreende a porção de marcação 5’ com um marcador fluorescente único. Através da hibridi- zação, a intensidade de sinal proveniente do marcador fluorescente único na porção de marcação 5’ é aumentada. Quando o duplex estendido é fundido na etapa (e), a intensidade de sinal proveniente do marcador fluorescente único se torna reduzida, de forma que o sinal- alvo é fornecido para indicar a presença do duplex estendido na etapa (e).

[00209] De acordo com uma modalidade preferida, o marcador único pode estar localizada em qualquer sítio no fragmento de PTO, contanto que o nível de sinal proveniente do marcador único seja alterado dependendo da fusão do duplex estendido.

[00210] Como representado na Fig. 7, o híbrido entre o PTO não clivado e o CTO fornece um sinal que não é alvo na etapa de fusão. Neste caso, a diferença em valores de Tm do duplex estendido e o híbrido permite discriminar o sinal-alvo do duplex estendido do sinal que não é alvo do híbrido.

[00211] O marcador único utilizado aqui tem que ser capaz de fornecer um sinal diferente dependendo de sua presença em uma fita dupla ou uma fita simples. O marcador único inclui um marcador fluorescente, um marcador luminescente, um marcador quimioluminescen- te, um marcador eletroquímico e um marcador com metal. Preferencialmente, o marcador único inclui um marcador fluorescente.

[00212] Os tipos e os sítios de ligação preferíveis de marcadores fluorescentes isolados utilizados na presente invenção são revelados nas Pat. U.S. Nos. 7.537.886 e 7.348.141, cujos ensinamentos são incorporados aqui como referência em sua totalidade. Preferencialmente, o marcador fluorescente único inclui JOE, FAM, TAMRA, ROX e o marcador à base de fluoresceína. O resíduo de nucleotídeo marcado é preferencialmente posicionado no resíduo de nucleotídeo interno dentro do oligonucleotídeo ao invés da extremidade 5’ ou da extre- midade 3’.

[00213] O marcador fluorescente único útil na presente invenção pode ser descrito com referência às descrições para moléculas repórteres e de extinção como indicado anteriormente.

[00214] Em particular, em que a presente invenção em uma fase sólida for realizada utilizando um marcador único, esta pode utilizar um marcador fluorescente geral e não requer um marcador fluorescente específico capaz de fornecer um sinal fluorescente com intensidades diferentes dependendo de sua presença na fita dupla ou na fita simples. O sinal-alvo fornecido no substrato sólido é medido. A modalidade do sistema de marcador único com CTO imobilizado é ilustrada na Fig. 12.

[00215] Quando o CTO imobilizado sobre um substrato sólido é utilizado, marcadores químicos (por exemplo, biotina) ou marcadores en- zimáticos (por exemplo, fosfatase alcalina, peroxidase, β-galactosidase e β-glucosidase) podem ser utilizados.

[00216] No sistema de marcação utilizando “marcador ligado ao fragmento e/ou ao CTO”, os marcadores podem ser posicionados até o ponto que quando um híbrido entre um PTO não clivado e o CTO é formado, o híbrido não fornece um sinal que não é alvo na etapa (e). Alternativamente, os marcadores podem ser posicionados até o ponto que quando um híbrido entre um PTO não clivado e o CTO é formado, o híbrido fornece um sinal que não é alvo na etapa (e); em que o valor de Tm do duplex estendido é maior que aquele do híbrido entre o PTO não clivado e o CTO.

[00217] Particularmente, em que os marcadores são posicionadas até o ponto que um híbrido entre um PTO não clivado e o CTO não fornece um sinal que não é alvo, a faixa incluindo o valor de Tm do híbrido pode ser utilizada para selecionar o valor de Tm do duplex estendido para a detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo. (iii) Marcador incorporado ao duplex estendido

[00218] A presente invenção pode empregar um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão para o fornecimento do sinal-alvo indicativo da presença do duplex estendido.

[00219] Embora o fragmento de PTO ou CTO não possua nenhum marcador, um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão é utilizado de forma bem sucedida para permitir que o duplex estendido seja marcado. As Figs. 10 e 11 ilustram uma modalidade em que um nucleotídeo com marcador único é incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão (vide C e D das Figs. 10 e 11). Esta modalidade também é aplicável a outras modalidades utilizando uma análise de fusão.

[00220] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo é fornecido por um marcador único incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão; em que o marcador único incorporada é ligado a um nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão; em que a fusão do duplex estendido na etapa (e) induz a alteração de um sinal proveniente do marcador único para fornecer o sinal-alvo na etapa (e).

[00221] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Fig. 10. O PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo é digerido para liberar o fragmento. O fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO imobilizado sobre um substrato sólido e estendido na presença de nucleotídeos marcados com um marcador fluorescente único para formar o duplex estendido. O sinal fluorescente partindo do duplex estendido pode ser detectado no ponto do substrato sólido com CTO imobilizado. Quando o duplex estendido é fundido, uma fita que possui uma marcação fluorescente é liberada e o sinal fluorescente não é mais detectado no ponto (não mostrado na Fig. 10). Portanto, uma alteração de sinal pode ser fornecida no ponto através da fusão do duplex estendido. Sob este aspecto, o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença do duplex estendido na etapa (e).

[00222] O sinal-alvo fornecido na etapa (e) inclui uma curva de fusão, um padrão de fusão ou um valor de Tm que é obtido através da medida da alteração da intensidade fluorescente no ponto com CTO imobilizado.

[00223] De acordo com uma modalidade preferida, um nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão é um ddNTP.

[00224] De acordo com uma modalidade preferida, um nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão possui uma primeira base não natural e o CTO possui um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural com uma afinidade de ligação específica com a primeira base não natural, como ilustrado na Fig. 11. O nucleotídeo que possui a segunda base não natural é preferencialmente localizado em qualquer sítio na porção de modelagem do CTO.

[00225] O termo utilizado aqui “base não natural” refere-se a derivados de bases naturais tais como adenina (A), guanina (G), timina (T), citosina (C) e uracila (U), que são capazes de formar pares de bases com ligação de hidrogênio. O termo utilizado aqui “base não natural” inclui bases que possuem diferentes padrões de pareamento de base de bases naturais como compostos de origem, como descrito, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos. 5.432.272, 5.965.364, 6.001.983 e 6.037.120. O pareamento de base entre bases não naturais envolve duas ou três ligações de hidrogênio como as bases naturais. O pare- amento de base entre bases não naturais também é formado de uma maneira específica.

[00226] Os exemplos específicos de bases não naturais incluem as bases a seguir em combinações de pares de bases: iso-C/iso-G, iso- dC/iso-dG, K/X, H/J e M/N (ver a Pat. U.S. No. 7.422.850).

[00227] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Fig. 11. O fragmento é hibridizado com o CTO com um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural (por exemplo, iso-dC) com uma afinidade de ligação específica a uma primeira base não natural (por exemplo, iso-dG). A extensão é realizada na presença do nucleo- tídeo que possui a primeira base não natural marcada com um marcador fluorescente único, formando o duplex estendido. Na reação de extensão, o nucleotídeo que possui a primeira base não natural é incorporado em um sítio oposto ao nucleotídeo que possui a segunda base não natural.

[00228] O sinal fluorescente proveniente do duplex estendido pode ser detectado no ponto de um substrato sólido com CTO imobilizado. Quando o duplex estendido é fundido, uma fita que possui um marcador fluorescente é liberada e o sinal fluorescente não é mais detectado no ponto (não mostrado na Fig. 11). Portanto, uma alteração de sinal pode ser fornecida no ponto através da fusão do duplex estendido. Sob este aspecto, o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença do duplex estendido na etapa (e).

[00229] Onde o marcador incorporada ao duplex estendido durante a reação de extensão é empregado, um marcador não é incorporado ao híbrido entre o PTO não clivado e o CTO porque o híbrido não é estendido. Portanto, o híbrido não fornece um sinal que não é alvo.

[00230] Os tipos e as características dos marcadores útnicos utilizados podem ser descritos com referência às descrições para o sistema de marcação utilizando “marcador ligado ao fragmento e/ou ao CTO” como indicado anteriormente aqui. (iv) ) Marcador incorporada ao duplex estendido e marcador ligado ao fragmento ou ao CTO

[00231] A presente invenção pode empregar um sistema de marcação utilizando a cooperação de um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão e um marcador ligado ao fra- gmento e/ou ao CTO, como ilustrada nas Figs. 4 e 5.

[00232] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo é fornecido por um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão e um marcador ligado ao fragmento e/ou ao CTO e o marcador incorporado é ligado a um nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão; em que os dois marcadores são um marcador duplo interativo de uma molécula repórter e uma molécula de extinção; em que a fusão do duplex estendido na etapa (e) induz a alteração de um sinal proveniente do marcador duplo interativo para fornecer o sinal-alvo na etapa (e).

[00233] Mais preferencialmente, o nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão possui uma primeira base não natural e o CTO possui um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural com uma afinidade de ligação específica com a primeira não natural.

[00234] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Fig. 4. O fragmento é hibridizado com o CTO que compreende uma molécula repórter ou de extinção e um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural (por exemplo, iso-dC) que é uma afinidade de ligação específica com uma primeira base não natural (por exemplo, iso-dG). A extensão é realizada na presença de um nucleotídeo que possui a primeira base não natural marcada com uma molécula de extinção ou repórter, formando o duplex estendido em que o sinal da molécula repórter é extinto pela molécula de extinção. Na reação de extensão, o nucleotídeo que possui a primeira base não natural é incorporado em um sítio oposto ao nucleotídeo que possui a segunda base não natural.

[00235] Quando o duplex estendido é fundido na etapa (e), a molécula repórter e a molécula de extinção são separadas para permitir que a molécula de extinção não elimine o sinal da molécula repórter, de forma que o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença do du- plex estendido na etapa (e).

[00236] Preferencialmente, o sinal-alvo fornecido na etapa (e) inclui uma curva de fusão, um padrão de fusão ou um valor de Tm que é obtido através da medida da alteração do sinal proveniente do marcador duplo interativo.

[00237] O sítio do marcador no CTO e o sítio de incorporação do marcador incorporado são determinados até o ponto que que os dois marcadores atuam como um marcador duplo interativo para a indução de alteração de sinal na etapa de fusão.

[00238] Ainda mais preferencialmente, a porção de modelagem do CTO possui uma molécula repórter ou de extinção e um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural. A reação de extensão na etapa (d) é realizada na presença de um nucleotídeo que possui a molécula de extinção ou repórter e uma primeira base não natural com uma afinidade de ligação específica com a segunda base não natural no CTO. As duas bases não naturais no duplex estendido na etapa (d) formam um pareamento de base para extinguir um sinal proveniente da molécula repórter pela molécula de extinção e para induzir a alteração de um sinal, de maneira que o sinal-alvo é fornecido. Alternativamente, o fragmento possui uma molécula repórter ou de extinção e a porção de modelagem do CTO possui um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural. A reação de extensão na etapa (d) é realizada na presença de um nucleotídeo que possui a molécula de extinção ou repórter e a primeira base não natural com uma afinidade de ligação específica com a segunda base não natural no CTO. As duas bases não naturais no duplex estendido na etapa (d) formam um pare- amento de base para induzir a alteração de um sinal proveniente da molécula repórter através de extinção, de maneira que o sinal-alvo é fornecido.

[00239] Outra modalidade exemplificada é descrita com referência à Fig. 5. Nesta modalidade, o fragmento que possui uma molécula repórter ou de extinção é hibridizado com o CTO que compreende um nu- cleotídeo que possui uma segunda base não natural (por exemplo, isodC) que é uma afinidade de ligação específica com a primeira base não natural (por exemplo, iso-dG). A extensão é realizada na presença de um nucleotídeo que possui a primeira base não natural marcada com a molécula de extinção ou repórter, formando o duplex estendido em que o sinal da molécula repórter é extinto pela molécula de extinção. Na reação de extensão, o nucleotídeo que possui a primeira base não natural é incorporado em um sítio oposto ao nucleotídeo que possui a segunda base não natural.

[00240] Quando o duplex estendido é formado na etapa (d), a molécula repórter e a molécula de extinção são conformacionalmente separadas para permitir que a molécula de extinção não elimine o sinal da molécula repórter; em que quando o duplex estendido é fundido na etapa (e), a molécula repórter e a molécula de extinção estão confor- macionalmente adjacentes uma à outra para permitir que a molécula de extinção elimine o sinal da molécula repórter, de forma que o sinal- alvo é fornecido para indicar a presença do duplex estendido na etapa (e).

[00241] Preferencialmente, o sinal-alvo fornecido na etapa (e) inclui uma curva de fusão, um padrão de fusão ou um valor de Tm que é obtido através da medida da alteração do sinal proveniente do marcador duplo interativo.

[00242] O sítio do marcador no PTO e o sítio de incorporação do marcador incorporado são determinados até o ponto que os dois marcadores atuam como um marcador duplo interativo para a indução de alteração de sinal na etapa de fusão.

[00243] Onde o marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão é empregado, um marcador não é incorporado ao híbrido entre o PTO não clivado e o CTO porque o híbrido não é estendido. Portanto, o híbrido não fornece um sinal que não é alvo na etapa de fusão.

(v) ) Marcador intercalante

[00244] A presente invenção pode empregar um marcador interca- lante para o fornecimento do sinal-alvo indicativo da presença do duplex estendido. O marcador intercalente é mais útil em uma reação em fase sólida utilizando CTOs imobilizados porque as moléculas de ácidos nucleico de fita dupla presentes nas amostras podem gerar sinais.

[00245] Os corantes intercalantes exemplificados úteis na presente invenção incluem SYBR® Green I, PO-PRO®-1, BO-PRO®-1, SYTO®43, SYTO®44, SYTO®45, SYTOX®Blue, POPO®-1, POPO®-3, BOBO®-1, BOBO®-3, LO-PRO®-1, JO-PRO®-1, YO-PRO®1, TO-PRO®1, SYTO®11, SYTO®13, SYTO®15, SYTO®16, SYTO®20, SYTO®23, TO- TO®-3, YOYO®3, GelStar® e laranja de tiazol. Os corantes intercalantes se intercalam especificamente dentro das moléculas de ácidos nuclei- cos de fita dupla para gerar sinais.

[00246] A Fig. 13 ilustra uma modalidade em que os corantes inter- calantes se intercalam entre pares de bases do duplex estendido (C e D na Fig. 13). A modalidade também é aplicável à outra modalidade utilizando uma análise de fusão.

[00247] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Fig. 13. O fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO imobilizado sobre um substrato sólido. A extensão é realizada na presença de um corante intercalante (por exemplo, SYBR® Green) e produz o duplex estendido com corantes intercalantes. O sinal fluorescente proveniente do duplex estendido no ponto do substrato sólido com CTO imobilizado pode ser detectado utilizando corantes fluorescentes intercalantes. Quando o duplex estendido é fundido, corantes fluorescentes intercalantes são liberados e o sinal fluorescente não é mais detectado no ponto (não mostrado na Fig. 13). Sob este aspecto, o sinal-alvo é fornecido para indicar a presença do duplex estendido na etapa (e).

[00248] O híbrido entre o PTO não clivado e o CTO fornece um sinal que não é alvo na etapa de fusão. Neste caso, a diferença nos valores de Tm do duplex estendido e o híbrido permite discriminar o sinal- alvo do duplex estendido do sinal que não é alvo do híbrido (não mostrado na Fig. 13).

[00249] Preferencialmente, o sinal-alvo fornecido na etapa (e) inclui uma curva de fusão, um padrão de fusão ou um valor de Tm que é obtido através da medida da alteração do sinal fluorescente gerado na etapa (d). Etapa (f): Detecção do sinal-alvo

[00250] Finalmente, o duplex estendido é detectado através da medida do sinal-alvo fornecido na etapa (e), em que a presença do duplex estendido indica a presença da sequência de ácido nucleico-alvo.

[00251] A detecção pode ser realizada de várias maneiras dependendo dos tipos do sinal-alvo.

[00252] De acordo com uma modalidade preferida, a detecção do sinal-alvo é realizada através da análise de fusão.

[00253] O termo utilizado aqui “análise de fusão” significa um método em que um sinal-alvo indicativo da presença do duplex estendido é obtido através da fusão do duplex estendido, incluindo um método para medir os sinais em duas temperaturas diferentes, análise da curva de fusão, análise do padrão de fusão e análise do pico de fusão. Preferencialmente, a análise de fusão é uma análise da curva de fusão.

[00254] De acordo com uma modalidade preferida, a detecção da presença da fita estendida na etapa (e) é realizada através de uma análise de fusão em que o duplex estendido é fundido em uma ampla faixa de temperaturas para fornecer um sinal indicativo da presença do duplex estendido.

[00255] Alternativamente, a detecção da presença da fita estendida na etapa (e) é realizada através de uma análise de hibridização. Preferivelmente, a detecção da presença da fita estendida na etapa (e) é realizada através de uma análise de hibridização em que o duplex estendido é fundido e o resultado é hibridizado em uma faixa de temperatura para fornecer um sinal alvo indicativo da presença do duplex estendido.

[00256] De acordo com uma modalidade preferida, a fusão da etapa (e) é seguida pela a hibridização para fornecer o sinal-alvo indicativo da presença do duplex estendido. Em tal caso, a presença do duplex estendido é detectada através da análise da curva de hibridização.

[00257] A curva de fusão ou a curva de hibridização pode ser obtida através de tecnologias convencionais, por exemplo, como descrito nas U.S. Pat Nos. 6.174.670 e 5.789.167, Drobyshev e outros, Gene 188: 45(1997); Kochinsky e Mirzabekov Human Mutation 19:343(2002); Li- vehits e outros J. Biomol. Structure Dynam. 11:783(1994); e Howell e outros Nature Biotechnology 17:87(1999). Por exemplo, uma curva de fusão ou uma curva de hibridização pode consistir em uma representação gráfica ou exibição da variação do sinal de saída com o parâmetro de adstringência de hibridização. O sinal de saída pode ser representado graficamente diretamente contra o parâmetro de hibridização. Tipicamente, uma curva de fusão ou uma curva de hibridização terá o sinal de saída, por exemplo, fluorescência, que indica o grau de estrutura do duplex (isto é, a extensão de hibridização), representado graficamente no eixo Y e o parâmetro de hibridização no eixo X.

[00258] Um gráfico do primeiro derivado da fluorescência vs. temperatura, isto é, um gráfico da taxa de mudança em fluorescência vs. temperatura (dF/dT vs. T) ou (-dF/dT vs. T) provê pico de fusão.

[00259] O PTO e o CTO podem ser compreendidos de dNMPs que ocorrem naturalmente. Alternativamente, o PTO e CTO podem ser compreendidos de nucleotídeo modificado ou nucleotídeo não natural tal como PNA (ácido nucleico peptídico, vide Publicação PCT No. WO 92/20702) e LNA (ácido nucleico bloqueado, vide Publicações PCT Nos. WO 98/22489, WO 98/39352 e WO 99/14226). O PTO e o CTO podem compreender bases universais tais como desoxiinosina, inosina, 1-(2’-desoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrol e 5-nitroindol. O termo “base universal” refere-se a uma capaz de formar pares de base com cada uma das bases de DNA/RNA naturais com pouca discriminação entre as mesmas.

[00260] Como descrito anteriormente, o PTO pode ser clivado em um sítio localizado em uma direção 3’ distante da extremidade 3’ da porção de marcação 5’ do PTO. O sítio de clivagem pode estar localizado na parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO. Em que o fragmento de PTO compreende a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO, um sítio do CTO hibridi- zado com a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ pode compreender uma base universal, sequência de degeneração ou combinação das mesmas. Por exemplo, se o PTO for clivada em um sítio localizado um nucleotídeo em uma direção 3’ distante da extremidade 3’ da porção de marcação 5’ do PTO, é vantajoso que a parte da extremidade 5’ da porção de captura do CTO compreenda uma base universal para a hibridização com o nucleotídeo. Se o PTO for clivado em um sítio localizado dois nucleotídeos em uma direção 3’ distante da extremidade 3’ da porção de marcação 5’ do PTO, é vantajoso que a extremidade 5’ da porção de captura do CTO compreenda uma sequência de degeneração e seu nucleotídeo adjacente na direção 3’ compreenda uma base universal. Desta maneira, em que a clivagem do PTO ocorre em vários sítios da parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’, a utilização de bases universais e sequências de degeneração no CTO é útil. Ainda, em que os PTOs que possuem a mesma porção de marcação 5’ são utilizados para a verificação de várias sequências de ácido nucleico-alvo sob indução de clivagem dependente da extensão do iniciador a montante, os fragmentos de PTO que possuem partes da extremidade 5’ diferentes da porção de direcionamento 3’ podem ser gerados. Em tais casos, as bases universais e as sequências de degeneração são empregadas de forma útil no CTO. As estratégias que utilizam bases universais e sequências de degeneração no CTO garantem o uso de um tipo ou tipos mínimos do CTO para a avaliação de várias sequência de ácidos nucleico-alvo.

[00261] De acordo com uma modalidade preferida, o método compreende ainda repetição de todas ou algumas das etapas (a) a (e) com desnaturação entre os ciclos de repetição.

[00262] De acordo com uma modalidade preferida, o método compreende ainda a repetição das etapas (a) a (b), (a) a (d) ou (a) a (f) com desnaturação entre ciclos de repetição, mais preferencialmente usando um iniciador a jusante. Esta repetição permite amplificar a sequência de ácido nucleico-alvo e/ou o sinal-alvo.

[00263] A desnaturação pode ser realizada através de tecnologias convencionais, incluindo, mas não limitado a, tratamento com aquecimento, álcali, formamida, ureia e glicoxal, métodos enzimáticos (por exemplo, ação de helicase) e proteínas de ligação. Por exemplo, a fusão pode ser obtida através de aquecimento em temperatura variando de a partir de 80° C a 105° C. Métodos gerais para realização deste tratamento são providos por Joseph Sambrook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).

[00264] De acordo com uma modalidade preferida, a presente invenção pode ser realizada através de uma série de análises de fusão para qualitativamente ou quantitativamente detectar a sequência de ácido nucleico alvo.

[00265] Mais preferivelmente, a presente invenção compreende (i) repetição das etapas (a) a (d) com desnaturação entre os ciclos de repetição para formar o duplex estendido, (ii) realização de uma análise de fusão e (iii) repetição das etapas (i) e (ii) pelo menos duas vezes. Em tal abordagem, a análise de fusão é repetidamente realizada pelo menos duas vezes em um certo intervalo.

[00266] De acordo com uma modalidade preferida, o número de repetição das etapas (a) a (d) pode ser opcionalmente controlado. Na realização de uma série de análises de fusão, o número de repetição das etapas (a) a (d) para uma rodada de uma análise de fusão pode ser o mesmo que ou diferente daquele de repetição das etapas (a) a (d) para outra rodada de uma análise de fusão.

[00267] Deve ser compreendido por um versado na técnica que a repetição das etapas (a) a (d) é um exemplo ilustrativo para a formação do duplex estendido. Por exemplo, a presente invenção pode ser realizada repetindo as etapas (a) a (b) e realizando as etapas (c) e (d) para formar um duplex estendido seguido por realização de uma análise de fusão.

[00268] De acordo com uma modalidade preferida, as etapas (a) a (f) são realizadas em um recipiente de reação ou em recipientes de reação separados. Por exemplo, as etapas (a) a (b), (c) a (d) ou (e) a (f) podem ser realizadas em recipientes de reação separados.

[00269] De acordo com uma modalidade preferida, as etapas (a) a (b) e (c) a (f) podem ser simultaneamente ou separadamente mesmo em um recipiente de reação dependendo das condições de reação (particularmente, temperatura).

[00270] De acordo com uma modalidade preferida, pelo menos duas análises de fusão na presente invenção permitem detectar quantitativamente a sequência de ácido nucleico alvo.

[00271] A área e a altura de um pico de fusão obtidas através de uma análise de fusão são dependentes da quantidade do duplex estendido, provendo informação sobre a quantidade inicial da sequência de ácido nucleico alvo.

[00272] De acordo com uma modalidade preferida, a presente invenção compreende (i) aumento do número de duplex estendido através da repetição das etapas (a) a (d) com desnaturação entre ciclos de repetição, (ii) realização de uma análise de fusão e (iii) repetição das etapas (i) e (ii) pelo menos duas vezes. A quantidade da sequência de ácido nucleico alvo pode ser medida através da determinação de um número de ciclo nas análises de fusão em que um valor limiar predeterminado nas áreas e/ou nas alturas de picos de fusão obtidos é atingido.

[00273] Alternativamente, a quantificação da sequência de ácido nucleico alvo pode ser realizada pondo em gráfico informação de análise de fusão (por exemplo, área ou altura de picos) contra o número de ciclo da repetição para aumento na quantidade do duplex estendido.

[00274] A presente invenção não requer que sequência de ácidos nucleico-alvo que serão detectadas e/ou amplificadas tenham qualquer sequência ou comprimento particular, incluindo quaisquer moléculas de DNA (gDNA e cDNA) e RNA.

[00275] Quando um mRNA é empregado como material de partida, uma etapa de transcrição inversa é necessária antes de realizar a etapa de anelamento, cujos detalhes são encontrados em Joseph Sam- brook e outros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); e Noonan, K. F. e outros, Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988). Para a transcrição inversa, um hexâmero aleatório ou um iniciador de oligonucleotídeo dT que pode ser hibridizado ao mRNA pode ser utilizado.

[00276] As sequência de ácidos nucleico-alvo que podem ser detectadas e/ou amplificadas incluem qualquer ácido nucleico procariótico, eucariótico (por exemplo, protozoários e parasitas, fungos, levedura, plantas superiores, animais inferiores e superiores, incluindo mamíferos e humanos) ou viral (por exemplo, vírus do Herpes, HIV, vírus influenza, vírus Epstein-Barr, vírus da hepatite, vírus da pólio etc.) ou viroide que ocorre naturalmente.

[00277] A sequência de ácido nucleico-alvo a ser detectada pela presente invenção inclui uma ampla variedade de sequências de ácido nucleico, por exemplo, sequências em um genoma, sequências artificialmente isoladas ou fragmentadas e sequências sintetizadas (por exemplo, sequências de cDNA e sequências de código de barra). Por exemplo, a sequência de ácido nucleico alvo inclui sequências marcadoras de ácido nucleico para Imuno-PCR (IPCR). IPCR emprega conjugados entre sequências marcadoras de ácido nucleico e anticorpos junto com PCR, que é amplamente aplicada para detecção de vários tipos de alvos incluindo proteínas (vide Sano e outros, Science 258 pp:120-122 (1992), Pat. U.S. No. 5.665.539, Niemeyer e outros, Trends in Biotechnology 23 pp:208-216 (2005), Pub. Pat. U.S. No. 2005/0239108 e Ye e outros, Journal of Environmental Science 22 pp:796-800 (2010)).

[00278] A presente invenção é também útil na detecção de uma variação de nucleotídeo. Preferencialmente, a sequência de ácido nu- cleico-alvo compreende uma variação de nucleotídeo. O termo “variação de nucleotídeo” utilizado aqui se refere a quaisquer substituições, deleções ou inserções de nucleotídeos únicas ou múltiplas em uma sequência de DNA em uma localização particular entre os segmentos de DNA contíguos que são de outra maneira similares em sequência. Tais segmentos de DNA contíguos incluem um gene ou qualquer outra porção de um cromossomo. Essas variações de nucleotídeos podem ser variações alélicas mutantes ou polimórficas. Por exemplo, a variação de nucleotídeo detectada na presente invenção inclui SNP (polimorfismo de nucleotídeo único), mutação, deleção, inserção, substituição e translocação. A variação de nucleotídeo exemplificada inclui inúmeras variações no genoma humano (por exemplo, variações no gene da MTHFR (metilenotetraidrofolato redutase)), variações envolvidas na resistência a fármacos de agentes patogênicos e variações que causam tumorigênese. O termo variação de nucleotídeo usado aqui inclui qualquer variação em um local particular em uma sequência de ácido nucleico. Em outras palavras, o termo variação de nucleotídeo inclui um tipo selvagem e seu qualquer tipo mutante em um local particular em uma sequência de ácido nucleico.

[00279] Na presente invenção para a detecção de uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico-alvo, quando iniciadores ou sondas utilizados possuem sequência complementar à variação de nucleotídeo na sequência de ácido nucleico-alvo, a sequência de ácido nucleico-alvo que contém a variação de nucleotídeo é descrita aqui como um modelo compatível. Quando iniciadores ou sondas utilizadas possuem uma sequência não complementar à variação de nucleotídeo na sequência de ácido nucleico-alvo, a sequência de ácido nucleico-alvo que contém a variação de nucleotídeo é descrita aqui como um modelo incompatível.

[00280] Para a detecção de variação de nucleotídeos, a extremidade 3’ do iniciador a montante pode ser planejada para ser oposta a um sítio de uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nu- cleico-alvo. De acordo com uma modalidade preferida, a extremidade 3’ do iniciador a montante possui uma sequência complementar à variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico-alvo. A extremidade 3’ do iniciador a montante que possui uma sequência complementar à variação de nucleotídeo na sequência de ácido nucleico- alvo é anelada para modelo compatível e estendida para induzir a clivagem do PTO. O fragmento resultado de PTO é hibridizado com o CTO fornecer o sinal-alvo. Em contraste, quando a extremidade 3’ do iniciador a montante é incompatível com um variação de nucleotídeo em um modelo incompatível, esta não é estendida sob condições de que o anelamento da extremidade 3’ de iniciadores é essencial para a extensão mesmo quando o iniciador a montante é hibridizado com o modelo incompatível, resultando assim na não geração do sinal-alvo.

[00281] Alternativamente, é possível utilizar a clivagem de PTO de pendendo da hibridização de PTO que possui a sequência complementar a uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico-alvo. Por exemplo, sob condições controladas, um PTO que possui a sequência complementar à variação de nucleotídeo na sequência de ácido nucleico-alvo é hibridizado com o modelo compatível e então clivado. O fragmento resultante de PTO é hibridizado com o CTO para fornecer o sinal-alvo. Enquanto que, sob as condições controladas, o PTO não é hibridizado com um modelo incompatível que possui sequência não complementar na posição da variação de nucle- otídeo e não é clivado. Preferencialmente, neste caso, a sequência complementar à variação de nucleotídeo no PTO é posicionada no meio de sua porção de direcionamento 3’ do PTO.

[00282] De acordo com uma modalidade, o uso de um nucleotídeo incompatível artificial aumenta o potencial de discriminação do PTO para variações de nucleotídeo.

[00283] Alternativamente, é preferível que a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO fique posicionada a uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico-alvo para a detecção da variação de nucleotídeo e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO possui a sequência complementar à variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico- alvo.

[00284] Para aperfeiçoamento da eficiência de detecção de variações de nucleotídeo, a presente invenção pode ser realizada com o método de coagulação por PCR. O método de coagulação por PCR representativo usando PNA é revelado em Henrik e outros, Nucleic Acid Research 21:5332-5336 (1993) e Luo e outros, Nucleic Acid Research Vol. 34, Nos. 2 e 12 (2006). Por exemplo, a tecnologia de coagulação por PCR usando PNA permite amplificar uma sequência de ácido nucleico tendo uma variação de nucleotídeo do tipo mutante, mas não amplificar uma sequência de ácido nucleico tendo uma variação de nucleotídeo do tipo selvagem, que é seguida pelo ensaio de PTOCE, permitindo detecção mais eficiente de variações de nucleotí- deo. Em particular, uma vez que a tecnologia de coagulação por PCR permite amplificar apenas uma sequência de ácido nucleico tendo uma variação de nucleotídeo do tipo específica, sua combinação com o presente método permitiria detecção de variante em minoria de uma maneira mais eficiente.

[00285] Onde uma sonda tendo em sua porção de extremidade 5’ uma porção de discriminação de variação de nucleotídeo é hibridizada com um modelo incompatível, sua porção de extremidade 5’ pode formar uma fita única sob uma certa condição. A sonda pode corresponder a um PTO. O sinal pode ser gerado através do ensaio de PTO da presente invenção. Esta abordagem pode ser útil na detecção de uma sequência de ácido nucleico alvo tendo uma variação de nucleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação de nucleotí- deo de sondas.

[00286] De acordo com uma modalidade preferida, a sequência de ácido nucleico-alvo utilizada na presente invenção é uma sequência de ácido nucleico pré-amplificada. A utilização da sequência de ácido nu- cleico pré-amplificada permite aumentar significativamente a sensibili- dade e a especificidade de detecção do alvo da presente invenção.

[00287] De acordo com uma modalidade preferida, o método é realizado na presença de um iniciador a jusante.

[00288] As vantagens da presente invenção podem ser destacadas na detecção simultânea (multiplex) de pelo menos duas sequências de ácido nucleicos alvo.

[00289] De acordo com uma modalidade preferida, o método é realizado para detectar pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sequências de ácido nucleico-alvo.

[00290] De acordo com uma modalidade preferida, o método é realizado para detectar pelo menos dois tipos (mais preferencialmente, pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de sequências de ácido nucleico-alvo; em que o oligonucleotí- deo a montante compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) de oligonucleotídeos, o PTO compreende pelo menos dois tipos (mais preferencialmente pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) dos PTOs e o CTO compreende pelo menos um tipo (preferencialmente pelo menos dois tipos, mais preferencialmente pelo menos três tipos, ainda mais preferencialmente pelo menos cinco tipos) do CTO; em que quando pelo menos dois tipos da sequência de ácidos nucleico-alvo estão presentes, o método fornece pelo menos dois tipos dos sinais-alvos correspondendo aos pelo menos dois tipos das sequências de ácido nucleico-alvo.

[00291] As porções de marcação 5’ dos pelo menos dois PTOs podem ter uma sequência idêntica à outra. Por exemplo, onde a presente invenção é realizada para verificação de sequência de ácidos nucleico- alvo, as porções de marcação 5’ de PTOs podem ter a sequência idêntica.

[00292] Além disso, um único tipo do CTO pode ser utilizado para a detecção do grande número de sequência de ácidos nucleico-alvo. Por exemplo, onde os PTOs que possuem uma sequência idêntica em suas porções de marcação 5’ são empregados para a verificação de sequência de ácidos nucleico-alvo, um único tipo do CTO pode ser utilizado.

[00293] De acordo com uma modalidade preferida, os dúplices estendidos que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequência de ácidos nucleico-alvo possuem valores de Tm diferentes um do outro.

[00294] De acordo com uma modalidade preferida, os pelo menos dois tipos do sinais-alvos que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequência de ácido nucleico-alvo são fornecidos partindo de tipos diferentes de marcadores um do outro.

[00295] De acordo com uma modalidade preferida, os pelo menos dois tipos dos sinais-alvos que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequência de ácidos nucleico-alvo são fornecidos partindo do mesmo tipo de marcadores.

[00296] De acordo com uma modalidade preferida, os pelos menos dois tipos dos sinais-alvo que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequências de ácido nucleico-alvo são fornecidos partindo do mesmo tipo de marcadores; em que os dúplices estendidos que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequência de ácido nuclei- co-alvo possuem valores de Tm diferentes um do outro.

[00297] O termo utilizado aqui “tipos diferentes de marcadores” refere-se a marcadores com diferentes características de sinais detectá- veis. Por exemplo, FAM e TAMRA como marcadores repórteres fluorescentes são considerados tipos diferentes de marcadores porque seus comprimentos de onda excitação e emissão são diferentes um do outro.

[00298] Onde a presente invenção é realizada para detectar simul-taneamente pelo menos dois tipos das sequência de ácido nucleico- alvo através da análise da curva de fusão e os dúplices estendidos que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequência de ácido nucleico-alvo possuem valores de Tm diferentes um do outro, é possível detectar pelo menos dois tipos das sequências de ácidos nucleico- alvo mesmo utilizando um único tipo de marcador (por exemplo, FAM). Detecção de alvo Utilizando CTO Imobilizado em uma Fase Sólida

[00299] A vantagem proeminente da presente invenção é ser eficiente na detecção de sequências de ácidos nucleico-alvo mesmo em uma fase sólida tal como uma microdisposição.

[00300] De acordo com uma modalidade preferida, a presente invenção é realizada na fase sólida e o CTO é imobilizado através de sua extremidade 5’ ou extremidade 3’ sobre um substrato sólido. Em uma fase sólida, o sinal-alvo fornecido sobre o substrato sólido é medido.

[00301] Onde CTO imobilizado é utilizado, a análise de fusão utilizando sistemas de marcação como descrito anteriormente é aplicável à reação em fase sólida da presente invenção.

[00302] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo é fornecido por um marcador único ligado ao fragmento ou por um marcador único incorporada ao duplex estendido durante a reação de extensão. Em particular, onde a presente invenção em uma fase sólida é realizada utilizando um marcador único, ela pode utilizar um marcador fluorescente geral e não requer um marcador fluorescente específico capaz de fornecer um sinal fluorescente com intensidades diferentes dependendo de sua presença na fita dupla ou na fita simples.

[00303] Quando o CTO imobilizado sobre um substrato sólido é utilizado, marcadores químicos (por exemplo, biotina) ou marcadores en- zimáticos (por exemplo, fosfatase alcalina, peroxidase, β-galactosidase e β-glucosidase) podem ser utilizados.

[00304] Para a reação em fase sólida, o CTO é imobilizado diretamente ou indiretamente (preferencialmente indiretamente) através de sua extremidade 5’ ou extremidade 3’ (preferencialmente a extremidade 3’) sobre a superfície do substrato sólido. Além disso, o CTO pode ser imobilizado sobre a superfície do substrato sólido de uma maneira covalente ou não covalente. Onde os CTOs imobilizados forem imobilizados indiretamente sobre a superfície do substrato sólido, ligantes adequados são utilizados. Os ligantes úteis nesta invenção podem incluir quaisquer ligantes utilizados para imobilização da sonda sobre a superfície do substrato sólido. Por exemplo, compostos alquila ou arila com funcionalidade amina ou compostos alquila ou arila com funcionalidade tiol servem como ligantes para a imobilização de CTO. Em adição, fita poli (T) ou fita poli (A) pode servir como ligantes.

[00305] De acordo com uma modalidade preferida, o substrato sólido utilizado na presente invenção é uma microdisposição. A microdis- posição para fornecer um ambiente de reação nesta invenção pode incluir qualquer um dos conhecidos por um versado na técnica. Todos os processos da presente invenção, isto é, hibridização para sequência de ácidos nucleico-alvo, clivagem, extensão, fusão e detecção por fluorescência, são realizados na microdisposição. Os CTOs imobilizados na microdisposição servem como elementos de disposição hibridi- záveis. O substrato sólido para fabricar microdisposição inclui, mas não limitado a, metais (por exemplo, ouro, liga de ouro e cobre, alumínio), óxido metálico, vidro, cerâmica, quartzo, silício, semicondutor, wafer de Si/SiO2, germânio, arsenieto de gálio, carbono, nanotubo de carbono, polímeros (por exemplo, poliestireno, polietileno, polipropile- no e poliacrilamida), sefarose, agarose e coloides. Um grande número de CTOs imobilizados nesta invenção pode ser imobilizado sobre uma região que pode ser direcionada ou duas ou mais regiões que podem ser direcionadas sobre um substrato sólido que pode compreender 2-1.000.000 regiões que podem ser direcionadas. Os CTOs imobilizados podem ser fabricados para produzir disposição ou disposições para uma dada aplicação através de tecnologias de fabricação convencionais tais como fotolitografia, jato de tinta, micromanchas mecânicas e derivados dos mesmos.

[00306] A presente invenção realizada sobre a fase sólida pode detectar simultaneamente um grande número de sequência de ácido nu- cleico-alvo mesmo quando utilizando um único tipo da marcador porque os marcadores nos CTOs imobilizados são fisicamente separados. Sob este aspecto, o número de sequências de ácido nucleico-alvo que será detectado pela presente invenção sobre a fase sólida não é limitado.

[00307] Na presente invenção, um fragmento de PTO é produzido através de clivagem do PTO hibridizado com o ácido nucleico alvo e ele é anelado para e estendido no CTO, resultando na formação de uma fita estendida.

[00308] É também possível prover fragmentos adicionais que podem ser estendidos no CTO para aumento do número das fitas estendidas através de uma reação de clivagem de nuclease 5’ usando um PTO adicional que compreende (i) uma porção de direcionamento 3’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à fita estendida e (ii) uma porção de marcação compreendendo uma sequência de nucleotídeo não complementar à fita estendida, mas complementar à porção de captura do CTO. É preferível usar um oligonucleotídeo a montante adicional compreendendo uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à fita estendida e estando localizado a montando do PTO adicional para reação de clivagem de nuclease 5’.

[00309] A modalidade preferida acima tem a característica que in- formação dos fragmentos adicionais é dependente da formação de uma fita estendida.

[00310] Alternativamente, os fragmentos adicionais podem ser providos usando um PTO adicional que compreende (i) uma porção de direcionamento 3’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à porção de modelagem de CTO e (ii) uma porção de marcação 5’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo não complementar à porção de modelagem de CTO, mas complementar à porção de captura do CTO.

[00311] De acordo com uma modalidade preferida, dúplices estendidos adicionais são formados através da produção adicional das fitas estendidas, contribuindo para amplificação do sinal alvo no substrato sólido.

II. Modalidade Preferível com Amplificação de uma Sequência de Ácido Nucleico-Alvo

[00312] Preferencialmente, a presente invenção é realizada simul-taneamente com amplificação de uma sequência de ácido nucleico- alvo utilizando um par de iniciadores composto de um iniciador a montante e um iniciador a jusante capaz de sintetizar a sequência de ácido nucleico-alvo.

[00313] Em outro aspecto da presente invenção, é provido um método para a detecção das sequência de ácido nucleico-alvo partindo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO), que compreende: (a) hibridização das sequência de ácido nucleico-alvo com um par de iniciadores que compreende um iniciador a montante e um iniciador a jusante e um PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação); em que cada um do iniciador a montante e do iniciador a jusante compreende uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico-alvo; o PTO compreende (1) uma porção de direcionamento 3’ que compreende uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico-alvo e (ii) uma porção de marcação 5’ que compreende uma sequência de nucleotídeo não complementar à sequência de ácido nu- cleico-alvo; em que a porção de direcionamento 3’ é hibridizada com a sequência de ácido nucleico-alvo e a porção de marcação 5’ não é hi- bridizada com a sequência de ácido nucleico-alvo; o PTO está localizado entre o iniciador a montante e o iniciador a jusante; em que o PTO é bloqueado em sua extremidade 3’ para proibir sua extensão; (b) contato do resultado da etapa (a) com um ácido nucleico polimerase dependente do modelo que possui a atividade de nuclease 5’ sob condições para a extensão dos iniciadores e para a clivagem do PTO; em que quando o PTO é hibridizado com as sequência de ácidos nucleico-alvo, o iniciador a montante é estendido e a fita estendida induz a clivagem do PTO pela ácido nucleico polimerase dependente de modelo que possui a atividade de nuclease 5’ de forma que a clivagem libera um fragmento que compreende a porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO; (c) hibridização do fragmento liberado do PTO com um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelo); em que o CTO compreende em uma direção 3’ para 5’ (i) uma porção de captura que compreende uma sequência de nucleotídeos complementar à porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO e (ii) uma porção de modelagem que compreende uma sequência de nucleotídeo não complementar à porção de marcação 5’ e a porção de direcionamento 3’; em que o fragmento liberado do PTO é hibridizado com as porções de captura do CTO; (d) realização de uma reação de extensão utilizando o resultado da etapa (c) e a polimerase de ácido nucleico dependente de modelo; em que o fragmento hibridizado com a porção de captura do CTO é estendido e um duplex estendido é formado; em que o duplex estendido possui um valor de Tm que pode ser ajustado por (i) uma se-quência e/ou um comprimento do fragmento, (ii) uma sequência e/ou um comprimento do CTO ou (iii) a sequência e/ou o comprimento do fragmento e a sequência e/ou o comprimento do CTO; (e) fusão do duplex estendido ao longo de uma faixa de temperaturas para fornecer um sinal-alvo indicativo da presença do duplex estendido; em que o sinal-alvo é fornecido por (i) pelo menos um marcador ligado ao fragmento e/ou ao CTO, (ii) uma marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão, (iii) um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão e um marcador ligado ao fragmento e/ou ao CTO ou (iv) marcador intercalante; e (f) detecção do duplex estendido através da medida do sinal-alvo; em que a presença do duplex estendido indica a presença da sequência de ácido nucleico-alvo.

[00314] Uma vez que a modalidade preferível da presente invenção segue as etapas do presente método descrito anteriormente, as descrições comuns entre eles são omitidas para evitar redundância desnecessária que leva à complexidade do presente pedido de patente.

[00315] De acordo com uma modalidade preferida, o método compreende ainda a repetição das etapas (a) a (b), (a) a (d) ou (a) a (f) com desnaturação entre ciclos de repetição. A repetição de reação é acompanhada pela amplificação da sequência de ácido nucleico-alvo. Preferencialmente, a amplificação é realizada de acordo com a PCR (reação em cadeia da polimerase) que é revelada nas Pat. U.S. Nos. 4.683.195, 4.683.202 e 4.800.159.

[00316] De acordo com uma modalidade preferida, o método é realizado para detectar pelo menos dois tipos de sequência de ácido nu- cleico-alvo.

[00317] De acordo com uma modalidade preferida, os pelos menos dois tipos dos sinais-alvo que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequência de ácido nucleico-alvo são fornecidos partindo do mesmo tipo de marcadores; em que os dúplices estendidos que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequência de ácidos nuclei- co-alvo possuem valores de Tm diferentes um do outro.

III. Processo de Detecção de alvo por PTOCE que Compreende a Detecção a uma Temperatura Predeterminada

[00318] A presente invenção pode ser modificada para utilizar um sinal-alvo gerado em associação à formação do duplex estendido.

[00319] Ainda em outro aspecto da presente invenção é fornecido um método para a detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo partindo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO) que compreende: (a) hibridização da sequência de ácido nucleico-alvo com um oligonucleotídeo a montante e um PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação); em que o oligonucleotídeo a montante compreende uma sequência de nucleotídeos de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico-alvo; o PTO compreende (i) uma porção de direcionamento 3’ que compreende uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico-alvo e (ii) uma porção de marcação 5’ que compreende uma sequência de nu- cleotídeos não complementar à sequência de ácido nucleico-alvo; em que a porção de direcionamento 3’ é hibridizada com a sequência de ácido nucleico-alvo e a porção de marcação 5’ não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico-alvo; o oligonucleotídeo a montante fica localizado a montante do PTO; (b) contato do resultado da etapa (a) com uma enzima que possui a atividade de nuclease 5’ sob condições para a clivagem do PTO; em que o oligonucleotídeo a montante ou sua fita estendida induz clivagem do PTO pela enzima que possui a atividade de nuclease 5’ de forma que a clivagem libera um fragmento que compreende a porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO; (c) hibridização do fragmento liberado do PTO com um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelo); em que o CTO compreende em uma direção 3’ para 5’ (i) uma porção de captura que compreende uma sequência de nucleotídeo complementar à porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO e (ii) uma porção de modelagem que compreende uma sequência de nucleotídeos não complementar à porção de marcação 5’ e a porção de direcionamento 3’ do PTO; em que o fragmento liberado do PTO é hibridizado com a porção de captura do CTO; (d) a realização de uma reação de extensão utilizando o re-sultado da etapa (c) e uma polimerase de ácido nucleico dependente do modelo; em que o fragmento hibridizado com a porção de captura do CTO é estendido para formar um duplex estendido; em que o duplex estendido possui um valor de Tm que pode ser ajustado por (i) uma sequência e/ou um comprimento do fragmento, (ii) uma sequência e/ou um comprimento do CTO ou (iii) a sequência e/ou o comprimento do fragmento e a sequência e/ou o comprimento do CTO; em que o duplex estendido fornece um sinal-alvo por (i) pelo menos um marcador ligado ao fragmento e/ou CTO, (ii) um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão, (iii) pelo menos um marcador ligado ao fragmento e/ou CTO e um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão ou (iv) marcador intercalante; e (e) detecção do duplex estendido através da medida do sinal-alvo em uma temperatura predeterminada que o duplex estendido mantém sua forma de fita dupla, em que a presença do duplex estendido indica a presença da sequência de ácido nucleico-alvo.

[00320] Uma vez que a modalidade preferível da presente invenção segue as etapas do presente método descrito anteriormente, exceto pela etapa de fusão, as descrições comuns entre eles são omitidas com a finalidade de evitar redundância desnecessária levando à complexidade deste relatório descritivo.

[00321] A presente invenção que utiliza uma análise de fusão descrita anteriormente acimai requer a detecção de sinais dos marcadores em não menos que duas temperaturas diferentes porque o sinal-alvo é fornecido através da medida da alteração de sinal fornecida na fusão do duplex estendido.

[00322] Improvavelmente, neste aspecto desta invenção, o duplex estendido per se fornece sinal capaz de discriminar a formação da não formação do duplex estendido e o sinal é detectado em uma temperatura predeterminada que o duplex estendido mantém sua forma de fita dupla, em que a presença de uma sequência de ácido nucleico-alvo é determinada.

[00323] A presente invenção é para medir um sinal-alvo em associ ação com a formação do duplex estendido, para a detecção da presença da sequência de ácido nucleico-alvo.

[00324] Na presente invenção, o duplex estendido possui um marcador de forma que o duplex estendido fornece um sinal-alvo.

[00325] Preferencialmente, o sinal-alvo inclui um sinal (geração de sinal ou extinção de sinal) do marcador no duplex estendido em uma temperatura predeterminada.

[00326] A marcação na presente invenção pode ser executada da mesma maneira que para o método que utiliza uma análise de fusão descrita anteriormente. As Figs. 2-13 podem ilustrar este aspecto da presente invenção com uma pequena modificação para a detecção em uma temperatura predeterminada.

[00327] O princípio de trabalho que sustenta um sinal-alvo proveniente do duplex estendido é como a seguir: (i) a extensão do fragmento induz a alteração de um sinal proveniente de um marcador para fornecer o sinal-alvo; ou (ii) a hibridização do fragmento e do CTO induz a alteração de um sinal proveniente de um marcador para fornecer o sinal-alvo e o duplex estendido mantém o sinal-alvo.

[00328] A modalidade exemplificada do princípio de trabalho (i) pode ser descrita com referência à Fig 9. Quando os CTOs imobilizados são utilizados, a presente invenção detecta um grande número de sequência de ácido nucleico-alvo de uma maneira muito mais eficiente. A porção de modelaegm do CTO imobilizado possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção. A molécula repórter e a molécula de extinção são conformacionalmente adjacentes uma à outra para permitir que a molécula de extinção elimine um sinal proveniente da molécula repórter. Quando o fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO, a molécula de extinção extingue o sinal da molécula repórter. Através da formação do duplex estendido, a molécula repórter e a molécula de extinção são conformacionalmente separadas para permitir que a molécula de extinção não elimine o sinal da molécula repórter. O sinal-alvo é fornecido na etapa de extensão (C e D na Fig. 9).

[00329] Na Fig 9, o híbrido entre o PTO não clivado e o CTO não forma um duplex estendido. Portanto, é permitido que a molécula de extinção ainda elimine um sinal proveniente da molécula repórter. O híbrido não fornece sinal que não é alvo.

[00330] A modalidade exemplificada para o princípio de trabalho (ii) pode ser descrita com referência à Fig. 6. A figura ilustra o presente aspecto bem como o método que utiliza análise de fusão. A porção de marcação 5’ do PTO possui uma molécula repórter e uma molécula de extinção. A molécula repórter e a molécula de extinção são conforma- cionalmente adjacentes uma à outra para permitir que a molécula de extinção elimine um sinal proveniente da molécula repórter. O PTO hi- bridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo é digerido para liberar o fragmento que compreende a porção de marcação 5’ com a molécula repórter e a molécula de extinção, e o fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO. Através da hibridização, a molécula repórter e a molécula de extinção são conformacionalmente separadas para permitir que a molécula de extinção não elimine o sinal da molécula repórter. O sinal-alvo é fornecido na etapa de hibridização do fragmento e o duplex estendido mantém o sinal-alvo (C e D na Fig. 6).

[00331] Na Fig. 6, o híbrido entre o PTO não clivado e o CTO fornece sinal que não é alvo (C e D na Fig. 6) e é necessário para dissociar o híbrido para remover o sinal que não é alvo. Portanto, a temperatura para a medida do sinal-alvo é determinada para dissociar o híbrido. De acordo com uma modalidade preferida, a temperatura é adicionalmente determinada em consideração ao valor de Tm do híbrido.

[00332] De acordo com uma modalidade preferida, o duplex estendido pode ser detectado a temperaturas que o híbrido é parcialmente dissociado.

[00333] A temperatura predeterminada é maior que o valor de Tm do híbrido menos 10oC, preferencialmente, maior que o valor de Tm do híbrido menos 5oC, mais preferencialmente, maior que o valor de Tm do híbrido e ainda mais preferencialmente, maior que o valor de Tm do híbrido mais 5oC.

[00334] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo fornecido pelo duplex estendido é fornecido durante a extensão da etapa (d); em que um híbrido entre um não clivado PTO e CTO não fornece um sinal que não é alvo, como representado nas Figs. 2 a 4 e 9 a 11.

[00335] De acordo com uma modalidade o sinal-alvo fornecido pelo duplex estendido é fornecido pela hibridização do fragmento e o CTO na etapa (c) e a formação do duplex estendido mantém o sinal-alvo na etapa (d); em que um híbrido entre um PTO não clivado e o CTO fornece um sinal não alvo; em que a temperatura predeterminada é suficiente para dissociar o híbrido para remover o sinal não alvo.

[00336] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo fornecido pelo duplex estendido é fornecido pela hibridização do fragmento e do CTO na etapa (c) e a formação do duplex estendido mantém o sinal-alvo na etapa (d); em que um híbrido entre um PTO não clivado e o CTO fornece um sinal não alvo; em que a temperatura predeterminado é maior do que o valor da Tm do híbrido, conforme representado nas Figs. 5 a 8 e 12 a 13.

[00337] Quando o híbrido entre o PTO não clivado e o CTO fornece sinal que não é alvo (D na Fig 6), é necessário dissociar o híbrido para remover o sinal que não é alvo. Portanto, a temperatura para a medida do sinal-alvo é determinada para dissociar o híbrido.

[00338] Os sistemas de marcação úteis nesta invenção serão descritos como a seguir:

(iii) Marcador ligada ao fragmento e/ou ao CTO (i-1) Marcador duplo interativo

[00339] Em uma modalidade de um sistema de marcador duplo interativo, o CTO possui um marcador duplo interativo que compreende uma molécula repórter e uma molécula de extinção; em que a extensão do fragmento na etapa (d) induz a alteração de um sinal proveniente do marcador duplo interativo para fornecer o sinal-alvo. A primeira modalidade do sistema de marcador duplo interativo é ilustrada na Fig. 2. O sinal-alvo é fornecido com a geração de sinal sincronizada com a extensão.

[00340] De acordo com uma modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção podem estar localizadas na porção de modelagem do CTO.

[00341] De acordo com uma modalidade preferida, uma da molécula repórter e da molécula de extinção no CTO está localizadas em sua extremidade 5’ ou 1 a 5 nucleotídeos de distância de sua extremidade 5’ e a outra está localizada para extinguir e não extinguir o sinal da molécula repórter dependendo de conformação de CTO.

[00342] Em uma modalidade de um sistema de marcador duplo interativo, o CTO possui um marcador duplo interativo que compreende uma molécula repórter e uma molécula de extinção; em que a hibridi- zação do fragmento e o CTO na etapa (c) induz a alteração de um sinal proveniente do marcador duplo interativo para fornecer o sinal-alvo e o duplex estendido mantém o sinal-alvo.

[00343] De acordo com a modalidade preferida, a molécula repórter e a molécula de extinção podem estar localizadas na porção de captura do CTO.

[00344] De acordo com a modalidade preferida, uma molécula repórter e uma molécula de extinção no CTO está localizada em sua extremidade 3’ ou 1 a 5 nucleotídeos de distância da sua extremidade 3’ e a outra está localizada para extinguir e não extinguir o sinal da molécula repórter dependendo da conformação de CTO.

[00345] Nesta modalidade, o híbrido entre o PTO não clivado e o CTO fornece sinal que não é alvo; em que a temperatura para a medida do sinal-alvo é determinada com consideração do valor de Tm do híbrido.

[00346] Em uma modalidade de um sistema de marcador duplo interativo, o fragmento possui um marcador duplo interativo que compreende uma molécula repórter e uma molécula de extinção; em que a hibridização do fragmento e do CTO na etapa (c) induz a alteração de um sinal proveniente do marcador duplo interativo para fornecer o sinal-alvo e o duplex estendido mantém o sinal-alvo. A primeira modali- dade do sistema de marcador duplo interativo é ilustrada na Fig. 6.

[00347] De acordo com a modalidade preferida, uma da molécula repórter e da molécula de extinção no fragmento está localizada em sua extremidade 5’ ou a 1 a 5 nucleotídeos de distância da extremidade 5’ do fragmento e a outra está localizada para extinguir o sinal da molécula repórter dependendo de conformação do fragmento.

[00348] Nesta modalidade, o híbrido entre o PTO não clivado e o CTO fornece sinal que não é alvo; em que a temperatura para a medida do sinal-alvo é determinada com consideração do valor de Tm do híbrido.

[00349] Em uma modalidade do sistema de marcador interativo, em que o fragmento possui um de um marcador duplo interativo que compreende uma molécula repórter e um molécula de extinção e o CTO possui o outro do marcador duplo interativo; em que a hibridização do fragmento e do CTO na etapa (c) induz a alteração de um sinal proveniente do marcador duplo interativo para fornecer o sinal-alvo e o duplex estendido mantém o sinal-alvo. A modalidade do sistema de marcador duplo interativo é ilustrada nas Fig. 8.

[00350] A molécula repórter e a molécula de extinção podem estar localizadas em qualquer sítio do fragmento de PTO e do CTO, contanto que o sinal da molécula repórter seja extinto pela molécula de extinção.

[00351] De acordo com a modalidade, a molécula repórter ou a molécula de extinção no fragmento de PTO está localizada, preferencialmente, em sua extremidade 5’.

[00352] De acordo com a modalidade, a molécula repórter ou a molécula de extinção no CTO está localizada, preferencialmente, em sua extremidade 5’.

[00353] Nesta modalidade, o híbrido entre o PTO não clivado e o CTO fornece sinal que não é alvo; em que a temperatura para a medi- da do sinal-alvo é determinada com consideração do valor de Tm do híbrido.

(i-2) Marcador Único

[00354] Em uma modalidade de um sistema de marcador único, o CTO possui um marcador único e a extensão do fragmento na etapa (d) induz a alteração de um sinal proveniente do marcador único para fornecer o sinal-alvo. A modalidade do sistema de marcador único é ilustrada na Fig. 3. O sinal-alvo é fornecido com geração de sinal sincronizada com extensão.

[00355] De acordo com a modalidade, a porção de modelagem do CTO é marcada com o marcador único.

[00356] Em uma modalidade de um sistema de marcador único, o CTO possui um marcador único e a hibridização do fragmento e do CTO na etapa (c) induz a alteração de um sinal proveniente do marcador duplo interativo para fornecer o sinal-alvo e o duplex estendido mantém o sinal-alvo.

[00357] De acordo com a modalidade, a porção de captura do CTO é marcada com o marcador único.

[00358] Nesta modalidade, o híbrido entre o PTO não clivado e o CTO fornece sinal que não é alvo; em que a temperatura para a medida do sinal-alvo é determinada com consideração do valor de Tm do híbrido.

[00359] Em uma modalidade de um sistema de marcador único, o fragmento possui um marcador único e a hibridização do fragmento e do CTO na etapa (c) induz a alteração de um sinal proveniente do marcador duplo interativo para fornecer o sinal-alvo e o duplex estendido mantém o sinal-alvo. A modalidade do sistema de marcador único é ilustrada na Fig. 12.

[00360] Nesta modalidade, o híbrido entre o PTO não clivado e o CTO fornece sinal que não é alvo; em que a temperatura para a medi- da do sinal-alvo é determinada com consideração do valor de Tm do híbrido.

[00361] O marcador único usado aqui tem que ser capaz de fornecer um sinal diferente dependendo de sua presença na fita dupla ou na fita simples. O marcador único inclui um marcador fluorescente, um marcador luminescente, um marcador quimioluminescente, um marcador eletroquímico e um marcador metálico. Preferencialmente, o marcador único inclui um marcação fluorescente. Os tipos e os sítios de ligação preferíveis de marcadores fluorescentes únicos utilizados nesta invenção são revelados nas Pat. U.S. Nos. 7.537.886 e 7.348.141, cujos ensinamentos são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade. Preferencialmente, marcador fluorescente único inclui JOE, FAM, TAMRA, ROX e marcador à base de fluoresceína. Um resíduo de nucleotídeo marcado está preferencialmente posicionado no resíduo de nucleotídeo interno dentro do oligonucleotídeo ao invés da extremidade 5’ ou da extremidade 3’.

[00362] O marcador fluorescente único útil na presente invenção pode ser descrito com referência às descrições para as moléculas repórteres e de extinção como indicado anteriormente.

[00363] Em particular, quando a presente invenção em uma fase sólida é realizada utilizando um marcador único, ela pode utilizar um marcador fluorescente geral e não requer um marcador fluorescente específico capaz de fornecer um sinal fluorescente com intensidades diferentes dependendo de sua presença na fita dupla ou na fita simples.

[00364] Quando o CTO imobilizado sobre um substrato sólido é utilizado, marcadores químicos (por exemplo, biotina) ou marcadores en- zimáticos (por exemplo, fosfatase alcalina, peroxidase, β-galactosidase e β-glucosidase) podem ser utilizados.

[00365] Em uma modalidade preferida, os marcadores ligados ao fragmento e/ou ao CTO estão posicionadas até o ponto que quando um híbrido entre um PTO clivado e um CTO é formado, o híbrido não fornece um sinal que não é alvo na etapa (d), como representado nas Figs. 2 a 3 e 9.

[00366] Alternativamente, os marcadores podem ser posicionados até ponto que quando um híbrido entre um PTO não clivado e um CTO é formado, o híbrido fornece um sinal que não é alvo na etapa (d); em que o valor de Tm do duplex estendido é maior que aquele do híbrido entre o PTO não clivado e o CTO como representado nas Figs. 6 a 8 e 12.

(iv) Marcador incorporado ao duplex estendido

[00367] Em particular, quando a presente invenção é realizada em uma fase sólida utilizando um CTO imobilizado, este sistema de marcador se torna mais útil para fornecer o sinal-alvo como ilustrado nas Figs. 10 e 11.

[00368] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo é fornecido por um marcador único incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão; em que o marcador único incorporado é ligado a um nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão; em que a extensão do fragmento na etapa (d) induz a alteração de um sinal proveniente do marcador único para fornecer o sinal-alvo na etapa (d).

[00369] De acordo com uma modalidade preferida, um nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão é ddNTP.

[00370] De acordo com uma modalidade preferida, o nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão possui uma primeira base não natural e o CTO possui um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural com uma afinidade de ligação específica com a primeira base não natural, como ilustrado na Fig. 11. O nucleotídeo que possui a segunda base não natural fica preferencialmente localizado em qualquer sítio na porção de modelagem do CTO.

[00371] Quando um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão é empregado, o marcador não é incorporada ao híbrido entre o PTO não clivado e o CTO porque o híbrido não é estendido. Portanto, o híbrido não fornece um sinal que não é alvo. (v) i) Marcador incorporada ao duplex estendido e marcador ligado ao fragmento ou ao CTO

[00372] A presente invenção pode empregar um sistema de marcação utilizando a cooperação de um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão e um marcador ligado ao fragmento e/ou ao CTO, como ilustrado nas Figs. 4 e 5.

[00373] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo é fornecido por um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão e um marcador ligado ao fragmento e/ou ao CTO; em que um marcador incorporado é ligado a um nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão; em que os dois marcadores são um marcador duplo interativo de uma molécula repórter e uma molécula de extinção; em que a extensão do fragmento na etapa (d) induz a alteração de um sinal proveniente do marcador duplo interativo para fornecer o sinal-alvo.

[00374] Mais preferencialmente, o nucleotídeo incorporado durante a reação de extensão possui uma primeira base não natural e o CTO possui um nucleotídeo que possui uma segunda base não natural com uma afinidade de ligação específica com a primeira não natural.

[00375] Preferencialmente, o sinal-alvo fornecido na etapa (e) é um sinal proveniente do marcador duplo interativo na etapa (d).

[00376] Quando o marcador incorporada ao duplex estendido durante a reação de extensão é empregado, o marcador não é incorporada ao híbrido entre o PTO não clivado e o CTO porque o híbrido não é estendido. Portanto, o híbrido não fornece um sinal que não é alvo.

(vi) Marcador intercalante

[00377] A presente invenção pode empregar um marcador interca- lante para o fornecimento do sinal-alvo indicativo da presença do duplex estendido. O marcador intercalante é mais útil em uma reação de fase sólida utilizando CTOs imobilizados porque as moléculas de ácidos nucleicos de fita dupla presentes nas amostras podem gerar sinais.

[00378] A modalidade exemplificada é descrita com referência à Fig. 13. O PTO hibridizado com a sequência de ácido nucleico-alvo é digerido para liberar o fragmento. O fragmento é hibridizado com o CTO. A extensão é realizada na presença de um corante intercalante (por exemplo, SYBR® Green) e forma o duplex estendido com corantes intercalantes.

[00379] Na Fig. 13, o híbrido entre o PTO não clivado e o CTO fornece sinal que não é alvo (C e D na Fig. 13) e é necessário dissociar o híbrido para remover o sinal que não é alvo. Portanto, a temperatura para a medida do sinal-alvo é determinada com consideração do valor de Tm do híbrido.

[00380] Preferencialmente, o sinal-alvo fornecido na etapa (e) é um sinal proveniente do corante intercalante.

[00381] De acordo com uma modalidade preferida, o PTO e/ou o CTO é bloqueado em sua extremidade 3’ para proibir sua extensão.

[00382] De acordo com uma modalidade preferida, o oligonucleotí- deo a montante é um iniciador a montante ou uma sonda a montante.

[00383] De acordo com uma modalidade preferida, o oligonucleotí- deo a montante fica localizado de forma adjacente ao PTO até o ponto que o oligonucleotídeo a montante induz a clivagem do PTO pela enzima que possui a atividade de nuclease 5’.

[00384] De acordo com uma modalidade preferida, o iniciador a montante induz através de sua fita estendida a clivagem do PTO pela enzima que possui a atividade de nuclease 5’.

[00385] De acordo com uma modalidade preferida, o método compreende ainda a repetição das etapas (a) a (b), (a) a (d) ou (a) a (e) com desnaturação entre ciclos de repetição.

[00386] De acordo com uma modalidade preferida, as etapas (a) a (b) e (c) a (e) são realizadas em um recipiente de reação ou em recipientes de reação separados.

[00387] De acordo com uma modalidade preferida, o método é realizado para detectar pelo menos dois tipos de sequência de ácido nu- cleico-alvo; em que o oligonucleotídeo a montante compreende pelo menos dois tipos de oligonucleotídeos, o PTO compreende pelo menos dois tipos dos PTOs e o CTO compreende pelo menos um tipo dos CTOs; em que quando pelo menos dois tipos das sequência de ácido nucleico-alvo estão presentes, o método fornece pelo menos dois tipos dos sinais-alvo que correspondem aos pelo menos dois tipos das sequência de ácidos nucleico-alvo.

[00388] De acordo com uma modalidade preferida, o oligonucleotí- deo a montante é um iniciador a montante e a etapa (b) utiliza uma polimerase de ácido nucleico dependente do modelo para a extensão do iniciador a montante.

[00389] De acordo com uma modalidade preferida, o CTO é imobilizado através de sua extremidade 5’ ou extremidade 3’ sobre um substrato sólido e o sinal-alvo fornecido sobre o substrato sólido é medido.

[00390] De acordo com uma modalidade preferida, o sinal-alvo é fornecido por um marcador único ligada ao fragmento ou por um marcador único incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão.

[00391] De acordo com uma modalidade preferida, o método é realizado na presença de um iniciador a jusante.

[00392] A detecção da etapa (e) pode ser realizada de uma maneira em tempo real, de uma maneira em ponto final ou de uma maneira com intervalo de tempo pré-determinados. Quando a presente invenção compreende ainda a repetição das etapas (a) a (b), (a) a (d) ou (a) a (e), é preferido que a detecção de sinal seja realizada para cada ciclo da repetição a uma temperatura predeterminada (isto é, maneira em tempo real), no final da repetição a uma temperatura predeterminada (isto é, maneira em ponto final) ou em cada um dos intervalos de tempo pré-determinados durante a repetição a uma temperatura predeterminada. Preferencialmente, a detecção pode ser realizada para cada ciclo da repetição de uma maneira em tempo real para aprimorar a acurácia e a quantificação da detecção. IV. Processo de Detecção de Alvo através do Ensaio de PTOCE Baseado em uma Atividade de Nuclease 5’ independente de Oli- gonucleotídeo a Montante

[00393] Em um aspecto adicional da presente invenção é provido um método para detecção de uma sequência de ácido nucleico alvo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO) compreendendo: (a) hibridização da sequência de ácido nucleico alvo com um PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação); em que o PTO compreende (i) uma porção de direcionamento 3’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico alvo e (ii) uma porção de marcação 5’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo não complementar à sequência de ácido nucleico alvo; em que a porção de direcionamento 3’ é hibri- dizada com a sequência de ácido nucleico e a porção de marcação 5’ não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo; (b) contato do resultado da etapa (a) com uma enzima tendo uma atividade de nuclease 5’ sob condições para clivagem do PTO; em que o PTO é clivado pela enzima tendo a atividade de nu clease 5’ de maneira que a clivagem libera um fragmento compreendendo uma porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO; (c) hibridização do fragmento liberado do PTO com um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelagem); em que o CTO compreende em uma direção 3’ para 5’ (i) uma porção de captura compreendendo uma sequência de nucleotídeo complementar à porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO e (ii) uma porção de modelagem compreendendo uma sequência de nu- cleotídeo não complementar à porção de marcação 5’ e à porção de direcionamento 3’ do PTO; em que o fragmento liberado do PTO é hi- bridizado com a porção de captura do CTO; (d) realização de uma reação de extensão usando o resultado da etapa (c) e uma polimerase de ácido nucleico dependente do modelo; em que o fragmento hibridizado com a porção de captura do CTO é estendido e um duplex estendido é formado; em que o duplex estendido tem um valor de Tm ajustado por (i) uma sequência e/ou comprimento do fragmento, (ii) uma sequência e/ou comprimento do CTO ou (iii) a sequência e/ou comprimento do fragmento e a sequência e/ou comprimento do CTO; (e) fusão do duplex estendido em uma faixa de temperaturas para dar um sinal alvo indicativo da presença do duplex estendido; em que o sinal alvo é provido por (i) pelo menos um marcador ligado ao fragmento e/ou ao CTO, (ii) um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão, (iii) um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão e um marcador ligado ao fragmento e/ou ao CTO ou (iv) um marcador intercalante; e (f) detecção do duplex estendido através da medição do sinal alvo; em que a presença do duplex estendido indica a presença da sequência de ácido nucleico alvo.

[00394] Em um aspecto adicional da presente invenção, é provido um método para detecção de uma sequência de ácido nucleico alvo de um DNA ou uma mistura de ácidos nucleicos através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO) compreendendo: (a) hibridização da sequência de ácido nucleico alvo com um PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação); em que o PTO compreende (i) uma porção de direcionamento 3’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico alvo e (ii) uma porção de marcação 5’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo não complementar à sequência de ácido nucleico alvo; em que a porção de direcionamento 3’ é hibri- dizada com a sequência de ácido nucleico alvo e a porção de marcação 5’ não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo; (b) contato do resultado da etapa (a) com uma enzima tendo uma atividade de nuclease 5’ sob condições para clivagem do PTO; em que o PTO é clivado pela enzima tendo a atividade de nuclease 5’ de maneira que a clivagem libera um fragmento compreendendo a porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO; (c) hibridização do fragmento liberado do PTO com um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelagem); em que o CTO compreende em uma direção 3’ para 5’ (i) uma porção de captura compreendendo uma sequência de nucleotídeo complementar à porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO e (ii) uma porção de modelagem compreendendo uma sequência de nu- cleotídeo não complementar à porção de marcação 5’ e a porção de direcionamento 3’ do PTO; em que o fragmento liberado do PTO é hi- bridizado com a porção de captura do CTO; (d) realização de uma reação de extensão usando o resultado da etapa (c) e uma polimerase de ácido nucleico dependente do modelo; em que o fragmento hibridizado com a porção de captura do CTO é estendido para formar um duplex estendido; em que o duplex estendido tem um valor de Tm ajustável por (i) uma sequência e/ou comprimento do fragmento, (ii) uma sequência e/ou comprimento do CTO ou (iii) a sequência e/ou comprimento do fragmento e a sequência e/ou comprimento do CTO; em que o duplex estendido provê um sinal alvo através de (i) pelo menos um marcador ligado ao fragmento e/ou CTO, (ii) um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão, (iii) pelo menos um marcador ligado ao fragmento e/ou CTO e um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão ou (iv) marcador intercalante; e (e) detecção do duplex estendido através da medição do sinal alvo em uma temperatura predeterminada que o duplex mantém sua forma de fita dupla, de maneira que a presença do duplex estendido indica a presença da sequência de ácido nucleico alvo.

[00395] Uma vez que o presente método com base na atividade de nuclease 5’ independente de oligonucleotídeo a montante é o mesmo que aqueles pelo ensaio de PTOCE usando oligonucleotídeos a montante exceto pelo uso de de quaisquer oligonucleotídeos a montante, as descrições comuns entre eles são omitidas a fim de evitar redundância indevida levando à complexidade do presente relatório.

[00396] Interessantemente, o presente método baseado em atividade de nuclease 5’ independente de oligonucleotídeo a montante praticamente provê sinais alvo através do ensaio de PTOCE mesmo sem uso de oligonucleotídeos a montante (vide Figs. 35A e 35B).

[00397] Para o presente método, enzimas convencionais tendo atividade de nuclease 5’ independente de oligonucleotídeo a montante podem ser usadas. Dentre as polimerases dependentes de modelo tendo atividade de nuclease 5’, há várias enzimas tendo atividade de nuclease 5’ independente de oligonucleotídeo a montante, por exem- plo, Taq polimerase de DNA.

[00398] Considerando amplificação de sequências de ácido nuclei- co alvo e eficiência de clivagem do PTO, o ensaio de PTOCE da presente invenção é preferivelmente realizado usando oligonucleotídeos a montante. V. Processo de Detecção de Variação de Nucleotídeo através de um Ensaio de PTOCE

[00399] Em um aspecto adicional da presente invenção é provido um método para detecção da variação de um oligonucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico alvo através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO) compreendendo: (a) hibridização da sequência de ácido nucleico alvo com um oligonucleotídeo a montante e um PTO-NV (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação para Variação de Nucleotídeo); em que o oli- gonucleotídeo a montante compreende uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico alvo; o PTO-NV compreende (i) uma porção de direcionamento 3’ compreen-dendo uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico alvo, (ii) uma porção de marcação 5’ compreendendo uma sequência de nucelotídeo não complementar à sequência de ácido nucleico alvo e (iii) um sítio de discriminação de variação de nucleotídeo, compreendendo uma sequência complemen-tar à variação de nucleotídeo no ácido nucleico alvo, posicionado em uma parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’; em que a porção de direcionamento 3’ é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo e a porção de marcação 5’ não é hibridizada com a se-quência de ácido nucleico alvo; o oligonucleotídeo a montante está localizado a montante do PTO-NV; o oligonucleotídeo a montante ou sua fita estendida induz clivagem do PTO-NV por uma enzima tendo uma atividade de nuclease 5’; (b) contato do resultado da etapa (a) com uma enzima tendo uma atividade de nuclease 5’ sob condições para clivagem do PTO-NV; em que quando o PTO-NV é hibridizado com a sequência de ácido nucleico alvo tendo a variação de nucleotídeo complementar ao sítio de discriminação de variação de nucleotídeo, e a parte de extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ forma uma fita dupla com a sequência de ácido nucleico alvo para induzir clivagem a partir de um primeiro sítio de clivagem inicial, um primeiro fragmento é liberado; em que quando o PTO-NV é hibridizado com uma sequência de ácido nucleico alvo tendo uma variação de nucleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação de nucleotídeo, e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ não forma uma fita dupla com a sequência de ácido nucleico alvo para induzir clivagem a partir de um segundo sítio de clivagem inicial localizado a ju-sante do primeiro sítio de clivagem inicial, um segundo fragmento é liberado; em que o segundo fragmento compreende uma porção de extremidade 3’ adicional permitindo o segundo fragmento diferente do primeiro fragmento; (c) hibridização do fragmento liberado do PTO-NV com um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelagem); em que o CTO compreende em uma direção 3’ para 5’ (i) uma porção de captura compreendendo uma sequência de nucleotídeo complementar à porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO- NV e (ii) uma porção de modelagem compreendendo uma sequência de nucleotídeo não complementar à porção de marcação 5’ e à porção de direcionamento 3’ do PTO-NV; em que o primeiro fragmento ou o segundo fragmento liberado do PTO-NV é hibridizado com a porção de captura do CTO; (d) realização de uma reação de extensão usando o resultado da etapa (c) e uma polimerase de ácido nucleico dependente de modelo; em que quando o primeiro fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO, ele é estendido para formar uma fita estendida compreendendo uma sequência estendida complementar à porção de modelagem do CTO; em que quando o segundo fragmento é hibri- dizado com a porção de captura do CTO, ele não é estendido; e (e) detecção da presença da fita estendida, de maneira que a presença da fita estendida indica a presença da variação do nu- cleotídeo complementar ao sítio de discriminação de nucleotídeo do PTO-NV.

[00400] Os presentes inventores fizeram intensas pesquisas para desenvolver novas abordagens para detectar variações de nucleotídeo com precisão e conveniência aperfeiçoadas, inter alia, de uma maneira multiplex. Como resultado, a requerente estabeleceu novos protocolos para detecção de variações de nucleotídeo, em que a detecção da variação de nucleotídeo é obtida através de hibridização de sonda, clivagem de sonda enzimática, extensão e detecção de uma fita estendida. Particularmente, a requerente de modo intrigante tornou o sítio de clivagem ajustável dependendo da presença e da ausência de variações de nucleotídeo de interesse e os fragmentos liberados pela clivagem em sítios diferentes são distinguidos pela habilidade de extensão em um modelo artificial. Os presentes protocolos são bem adotados para reações de fase líquida bem como reações de fase sólida, e asseguram detecção de variações de nucleotídeo múltiplas com precisão e conveniência aperfeiçoadas.

[00401] A presente invenção emprega eventos sucessivos seguido por hibridização de sonda; clivagem de PTO-NV (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação para Variação de Nucleotídeo) e extensão; formação de uma fita estendida dependente da variação de nucleotí- deo; e detecção da fita estendida. Desta maneira, ele é chamado um VD-PTOCE (Detecção de Variação através de Clivagem e Extensão de PTO).

[00402] De acordo com uma modalidade preferida, a variação de nucleotídeo detectada pela presente invenção é uma variação de substituição, uma variação de deleção ou uma variação de inserção, mais preferivelmente uma variação por um nucleotídeo único tal como SNP.

[00403] No presente pedido, uma sequência de ácido nucleico alvo tendo uma variação de nucleotídeo complementar ao sítio de discriminação de variação de nucleotídeo do PTO-NV é também descrita como “modelo compatível”. Uma sequência de ácido nucleico alvo tendo uma variação de nucleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação de nucleotídeo do PTO é também descrita como “modelo incompatível”.

[00404] De acordo com uma modalidade preferida, o termo “não complementar” em conjunto com uma variação de nucleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação de nucleotídeo é usado aqui para compreender não complementaridade devido à inserção ou deleção.

[00405] O ensaio VD-PTOCE da presente invenção usa o PTO-NV tendo o sítio de discriminação de variação de nucleotídeo posicionado na parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ para seletividade do PTO para uma variação de nucleotídeo específica. Onde o PTO-NV é hibridizado com a sequência de ácido nucleico alvo (isto é, modelo compatível) tendo a complementaridade de variação de nucle- otídeo para o sítio de discriminação de variação de nucleotídeo, a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ forma uma fita dupla com o modelo compatível; no entanto, onde o PTO-NV é hibridi- zado com uma sequência de ácido nucleico alvo (isto é, modelo compatível) tendo uma variação de nucleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação de nucleotídeo, a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ não forma uma fita dupla com o modelo incompatível.

[00406] É notável que tais padrões de hibridização distintos na variação de nucleotídeo de interesse são responsáveis por diferenças em sítios de clivagem iniciais do PTO-NV, desta maneira produzindo dois tipos de fragmentos de PTO-NV para fornecer diferenciação de sinal dependendo da presença da variação de nucleotídeo de interesse.

[00407] Um primeiro fragmento é gerado através da clivagem de híbrido entre o PTO e o modelo de compatibilidade. Um segundo fragmento é gerado através da clivagem de híbrido entre o PTO e o modelo de incompatibilidade. O segundo fragmento compreende mais nucleotídeos em sua porção de extremidade 3’ do que o primeiro fragmento.

[00408] A produção ou do primeiro fragmento ou do segundo fragmento pode ser distintamente detectada por uma reação de extensão no CTO.

[00409] Em geral, a hibridização entre uma parte da extremidade 3’ de iniciadores e um modelo é muito crucial para a extensão de iniciadores em uma condição adstringente. Na presente invenção, o primeiro fragmento e o segundo fragmento são hibridizados, cada um, com o mesmo sítio do CTO. Conforme acima descrito, o segundo fragmento compreende a porção de extremidade 3’ adicional comparado com o primeiro fragmento. Ao ajustar as condições de hibridização e uma sequência do CTO oposto à porção de extremidade 3’ adicional do segundo fragmento, apenas o primeiro fragmento pode ser permitido estender.

[00410] De acordo com uma modalidade preferida, o CTO tem uma sequência selecionada de maneira que o CTO não é hibridizado com a porção de extremidade 3’ adicional do segundo fragmento para prevenir que o segundo fragmento estenda quando o segundo fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO.

[00411] De acordo com uma modalidade preferida, a sequência do CTO oposta à porção de extremidade 3’ adicional do segundo fragmento é não complementar à porção de extremidade 3’ adicional.

[00412] A produção da fita estendida por extensão do primeiro fragmento pode ser detectada através de uma variedade de métodos.

[00413] De acordo com tecnologias convencionais usando atividades de nuclease 5’ para detecção de variações de nucleotídeo, hibridi- zação de sondas usada é determinada ou realizada por uma sequência integral de uma sonda. Em tais tecnologias convencionais, projeto e construção de sonda, e otimização de condições de reação, são muito problemáticos uma vez que a hibridização de sondas dependente da presença de variações de nucleotídeo é compelida para ser determinada principalmente por diferença por um nucleotídeo.

[00414] De acordo com o ensaio VD-PTOCE, um sítio de discriminação de variação de nucleotídeo é posicionado em uma parte da extremidade 5’ de uma porção de sondas envolvendo hibridização, permitindo que otimização de condições de hibridização seja conveniente. Ainda, o ensaio VD-PTOCE detecta diferencialmente uma variação de nucleotídeo através uma porção local de sondas ao invés de uma sequência integral de sondas, de maneira que a diferença por até mesmo um nucleotideo tais como SNPs pode ser detectada com precisão.

[00415] É conhecido de um versado na técnica que uma sequência de sonda adjacente a uma sequência oposta a um SNP afeta extremamente a hibridização de sonda. As sondas convencionais têm uma sequência oposta a um SNP geralmente em sua porção média. Com relação a isso, as sondas convencionais podem não selecionar uma sequência circundante em torno de um SNP envolvido em hibridiza- ção. As tecnologias convencionais têm sérias limitações devido a sequências circundantes de SNPs.

[00416] Improvável, na presente invenção, o sítio de discriminação de variação de nucleotídeo oposto a um SNP é posicionado em uma parte da extremidade 5’ de uma porção envolvendo hibridização das sondas, de maneira que tal sequência de sondas para uma sequência adjacente a 5’ SNP se torna ajustável. Devido ao fato das influências de uma sequência circundante em torno de um SNP sobre a hibridiza- ção serem precisamente controladas na presente invenção, se torna real analisar SNPs não ou pouco detectáveis através de tecnologias convencionais devido a influências de uma sequência circundante em torno de um SNP.

[00417] O ensaio de VD-PTOCE da presente invenção será descrito em mais detalhes como segue:

[00418] Uma vez que o ensaio VD-PTOCE da presente invenção é baseado em clivagem de PTO e extensão de fragmento de PTO em CTO como o ensaio de PTOCE descrito acima, as descrições comuns entre eles são omitidas a fim de evitar redundância indevida levando à complexidade do presente relatório. Etapa (a): Hibridização de um oligonucleotídeo a montante e um PTO-NV com uma sequência de ácido nucleico alvo

[00419] De acordo com a presente invenção, uma sequência de ácido nucleico alvo é primeiro hibridizada com um oligonucleotídeo a montante e um PTO-NV (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação para Variação de Nucleotídeo).

[00420] O termo usado aqui “PTO-NV (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação para Variação de Nucleotídeo)” significa um oligonu- cleotídeo compreendendo (i) uma porção de direcionamento 3’ servindo como uma sonda, (ii) uma porção de marcação 5’ com uma sequência de nucleotídeo não complementar à sequência de ácido nu- cleico alvo e (iii) um sítio de discriminação de variação de nucleotídeo, compreendendo uma sequência complementar para a variação de nu- cleotídeo no ácido nucleico alvo, posicionado em uma parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’. A porção de marcação 5’ é nucleoliticamente liberada do PTO após hibridização com a sequência de ácido nucleico alvo. A porção de marcação 5’ e a porção de direcionamento 3’ no PTO têm que ser posicionadas na ordem 5’ para 3’. O PTO-NV é esquematicamente ilustrado na Fig. 25. O PTO-NV pode ser compreendido como uma forma de aplicação do PTO para detecção de variações de nucleotídeo, que é construído através da introdução do sítio de discriminação de variação de nucleotídeo na parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’.

[00421] O PTO-NV compreende o sítio de discriminação de variação de nucleotídeo compreendendo uma sequência complementar para a variação de nucleotídeo posicionada na parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’.

[00422] Onde o PTO-NV é hibridizado com a sequência de ácido nucleico alvo tendo a variação de nucleotídeo complementar ao sítio de discriminação de variação, a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ forma uma fita dupla com a sequência de ácido nu- cleico alvo. Onde o PTO-NV é hibridizado com uma sequência de ácido nucleico alvo tendo uma variação de nucleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação, a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ não forma uma fita dupla com a sequência de ácido nucleico alvo. Tais padrões de hibridização distintos na variação de nucleotídeo de interesse são responsáveis por diferenças em sítios de clivagem do PTO-NV, desta maneira produzindo dois tipos de fragmentos de PTO-NV para fornecer diferenciação de sinal dependendo da presença da variação de nucleotídeo de interesse. A parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO-NV pode ser também descrita como uma porção de extremidade 5’ de formação de fita simples da porção de direcionamento 3’ do PTO-NV quando hibridizada com uma sequência de ácido nucleico alvo tendo uma variação de nucleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação.

[00423] O sítio de discriminação de variação de nucleotídeo posicionado em uma parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO-NV compreende uma sequência complementar para a variação de nucleotídeo. Por exemplo, onde uma variação de nucleotídeo a ser detectada for um SNP, o sítio de discriminação de variação de nucleotídeo compreende um nucleotídeo complementar para o SNP.

[00424] De acordo com uma modalidade preferida, o sítio de discriminação de variação de nucleotídeo está localizado dentro de 10 nucleotídeos, mais preferivelmente 8 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente 6 nucleotídeos, sobretudo preferivelmente 4 nucleotídeos, 3 nucleotídeos, 2 nucleotídeos ou 1 nucleotídeo de distância da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO-NV. Preferivelmente, o sítio de discriminação de variação de nucleotídeo está localizado na extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO-NV.

[00425] A localização do sítio de discriminação de variação de nu- cleotídeo pode ser determinada em consideração a sequências a serem detectadas, tipo de nucleases e condições de reação.

[00426] O termo “sítio” com referência ou ao sítio de discriminação de variação de nucleotídeo de sondas ou sítio de variação de nucleotí- deo em sequências alvo é usado aqui para compreender não apenas um nucleotídeo único, mas também uma pluralidade de nucleotídeos.

[00427] Preferivelmente, a hibridização na etapa (a) é realizada sob condições adstringentes que a porção de direcionamento 3’ é hibridi- zada com a sequência de ácido nucleico alvo e a porção de marcação 5’ não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo.

[00428] De acordo com uma modalidade preferida, o PTO-NV e/ou CTO é bloqueado em sua extremidade 3’ para proibir sua extensão.

[00429] De acordo com uma modalidade preferida, o oligonucleotí- deo a montante é um iniciador a montante ou uma sonda a montante.

[00430] De acordo com uma modalidade preferida, o oligonucleotí- deo a montante está localizado adjacentemente ao PTO-NV até o ponto que o oligonucleotídeo a montante induz clivagem do PTO-NV pela enzima tendo a atividade de nuclease 5’.

[00431] De acordo com uma modalidade preferida, o iniciador a montante induz através de sua fita estendida a clivagem do PTO-NV pela enzima tendo a atividade de nuclease 5’. Etapa (b): Liberação de um fragmento do PTO-NV

[00432] Em seguida, o resultado da etapa (a) é contatado com uma enzima tendo uma atividade de nuclease 5’ sob condições para clivagem do PTO-NV.

[00433] Onde o PTO-NV é hibridizado com a sequência de ácido nucleico alvo (isto é, modelo compatível) tendo a variação de nucleotí- deo complementar ao sítio de discriminação de variação, e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ forma uma fita dupla com a sequência de ácido nucleico alvo para induzir clivagem a partir de um primeiro sítio de clivagem inicial, um primeiro fragmento é liberado (vide Fig. 25).

[00434] Onde o PTO-NV é hibridizado com uma sequência de ácido nucleico alvo (isto é, modelo incompatível) tendo uma variação de nu- cleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação, e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ não forma uma fita dupla com a sequência de ácido nucleico alvo para induzir clivagem a partir de um segundo sítio de clivagem inicial localizado a jusante do primeiro sítio de clivagem inicial, um segundo fragmento é liberado; em que o segundo fragmento compreende uma porção de extremidade 3’ permitindo o segundo fragmento diferente do primeiro fragmento (vide Fig. 25).

[00435] Onde a sequência de ácido nucleico não está presente em uma amostra, a clivagem do PTO-NV não ocorre.

[00436] Desta maneira, diferenças em sítios de clivagem e tipos de fragmentos de PTO-NV gerados resultam em padrões de extensão diferentes dependendo da presença e da ausência da variação de nu- cleotídeo de interesse na sequência de ácido nucleico alvo, contribuindo para detecção diferencial da variação de nucleotídeo na sequência de ácido nucleico alvo.

[00437] Um sítio de clivagem inicial do PTO-NV é afetado pelo tipo de nucleases 5’, pelo tipo de oligonucleotídeos a montante (sonda a montante ou iniciador a montante), sítios de hibridização de oligonu- cleotídeos a montante e condições de clivagem.

[00438] Um sítio de clivagem inicial pela polimerase dependente de modelo tendo atividade de nuclease 5’ com extensão de iniciadores a montante está geralmente posicionado em uma direção 5’ para 3’ em um nucleotídeo inicial de uma fita dupla (isto é, sítio de bifurcação) em estruturas incluindo uma fita simples e uma fita dupla ou em 1 a 2 nu- cleotídeos separados do nucleotídeo inicial. Através da reação de clivagem, fragmentos compreendendo a porção de marcação 5’ e uma parte da porção de direcionamento 3’ são produzidos. Onde a presente invenção é realizada por indução de clivagem independente de extensão de oligonucleotídeo a montante, o sítio de clivagem do PTO-NV pode ser ajustado através de localização de oligonucleotídeos a montante (por exemplo, sonda a montante).

[00439] O termo usado aqui “um primeiro sítio de clivagem inicial” em conjunto com o PTO-NV significa um sítio de clivagem do PTO-NV sendo primeiro clivado quando o PTO-NV é hibridizado com a sequência de ácido nucleico alvo tendo a variação de nucleotídeo complementar ao sítio de discriminação de variação. O termo usado aqui “um segundo sítio de clivagem inicial” em conjunto com o PTO-NV significa um sítio de clivagem do PTO-NV sendo primeiro clivado quando o PTO-NV é hibridizado com uma sequência de ácido nucleico alvo tendo uma variação de nucleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação.

[00440] O termo usado aqui “um primeiro fragmento” se refere a um fragmento produzido quando da clivagem no primeiro sítio de clivagem inicial. O termo é usado intercomutavelmente com “um primeiro segmento” e “um primeiro fragmento de PTO-NV”. O termo aqui “um segundo fragmento” se refere a um fragmento produzido quando da clivagem no segundo sítio de clivagem inicial. O termo é usado interco- mutavelmente com “um segundo segmento” e um “segundo fragmento de PTO-NV”.

[00441] Preferivelmente, o primeiro fragmento e o segundo fragmento compreendem cada um a porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’.

[00442] A clivagem pode ocorrer com sucesso após a clivagem do primeiro sítio de clivagem inicial (ou o segundo sítio de clivagem inicial) dependendo dos métodos de clivagem usados. Por exemplo, onde uma reação de clivagem de nuclease 5’ junto com extensão de iniciadores a montante é usada, o sítio de clivagem inicial e sua sequência sucessiva são clivados. Onde uma sonda a montante é usada e a reação de clivagem ocorre em um sítio distante de um sítio de localização da sonda, a reação de clivagem pode ocorrer apenas no sítio e clivagem em sítios sucessivos pode não ocorrer.

[00443] De acordo com uma modalidade preferida, um sítio de clivagem inicial dependente da extensão de iniciadores a montante pode ser posicionado em uma direção 5’ para 3’ em um nucleotídeo inicial de uma fita dupla (isto é, sítio de bifurcação).

[00444] Conforme mostrado na Fig. 25 representando um exemplo da presente invenção, o sítio de discriminação de variação de nucleo- tídeo é posicionado na extremidade 5’ da parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’. Em tal caso, o primeiro sítio de clivagem inicial é posicionado imediatamente adjacente, em uma direção 5’ para 3’, à parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’. Em outras palavras, o primeiro sítio de clivagem inicial é posicionado imediatamente adjacente, em uma direção 3’, ao sítio de discriminação de variação de nucleotídeo. O segundo sítio de clivagem inicial é geralmente posicionado 1 nucleotídeo de distância, em uma direção 3’, do sítio de discriminação de variação de nucleotídeo.

[00445] Conforme mostrado na Fig. 26 representando outro exemplo da presente invenção, o sítio de discriminação de variação de nu- cleotídeo é posicionado 1 nucleotídeo de distância da extremidade 5’ da parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’. Em tal caso, o primeiro sítio de clivagem inicial é posicionado imediatamente adjacente, em uma direção 5’, ao sítio de discriminação de variação de nucleotídeo. O segundo sítio de clivagem inicial é geralmente posicionado 1 nucleotídeo de distância, em uma direção 3’, do sítio de discriminação de variação de nucleotídeo.

[00446] A parte da extremidade 5’ compreendendo o sítio de discriminação de variação de nucleotídeo pode ser composta de uma sequência hibridizável com a sequência de ácido nucleico alvo. Alternativamente, a parte da extremidade 5’ pode compreender parcialmente uma sequência não hibridizável (vide Fig. 27). A introdução de uma sequência não hibridizável na parte da extremidade 5’ é muito vantajosa na formação de fita simples da parte da extremidade 5’ quando o PTO-NV é hibridizado com uma sequência de ácido nucleico alvo tendo uma variação de nucleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação de nucleotídeo.

[00447] De acordo com uma modalidade preferida, a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO-NV compreende uma porção de não pareamento de base localizada dentro de 1-10 nu- cleotídeos (mais preferivelmente 1-5 nucleotídeos) distante do sítio de discriminação de variação de nucleotídeo.

[00448] A porção de não pareamento de base previne que a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ forme uma fita dupla com a sequência de nucleotídeo alvo quando o PTO-NV é hibridi- zado com a sequência de ácido nucleico alvo tendo a variação de nu- cleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação.

[00449] De acordo com uma modalidade preferida, a porção de não pareamento de base não inibe a formação de uma fita dupla entre a parte da extremidade 5’ e a sequência de ácido nucleico alvo quando o PTO-NV é hibridizado com a sequência de ácido nucleico alvo tendo a variação de nucleotídeo complementar ao sítio de discriminação de variação de ácido nucleico.

[00450] De acordo com uma modalidade, a porção de não parea- mento de base aumenta a diferenciação entre o primeiro sítio de clivagem inicial e o segundo sítio de clivagem inicial. Por exemplo, em que os sítios de clivagem não se tornarem diferenciados em um modelo de compatibilidade e um modelo de incompatibilidade por diferença no sítio de discriminação de variação devido a nenhuma diferença em padrões de hibridização da parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO-NV, o uso da porção de não pareamento de base faz com que os padrões de hibridização se tornem diferenciados. Ainda, mesmo quando a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO-NV mostra padrões de hibridização diferentes em um modelo de compatibilidade e modelo de incompatibilidade através de diferença no sítio de discriminação de variação, o uso da porção de não pareamento de base permite fornecer porção de extremidade 3’ muito mais longa do segundo fragmento do que aquele do primeiro fragmento, desta maneira prevenindo completamente a extensão do segundo fragmento no CTO.

[00451] O uso da porção de não pareamento de base aperfeiçoa o ensaio de VD-PTOCE.

[00452] De acordo com uma modalidade preferida, o uso da porção de não pareamento de base (por exemplo, nucleotídeo de incompatibilidade artificial) aumenta a o potencial de discriminação do PTO-NV para variações de nucleotídeo.

[00453] De acordo com uma modalidade, o reconhecimento diferencial pela enzima tendo a atividade de nuclease 5’ entre o primeiro sítio de clivagem inicial e o segundo sítio de clivagem inicial é melhorado pela diferenciação imposta pela porção de não pareamento de base. A diferenciação pode ser aumentada pela distância entre o primeiro sítio de clivagem inicial e o segundo sítio de clivagem inicial causada pela porção de não pareamento de base. De acordo com uma modalidade preferida, a porção de não pareamento de base aumenta a distância entre o primeiro sítio de clivagem inicial e o segundo sítio de clivagem inicial.

[00454] De acordo com uma modalidade preferida, a introdução de uma sequência de porção de não pareamento de base permite que o segundo sítio de clivagem inicial seja ajustado.

[00455] Preferivelmente, a porção de não pareamento de base está localizada a jusante do sítio de discriminação de variação de nucleotí- deo.

[00456] Por exemplo, onde um nucleotídeo de incompatibilidade como uma porção de não pareamento de base é introduzido em uma posição com 2 nucleotídeos de distância, em uma direção 3’, a partir do sítio de discriminação de variação de nucleotídeo, o segundo sítio de clivagem inicial é ajustado para uma posição 2 nucleotídeos de distância do sítio de discriminação de variação de nucleotídeo (vide Fig. 27). No caso de não usar o nucleotídeo de incompatibilidade, o segun- do sítio de clivagem inicial é posicionado 1 nucleotídeo de distância do sítio de discriminação de variação de nucleotídeo. Isto quer dizer, a porção de não pareamento de base pode aumentar a distância entre o primeiro sítio de clivagem inicial e o segundo sítio de clivagem inicial.

[00457] A porção de não pareamento de base inclui quaisquer porções que não formam um par de base entre as sequências de ácido nucleico alvo. Preferivelmente, a porção de não pareamento de base é (i) um nucleotídeo compreendendo uma base de incompatibilidade artificial, uma base de não pareamento de base modificada para ser capaz de pareamento de base ou uma base universal, (ii) um nucleotídeo de não pareamento de base modificado para ser incapaz de parea- mento de base ou (iii) um composto químico de não pareamento de base.

[00458] Por exemplo, a porção de não pareamento de base inclui grupo alquileno, naftaleno de ribofuranosila, naftaleno de desoxi ribofuranosila, metafosfato, ligação fosforotioato, ligação fosfotriéster de alquila, ligação fosfotriéster de arila, ligação fosfonato de alquila, ligação fosfonato de arila, ligação fosfonato de hidrogênio, ligação fosforoami- dato de alquila e ligação fosforoamidato de arila. Espaçadores de carbono convencionais são também usados como porções de não pare- amento de base. Bases universais como porções de não pareamento de base são úteis no ajuste de sítios de clivagem do PTO-NV.

[00459] Como pares de base contendo bases universais tal como desoxiinosina, 1-(2’-desoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitropirrol e 5- nitroindol têm uma resistência de ligação menor do que aqueles entre bases naturais, bases universais podem ser empregadas como porções de não pareamento de base sob certas condições de hibridiza- ção.

[00460] A porção de não pareamento de base introduzida na parte da extremidade 5’ tem preferivelmente 1 a 5, mais preferivelmente 1 a 2, porções. Uma pluralidade de porções de não pareamento de base na parte da extremidade 5’ pode estar presente de uma maneira consecutiva ou intermitente. Preferivelmente, a porção de não pareamento de base tem 2 a 5 porções consecutivas.

[00461] Preferivelmente, a porção de não pareamento de base é um composto químico de não pareamento de base.

[00462] De acordo com uma modalidade preferida, o sítio de discriminação de variação de nucleotídeo e a porção de não pareamento de base do PTO-NV estão localizados dentro de 10 nucleotídeos (mais preferivelmente 8 nucleotídeos, 7 nucleotídeos, 6 nucleotídeos, 5 nu- cleotídeos, 4 nucleotídeos, 3 nucleotídeos, 2 nucleotídeos ou 1 nucleo- tídeo, com mais preferência ainda 1 nucleotídeo) distante da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’.

[00463] Alternativamente, a reação de clivagem pode ser executada apenas no primeiro sítio de clivagem inicial, não no segundo sítio de clivagem inicial. Por exemplo, em que uma sonda a montante é usada e a reação de clivagem ocorre em um sítio distante de um sítio de localização da sonda, a reação de clivagem pode ocorrer apenas no primeiro sítio de clivagem inicial quando o PTO-NV é hibridizado com o modelo compatível. Quando o PTO-NV é hibridizado com o modelo de incompatibilidade, o sítio de bifurcação (o segundo sítio de clivagem inicial) pode não ser clivado por causa de uma longa distância da sonda a montante.

[00464] De acordo com uma modalidade preferida, em que PTO-NV é hibridizado com o modelo de incompatibilidade, o segundo sítio de clivagem inicial compreende um sítio inicial de uma fita dupla (isto é, sítio de bifurcação) em estruturas incluindo uma fita simples e uma fita dupla.

[00465] De acordo com uma modalidade, o PTO-NV tem uma porção bloqueadora contendo como um bloqueador pelo menos um nu- cleotídeo resistente à clivagem pela enzima tendo atividade de nuclease 5’ e a porção bloqueadora está posicionada para controlar o sítio de clivagem inicial ou prevenir a clivagem em um sítio ou sítios. Etapa (c): Hibridização do fragmento liberado do PTO com CTO

[00466] O fragmento liberado do PTO é hibridizado com um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelo).

[00467] O primeiro fragmento e o segundo fragmento têm comu- mente uma sequência hibridizável com a porção de captura do CTO e então um deles é hibridizado com o CTO.

[00468] O segundo fragmento produzido quando hibridizado com o modelo de incompatibilidade compreende uma porção de extremidade 3’ adicional sendo diferente do primeiro segmento produzido quando hibridizado com o modelo compatível.

[00469] De acordo com uma modalidade preferida, o CTO tem uma sequência selecionada de maneira que o CTO não é hibridizado com a porção de extremidade 3’ adicional do segundo fragmento para prevenir que o segundo fragmento estenda quando o segundo fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO. Por exemplo, a sequência do CTO pode ser selecionada de maneira que o CTO tenha um nucleotídeo(s) de incompatibilidade oposto à porção de extremidade 3’ adicional do segundo fragmento. Alternativamente, bases universais podem ser usadas ao invés do nucleotídeo de incompatibilidade dependendo das condições de reação.

[00470] O primeiro sítio de clivagem inicial (ou o segundo sítio de clivagem inicial) pode não ser fixo, mas ao contrário múltiplo em uma condição. Por exemplo, sítios de clivagem iniciais podem ser posicionados em uma direção 5’ para 3’ em um nucleotídeo inicial de uma fita dupla (isto é, sítio de bifurcação) em estruturas incluindo uma fita simples e uma fita dupla e 1-2 nucleotídeos de distância do nucleotídeo inicial. Em tal caso, preferivelmente, a sequência do CTO é seleciona- da de maneira que o fragmento mais curto liberado pela primeira clivagem inicial seja seletivamente estendido na presente invenção para gerar a fita estendida indicativa da presença da variação de nucleotí- deo. Etapa (d): Extensão do Fragmento

[00471] Quando o primeiro fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO, ele é estendido para formar uma fita estendida compreendendo uma sequência estendida complementar à porção de modelagem do CTO. Quando o segundo fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO, ele não é estendido.

[00472] Em geral, as extensões de iniciadores podem ser controladas através de hibridização entre uma parte da extremidade 3’ de iniciadores e um modelo. Ao ajustar as sequências de iniciador e condições de reação (por exemplo, temperatura de anelamento), a extensão de iniciadores tendo em sua parte de extremidade 3’ 1 a 3 nucleotí- deos de incompatibilidade é permissível. Alternativamente, a extensão de iniciadores pode ser permissível apenas quando eles têm sequência perfeitamente complementar às sequências alvo.

[00473] De acordo com uma modalidade preferida, a sequência do CTO é selecionada de maneira que ou o primeiro fragmento ou o segundo fragmento é seletivamente estendido.

[00474] De acordo com uma modalidade preferida, a extensão do fragmento é realizada sob condições de maneira que a extensão não ocorre mesmo quando uma incompatibilidade única está presente na parte da extremidade 3’ do fragmento. Etapa (e): Detecção da fita estendida

[00475] A fita estendida é detectada após a reação de extensão. A presença da fita estendida indica a presença da variação de nucleotí- deo complementar ao sítio de discriminação de nucleotídeo do PTO- NV.

[00476] De acordo com uma modalidade preferida, a detecção na etapa (e) é realizada de acordo com o ensaio de PTOCE compreendendo análise de fusão ou do PTOCE compreendendo detecção em uma temperatura predeterminada usando sinais do duplex estendido entre a fita estendida e o CTO descrito acima.

[00477] De acordo com uma modalidade preferida, a fita estendida do primeiro fragmento e o CTO formam um duplex estendido na etapa (d); em que o duplex estendido tem um valor de Tm ajustável por (i) uma sequência e/ou comprimento do primeiro fragmento, (ii) uma sequência e/ou fragmento do CTO ou (iii) a sequência e/ou comprimento do primeiro fragmento e a sequência e/ou comprimento do CTO; em que o duplex estendido provê um sinal-alvo através de (i) pelo menos um marcador ligado ao primeiro fragmento e/ou CTO, (ii) um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão, (iii) pelo menos um marcador ligado ao primeiro fragmento e/ou CTO e um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão ou (iv) marcador intercalante; e em que a presença da fita estendida é detectada através da medição do sinal-alvo a partir do duplex estendido de acordo com uma análise de fusão ou uma análise de hi- bridização para o duplex estendido.

[00478] De acordo com uma modalidade preferida, a fita estendida do primeiro fragmento e o CTO formam um duplex estendido na etapa (d); em que o duplex estendido tem um valor de Tm ajustável por (i) uma sequência e/ou comprimento do primeiro fragmento, (ii) uma sequência e/ou comprimento do CTO ou (iii) a sequência e/ou comprimento do primeiro fragmento e a sequência e/ou comprimento do CTO; em que o duplex estendido provê um sinal alvo através de (i) pelo menos um marcador ligado ao primeiro fragmento e/ou CTO, (ii) um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão, (iii) pelo menos um marcador ligado ao primeiro fragmento e/ou CTO e um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão ou (iv) marcador intercalante; e em que a presença da fita estendida é detectada pela medição do sinal alvo a partir do duplex estendido em uma temperatura predeterminada suficiente para manter uma fita dupla do duplex estendido.

[00479] De acordo com uma modalidade preferida, a fita estendida do primeiro fragmento pode ser detectada através da medição de sinais gerados a partir da clivagem de sondas marcadas hibridizadas com o CTO em extensão do primeiro fragmento.

[00480] De acordo com uma modalidade preferida, a fita estendida do primeiro fragmento pode ser detectada com base ou no tamanho ou sequência da fita estendida. Por exemplo, a fita estendida pode ser detectada usando uma análise por eletroforese ou massa (por exemplo, impacto de elétron (EI) (Electron Impact), ionização química (CI) (Chemical Ionization), Dessorção por Campo (FD) (Field Desorption), Dessorção de 252Cf-Plasma (PD) (Plasma Desorption), ionização química por Dessorção (DCI) (Desorption Chemical Ionization), espec- trometria de massa por íon secundária (SIMS) (Secondary Ion Mass Spectrometry), bombardeamento de átomo rápido (FAB) (Fast Atom Bombardment), ionização por eletropulverização (ESI) (Electrospray Ionization), Ionização por Dessorção a laser auxiliada por matriz (MALDI) (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) e Espectrome- tria de Massa em Tandem.

[00481] De acordo com uma modalidade preferida, o presente método compreende ainda repetição de todas ou algumas das etapas (a)- (e) com desnaturação entre ciclos de repetição.

[00482] De acordo com uma modalidade preferida, o método é realizado para detectar pelo menos dois tipos de variações de nucleotí- deos; em que o oligonucleotídeo a montante compreende pelo menos dois tipos de oligonucleotídeos e o PTO-NV compreende pelo menos dois tipos de PTO-NVs.

[00483] De acordo com uma modalidade preferida, o oligonucleotí- deo a montante é um iniciador a montante e a etapa (b) usa uma poli- merase de ácido nucleico dependente de modelo para a extensão do iniciador a montante; em que a polimerase de ácido nucleico dependente de modelo é igual à enzima tendo a atividade de nuclease 5’.

[00484] De acordo com uma modalidade preferida, o oligonucleotí- deo a montante é um iniciador a montante e a etapa (b) usa uma po- limerase de ácido nucleico dependente de modelo para a extensão do iniciador a montante; em que a polimerase de ácido nucleico dependente de modelo é diferente da enzima tendo a atividade de nuclease 5’.

[00485] De acordo com uma modalidade preferida, a enzima tendo a atividade de nuclease 5’ é uma polimerase de DNA termoestável tendo uma atividade de nuclease 5’ ou FEN nuclease.

[00486] De acordo com uma modalidade preferida, o método é realizado na presença de um iniciador a jusante.

[00487] O presente método pode ser realizado com método de coagulação por PCR usando PNA em que o PNA e PTO-NV usados podem ser projetados para serem hibridizados com a mesma fita em uma fita de DNA dupla ou fitas diferentes uma da outra.

[00488] De acordo com uma modalidade, a presente invenção pode ser realizada sem nenhuma ajuda de oligonucleotídeos a montante. Em tal caso, enzimas convencionais tendo atividade de nuclease 5’ independente de oligonucleotídeo a montante podem ser usadas. Dentre as polimerases dependentes de modelo tendo atividade de nuclease 5’, há várias enzimas tendo atividade de nuclease 5’ independente de oligonucleotídeo a montante, por exemplo, Taq DNA polime- rase.

[00489] Considerando a amplificação de sequências de ácido nu- cleico alvo, condições de reação e atividade de nuclease 5’, a presente invenção é preferivelmente realizada usando oligonucleotídeos a montante, mais preferivelmente iniciadores a montante.

[00490] O método para detecção de uma variação de nucleotídeo através de um ensaio de PTOCE baseado em atividade de nuclease 5’ independente de oligonucleotídeo a montante compreende: (a) hibridização da sequência de ácido nucleico alvo com um PTO-NV (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação para Variação de Nucleotídeo); em que o PTO-NV compreende (i) uma porção de direcionamento 3’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico alvo, (ii) uma porção de marcação 5’ compreendendo uma sequência de nucle- otídeo não complementar à sequência de ácido nucleico alvo e (iii) um sítio de discriminação de variação de nucleotídeo compreendendo uma sequência complementar à variação de nucleotídeo no ácido nu- cleico alvo, posicionado em uma parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’; em que a porção de direcionamento 3’ é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo e a porção de marcação 5’ não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo; (b) contato do resultado da etapa (a) com uma enzima tendo uma atividade de nuclease 5’ sob condições para clivagem do PTO-NV; em que quando o PTO-NV é hibridizado com a sequência de ácido nucleico alvo tendo a variação de nucleotídeo complementar ao sítio de discriminação de variação de nucleotídeo e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ forma uma fita dupla com a sequência de ácido nucleico alvo para induzir clivagem a partir de um primeiro sítio de clivagem inicial, um primeiro fragmento é liberado; em que o PTO-NV é hibridizado com uma sequência de ácido nucleico alvo tendo uma variação de nucleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação de nucleotídeo, e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ não forma uma fita dupla com a sequência de ácido nucleico para induzir clivagem a partir de um segundo sítio de clivagem inicial localizado a montante do primeiro sítio de clivagem inicial, um segundo fragmento é liberado; em que o segundo fragmento compreende uma porção de extremidade 3’ adicional permitindo o segundo fragmento diferente do primeiro fragmento; (c) hibridização do fragmento liberado do PTO-NV com um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelagem); em que o CTO compreende em uma direção 3’ para 5’ (i) uma porção de captura compreendendo uma sequência de nucleotídeo complementar à porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO- NV e (ii) uma porção de modelagem compreendendo uma sequência de nucleotídeo não complementar à porção de marcação 5’ e a porção de direcionamento 3’ do PTO-NV; em que o primeiro fragmento ou o segundo fragmento liberado do PTO-NV é hibridizado com a porção de captura do CTO; (d) realização de uma reação de extensão usando o resultado da etapa (c) e uma polimerase de ácido nucleico dependente de modelo; em que quando o primeiro fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO, ele é estendido para formar uma fita estendida compreendendo uma sequência estendida complementar à porção de modelagem do CTO; em que quando o segundo fragmento é hibri- dizado com a porção de captura do CTO, ele não é estendido; e (e) detecção da presença da fita estendida, de maneira que a presença da fita estendida indica a presença da variação de nu- cleotídeo complementar ao sítio de discriminação de nucelotídeo do PTO-NV.

[00491] Uma vez que o presente método baseado na atividade de nuclease 5’ independente de oligonucleotídeo a montante é o mesmo que aqueles do ensaio de PTOCE usando oligonucleotídeos a montan- te exceto por nenhum uso de oligonucleotídeos a montante, as descrições comuns entre eles são omitidas a fim de evitar redundância indevida levando à complexidade do presente relatório.

[00492] Em outro aspecto da presente invenção, é provido um kit para detecção de uma variação de nucelotídeo em uma sequência de ácido nucleico alvo através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO) compreendendo: (a) um PTO-NV (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação para Variação de Nucleotídeo); em que o PTO-NV compreende (i) uma porção de direcionamento 3’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico alvo, (ii) uma porção de marcação 5’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo não complementar à sequência de ácido nu- cleico alvo e (iii) um sítio de discriminação de variação de nucleotídeo compreendendo uma sequência complementar à variação de nucleotí- deo no ácido nucleico alvo, posicionado em uma parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’; em que a porção de direcionamento 3’ é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo e a porção de marcação 5’ não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo; (b) um oligonucleotídeo a montante; em que o oligonucle- otídeo a montante compreende uma sequência de nucleotídeo de hi- bridização complementar à sequência de ácido nucleico alvo; em que o oligonucleotídeo a montante está localizado a montante do PTO-NV; o oligonucleotídeo a montante ou sua fita estendida induz clivagem do PTO-NV por uma enzima tendo uma atividade de nuclease 5’; e (c) um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelagem); em que o CTO compreende em uma direção 3’ para 5’ (i) uma porção de captura compreendendo uma sequência de nucleotídeo complementar à porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO-NV e (ii) uma porção de modelagem compreendendo uma sequência de nucelotídeo não complementar à porção de marcação 5' e a porção de direcionamento 3’ do PTO-NV; em que quando o PTO-NV é hibridizado com a sequência de ácido nucleico alvo tendo a variação de nucleotídeo complementar ao sítio de discriminação de variação, e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ forma uma fita dupla com a sequência de ácido nucleico alvo para induzir clivagem a partir de um primeiro sítio de clivagem inicial, um primeiro fragmento é liberado; em que quando o PTO-NV é hibridizado com uma sequência de ácido nucleico alvo tendo uma variação de nucleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação, e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ não forma uma fita dupla com a sequência de ácido nucleico para induzir clivagem a partir de um segundo sítio de clivagem inicial localizado a jusante do primeiro sítio de clivagem inicial, um segundo fragmento é liberado; em que o segundo fragmento compreende uma porção de extremidade 3’ adicional permitindo o segundo fragmento diferente do primeiro fragmento; em que o primeiro fragmento ou o segundo fragmento liberado do PTO-NV é hibridizado com a porção de captura do CTO.

[00493] Em um aspecto adicional da presente invenção, é provido um kit para detecção de uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico alvo através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO) com base em atividade de nuclease 5’ independente de oligonucleotídeo a montante compreendendo: (a) um PTO-NV (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação para Variação de Nucleotídeo); em que o PTO-NV compreende (i) uma porção de direcionamento 3’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico alvo, (ii) uma porção de marcação 5’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo não complementar à sequência de ácido nu- cleico alvo e (iii) um sítio de discriminação de variação de nucleotídeo compreendendo uma sequência complementar à variação de nucleotí- deo no ácido nucleico alvo, posicionado em uma parte da extremidade 5’ da porção alvo 3; em que a porção de direcionamento 3’ é hibridiza- da com a sequência de ácido nucleico alvo e a porção de marcação 5’ não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo; (b) um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelagem); em que o CTO compreende em uma direção 3’ para 5’ (i) uma porção de captura compreendendo uma sequência de nucleotídeo complementar à porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO-NV e (ii) uma porção de modelagem compreendendo uma sequência de nucleotídeo não complementar à porção de marcação 5’ e à porção de direcionamento 3’ do PTO-NV; em que quando o PTO-NV é hibridizado com a sequência de ácido nucleico alvo tendo a variação de nucleotídeo complementar ao sítio de discriminação de variação, e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ forma uma fita dupla com a sequência de ácido nucleico alvo para induzir clivagem a partir de um primeiro sítio de clivagem inicial, um primeiro fragmento é liberado; em que quando PTO-NV é hibridizado com uma sequência de ácido nucleico alvo tendo uma variação de nucleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação, e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ não forma uma fita dupla com a sequência de ácido nucleico alvo para induzir clivagem a partir de um segundo sítio de clivagem inicial localizado a jusante do primeiro sítio de clivagem inicial, um segundo fragmento é liberado; em que o segundo fragmento compreende uma porção de extremidade 3’ adicional permitindo o segundo fragmento diferente do primeiro fragmento; em que o primeiro fragmento ou o segundo fragmento liberado do PTO-NV é hibridizado com a porção de captura do CTO.

[00494] Uma vez que o kit da presente invenção é construído para realizar o método de detecção da presente invenção descrito acima, as descrições comuns entre eles são omitidas a fim de evitar redundância indevida levando à complexidade do presente pedido.

[00495] As características e vantagens da presente invenção serão sumarizadas como segue: (a) A presente invenção provê um duplex estendido dependendo do alvo em que PTO (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação) hibridizado com uma sequência de ácido nucleico alvo é clivado para liberar um fragmento e o fragmento é hibridizado com CTO (Oli- gonucleotídeo de Captura e Modelo) para formar um duplex estendido. O duplex estendido provê um sinal (geração ou extinção de sinal) ou uma mudança de sinal (aumento ou diminuição de sinal) indicando a presença de uma sequência de ácido nucleico alvo. (b) A presença do duplex estendido é determinada através de uma variedade de métodos ou processos tais como análise de curva de fusão e detecção em uma temperatura predeterminada (por exemplo, de uma maneira em tempo real e maneira de ponto final). (c) A presente invenção permite detectar simultaneamente pelo menos dois tipos de sequências de ácido nucleico alvo através de análise de curva de fusão mesmo usando um tipo único de um marcador (por exemplo, FAM). Em contraste, o método em tempo real multiplex convencional realizado em uma fase líquida está sofrendo seriamente de limitação associada com o número de marcadores de fluorescência detectáveis. A presente invenção permite superar com sucesso tais inconvenientes e ampliar a aplicação de detecção em tempo real multiplex. (d) A presente invenção pode ser realizada usando variedade de sistemas de marcação. Por exemplo, os marcadores ligados a qualquer sítio de PTO e/ou CTO podem ser utilizados para provisão do sinal alvo indicando o duplex estendido. Também, marcadores incorporados ao duplex estendido durante a reação de extensão podem ser usados na presente invenção. Em adição a isso, uma combinação de tais marcadores pode ser usada. Os sistemas de marcação versáteis aplicáveis à presente invenção permitem que seja escolhido um sistema de marcação apropriado dependendo das condições experimentais ou objetivos. (e) A presente invenção provê um duplex estendido dependente do alvo que tem um valor de Tm predeterminado ajustável através de (i) uma sequência e/ou comprimento do fragmento, (ii) uma sequência e/ou comprimento do CTO ou (iii) a sequência e/ou comprimento do fragmento e a sequência e/ou comprimento do CTO. (f) Análise de curva de fusão convencional usando um produto amplificado depende da sequência do produto amplificado de maneira que é difícil obter um valor de Tm desejado de produto amplificado. Em contraste, a presente invenção depende da sequência de um duplex estendido não da sequência de um produto amplificado, permitindo selecionar um valor de Tm desejado de duplex estendido. Desta maneira, a presente invenção é facilmente adaptável para a detecção de sequências alvo múltiplas. (g) Análise de curva de fusão convencional usando uma hi- bridização direta entre sondas marcadas e sequências de ácido nu- cleico alvo é muito provável gerar sinais falso positivos devido à hibri- dização não específica de sondas. Em contraste, a presente invenção emprega não apenas hibridização de PTO, mas também clivagem e extensão enzimáticas, o que supera completamente problemas de sinais falso positivos. (h) O valor de Tm de análise de curva de fusão convencional é afetado por uma variação de sequência nas sequências de ácido nucleico alvo. No entanto, um duplex estendido na presente invenção provê um valor de Tm constante sem importar uma variação de sequência nas sequências de ácido nucleico alvo, permitindo assegurar excelente precisão em análise de curva de fusão. (i) É notável que a sequência da porção de marcação 5’ de PTO e a sequência de CTO podem ser selecionadas sem nenhuma consideração de sequências de ácido nucleico alvo. Isso torna possível pré-planejar um grupo de sequências para a porção de marcação 5’ de PTO e CTO. Embora a porção de direcionamento 3’ do PTO tenha que ser preparada com consideração às sequências de ácido nu- cleico alvo, o CTO pode ser preparado de uma maneira pronta sem nenhuma consideração ou conhecimento de sequências de ácido nu- cleico alvo. Tais características proveem vantagens proeminentes em detecção de alvo múltipla, inter alia, em um ensaio de microdisposição usando CTOs imobilizados em um substrato sólido.

[00496] (j) De acordo com a presente invenção para a detecção de uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico alvo, isto é, o ensaio VD-PTOCE, a sonda (PTO-NV) mostra padrões de hibridização distintamente diferentes dependendo da presença da variação de nucleotídeo de interesse.

[00497] (k) Tais padrões de hibridização distintos na variação de nucleotídeo de interesse são responsáveis por diferenças em sítios de clivagem inicial do PTO-NV, desta maneira produzindo dois tipos de fragmentos PTO-NV para fornecer diferenciação de sinal dependendo da presença da variação de nucleotídeo de interesse.

[00498] A presente invenção será agora descrita em detalhes adicionais pelos exemplos. Seria óbvio àqueles versados na técnica que esses exemplos pretendem ser mais concretamente ilustrativos e o escopo da presente invenção conforme mostrado nas reivindicações apensas não é limitado a ou pelos exemplos.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: Avaliação de ensaio de Clivagem e Extensão de Oli- gonucleotídeo (PTOCE) de Sondagem e Marcação

[00499] Um novo ensaio, ensaio de Clivagem & Extensão de Oligo- nucleotídeo de Sondagem e Marcação (PTOCE), foi avaliado se um duplex estendido pode fornecer um sinal-alvo para a detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo.

[00500] Para esta avaliação, ensaio de PTOCE que detecta a presença de um duplex estendido através de análise de fusão foi realizado (ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão). Os presentes inventores utilizaram Taq DNA polimerase que possui uma atividade de nuclease 5’ para a extensão do iniciador a montante, a clivagem de PTO e a extensão de fragmento de PTO.

[00501] O duplex estendido formado durante o ensaio foi planejado para ter um marcador duplo interativo. A marcador duplo interativo no duplex estendido foi fornecida por (i) CTO marcado com uma molécula repórter e uma molécula de extinção (CTO com marcador duplo) ou (ii) PTO que possui uma molécula de extinção e CTO que possui uma molécula repórter (um PTO marcado com extintor e um CTO marcado com repórter). PTO e CTO são bloqueados com um espaçador de carbono em suas extremidades 3’. O oligonucleotídeo sintético para o gene de Neisseria gonorrhoeae (NG) foi utilizado como um modelo-alvo. 1-1. Ensaio de PTOCE utilizando um CTO com marcação dupla

[00502] O PTO não possui nenhum marcador. O CTO possui uma molécula de extinção (BHQ-1) e uma molécula repórter fluorescente (FAM) em sua porção de modelagem. As sequências de modelo sintético, iniciador a montante, PTO e CTO utilizados neste Exemplo são: NG-T 5’- AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTG- TTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA CCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1) NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-1 5’- ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 3) NG-CTO-1 5’-[BHQ- 1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGT CGT[espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 4) (As letras sublinhadas indicam a porção de marcação 5’ de PTO)

[00503] A reação foi realizada no volume final de 20 μL contendo 2 pmoles de modelo sintético (SEQ ID NO: 1) para o gene de NG, 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 5 pmoles de PTO (SEQ ID NO: 3), 2 pmoles de CTO (SEQ ID NO: 4) e 10 μl de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 1,6 unidade de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 30 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C. Após a reação, a curva de fusão foi obtida através do resfriamento da mistura de reação para 35°C, mantendo a 35°C durante 30 s e aquecimento lento a 35°C até 90°C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento da temperatura para monitorar a dissociação dos DNAs de fita du-pla. O pico de fusão era derivado dos dados da curva de fusão.

[00504] Como mostrado na Figura 14, um pico a 76,5°C que corresponde ao valor de Tm esperado do duplex estendido foi detectado na presença do modelo. Nenhum pico foi detectado na ausência do modelo. Uma vez que o híbrido de PTO não clivado e CTO não fornece qualquer sinal neste método de marcação, não havia pico que correspondesse ao híbrido de PTO não clivado e CTO. No caso de nenhum PTO ou nenhum CTO, não foi observado qualquer pico. 1-2. Ensaio de PTOCE utilizando um PTO marcado com extintor e um CTO marcado com repórter

[00505] O PTO é marcado com uma molécula de extinção (BHQ-1) em sua extremidade 5’. O CTO é marcado com uma molécula repórter fluorescente (FAM) em sua extremidade 3’.

[00506] As sequências de modelo sintético, iniciador a montante, PTO e CTO utilizados neste Exemplo são: NG-T 5’- AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTG- TTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA CCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1) NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-2 5’- [BHQ- 1]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaç ador C3]-3’ (SEQ ID NO: 5) NG-CTO-2 5’- CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCG- TCGT[FAM]-3’ (SEQ ID NO: 6) (As letras sublinhadas indicam a porção de marcação 5’ de PTO)

[00507] A reação foi realizada no volume final de 20 μL contendo 2 pmoles de modelo sintético (SEQ ID NO: 1) para o gene de NG, 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 5 pmoles de PTO (SEQ ID NO: 5), 2 pmoles de CTO (SEQ ID NO: 6) e 10 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 1,6 unidade de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 30 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C, 30 s a 72°C. Após a reação, a curva de fusão foi obtida através do resfriamento da mistura de reação a 35°C, mantendo a 35°C durante 30 s e aquecimento lento a 35°C até 90°C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento da temperatura para monitorar a dissociação dos DNAs de fita dupla. O pico de fusão era derivado dos dados da curva de fusão.

[00508] Como mostrado na Figura 15, um pico a 77,0°C que corresponde ao valor de Tm esperado do duplex estendido foi detectado na presença do modelo. Uma vez que o híbrido de PTO não clivado e CTO fornece um sinal que não é alvo neste método de marcação, havia um pico a 64,0°C ~64,5°C que corresponde ao valor de Tm esperado do híbrido de PTO não clivado e CTO. No caso de nenhum PTO ou nenhum CTO, não foi observado qualquer pico.

[00509] Estes resultados indicam que um duplex estendido dependente do alvo é produzido e o duplex estendido fornece o sinal-alvo indicando a presença da sequência de ácido nucleico-alvo.

EXEMPLO 2: Capacidade de ajuste do valor de Tm de um duplex estendido

[00510] Foi adicionalmente verificado se o valor de Tm de um duplex estendido pode ser ajustado pela sequência de CTO no ensaio de PTOCE.

[00511] Para a verificação, os presentes inventores utilizaram três tipos de CTOs que possuem sequências diferentes em sua porção de modelagem. O PTO não possui marcação. Os três tipos de CTOs possuem uma molécula de extinção (BHQ-1) e uma molécula repórter fluorescente (FAM) em suas porções de modelo. PTO e CTO são bloqueados com um espaçador de carbono em suas extremidades 3’.

[00512] O ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão foi realizado com cada um dos três tipos de CTOs.

[00513] As sequências de modelo sintético, iniciador a montante, PTOs e CTOs utilizados neste Exemplo são: NG-T 5’- AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTG- TTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA CCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1) NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-3 5’- ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaçador C3] -3’ (SEQ ID NO: 7) NG-CTO-1 5’-[BHQ- 1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGT CGT[espaçador C3] -3 (SEQ ID NO: 4) NG-CTO-3 5’-[BHQ- 1]TTTTTTTTTTCCTCCTCCAG[T(FAM)]AAAGCCAAGCCGTCGT[espa çador C3] -3’ (SEQ ID NO: 8) NG-CTO-4 5’-[BHQ- 1]TTTTTTTTTTTTTTTTTTAG[T(FAM)]AAAGCCAAGCCGTCGT[espaç ador C3] -3’ (SEQ ID NO: 9) (As letras sublinhadas indicam a porção de marcação 5’ de PTO)

[00514] A reação foi realizada no volume final de 20 μL contendo 2 pmoles de modelo sintético (SEQ ID NO: 1) para o gene de NG, 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 5 pmoles de PTO (SEQ ID NO: 7), 2 pmoles de CTO (SEQ ID NO: 4, 8 ou 9) e 10 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 1,6 unidade de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 30 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C. Após a reação, a curva de fusão foi obtida através do resfriamento da mistura de reação para 35°C, mantendo a 35°C durante 30 s e aquecimento lento a 35°C até 90°C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento da temperatura para monitorar a dissociação dos DNAs de fita dupla. O pico de fusão era derivado dos dados da curva de fusão.

[00515] Como mostrado na Figura 16, um pico foi detectado a 76,0°C, 69,0°C ou 64,5°C na presença do modelo. Cada pico corresponde à Tm esperado da duplex estendido gerado partindo do CTO verificado. Nenhum pico foi detectado na ausência do modelo.

[00516] Estes resultados indicam que o valor de Tm do duplex estendido pode ser ajustado pela sequência de CTO.

EXEMPLO 3: Detecção de uma sequência de ácido nucleico-alvo utilizando o ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real ou a análise de fusão

[00517] Foi adicionalmente verificado se o ensaio de PTOCE pode detectar uma sequência de ácido nucleico-alvo da maneira de PCR em tempo real (i) ou da maneira da análise de fusão pós-PCR (ii): (i) A clivagem de PTO e a extensão de fragmento de PTO foram acompanhadas com a amplificação de um ácido nucleico-alvo através do processo de PCR e a presença do duplex estendido foi detectada em uma temperatura predeterminada em cada ciclo (ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real em uma temperatura predeterminada) ou; (ii) A clivagem de PTO e a extensão de fragmento de PTO foram acompanhadas com a amplificação de um ácido nucleico-alvo através do processo de PCR e a presença do duplex estendido foi detectada através da análise de fusão pós-PCR (ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão).

[00518] O iniciador a montante está envolvido na clivagem de PTO por uma enzima que possui a atividade de nuclease 5’ e também envolvida na amplificação da sequência de ácido-alvo com iniciador a jusante através do processo de PCR. A Taq DNA polimerase que possui a atividade de nuclease 5’ foi utilizada para a extensão do iniciador a montante e do iniciador a jusante, a clivagem de PTO e a extensão do fragmento de PTO.

[00519] O duplex estendido foi planejado para ter um marcador duplo interativo. O marcador duplo interativo no duplex estendido foi fornecida por (i) CTO marcado com uma molécula repórter e uma molécula de extinção, (ii) um extintor-iso-dGTP incorporado durante a reação de extensão e CTO que possui uma molécula repórter e um resíduo de iso-dC ou (iii) PTO que possui uma molécula de extinção e CTO que possui uma molécula repórter. PTO e CTO são bloqueados com um espaçador de carbono em suas extremidades 3’.

[00520] O DNA genômico de Neisseria gonorrhoeae (NG) foi utilizado como um ácido nucleico-alvo. 3-1. Ensaio de PTOCE utilizando um CTO com marcador duplo

[00521] O PTO não possui nenhum marcador e o CTO é marcado com uma molécula de extinção (BHQ-1) e uma molécula repórter fluorescente (FAM) em sua porção de modelagem.

[00522] As sequências de iniciador a montante, iniciador a jusante, PTO e CTO utilizados neste Exemplo são: NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’ (SEQ ID NO: 10) NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-3 5’- ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaçador C3] -3’ (SEQ ID NO: 7) NG-CTO-1 5’-[BHQ- 1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGT CGT[espaçador C3] -3’ (SEQ ID NO: 4) (As letras sublinhadas indicam a porção de marcação 5’ de PTO) 3-1-1. Ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real a uma temperatura predeterminada

[00523] A reação foi realizada no volume final de 20 μL contendo 100 pg de DNA genômico de NG, 10 pmoles de iniciador a jusante (SEQ ID NO: 10), 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 5 pmoles de PTO (SEQ ID NO: 7), 2 pmoles de CTO (SEQ ID NO: 4) e 10 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 1,6 unidade de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 60 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C, 30 s a 72°C. A detecção do sinal foi realizada a 60°C de cada ciclo. A temperatura de detecção foi determinada até o ponto que o duplex estendido mantém uma forma de fita dupla.

[00524] Como mostrado na Figura 17A, o sinal-alvo (Ct 31.36) foi detectado na presença do modelo. Nenhum sinal foi detectado na ausência do modelo. 3-1-2. Ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão

[00525] Após a reação no Exemplo 3-1-1, a curva de fusão foi obtida através do resfriamento da mistura de reação para 35°C, mantendo a 35°C durante 30 s e aquecimento lento a 35°C até 90°C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento da temperatura para monitorar a dissociação dos DNAs de fita dupla. O pico de fusão era derivado dos dados da curva de fusão.

[00526] Como mostrado na Figura 17B, um pico a 76,0°C que corresponde ao valor de Tm esperado do duplex estendido foi detectado na presença do modelo. Nenhum pico foi detectado na ausência do modelo. Uma vez que o híbrido de PTO e CTO não clivado não fornece qualquer sinal neste método de marcação, não havia pico que correspondesse ao híbrido de PTO e CTO não clivado. 3-2. Ensaio de PTOCE utilizando um extintor-iso-dGTPe um CTO mar- cado com repórter que possui um resíduo de iso-dC

[00527] O PTO não possui marcador. O CTO possui uma molécula repórter (FAM) e um resíduo iso-dC em sua extremidade 5’. Durante a reação de extensão de fragmento de PTO, um iso-dGTP marcado com uma molécula de extinção (dabcyl) é incorporado na posição complementar ao resíduo iso-dC.

[00528] As sequências de iniciador a montante, iniciador a jusante, PTO e CTO utilizados neste Exemplo são: NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’ (SEQ ID NO: 10) NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-1 5’- ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaçador C3] -3’ (SEQ ID NO: 3) NG-CTO-5 5’-[FAM][Iso- dC]CTCCTCCAGTAAAGCCAAGCCGTCGT[espaçador C3] -3’ (SEQ ID NO: 11) (As letras sublinhadas indicam a porção de marcação 5’ de PTO) 3-2-1. Ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real em uma temperatura predeterminada

[00529] A reação foi realizada no volume final de 20 μL contendo 100 pg de DNA genômico de NG, 10 pmoles de iniciador a jusante (SEQ ID NO: 10), 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 5 pmoles de PTO (SEQ ID NO: 3), 2 pmoles de CTO (SEQ ID NO: 11) e 10 μL de 2X Plexor® Master Mix (Cat. No. A4100, Promega, USA); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 60 ciclos de 30 s a 95 °C 60 s a 60 °C, 30 s a 72 °C e 5 ciclos de 30 s a 72 °C, 30 s a 55 °C. A detecção do sinal foi realizada a 60 °C de cada ciclo. A temperatura de detecção foi determinada até o ponto que o duplex estendido mantém a forma de fita dupla.

[00530] A polimerase de DNA que possui nuclease 5’ na Plexor® Master Mix foi utilizada para a extensão do iniciador a montante e do iniciador a jusante, a clivagem de PTO e a extensão do fragmento de PTO.

[00531] Como mostrado na Figura 18A, o sinal-alvo (Ct 33.03) foi detectado na presença do modelo. Nenhum sinal foi detectado na ausência do modelo. 3-2-2. Ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão

[00532] Após a reação no Exemplo 3-2-1, a curva de fusão foi obtida através do resfriamento da mistura de reação para 35°C, mantendo a 35°C durante 30 s e aquecimento lento a 35°C até 90°C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento da temperatura para monitorar a dissociação dos DNAs de fita dupla. O pico de fusão foi derivado dos dados da curva de fusão.

[00533] Como mostrado na Figura 18B, um pico a 70,0°C que corresponde ao valor de Tm esperado do duplex estendido foi detectado na presença do modelo. Nenhum pico foi detectado na ausência do modelo. Uma vez que o híbrido de PTO e CTO não clivado não fornece qualquer sinal neste método de marcação, não havia pico que correspondesse ao híbrido de PTO não clivado e CTO. 3-3. Ensaio de PTOCE utilizando um PTO marcado com extintor e um CTO marcado com repórter

[00534] O PTO é marcado com uma molécula de extinção (BHQ-1) em sua extremidade 5’. O CTO é marcado com uma molécula repórter fluorescente (FAM) em sua extremidade 3’.

[00535] As sequências de iniciador a montante, iniciador a jusante, PTO e CTO utilizados neste Exemplo são: NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’ (SEQ ID NO: 10) NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-4 5’-[BHQ- 1]ACGACGGCTTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 12) NG-CTO-2 5’- CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAA- GCCGTCGT[FAM]-3’ (SEQ ID NO: 6) (As letras sublinhadas indicam a porção de marcação 5’ de PTO) 3-3-1. Ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real em uma temperatura predeterminada

[00536] A reação foi realizada no volume final de 20 μL contendo 100 pg de NG DNA genômico, 10 pmoles de iniciador a jusante (SEQ ID NO: 10), 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 5 pmo- les de PTO (SEQ ID NO: 12), 2 pmoles de CTO (SEQ ID NO: 6) e 10 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 1,6 unidade de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 60 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C, 30 s a 72°C. A detecção do sinal foi realizada a 60°C de cada ciclo. A temperatura de detecção foi determinada até o ponto que o duplex estendido mantém a forma de fita dupla e a temperatura é maior que o valor de Tm de um híbrido entre PTO não clivado e CTO.

[00537] Como mostrado na Figura 19A, o sinal-alvo (Ct 29.79) foi detectado na presença do modelo. Nenhum sinal foi detectado na ausência do modelo. 3-3-2. Ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão

[00538] Após a reação no Exemplo 3-3-1, a curva de fusão foi obtida através do resfriamento da mistura de reação para 35°C, mantendo a 35°C durante 30 s e aquecimento lento a 35°C até 90°C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento da temperatura para monitorar a dissociação dos DNAs de fita dupla. O pico de fusão foi derivado dos dados da curva de fusão.

[00539] Como mostrado na Figura 19B, um pico a 76,5°C que corresponde ao valor de Tm esperado do duplex estendido foi detectado na presença do modelo. Uma vez que o híbrido de PTO não clivado e CTO fornece um sinal que não é alvo neste método de marcação, o pico que corresponde ao valor de Tm do híbrido de PTO e CTO não clivado foi detectado a 48,0°C na ausência do modelo.

[00540] Estes resultados indicam que uma sequência de ácido nu- cleico-alvo pode ser detectada através do ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real ou a análise de fusão.

EXEMPLO 4: Detecção de várias sequência de ácidos nucleico- alvo através do ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão

[00541] Também foi verificado se o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão pode detectar várias sequência de ácidos nu- cleico-alvo utilizando o mesmo tipo de uma molécula repórter.

[00542] A clivagem de PTOs e a extensão de fragmentos de PTO foram acompanhadas com a amplificação de sequência de ácidos nu- cleico-alvo através do processo de PCR e a presença de os dúplices estendidos foi detectada através da análise de fusão pós-PCR (ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão).

[00543] Os dúplices estendidos formados durante o ensaio foram planejados para ter um marcador duplo interativo. A marcador duplo interativo no duplex estendido foi fornecida por CTO marcado com uma molécula repórter e uma molécula de extinção em sua porção de modelagem. Os CTOs possuem o mesmo tipo de uma molécula repórter fluorescente (FAM), mas possuem sequências diferentes para gerar os valores de Tm diferentes dos dúplices estendidos. PTO e CTO são bloqueados com um espaçador de carbono em suas extremidades 3’.

[00544] Os DNA genômicos de Neisseria gonorrhoeae (NG) e Sta-phylococcus aureus (SA) foram utilizados como ácidos nucleicos- alvos.

[00545] As sequências de iniciador a montante, iniciador a jusante, PTOs e CTOs utilizados neste Exemplo são: NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’ (SEQ ID NO: 10) NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-3 5’- ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[espaçador C3] -3’ (SEQ ID NO: 7) NG-CTO-1 5’-[BHQ- 1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGT CGT[espaçador C3] -3’ (SEQ ID NO: 4) SA-F 5’-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAATC-3’ (SEQ ID NO: 13) SA-R 5’-GATAAGTTTAAAGCTTGACCGTCTG-3’ (SEQ ID NO: 14) SA-PTO-1 5’- AATCCGACCACGCATTCCGTGGTCAATCATTCGGTT- TACG[espaçador C3] -3’ (SEQ ID NO: 15) SA-CTO-1 5’-[BHQ- 1]TTTTTTTTTTTTTTTTTGCA[T(FAM)]AGCGTGGTCGGATT[espaçad or C3] -3’ (SEQ ID NO: 16) (As letras sublinhadas indicam a porção de marcação 5’ de PTO)

[00546] A reação foi realizada no volume final de 20 μL contendo 100 pg de DNA genômico de NG, 100 pg de DNA genômico de SA, 10 pmoles de cada iniciador a jusante (SEQ ID NOs: 10 e 13), 10 pmoles de cada iniciador a montante (SEQ ID NOs: 2 e 14), 5 pmoles de cada PTO (SEQ ID NOs: 7 e 15), 2 pmoles de cada CTO (SEQ ID NOs: 4 e 16) e 10 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 1,6 unidade de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 60 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C, 30 s a 72°C. Após a reação, a curva de fusão foi obtida através do resfriamento da mistura de reação para 35°C, mantendo a 35°C durante 30 s e aquecimento lento a 35°C até 90°C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento da temperatura para monitorar a dissociação dos DNAs de fita dupla. O pico de fusão foi derivado dos dados da curva de fusão.

[00547] Como mostrado na Figura 20, vários sinais-alvo (Tm de NG: 75,5°C e Tm de SA: 63,5°C) foram detectados na presença dos moldes. Nenhum sinal foi detectado na ausência dos moldes.

[00548] Estes resultados indicam que o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão permite detectar vários ácidos nuclei- cos-alvos através da utilização do mesmo tipo de uma molécula repórter (por exemplo, FAM) na condição que os dúplices estendidos que correspondem aos ácidos nucleicos-alvos possuem valores de Tm diferentes. EXEMPLO 5: Avaliação do ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão na microdisposição

[00549] Foi adicionalmente verificado o ensaio de PTOCE que compreende a análise de fusão em microdisposição. A clivagem de PTO foi realizada em um recipiente separado e uma alíquota do resultado foi colocada dentro de uma microdisposição em que o CTO foi imobilizado. Após a reação de extensão, a presença do duplex estendido foi detectada através da análise de fusão.

[00550] A Taq DNA polimerase que possui atividade de nuclease 5’ foi utilizada para a extensão do iniciador a montante, a clivagem de PTO e a extensão do fragmento de PTO. O duplex estendido formado durante o ensaio foi planejado para possuir um marcador único. O marcador único no duplex estendido foi fornecido por PTO marcado com Quasar570 como uma molécula repórter fluorescente em sua extremidade 5’. PTO e CTO são bloqueados com um espaçador de carbono em suas extremidades 3’. O CTO possui poli(T)5 como um braço ligante e foi imobilizado sobre a superfície de uma lâmina de vidro através da utilização de um grupo amino (AminnoC7) em sua extremidade 5’. Uma sonda marcadora que possui uma molécula repórter fluorescente (Quasar570) em sua extremidade 5’ foi imobilizada sobre a superfície da lâmina de vidro através da utilização de um grupo amino em sua extremidade 3’.

[00551] As sequências de modelo sintético, iniciador a montante, PTO, CTO e marcador utilizados neste Exemplo são: NG-T 5’- AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTG- TTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA CCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1) NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-5 5’- [Qua- sar570]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[ espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 17)

[00552] NG-CTO-S1 5’- [Ami- noC7]TTTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCC GTCGT[espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 18) Marcador 5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 19) (As letras sublinhadas indicam a porção de marcação 5’ de PTO)

[00553] Lâminas NHS NSB9 (NSBPOSTECH, Coreia) foram utiliza- das para a fabricação do CTO e do marcador (SEQ ID NOs: 18 e 19). O CTO e o marcador dissolvidos em tampão de formação de pontos de NSB na concentração final de 10 μM foram impressos sobre as lâminas NHS NSB9 com PersonalArrayer® 16 Microarray Spotter (CapitalBio, China). O CTO e o marcador foram aplicados em pontos lado a lado em um formato 2x1 (pontos em duplicata) e a microdisposição resultante foi incubada em uma câmara mantida a ~85% de umidade durante a noite. As lâminas foram então lavadas em uma solução tampão contendo 2xSSPE (0,3 M de cloreto de sódio, 0,02 M de hidroge- no fosfato de sódio e 2,0 mM de EDTA), pH 7,4 e 7,0 mM de SDS a 37°C durante 30 min para remover o CTO e o marcador não ligados especificamente e lavadas com água destilada. Então, as lâminas fun- cionalizadas com DNA foram secas utilizando uma centrífuga de lâmina e armazenadas na escuridão a 4°C até o uso.

[00554] A reação de clivagem foi realizada no volume final de 50 μL contendo 2 pmoles de modelo sintético (SEQ ID NO: 1) para o gene de NG, 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 1 pmol de PTO (SEQ ID NO: 17) e 25 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 4 unidades de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 30 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 63°C.

[00555] Os 30 μL da mistura resultante foram aplicados a uma câmara montada sobre a superfície de lâmina de vidro NSB sobre a qual o CTO (SEQ ID NO: 18) foi reticulado. A lâmina foi colocada sobre bloco in situ em um termociclador (GenePro B4I, China). Seis lâminas iguais foram preparadas para a análise de fusão. A reação de extensão foi permitida por 20 min a 55°C. Então, as lâminas resultantes foram incubadas durante 1 min à temperatura ambiente. Finalmente ca- da lâmina foi lavada em água destilada durante 1 min a 44°C, 52°C, 60°C, 68°C, 76°C ou 84°C. A aquisição de imagem foi realizada através do uso de Confocal Laser Scanner, Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) com varredura em uma resolução de pixel de 5 μm. A intensidade de fluorescência foi analisada através do uso do software de análise quantitativa de microdisposições, software GenePix pro6.0 (Molecular Device, US). A intensidade de fluorescência foi expressa na forma de medianas de pontos após subtrações de base locais. Cada ponto foi duplicado para o teste de reprodutibilidade. A intensidade de fluorescência indica o valor médio dos pontos duplicados.

[00556] Como mostrado nas Figuras 21A e 21B, a curva de fusão foi obtida através da medida da intensidade fluorescente dos pontos preparados através de temperaturas de lavagem diferentes. A presença do duplex estendido foi determinada partindo dos dados da curva de fusão.

EXEMPLO 6: Avaliação do ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real em microdisposição

[00557] Foi adicionalmente verificado o ensaio de PTOCE que compreende a detecção em tempo real a uma temperatura predeterminada em microdisposição.

[00558] A clivagem de PTO e a extensão de fragmento de PTO foram repetidas em uma microdisposição em que o CTO foi imobilizado. A presença do duplex estendido foi detectada a uma temperatura pre-determinada em vários ciclos determinados.

[00559] A Taq DNA polimerase que possui atividade de nuclease 5’ foi utilizada para a extensão do iniciador a montante, a clivagem de PTO e a extensão do fragmento de PTO.

[00560] O duplex estendido formado durante o ensaio foi planejado para possuir um marcador único ou um marcador duplo interativo. O marcador único no duplex estendido foi fornecido pelo PTO marcado com uma molécula repórter (PTO marcado com repórter). O marcador duplo interativo no duplex estendido foi fornecida por CTO marcado com uma molécula repórter e uma molécula de extinção (CTO com marcador duplo). PTO e CTO são bloqueados com um espaçador de carbono em suas extremidades 3’.

[00561] O CTO possui poli(T) como um braço ligante. O CTO foi imobilizado em uma lâmina de vidro através da utilização de um grupo amino (AminnoC7) em sua extremidade 5’ ou sua extremidade 3’. Uma sonda marcadora que possui uma molécula repórter fluorescente (Quasar570) em sua extremidade 5’ foi imobilizada sobre a lâmina de vidro através da utilização de um grupo amino em sua extremidade 3’. Uma intensidade fluorescente sobre a lâmina de vidro foi medida em uma temperatura predeterminada. A temperatura de detecção foi determinada até o ponto que o duplex estendido mantém a forma de fita dupla. O oligonucleotídeo sintético para Neisseria gonorrhoeae (NG) foi utilizado como modelo. 6-1. Ensaio de PTOCE utilizando um PTO marcado com repórter

[00562] O PTO possui Quasar570 como uma molécula repórter fluorescente em sua extremidade 5’. O CTO foi imobilizado através de sua extremidade 5’. Neste método de marcação, a temperatura de detecção foi determinada até o ponto que o duplex estendido mantém uma forma de fita dupla e a temperatura é maior que o valor de Tm de um híbrido entre PTO não clivado e CTO.

[00563] As sequências de modelo sintético, iniciador a montante, PTO, CTO e marcador utilizados neste Exemplo são: NG-T 5’- AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTG- TTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA CCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1) NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-5 5’- [Qua- sar570]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[ espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 17) NG-CTO-S1 5’- [Ami- noC7]TTTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCC GTCGT[espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 18) Marcador 5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 19) (As letras sublinhadas indicam a porção de marcação 5’ de PTO)

[00564] A preparação de lâminas foi realizada com o mesmo protocolo utilizado no Exemplo 5.

[00565] A reação de PTOCE foi realizada no volume final de 30 μL contendo 2 pmoles de modelo sintético (SEQ ID NO: 1) para o gene de NG, 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 1 pmol de PTO (SEQ ID NO: 17) e 15 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 2,4 unidades de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coreia); a mistura toda foi aplicada em uma câmara montada sobre a superfície de lâmina de vidro NSB sobre a qual o CTO (SEQ ID NO: 18) foi reticulado. A lâmina foi colocada sobre um bloco in situ em um termociclador (GenePro B4I, China). Cinco lâminas do mesmo tipo foram preparadas para a análise de ciclização. A reação de PTO- CE foi realizada como a seguir: 15 min de desnaturação a 95°C e 0, 5, 10, 20 ou 30 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C, 60 s a 55°C. Após a reação do número de ciclos correspondentes, as lâminas foram lavadas em água destilada a 64°C durante 1 min. A aquisição de imagem foi realizada após cada lavagem através do uso de Confocal Laser Scanner, Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) com varredura em resolução de pixel de 5 μm. A intensidade de fluorescência foi ana- lisada através do uso do software de análise quantitativa de microdis- posição, software GenePix pro6.0 (Molecular Device, US). A intensidade de fluorescência foi expressa na forma de medianas de pontos após subtrações de base locais. Cada ponto foi duplicado para o teste de reprodutibilidade. A intensidade de fluorescência indica o valor médio dos pontos duplicados.

[00566] Como mostrado nas Figuras 22A e 22B, a intensidade fluorescente para a sequência de ácido nucleico-alvo foi aumentada dependendo dos números de ciclos (0 ciclo_UFR: 1.304±0,7; 5 ci- clos_UFR: 18.939±1.342,1; 10 ciclos_UFR: 30.619±285,0; 20 ci- clos_UFR: 56.248±2.208,3; e 30 ciclos_UFR: 64.645±1.110,2) na presença do modelo. Não havia alteração da intensidade fluorescente dependendo dos números de ciclos na ausência do modelo. 6-2. Ensaio de PTOCE utilizando um CTO com marcação dupla

[00567] O CTO foi imobilizado através de sua extremidade 3’ e possui uma molécula de extinção (BHQ-2) e uma molécula repórter fluorescente (Quasar570) em sua porção de modelagem.

[00568] As sequências de modelo sintético, iniciador a montante, PTO, CTO e marcador utilizados neste Exemplo são: NG-T 5’- AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTG- TTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA CCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1) NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-6 5’- ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTG- TTTCG[espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 20) NG-CTO-S2 5’- [BHQ- 2]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(Quasar570)]CCAGTAAAGCCAAG CCGTCGTTTTTTT TTTT[AminoC7]-3’ (SEQ ID NO: 21) Marcador 5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 19) (As letras sublinhadas indicam a porção de marcação 5’ de PTO)

[00569] A preparação de lâminas foi realizada com o mesmo protocolo utilizado no Exemplo 5.

[00570] A reação de PTOCE foi realizada no volume final de 30 μL contendo 2 pmoles de modelo sintético (SEQ ID NO: 1) para o gene de NG, 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NO: 2), 1 pmol de PTO (SEQ ID NO: 20) e 15 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 2,4 unidades de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); a mistura toda foi aplicada a uma câmara montada sobre a superfície de lâmina de vidro NSB sobre a qual o CTO foi reticulado (SEQ ID NO: 21). A lâmina foi colocada sobre um bloco in situ em um termociclador (GenePro B4I, China). Cinco lâminas do mesmo tipo foram preparadas para a análise de ciclos. A reação de PTOCE foi realizada como a seguir: 15 min de desnaturação a 95°C e 0, 5, 10, 20 ou 30 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 60°C, 60 s a 50°C. Após a reação do número de ciclos correspondentes, a aquisição de imagem foi realizada através do uso de Confocal Laser Scanner, Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) com varredura a uma resolução de pixel de 5 μm. A intensidade de fluorescência foi analisada através do uso do software de análise quantitativa de microdisposições, software Ge- nePix pro6.0 (Molecular Device, US). A intensidade de fluorescência foi expressa na forma de medianas de pontos após subtrações de bases locais. Cada ponto foi duplicado para o teste de reprodutibilidade. A intensidade de fluorescência indica o valor médio dos pontos duplicados.

[00571] Como mostrado nas Figuras 23A e 23B, a intensidade fluorescente para a sequência de ácido nucleico-alvo foi aumentada dependendo dos números de ciclos (0 ciclo_UFR: 28.078±460,3; 5 ci- clos_UFR: 35.967±555,1; 10 ciclos_UFR: 44.674±186,0; 20 ci- clos_UFR: 65.423±2,1; e 30 ciclos_UFR: 65.426±2,8) na presença de modelo. Não havia alteração da intensidade fluorescente dependendo dos números de ciclos na ausência do modelo. EXEMPLO 7: Detecção de várias sequência de ácidos nucleico- alvo através do ensaio de PTOCE que compreende a detecção em ponto final em uma temperatura predeterminada na microdisposi- ção

[00572] Foi adicionalmente verificada a detecção de vários-alvos através do ensaio de PTOCE que compreende a detecção em ponto final em uma temperatura predeterminada na microdisposição.

[00573] A clivagem de PTO foi realizada em um recipiente separado com processo de PCR e uma alíquota do resultado foi colocada dentro de uma micro posição em que o CTO foi imobilizado. Após a reação de extensão, a presença do duplex estendido foi detectada através da detecção em ponto final em uma temperatura predeterminada.

[00574] A Taq DNA polimerase que possui atividade de nuclease 5’ foi utilizada para a extensão do iniciador a montante e iniciador a jusante, a clivagem de PTO e a extensão de fragmento de PTO.

[00575] O duplex estendido formado durante o ensaio foi planejado para possuir um marcador único. O marcador único no duplex estendido foi fornecido por PTO marcado com Quasar570 como uma molécula repórter fluorescente na extremidade 5’ do PTO. PTO e CTO são bloqueados com um espaçador de carbono em suas extremidades 3’.

[00576] O CTO possui poli(T)5 como um braço ligante e foi imobilizado sobre uma lâmina de vidro através da utilização de um grupo amino (AminnoC7) em sua extremidade 5’. Uma sonda marcadora que possui uma molécula repórter fluorescente (Quasar570) em sua extremidade 5’ foi imobilizada sobre a lâmina de vidro através da utilização de um grupo amino em sua extremidade 3’.

[00577] Uma intensidade fluorescente sobre a lâmina de vidro foi medida a uma temperatura predeterminada. A temperatura de detecção foi determinada até o ponto que o duplex estendido mantém a forma de fita dupla e a temperatura é maior que o valor de Tm de um híbrido entre PTO e CTO não clivado. Os DNA genômicos de Staphylococcus aureus (SA) e Neisseria gonorrhoeae (NG) foram utilizados.

[00578] As sequências de iniciador a montante, iniciador a jusante, PTO, CTO e marcador utilizados neste Exemplo são: NG-F 5’- TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’ (SEQ ID NO: 10) NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’ (SEQ ID NO: 2) NG-PTO-5 5’- [Qua- sar570]ACGACGGCTTGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[ espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 17)

[00579] NG-CTO-S1 5’- [Ami- noC7]TTTTTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCAGTAAAGCCAAGCC GTCGT[espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 18) SA-F 5’-TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAATC-3’ (SEQ ID NO: 13) SA-R2 5’-TTAGCTCCTGCTCCTAAACCA-3’ (SEQ ID NO: 22) SA-PTO-2 5’-[Quasar570] AATCCGACCACGCTATGCTCATTCCG- TGGTCAATCATTCGGTTTACG[espaçador C3]- 3’ (SEQ ID NO: 23) SA_CTO-S1 5’- [Ami- noC7]TTTTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCCCCCAGCATAGCG TGGTCGGATT [espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 24) Marcador 5’-[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]-3' (SEQ ID NO: 19) (As letras sublinhadas indicam a porção de marcação 5’ de PTO)

[00580] A preparação de lâminas foi realizada com o mesmo protocolo utilizado no Exemplo 5.

[00581] A reação de clivagem foi realizada no volume final de 50 μL contendo cada 100 pg DNA genômico de SA e/ou NG, cada 10 pmoles de iniciador a jusante (SEQ ID NOs: 10 e/ou 13), cada 10 pmoles de iniciador a montante (SEQ ID NOs: 2 e/ou 22), cada 1 pmol de PTO (SEQ ID NOs: 17 e/ou 23) e 25 μL de 2X Master Mix contendo 2,5 mM de MgCl2, 200 μM de dNTPs e 4 unidades de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coréia); o tubo contendo a mistura de reação foi colocado no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada durante 15 min a 95°C e submetida a 60 ciclos de 30 s a 95°C, 60 s a 63°C. Os 30 μL da mistura resultante foram aplicados a uma câmara montada sobre a superfície de lâmina de vidro NSB sobre a qual os CTOs (SEQ ID NOs: 18 e 24) foram reticulados. A lâmina foi colocada sobre um bloco in situ em um termociclador (GenePro B4I, China). A reação de extensão foi permitida por 20 min a 55°C. Então as lâminas foram lavadas em água destilada a 64°C durante 1 min. A aquisição de imagem foi realizada após cada lavagem através do uso de Confocal Laser Scanner, Axon GenePix4100A (Molecular Device, US) com varredura a uma resolução de pixel de 10 μm. A intensidade de fluorescência foi analisada através do uso do software de análise quantitativa de microdisposições, software GenePix pro6.0 (Molecular Device, US). A intensidade de fluorescência foi expressa na forma de medianas de pontos após subtrações de bases locais. Cada ponto foi duplicado para o teste de reprodutibilidade. A intensidade de fluores-cência indica o valor médio dos pontos duplicados.

[00582] Como mostrado na Figura 24, o sinal-alvo para SA (UFR: 65.192±198,7) foi detectado na presença de modelo de SA. O sinal- alvo para NG (UFR: 65.332±1,4) foi detectado na presença de modelo de NG. Ambos os sinais-alvo para SA (UFR: 65.302±0,7) e NG (UFR 65.302±0,7) foram detectados na presença de ambos os modelos. EXEMPLO 8: Detecção de uma variação de nucleotídeo única de uma sequência de ácido nucleico alvo usando ensaio de Clivagem & Extensão de Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação (PTOCE)

[00583] A requerente examinou se o ensaio de PTOCE com ensaio de PTO-NV (PTO para Variação de Nucleotídeo) pode discriminar uma variação de nucleotídeo única de uma sequência de ácido nucleico alvo.

[00584] Clivagem de PTO-NV e extensão de fragmento de PTO-NV foram acompanhadas com a amplificação do ácido nucleico alvo através de processo de PCR e a presença do duplex estendido foi detectada pós-análise de fusão por PCR (Análise de fusão). O iniciador a montante está envolvido na clivagem de PTO-NV por uma enzima tendo uma atividade de nuclease 5’ e também envolvida em amplificação da sequência de ácido alvo com iniciador a jusante através do processo de PCR. A Taq DNA polimerase tendo uma atividade de nuclease 5’ foi usada para a extensão de iniciador a montante e iniciador a jusante, a clivagem de PTO-NV e a extensão de fragmento de PTO-NV.

[00585] PTO-NV e CTO são bloqueados com um espaçador de carbono em suas extremidades 3’. DNAs genômicos humano do tipo selvagem (V600E) (T) e tipo mutante (A) BRAF foram uados como modelos.

[00586] PTO-NV não tem nenhum marcador e o sítio de discriminação de variação de nucleotídeo única na parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ tem um nucleotídeo complementar ao modelo tipo mutante (A). Quatro tipos diferentes de PTO-NVs foram examinados com variação de localização do sítio de discriminação de variação de nucleotídeo única na parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’. Os sítios de discriminação de variação de nucleotí- deo única estão localizados no primeiro nucleotídeo (SEQ ID NO:27), no segundo nucleotídeo (SEQ ID NO:28), no terceiro nucleotídeo (SEQ ID NO:29) e no quarto nucleotídeo (SEQ ID NO:30) a partir da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’, respectivamente.

[00587] CTO é marcado com uma molécula de extinção (BHQ-2) e uma molécula repórter fluorescente (CAL Fluor Red 610) em sua porção de modelagem. A combinação do PTO-NV e CTO é como segue: (i) PTO-NV de SEQ ID NO: 27 e CTO de SEQ ID NO: 31, (ii) PTO-NV de SEQ ID NO: 28 e CTO de SEQ ID NO: 32, (iii) PTO-NV de SEQ ID NO: 29 e CTO de SEQ ID NO: 31, (iv) PTO-NV de SEQ ID NO: 30 e CTO de SEQ ID NO: 33.

[00588] As sequências de iniciador a montante, iniciador a jusante, PTO-NVs e CTOs usados neste Exemplo são: BRAF-F 5’-CTTCATAATGCTTGCTCTGATAGGIIIIIGAGATCTACT-3’ (SEQ ID NO: 25) BRAF-R 5’-ATAGCCTCAATTCTTACCATCCAIIIIITGGATCCAGA-3’ (SEQ ID NO: 26) BRAF-PTO-NV-1 5’- CACAAGGGTGGGTAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAT- CAG[espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 27) BRAF-PTO-NV-2 5’- CACAAGGGTGGGTGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAT- CAG[espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 28) BRAF-PTO-NV-3 5’- CACAAGGGTGGGTAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAT- CAG[espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 29) BRAF-PTO-NV-4 5’- CACAAGGGTGGGTCAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAT- CAG[espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 30) BRAF-CTO-1 5’-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[T(CAL Fluor Red610)]CTCCGAGTTACCCACCCTTGTG [espaçador C3] -3’ (SEQ ID NO: 31) BRAF-CTO-2 5’-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[T(CAL Fluor Red610)]GCTGAGTACACCCACCCTTGTG [espaçador C3] -3’ (SEQ ID NO: 32) BRAF-CTO-3 5’-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[T(CAL Fluor Red610)]CGAGTAGAGACCCACCCTTGTG [espaçador C3] -3’ (SEQ ID NO: 33) (I: Desoxiinosina) (As letras sublinhadas indicam a porção de marcação 5’ de PTO-NV) (A letra em negrito indica o sítio de discriminação de variação de nuce- lotídeo)

[00589] A reação foi conduzida no volume final de 20 μl contendo 10 ng de DNA genômico humano do tipo selvagem (T) (V600E) ou mutante (A) BRAF, 10 pmol de iniciador a montante (SEQ ID NO:25), 10 pmol de iniciador a jusante (SEQ ID NO:26), 5 pmol de PTO-NV (SEQ ID NOs:27, 28, 29 ou 30) e 1 pmol de CTO correspondente (SEQ ID NOs: 31, 32, 31 ou 33) e 10 μl de Master Mix 2X contendo MgCl2 2,5 mM, 200 μM de dNTPs e 1,6 unidade de H-Taq DNA polimerase (Sol- gent, Coreia); o tubo contendo a mistura de reação foi posto no termo- ciclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada por 15 min a 95° C e submetida a 50 ciclos de 30 seg a 95° C, 60 seg a 55° C, 30 seg a 72° C. Depois da reação, a curva de fusão foi obtida esfriando a mistura de reação para 55° C, mantendo em 55° C por 30 seg e aquecendo lentamente para 55° C até 85° C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento da temperatura para monitorar a dissociação de DNAs de fita dupla. O pico de fusão foi derivado dos dados da curva de fusão.

[00590] Conforme mostrado nas Figuras 33A e B, os picos correspondendo ao valor da Tm esperado dos dúplices estendidos foram de- tectados para todos os PTO-NVs (SEQ ID NOs: 27, 28, 29 e 30) na presença do modelo do tipo mutante (A).

[00591] Quaisquer picos foram detectados para os PTO-NVs de SEQ ID NOs: 27, 28 e 29 na presença de modelo do tipo selvagem (T). Embora PTO-NV de SEQ ID NO:30 tenha provido um pico tendo uma altura baixa, ele pôde ser discriminado do pico obtido na presença do modelo do tipo selvagem (T). Nenhum pico foi detectado na ausência dos modelos.

[00592] Este resultado mostra que o ensaio de PTOCE usando PTO-NV (isto é, ensaio VD-PTOCE) é capaz de discriminar uma variação de nucleotídeo única.

EXEMPLO 9: Detecção de uma variação de nucleotídeo única de uma sequência de ácido nucleico alvo através do ensaio de PTO- CE usando PTO-NV tendo porção de não pareamento de base

[00593] A requerente ainda examinou se o uso de uma porção de não pareamento de base em PTO-NV melhora o ensaio de VD- PTOCE.

[00594] Taq DNA polimerase tendo uma atividade de nuclease 5’ foi usada para a extensão de iniciador a montante e iniciador a jusante, a clivagem de PTO-NV e a extensão de fragmento de PTO-NV.

[00595] O duplex estendido foi projetado para ter um marcador duplo interativo. O marcador duplo interativo no duplex estendido foi provido através de CTO marcado com uma molécula repórter e uma molécula de extinção. PTO-NV e CTO são bloqueados com um espaça- dor de carbono em suas extremidades 3’.

[00596] DNA genômico humano do tipo selvagem (T) (V5600E) e tipo mutante (A) BRAF foram usados como modelos.

[00597] PTO-NV não tem nenhum marcador e o sítio de discriminação de variação de nucelotídeo única na parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ tem um nucleotídeo complementar ao modelo do tipo mutante (A). O sítio de discriminação de variação de nucleotídeo única está localizado no quarto nucleotídeo na parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’.

[00598] Três tipos de PTO-NVs foram preparados, os quais têm um nucleotídeo de incompatibilidade artificial como uma porção de não emparelhamento de base no segundo nucleotídeo (SEQ ID NO:34), no terceiro nucleotídeo (SEQ ID NO:35) e no quarto nucelotídeo (SEQ ID NO:36) na direção 3’ do sítio de discriminação de variação de nucleo- tídeo única, respectivamente.

[00599] CTO é marcado com uma molécula de extinção (BHQ-2) e uma molécula repórter fluorescente (CAL Fluor Red 610) em sua porção de modelagem (SEQ ID NO:33).

[00600] Um PTO-NV não tendo nenhuma porção de não pareamen- to de base foi usado para a comparação (SEQ ID NO:30).

[00601] As sequências de iniciador a montante, iniciador a jusante, PTO-NVs e CTO usados neste Exemplo são:

[00602] BRAF-F 5’-CTTCATAATGCTTGCTCTGATAGGIIIIIGAGATCTACT-3’ (SEQ ID NO: 25) BRAF-R 5’-ATAGCCTCAATTCTTACCATCCAIIIIITGGATCCAGA-3’ (SEQ ID NO: 26) BRAF-PTO-NV-4 5’- CACAAGGGTGGGTCAGAGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAT- CAG[espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 30) BRAF-PTO-NV-5 5’- CACAAGGGTGGGTCAGAGTAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAT- CAG[espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 34) BRAF-PTO-NV-6 5’- CACAAGGGTGGGTCAGAGATATCTCGATGGAGTGGGTCCCAT- CAG[espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 35) BRAF-PTO-NV-7 5’- CACAAGGGTGGGTCAGAGAATTCTCGATGGAGTGGGTCCCAT- CAG[espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 36) BRAF-CTO-3 5’-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT[T(CAL Fluor Red610)]CGAGTAGAGACCCACCCTTGTG[espaçador C3] -3’ (SEQ ID NO: 33) (I: Desoxiinosina) (As letras sublinhadas indicam a porção de marcação 5’ de PTO-NV) (A letra em negrito indica o sítio de discriminação de variação de nuce- lotídeo) (A letra na caixa indica o nucleotídeo de incompatibilidade artificial fun-cionando como uma porção de não pareamento de base)

[00603] A reação foi conduzida no volume final de 20 μl contendo 10 ng de DNA genômico humano do tipo selvagem (T) (V600E) ou mutante (A) BRAF, 10 pmol de iniciador a montante (SEQ ID NO:25), 10 pmol de iniciador a jusante (SEQ ID NO:26), 5 pmol de PTO-NV (SEQ ID NO: 30, 34, 35 ou 36) e 1 pmol de CTO correspondente (SEQ ID NO: 33) e 10 μl de Master Mix 2X contendo MgCl2 2,5 mM, 200 μM de dNTPs e 1,6 unidade de H- Taq DNA polimerase (Solgent, Coreia); o tubo contendo a mistura de reação foi posto no termociclador em tempo real (CFX96, Bio-Rad); a mistura de reação foi desnaturada por 15 min a 95° C e submetida a 50 ciclos de 30 seg a 95° C, 60 seg a 55° C, 30 seg a 72° C. Depois da reação, a curva de fusão foi obtida esfriando a mistura de reação para 55° C, mantendo em 55° C por 30 seg e aquecendo lentamente para 55° C até 85° C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento da temperatura para monitorar a dissociação de DNAs de fita dupla. O pico de fusão foi derivado dos dados da curva de fusão.

[00604] Conforme mostrado nas Figuras 34A e B, os picos correspondendo ao valor de Tm esperado dos dúplices estendidos foram de- tectados e as alturas de pico foram similares para todos os PTO-NVs (SEQ ID NOs: 30, 34, 35 e 360) sem importar a presença e a localização da porção de não pareamento de base na presença do modelo do tipo mutante (A).

[00605] Na presença de tipo selvagem (T) de modelo, os picos foram detectados, mas as alturas do pico foram diminuídas para os PTO-NVs (SEQ ID NOs: 34, 35 e 36) tendo porções de não pareamen- to de base em comparação com a altura de pico para o PTO-NV (SEQ ID NO:30) não tendo nenhuma porção de não pareamento de base. Nenhum pico foi detectado na ausência dos modelos.

[00606] Este resultado mostra que o uso de porção de não parea- mento de base melhora a habilidade de discriminação de PTO-NV.

EXEMPLO 10: Avaliação de ensaio de PTOCE usando clivagem de PTO independente de oligonucleotídeo a montante

[00607] O ensaio de PTOCE foi avaliado adicionalmente para a detecção de uma sequência de ácido nucleico alvo sem uso de oligonu- cleotídeo a montante em (i) detecção em tempo real em uma temperatura predeterminada ou (ii) maneira de análise de fusão.

[00608] Taq DNA polimerase tendo uma atividade de nuclease 5’ foi usada para a clivagem de PTO e a extensão de fragmento de PTO.

[00609] O duplex estendido formado durando o ensaio foi projetado para ter um marcador duplo interativo. PTO não tem nenhum marcador. CTO tem uma molécula de extinção (BHQ-1) e uma molécula repórter fluorescente (FAM) em sua porção de modelagem. PTO e CTO são bloqueados com um espaçador de carbono em suas extremidades 3’. O oligonucleotídeo sintético para o gene de Neisseria gonorrhoeae (NG) foi usado como um modelo alvo.

[00610] As sequências de modelo sintético, PTO e CO usados neste Exemplo são: NG-T 5’- AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTG- TTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA CCGATCCATTGAAAAA-3’ (SEQ ID NO: 1) NG-PTO-1 5’- ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[Espaçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 3) NG-CTO-1 5’-[BHQ- 1]CCTCCTCCTCCTCCTCCTCC[T(FAM)]CCAGTAAAGCCAAGCCGT CGT[Es paçador C3]-3’ (SEQ ID NO: 4) (As letras sublinhadas indicam a porção de marcação 5’ de PTO) 10-1. Detecção em tempo real em uma temperatura predeterminada

[00611] A reação foi conduzida no volume final de 20 μl contendo 2 pmol de modelo sintético (SEQ ID NO: 1) para gene de NG, 5 pmol de PTO (SEQ ID NO:3), 2 pmol de CTO (SEQ ID NO: 4) e 10 μl de Master Mix 2X contendo MgCl2 2,5 mM, 200 μM de dNTPS e 1,6 unidade de H-Taq DNA polimerase (Solgent, Coreia); o tubo contendo a mistura de reação foi posto em um termociclador em tempo real (CFX96, BioRad); a mistura de reação foi desnaturada por 15 minutos a 95° C e submetida a 30 ciclos de 30 seg a 95° C, 60 seg a 60° C. Detecção do sinal gerado foi realizada a 60° C de cada ciclo. A temperatura de detecção foi determinada até o ponto que o duplex estendido mantém uma forma de fita dupla.

[00612] Conforme mostrado na Fig. 35A, o sinal fluorescente (Ct 1.15) foi detectado na presença do modelo. Nenhum sinal foi detectado na ausência do modelo. 10-2. Análise de fusão

[00613] Após a reação no Exemplo 10-1, curva de fusão foi obtida esfriando a mistura de reação para 55° C, mantendo a 55° C por 30 seg e aquecendo lentamente a 55° C até 90° C. A fluorescência foi medida continuamente durante o aumento de temperatura para monitorar dissociação de DNAs de fita dupla. O pico de fusão foi derivado dos dados da curva de fusão.

[00614] Conforme mostrado na Fig. 35B, um pico a 76,0o C correspondendo ao valor de Tm esperado do duplex estendido foi detectado na presença do modelo. Nenhum pico foi detectado na ausência do modelo.

[00615] Tendo descrito uma modalidade preferida da presente invenção, deve ser compreendido que variantes e suas modificações que se encaixarem no espírito da invenção podem se tornar aparentes àqueles versados na presente técnica, e o escopo da presente invenção deve ser determinado pelas reivindicações apensas e seus equivalentes.

Claims

1. Método para detecção de uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico alvo através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO), caracterizado pelo fato de que compreende: (a) hibridização da sequência de ácido nucleico alvo com um iniciador a montante e um PTO-NV (Oligonucleotídeo de Sonda-gem e Marcação para Variação de Nucleotídeo); em que o iniciador a montante compreende uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico alvo; o PTO-NV compre-ende (i) uma porção de direcionamento 3’ compreendendo uma se-quência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico alvo, (ii) uma porção de marcação 5’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo não complementar à sequência de áci-do nucleico alvo e (iii) um sítio de discriminação de variação de nucleo- tídeo, compreendendo uma sequência complementar à variação de nucleotídeo no ácido nucleico alvo, posicionado em uma parte da ex-tremidade 5’ da porção de direcionamento 3’; em que a porção de di-recionamento 3’ é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo e a porção de marcação 5’ não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo; o iniciador a montante está localizado a montante do PTO-NV; a fita estendida do iniciador a montante induz clivagem do PTO-NV por uma polimerase de ácido nucleico dependente de modelo tendo uma atividade de nuclease 5’; (b) contato do resultado da etapa (a) com a polimerase de ácido nucleico dependente de modelo tendo uma atividade de nuclease 5’ sob condições para clivagem do PTO-NV; em que quando o PTO-NV é hibridizado com a sequência de ácido nucleico alvo tendo a variação de nucleotídeo complementar ao sítio de discriminação de variação de nucleotídeo, e a parte de extremidade 5’ da porção de di- recionamento 3’ forma uma fita dupla com a sequência de ácido nu- cleico alvo para induzir clivagem a partir de um primeiro sítio de cliva-gem inicial, um primeiro fragmento é liberado; em que quando o PTO- NV é hibridizado com uma sequência de ácido nucleico alvo tendo uma variação de nucleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação de nucleotídeo, e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ não forma uma fita dupla com a sequência de ácido nucleico alvo para induzir clivagem a partir de um segundo sítio de clivagem inicial localizado a jusante do primeiro sítio de clivagem inicial, um segundo fragmento é liberado; em que o segundo fragmento compreende uma porção de extremidade 3’ adicional permitindo o segundo fragmento diferente do primeiro fragmento; (c) hibridização do fragmento liberado do PTO-NV com um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelagem); em que o CTO compreende em uma direção 3’ para 5’ (i) uma porção de captura compreendendo uma sequência de nucleotídeo complementar à porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO- NV e (ii) uma porção de modelagem compreendendo uma sequência de nucleotídeo não complementar à porção de marcação 5’ e à porção de direcionamento 3’ do PTO-NV; em que o primeiro fragmento ou o segundo fragmento liberado do PTO-NV é hibridizado com a porção de captura do CTO; (d) realização de uma reação de extensão usando o resultado da etapa (c) e uma polimerase de ácido nucleico dependente de modelo; em que quando o primeiro fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO, ele é estendido para formar uma fita estendida compreendendo uma sequência estendida complementar à porção de modelagem do CTO; em que quando o segundo fragmento é hibri- dizado com a porção de captura do CTO, ele não é estendido; e (e) detecção da presença da fita estendida, de maneira que a presença da fita estendida indique a presença da variação do nucleotídeo complementar ao sítio de discriminação de nucleotídeo do PTO-NV.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o CTO tem uma sequência selecionada de maneira que o CTO não seja hibridizado com a porção de extremidade 3’ adicional do segundo fragmento para prevenir extensão do segundo fragmento quando o segundo fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sítio de discriminação de variação de nucleotídeo está localizado dentro de 10 nucleotídeos de distância da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO-NV.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO-NV compreende uma porção de não pareamento de base localizada dentro de 1 a 5 nucleotídeos de distância do sítio de discriminação de variação de nucleotídeo; em que a porção de não parea- mento de base aumenta a diferenciação entre o primeiro sítio de clivagem inicial e o segundo sítio de clivagem inicial.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a porção de não pareamento de base aumenta a distância entre o primeiro sítio de clivagem inicial e o segundo sítio de clivagem inicial.

6. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a porção de não pareamento de base é (i) um nucleo- tídeo compreendendo uma base de incompatibilidade artificial, uma base de não pareamento de base modificada para ser incapaz de pa- reamento de base ou uma base universal, (ii) um nucleotídeo de não pareamento de base modificado para ser incapaz de pareamento de base ou (iii) um composto químico de não pareamento de base.

7. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a porção de não pareamento de base tem 1 a 5 porções.

8. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o sítio de discriminação de variação de nucleotídeo e a porção de não pareamento de base do PTO-NV estão localizados dentro de 10 nucleotídeos de distância da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a variação de nucleotídeo é uma variação de substituição, uma variação de deleção ou uma variação de inserção.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fita estendida do primeiro fragmento e o CTO formam um duplex estendido na etapa (d); em que o duplex estendido tem um valor de Tm ajustável por (i) uma sequência e/ou comprimento do primeiro fragmento, (ii) uma sequência e/ou comprimento do CTO ou (iii) a sequência e/ou comprimento do primeiro fragmento e a sequência e/ou comprimento do CTO; em que o duplex estendido provê um sinal alvo através de (i) pelo menos um marcador ligado ao primeiro fragmento e/ou CTO, (ii) um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão, (iii) pelo menos um marcador ligado ao primeiro fragmento e/ou CTO e um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão ou (iv) marcador inter- calante; e em que a presença da fita estendida é detectada através da medição do sinal-alvo a partir do duplex estendido de acordo com uma análise de fusão ou uma análise de hibridização para o duplex estendido.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fita estendida do primeiro fragmento e o CTO for mam um duplex estendido na etapa (d); em que o duplex estendido tem um valor de Tm ajustável por (i) uma sequência e/ou comprimento do primeiro fragmento, (ii) uma sequência e/ou comprimento do CTO ou (iii) a sequência e/ou comprimento do primeiro fragmento e a sequência e/ou comprimento do CTO; em que o duplex estendido provê um sinal-alvo através de (i) pelo menos um marcador ligado ao primeiro fragmento e/ou CTO, (ii) um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão, (iii) pelo menos um marcador ligado ao primeiro fragmento e/ou CTO e um marcador incorporado ao duplex estendido durante a reação de extensão ou (iv) marcador inter- calante; e em que a presença da fita estendida é detectada através da medição do sinal-alvo a partir do duplex estendido em uma temperatura predeterminada suficiente para manter uma fita dupla do duplex estendida.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o PTO-NV e/ou CTO é bloqueado em sua extremidade 3’ para proibir sua extensão.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda repetição de todas ou algumas das etapas (a) a (e) com desnaturação entre os ciclos de repetição.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é realizado para detectar pelo menos dois tipos de variações de nucleotídeo; em que o iniciador a montante compreende pelo menos dois tipos de iniciadores a montante e o PTO-NV compreende pelo menos dois tipos dos PTO-NVs.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que é realizado na presença de um iniciador a jusante.

16. Método para detecção de uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico alvo através de um ensaio de PTOCE (Clivagem e Extensão de PTO), caracterizado pelo fato de que compreende: (a) hibridização da sequência de ácido nucleico alvo com um PTO-NV (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação para Variação de Nucleotídeo); em que o PTO-NV compreende (i) uma porção de direcionamento 3’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico alvo, (ii) uma porção de marcação 5’ compreendendo uma sequência de nucle- otídeo não complementar à sequência de ácido nucleico alvo e (iii) um sítio de discriminação de variação de nucleotídeo compreendendo uma sequência complementar à variação de nucleotídeo no ácido nu- cleico alvo, posicionado em uma parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’; em que a porção de direcionamento 3’ é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo e a porção de marcação 5’ não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo; (b) contato do resultado da etapa (a) com uma polimerase de ácido nucleico dependente de modelo tendo uma atividade de nuclease 5’ sob condições para clivagem do PTO-NV; em que quando o PTO-NV é hibridizado com a sequência de ácido nucleico alvo tendo a variação de nucleotídeo complementar ao sítio de discriminação de variação de nucleotídeo, e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ forma uma fita dupla com a sequência de ácido nu- cleico alvo para induzir clivagem a partir de um primeiro sítio de clivagem inicial, um primeiro fragmento é liberado; em que o PTO-NV é hi- bridizado com uma sequência de ácido nucleico alvo tendo uma variação de nucleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação de nucleotídeo, e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ não forma uma fita dupla com a sequência de ácido nu- cleico para induzir clivagem a partir de um segundo sítio de clivagem inicial localizado a montante do primeiro sítio de clivagem inicial, um segundo fragmento é liberado; em que o segundo fragmento compreende uma porção de extremidade 3’ adicional permitindo o segundo fragmento diferente do primeiro fragmento; (c) hibridização do fragmento liberado do PTO-NV com um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelagem); em que o CTO compreende em uma direção 3’ para 5’ (i) uma porção de captura compreendendo uma sequência de nucleotídeo complementar à porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO- NV e (ii) uma porção de modelagem compreendendo uma sequência de nucleotídeo não complementar à porção de marcação 5’ e à porção de direcionamento 3’ do PTO-NV; em que o primeiro fragmento ou o segundo fragmento liberado do PTO-NV é hibridizado com a porção de captura do CTO; (d) realização de uma reação de extensão usando o resultado da etapa (c) e uma polimerase de ácido nucleico dependente de modelo; em que quando o primeiro fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO, ele é estendido para formar uma fita estendida compreendendo uma sequência estendida complementar à porção de modelagem do CTO; em que quando o segundo fragmento é hibri- dizado com a porção de captura do CTO, ele não é estendido; e (e) detecção da presença da fita estendida, de maneira que a presença da fita estendida indique a presença da variação de nucleotídeo complementar ao sítio de discriminação de nucleotídeo do PTO-NV.

17. Kit para detecção de uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico alvo através de um ensaio de PTO- CE (Clivagem e Extensão de PTO) para uso no desempenho do método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um PTO-NV (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação para Variação de Nucleotídeo); em que o PTO-NV compreende (i) uma porção de direcionamento 3’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico alvo, (ii) uma porção de marcação 5’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo não complementar à sequência de ácido nu- cleico alvo e (iii) um sítio de discriminação de variação de nucleotídeo compreendendo uma sequência complementar à variação de nucleotí- deo no ácido nucleico alvo, posicionado em uma parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’; em que a porção de direcionamento 3’ é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo e a porção de marcação 5’ não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo; (b) um iniciador a montante; em que o iniciador a montante compreende uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico alvo; em que o iniciador a montante está localizado a montante do PTO-NV; a fita estendida do iniciador a montante induz clivagem do PTO-NV por uma polimerase de ácido nucleico dependente de modelo tendo uma atividade de nuclease 5’; e (c) um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelagem); em que o CTO compreende em uma direção 3’ para 5’ (i) uma porção de captura compreendendo uma sequência de nucleotídeo complementar à porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO-NV e (ii) uma porção de modelagem compreendendo uma sequência de nucleotídeo não complementar à porção de marcação 5' e à porção de direcionamento 3’ do PTO-NV; em que quando o PTO-NV é hibridizado com a sequência de ácido nucleico alvo tendo a variação de nucleotídeo complementar ao sítio de discriminação de variação, e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ forma uma fiat dupla com a sequência de ácido nucleico alvo para induzir clivagem a partir de um primeiro sítio de clivagem inicial, um primeiro fragmento é liberado; em que quando o PTO-NV é hibridizado com uma sequência de ácido nucleico alvo tendo uma variação de nucleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação, e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ não forma uma fita dupla com a sequência de ácido nucleico para induzir clivagem a partir de um segundo sítio de clivagem inicial localizado a jusante do primeiro sítio de clivagem inicial, um segundo fragmento é liberado; em que o segundo fragmento compreende uma porção de extremidade 3’ adicional permitindo o segundo fragmento diferente do primeiro fragmento; em que o primeiro fragmento ou o segundo fragmento liberado do PTO-NV é hibridizado com a porção de captura do CTO.

18. Kit de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma polimerase de ácido nucleico dependente de modelo tendo a atividade de nuclease 5’; em que quando o primeiro fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO, ele é estendido para formar uma fita estendida compreendendo uma sequência estendida complementar à porção de modelagem do CTO; em que quando o segundo fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO, ele não é estendido.

19. Kit de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o CTO tem uma sequência selecionada de maneira que o CTO não é hibridizado com a porção de extremidade 3’ adicional do segundo fragmento para prevenir que o segundo fragmento se estenda quando o segundo fragmento é hibridizado com a porção de captura do CTO.

20. Kit de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ do PTO-NV compreende uma porção de não pareamento de base localizada dentro de 1 a 5 nucleotídeos de distância do sítio de discri-minação de variação de nucleotídeo; em que a porção de não parea- mento de base aumenta a diferenciação entre o primeiro sítio de clivagem inicial e o segundo sítio de clivagem inicial.

21. Kit para detecção de uma variação de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico alvo através de um ensaio de PTO- CE (Clivagem e Extensão de PTO) para uso no desempenho do método como definido na reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um PTO-NV (Oligonucleotídeo de Sondagem e Marcação para Variação de Nucleotídeo); em que o PTO-NV compreende (i) uma porção de direcionamento 3’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo de hibridização complementar à sequência de ácido nucleico alvo, (ii) uma porção de marcação 5’ compreendendo uma sequência de nucleotídeo não complementar à sequência de ácido nu- cleico alvo e (iii) um sítio de discriminação de variação de nucleotídeo compreendendo uma sequência complementar à variação de nucleotí- deo no ácido nucleico alvo, posicionado em uma parte da extremidade 5’ da porção alvo 3; em que a porção de direcionamento 3’ é hibridiza- da com a sequência de ácido nucleico alvo e a porção de marcação 5’ não é hibridizada com a sequência de ácido nucleico alvo; (b) um CTO (Oligonucleotídeo de Captura e Modelagem); em que o CTO compreende em uma direção 3’ para 5’ (i) uma porção de captura compreendendo uma sequência de nucleotídeo complementar à porção de marcação 5’ ou uma parte da porção de marcação 5’ do PTO-NV e (ii) uma porção de modelagem compreendendo uma sequência de nucleotídeo não complementar à porção de marcação 5’ e à porção de direcionamento 3’ do PTO-NV; em que quando o PTO-NV é hibridizado com a sequência de ácido nucleico alvo tendo a variação de nucleotídeo complementar ao sítio de discriminação de variação, e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ forma uma fita dupla com a sequência de ácido nucleico alvo para induzir clivagem a partir de um primeiro sítio de clivagem inicial, um primeiro fragmento é liberado; em que quando PTO-NV é hibridizado com uma sequência de ácido nucleico alvo tendo uma variação de nucleotídeo não complementar ao sítio de discriminação de variação, e a parte da extremidade 5’ da porção de direcionamento 3’ não forma uma fita dupla com a sequência de ácido nucleico alvo para induzir clivagem a partir de um segundo sítio de clivagem inicial localizado a jusante do primeiro sítio de clivagem inicial, um segundo fragmento é liberado; em que o segundo fragmento compreende uma porção de extremidade 3’ adicional permitindo o segundo fragmento diferente do primeiro fragmento; em que o primeiro fragmento ou o segundo fragmento liberado do PTO-NV é hibridizado com a porção de captura do CTO.