JP5976849B2 - ＰＴＯ切断及び伸長アッセイによるターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異検出｛ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＶａｒｉａｔｉｏｎｏｎＴａｒｇｅｔＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅｂｙＰＴＯＣｌｅａｖａｇｅａｎｄＥｘｔｅｎｓｉｏｎＡｓｓａｙ｝ - Google Patents

ＰＴＯ切断及び伸長アッセイによるターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異検出｛ＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＶａｒｉａｔｉｏｎｏｎＴａｒｇｅｔＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅｂｙＰＴＯＣｌｅａｖａｇｅａｎｄＥｘｔｅｎｓｉｏｎＡｓｓａｙ｝ Download PDF

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Description

本発明は、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイによるターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異検出に関するものである。
ＤＮＡハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）は分子生物学の基本的な過程であり、イオン強度、塩基構成、核酸断片の長さ、ミスマッチの程度及び変性剤の存在によって影響される。ＤＮＡハイブリダイゼーション基盤技術は特定の核酸配列の決定に非常に有用な道具になるはずであり、臨床診断、遺伝子研究及び法医学的な実験分析に明らかに役立つだろう。
しかしながら、ハイブリダイゼーションのみに依存する従来の方法及び過程では、プローブと非ターゲット配列との非特異的なハイブリダイゼーションによる偽陽性結果が発生する可能性が高い。よって、従来の方法及び過程は、信頼度を改善しなければならない問題点が残っている。
プローブハイブリダイゼーション過程の以外にも追加で酵素的反応を用いたいくつかの接近法、例えば、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ法が提示された。
ＴａｑＭａｎＴＭプローブ法において、ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされた標識プローブは上流プライマー依存的なＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断されて、ターゲット配列の存在を示すシグナルを発生させる（特許文献１〜３）。ＴａｑＭａｎＴＭプローブ法は、シグナル発生のための二つの接近法を提示する：重合依存的な切断（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｅａｖａｇｅ）及び重合独立的な切断（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｅａｖａｇｅ）。重合依存的な切断において、上流プライマーの伸長は必ず核酸ポリメラーゼが標識プローブの５’末端に接触する前に発生されなければならない。伸長反応が進行されながら、ポリメラーゼは標識プローブの５’末端を次第に切断する。重合独立的な切断において、上流プライマー及び標識プローブは非常に近接してターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上流プライマーの３’末端と核酸ポリメラーゼとの結合は、上記核酸ポリメラーゼが標識プローブの５’末端に接触するようにして標識が放出される。また、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ法は、それの５’末端部位にターゲット配列とハイブリダイゼーションされない５’テール区域を持つ標識プローブが切断されて、５’テール区域を含む断片が形成されることを開示している。
ターゲット配列に非相補的な５’テール区域を持つプローブが５’ヌクレアーゼによって切断されて５’テール区域を含む断片が放出されるいくつかの方法が報告された。
例えば、特許文献４は、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断される切断構造を開示している。鋳型に対して非相補的な５’部位及び鋳型に対して相補的な３’部位を含むオリゴヌクレオチドが鋳型にハイブリダイゼーションされ、上流オリゴヌクレオチドは非常に近接して鋳型にハイブリダイゼーションされる切断構造が例示されている。切断構造は５’ヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼ又は減少された合成活性を持つ変形ＤＮＡポリメラーゼによって切断されて、鋳型に非相補的な５’部位が放出される。その後、放出された５’部位はヘアピン構造を持つオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションされて切断構造を形成し、これによって漸進的な切断反応が誘導されてターゲット配列が検出される。
特許文献５は、３’末端がブロッキングされた上流オリゴヌクレオチドを持つ切断構造が、５’ヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼ又はＦＥＮヌクレアーゼによって切断されて非相補的な５’フラップ（ｆｌａｐ）部位が放出され、放出された５’フラップ部位は大きさの分析又は相互作用的な二重標識によって検出される過程を開示している。特許文献６は、検出可能な放出されたフラップが核酸合成依存的な、フラップ媒介連続的な増幅方法によって生成されることを開示している。この方法において、一番目の切断構造から放出されたフラップは、核酸合成依存的な方式で二番目の切断構造を切断してフラップを放出させ、放出されたフラップを検出する。
特許文献７は、核酸合成によって生成された放出されたフラップの生成、放出されたフラップの伸長、フラップ伸長中にオリゴヌクレオチドの切断及びオリゴヌクレオチド切断によって生成されたシグナル検出を含む方法を開示している。
液相での蛍光標識プローブのハイブリダイゼーションによって、一種類の蛍光標識を用いても融解曲線分析によって多数のターゲット核酸配列を同時に検出することができる。しかしながら、相互作用的な二重標識プローブの５’ヌクレアーゼ媒介切断によってターゲット配列を検出する従来の技術は、マルチプレックスターゲット検出で互いに異なるターゲット配列に対して互いに異なる種類の蛍光標識を必要とし、このような蛍光標識種類の数の限界のため、検出されるターゲット配列の数は制限される。
特許文献８は、ターゲット核酸配列に非相補的な５’部位を持つプローブの切断及びキャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅ）プローブのハイブリダイゼーションを用いたターゲット検出方法を開示している。標識は非相補的な５’部位に位置する。ターゲット配列にハイブリダイゼーションされた標識プローブは切断されて断片を放出し、その後、断片はキャプチャープローブにハイブリダイゼーションされてターゲット配列の存在が検出される。この方法において、非切断された／無傷な（ｕｎｃｌｅａｖｅｄ／ｉｎｔａｃｔ）プローブはキャプチャープローブにハイブリダイゼーションされないことが必須である。このためには、短い長さを持つキャプチャープローブが固相基質上に固定化されなければならない。しかしながら、このような制限は固相基質でのハイブリダイゼーションの効率性を低くし、また反応条件の最適化も難しくする。
したがって、より便利で、信頼性及び再現性のある方式で、ハイブリダイゼーションだけでなく、５’核酸分解切断方式（５’ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のような酵素的反応によって液相及び固相でターゲット配列、より好ましくは複数のターゲット配列を検出するための新規な接近法に対する開発要求が浮上している。さらに、当業界で標識（特に、蛍光標識）の種類の数に制限されない新規なターゲット検出方法が要求されている。
一方、ヌクレオチド変異は研究及び臨床領域において重要である。この中でＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）はヒトゲノムで最もよく発見され、疾病関連位置及び薬物遺伝学に対するマーカーとしての役割をする（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｒｏｓｅｓ， ２０００）。ＳＮＰはヒトゲノムで１，０００ｂｐ当たり約１個の割合で発見され、これらの総数は約３００万個と推定される。ＳＮＰ、欠失、挿入及び転座（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）のようなヌクレオチド変異を検出するための多様な対立遺伝子の区別技術が報告されている。
対立遺伝子特異的なＴａｑＭａｎプローブは、ＰＣＲの伸長ステップでターゲット配列と完璧にマッチングされる場合にのみハイブリダイゼーションされるようにデザインされる。ＴａｑＭａｎプローブは、レポーター分子及びレポーター分子から蛍光シグナルをクエンチングすることができるクエンチャー分子を持つ。ターゲット配列とハイブリダイゼーションされるＴａｑＭａｎプローブは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、レポーター分子及びクエンチャー分子はターゲットシグナル生成のために分離される。対立遺伝子の区別のためにＭＧＢ（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）と結合された１３〜２０ｍｅｒのプローブが使用される（非特許文献１）。ＴａｑＭａｎプローブを用いた対立遺伝子区別方法は、ハイブリダイゼーション反応だけでなく５’ヌクレアーゼ活性の酵素反応を用いるため、特異性が増加する。しかしながら、上記方法は、対立遺伝子特異的なプローブデザインの難しさと、一つのミスマッチによる差を区別することができる反応条件の最適化の難しさといった深刻な問題点を持っている。さらに、ＭＧＢとの結合は、対立遺伝子特異的なＴａｑＭａｎプローブに対する問題解決法の一つである。
したがって、従来の技術の短所を克服し、かつ、より便利で信頼でき、再現可能な方式でヌクレオチド変異を検出することができる新規な接近法に対する開発要求が続いている。
本明細書の全体にかけて多数の特許及び文献が参照されてその引用がカッコで表示されている。このような特許及び文献の公開はその全体が本明細書に参照により組み込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
米国特許第５，２１０，０１５号 米国特許第５，５３８，８４８号 米国特許第６，３２６，１４５号 米国特許第５，６９１，１４２号 米国特許第７，３８１，５３２号 米国特許第６，８９３，８１９号 米国特許第７，３０９，５７３号 米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号
Ｌｉｖａｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔ． Ａｎａｌ． １４：１４３−１４９（１９９９）
本発明者らは、より改善した正確性及び便宜性を有し、特に、マルチプレックス方式でターゲット配列を検出する新規な接近法を開発すべく鋭意研究努力した。その結果、本発明者らは、ターゲット配列を検出するための新規なプロトコルを定立し、このようなターゲット検出はプローブハイブリダイゼーション、酵素的なプローブ切断、伸長及び伸長二重体（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｄｕｐｌｅｘ）の検出によって達成される。本発明のプロトコルは固相反応だけでなく、液相反応にも優秀に適用され、より改善した正確性及び便宜性を持って複数のターゲット配列が検出されるようにする。
また、本発明者らは、より改善した正確性及び便宜性を有し、特に、マルチプレックス方式でヌクレオチド変異を検出する新規な接近法を開発すべく鋭意研究努力した。その結果、本発明者らは、ヌクレオチド変異を検出するための新規なプロトコルを定立し、この新規なプロトコルによれば、ヌクレオチド変異検出は、プローブハイブリダイゼーション、酵素的なプローブ切断、伸長及び伸長鎖の検出によって達成される。特に、本発明者らは、興味深いことに、関心のあるヌクレオチド変異の存在又は不在によって上記プローブの切断位置が調節できるようにし、互いに異なる位置で切断されて放出された断片は人為的なテンプレート上での伸長可能性によって区別される。本発明のプロトコルは固相反応だけでなく、液相反応でもよく適用され、より改善した正確性及び便宜性を持って複数のヌクレオチド変異を検出することができる。
したがって、本発明の目的は、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイを用いて、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイを用いて、ターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異を検出する方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイを用いて、ＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供することにある。
本発明のまた他の目的は、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイを用いて、ターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異を検出するためのキットを提供することにある。
本発明の他の目的及び利点は、添付の請求の範囲及び図面と共に下記の詳細な説明によってより明らかにされる。
本発明は、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイを用いて核酸配列を検出する新規な方法を提供する。特に、本発明は、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイを用いてターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異を検出する新規な方法、及びＰＴＯＣＥアッセイを用いてヌクレオチド変異を検出するためのキットを提供する。
ヌクレオチド変異検出のための本発明は、ＰＴＯＣＥアッセイであって、ＰＴＯの切断及びＣＴＯでのＰＴＯ断片の伸長に基づいており、これに関する詳細な説明はＰＴＯＣＥアッセイに関する説明の後に記述される。より良い理解のために、次のようにＰＴＯＣＥアッセイを説明する：
Ｉ． 融解分析を含むＰＴＯＣＥによるターゲット検出過程
本発明の一様態によれば、本発明は次のステップを含み、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイによってＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ） 上記ターゲット核酸配列を上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記上流オリゴヌクレオチドは上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み；上記ＰＴＯは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；上記３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記５’タギング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；上記上流オリゴヌクレオチドは上記ＰＴＯの上流に位置し；
（ｂ） 上記ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に上記ステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって；上記上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖は上記５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による上記ＰＴＯの切断を誘導し、このような上記切断は、上記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出し；
（ｃ） 上記ＰＴＯから放出された上記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記ＣＴＯは３’→５’の方向に、（ｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；上記ＰＴＯから放出された上記断片は、上記ＣＴＯの上記キャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされ；
（ｄ） 上記ステップ（ｃ）の結果物及び鋳型依存的な核酸ポリメラーゼを用いて伸長反応を行うステップであって；上記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた上記断片は伸長されて伸長二重体を形成し、上記伸長二重体は、（ｉ）上記断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）上記ＣＴＯの配列及び／又は長さ、又は（ｉｉｉ）上記断片の配列及び／又は長さと上記ＣＴＯの配列及び／又は長さによって調節可能なＴｍ値を持ち；
（ｅ） 一定範囲の温度で上記伸長二重体を融解（ｍｅｌｔｉｎｇ）して上記伸長二重体の存在を示すターゲットシグナルを提供するステップであって；上記ターゲットシグナルは、（ｉ）上記断片及び／又は上記ＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）上記伸長反応中に上記伸長二重体内に挿入された標識、（ｉｉｉ）上記伸長反応中に上記伸長二重体内に挿入された標識と上記断片及び／又は上記ＣＴＯに連結された標識、又は（ｉｖ）インターカレーティング標識（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｌａｂｅｌ）によって提供され；そして
（ｆ） 上記ターゲットシグナルを測定することで上記伸長二重体を検出するステップであって；上記伸長二重体の存在は上記ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明者らは、より改善した正確性及び便宜性を有し、特に、マルチプレックス方式でターゲット配列を検出する新規な接近法を開発すべく鋭意研究努力した。その結果、本発明者らは、ターゲット配列を検出するための新規なプロトコルを定立し、このようなターゲット検出は、プローブハイブリダイゼーション、酵素的なプローブ切断、伸長及び伸長二重体（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｄｕｐｌｅｘ）の検出によって達成される。本発明のプロトコルは、固相反応だけでなく液相反応にも立派に適用され、より改善した正確性及び便宜性を持って複数のターゲット配列が検出されるようにする。
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次のとおりである：
（ａ） 本発明は、ターゲット依存的な伸長二重体を提供する。本発明においてターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされたＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）は切断されて断片を放出し、上記断片はＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）にハイブリダイゼーションされて伸長二重体を形成する。上記伸長二重体は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナル（シグナル発生又は消滅）又はシグナル変化（シグナル増加又は減少）を提供する。
（ｂ） 伸長二重体の存在は、融解曲線分析及び指定温度での検出（例えば、リアルタイム方式及びエンドポイント方式）のような多様な方法又は過程によって決定される。
（ｃ） 本発明は一種類の標識（例えば、ＦＡＭ）のみを用いても、融解曲線分析によって少なくとも２種のターゲット核酸配列を同時に検出する。一方、液相で行われる従来のマルチプレックスリアルタイム方式は、検出可能な蛍光標識の数に関連する限界で深刻な問題がある。本発明はこのような短所を成功的に克服し、マルチプレックスリアルタイム検出の応用を広げた。
（ｄ） 本発明は多数の標識システムを用いて行うことができる。例えば、ＰＴＯ及び／又はＣＴＯのある位置に連結される標識は、伸長二重体を示すターゲットシグナルを提供するのに用いられることができる。また、伸長反応中に伸長二重体内に挿入された標識を本発明に用いることができる。これだけでなく、このような標識の組み合わせを用いることができる。本発明に適用可能な多目的の標識システムは、実験的な条件又は目的によって適合な標識システムを選択する。
（ｅ） 本発明は、（ｉ）上記断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）上記ＣＴＯの配列及び／又は長さ、又は（ｉｉｉ）上記断片の上記配列及び／又は長さと上記ＣＴＯの上記配列及び／又は長さによって調節可能な指定Ｔｍ値を持つターゲット依存的な伸長二重体を提供する。
（ｆ） 増幅産物を用いる従来の融解曲線分析は増幅産物の配列に依存し、これによって増幅産物の所望のＴｍ値を得ることが非常に難しかった。これに対し、本発明は、増幅産物の配列ではない伸長二重体の配列に依存し、伸長二重体の所望のＴｍ値を選択することができる。よって、本発明は、複数のターゲット配列を検出するのに容易に適用することができる。
（ｇ） 標識プローブとターゲット核酸配列との直接的なハイブリダイゼーションを用いる従来の融解曲線分析は、プローブの非特異的なハイブリダイゼーションのため偽陽性シグナルが発生する可能性が高い。これに対し、本発明は、ＰＴＯハイブリダイゼーションだけでなく、酵素的な切断及び伸長を用いて、偽陽性シグナルの問題を完璧に克服した。
（ｈ） 従来の融解曲線分析のＴｍ値はターゲット核酸配列の配列変異による影響を受ける。しかしながら、本発明の伸長二重体は、ターゲット核酸配列の配列変異に関らず一定のＴｍ値を提供して、融解曲線分析で優れた正確性を保障する。
（ｉ） ＰＴＯの５’タギング部位の配列及びＣＴＯの配列は、ターゲット核酸配列を考慮するまでもなく選択できるということは注目に値する。これはＰＴＯの５’タギング部位及びＣＴＯに対する配列のプール（ｐｏｏｌ）の事前デザインを可能にする。ＰＴＯの３’ターゲッティング部位はターゲット核酸配列を考慮して作製しなければならないが、ＣＴＯはターゲット核酸配列の情報又はターゲット核酸配列に関する考慮なく既存の方式（ｒｅａｄｙ−ｍａｄｅ ｆａｓｈｉｏｎ）で作製することができる。このような特徴は、マルチプレックスターゲット検出、特に、固相基質上に固定化されたＣＴＯを用いるマイクロアレイ上で著しい利点を提供する。
（ｊ） ターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異検出のための本発明（すなわち、ＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイ）によれば、上記プローブ（ＰＴＯ−ＮＶ）は、関心のあるヌクレオチド変異の存在有無によって確実に区分されるハイブリダイゼーションパターンを示す。
（ｋ） 関心のヌクレオチド変異に対するこのようなハイブリダイゼーションパターンは、ＰＴＯ−ＮＶの初期切断位置での差を提供し、これによって２種のＰＴＯ−ＮＶ断片が生成され、関心のあるヌクレオチド変異の存在有無によってシグナル差が発生する。
ＰＴＯ切断及び伸長アッセイ（ＰＴＯＣＥ ａｓｓａｙ）に用いられるＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及びＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の図式的な構造を示す。好ましくは、ＰＴＯ及びＣＴＯの３’末端はブロッキングされて伸長が防止される。 融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＣＴＯはそれのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を持つ。 融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＣＴＯはそれのテンプレーティング部位にレポーター分子を持つ。上記レポーター分子は、一本鎖形態又は二本鎖形態上に存在するのかによって異なるシグナル強度を示すことが要求される。 融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＣＴＯはそれのテンプレーティング部位にｉｓｏ−ｄＣ残基及びレポーター分子を持つ。クエンチャー−ｉｓｏ−ｄＧＴＰは伸長反応中に伸長二重体内に挿入（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）される。 融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＰＴＯはそれの５’タギング部位にレポーター分子を持ち、ＣＴＯはそれのテンプレーティング部位にｉｓｏ−ｄＣ残基を持つ。クエンチャー−ｉｓｏ−ｄＧＴＰは伸長反応中に伸長二重体内に挿入される。 融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＰＴＯはそれの５’タギング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を持つ。 融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＰＴＯはそれの５’タギング部位にレポーター分子を持つ。上記レポーター分子は、一本鎖形態又は二本鎖形態上に存在するのかによって異なるシグナル強度を示すことが要求される。 融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＰＴＯはそれの５’タギング部位にクエンチャー分子を持ち、ＣＴＯはそれのキャプチャリング部位にレポーター分子を持つ。 指定温度での検出を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＣＴＯはそれのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を持つ。ＣＴＯはそれの３’末端を通じて固相基質上に固定化される。 指定温度での検出を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。レポーター標識ｄＡＴＰは伸長反応中に伸長二重体内に挿入される。ＣＴＯはそれの３’末端を通じて固相基質上に固定化される。 指定温度での検出を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＣＴＯはそれのテンプレーティング部位にｉｓｏ−ｄＣ残基を持ち、レポーター−ｉｓｏ ｄＧＴＰは伸長反応中に伸長二重体内に挿入される。ＣＴＯはそれの３’末端を通じて固相基質上に固定化される。 指定温度での検出を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＰＴＯはそれの５’タギング部位にレポーター分子を持つ。ＣＴＯはそれの５’末端を通じて固相基質上に固定化される。 インターカレーティング標識を用いる指定温度での検出を含むＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。ＣＴＯはそれの５’末端を通じて固相基質上に固定化される。 融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯはそれのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を持つ。 融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＰＴＯはそれの５’末端にクエンチャー分子を持ち、ＣＴＯはそれの３’末端にレポーター分子を持つ。 伸長二重体のＴｍ値がＣＴＯ配列によって調節されるという結果を示す。 ＰＣＲ増幅を用いたＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯはそれのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を持つ。図１７ＡはリアルタイムＰＣＲ検出を含むＰＴＯＣＥアッセイの結果を示す。 ＰＣＲ増幅を用いたＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯはそれのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を持つ。図１７ＢはポストＰＣＲ融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイの結果を示す。 ＰＣＲ増幅を用いたＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯはそれの５’末端にｉｓｏ−ｄＣ残基及びレポーター分子を持つ。クエンチャー−ｉｓｏ−ｄＧＴＰは伸長反応中に伸長二重体内に挿入される。図１８ＡはリアルタイムＰＣＲ検出を含むＰＴＯＣＥアッセイの結果を示す。 ＰＣＲ増幅を用いたＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯはそれの５’末端にｉｓｏ−ｄＣ残基及びレポーター分子を持つ。クエンチャー−ｉｓｏ−ｄＧＴＰは伸長反応中に伸長二重体内に挿入される。図１８ＢはポストＰＣＲ融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイの結果を示す。 ＰＣＲ増幅を用いたＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＰＴＯはそれの５’末端にクエンチャー分子を持ち、ＣＴＯはそれの３’末端にレポーター分子を持つ。図１９ＡはリアルタイムＰＣＲ検出を含むＰＴＯＣＥアッセイの結果を示す。 ＰＣＲ増幅を用いたＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＰＴＯはそれの５’末端にクエンチャー分子を持ち、ＣＴＯはそれの３’末端にレポーター分子を持つ。図１９ＢはポストＰＣＲ融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイの結果を示す。 ポストＰＣＲ融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）遺伝子の同時的な検出結果を示す。ＣＴＯはそれのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を持つ。 マイクロアレイでの融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯはそれの５’末端を通じて固定化される。ＰＴＯはそれの５’タギング部位にレポーター分子を持つ。 マイクロアレイでの融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯはそれの５’末端を通じて固定化される。ＰＴＯはそれの５’タギング部位にレポーター分子を持つ。 マイクロアレイで指定温度でのリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯはそれの５’末端を通じて固定化される。ＰＴＯはそれの５’タギング部位にレポーター分子を持つ。 マイクロアレイで指定温度でのリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯはそれの５’末端を通じて固定化される。ＰＴＯはそれの５’タギング部位にレポーター分子を持つ。 マイクロアレイで指定温度でのリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯはそれの３’末端を通じて固定化され、それのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を持つ。 マイクロアレイで指定温度でのリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子の検出結果を示す。ＣＴＯはそれの３’末端を通じて固定化され、それのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を持つ。 マイクロアレイで指定温度でのエンドポイント検出を含むＰＴＯＣＥアッセイによる単一又は複数のターゲット検出結果を示す。ＣＴＯはそれの５’末端を通じて固定化される。ＰＴＯはそれの５’タギング部位にレポーター分子を持つ。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）遺伝子はターゲット核酸配列として用いた。 ヌクレオチド変異検出のためのＰＴＯＣＥアッセイを図式的に示す。このような適用はＶＤ−ＰＴＯＣＥ（Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）アッセイと命名される。ヌクレオチド変異区別サイトは３’ターゲッティング部位の５’末端の一部の５’末端に位置する。ヌクレオチド変異の存在は伸長鎖の存在を検出することで決定する。切断位置は、関心のあるヌクレオチド変異の存在及び不在によって異なる。 ＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイの一例を図式的に示す。ヌクレオチド変異区別サイトは３’ターゲッティング部位の５’末端の一部の５’末端から１ヌクレオチド離隔した位置に位置する。 ＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイの一例を図式的に示す。非塩基対部分である人為的なミスマッチヌクレオチドが３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に存在する。非塩基対部分は第１の初期切断位置と第２の初期切断位置との距離を拡大させる。 ＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイの一例を図式的に示す。ヌクレオチド変異区別サイトは３’ターゲッティング部位の５’末端の一部の５’末端に位置する。ＣＴＯはシグナル発生のためにそれのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を含む。 融解分析を含むＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイの一例を図式的に示す。ヌクレオチド変異区別サイトは３’ターゲッティング部位の５’末端の一部の５’末端から１ヌクレオチド離隔した位置に位置する。ＣＴＯはシグナル発生のためにそれのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を含む。 融解分析を含むＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイの一例を図式的に示す。非塩基対部分である人為的なミスマッチヌクレオチドが３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に存在する。ＣＴＯはシグナル発生のためにそれのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を含む。 マイクロアレイで指定温度での検出を含むＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイの一例を図式的に示す。単一蛍光標識からのシグナルは指定温度で検出される。 マイクロアレイで指定温度での検出を含むＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイの一例を図式的に示す。レポーター標識ｄｄＵＴＰは伸長反応中に伸長鎖内に挿入される。レポーターからのシグナルは指定温度で検出される。 ＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイによるＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００Ｅ突然変異の検出結果を示す。４種のＰＴＯ−ＮＶを試験し、上記ＰＴＯ−ＮＶは３’ターゲッティング部位の５’末端の一部での単一ヌクレオチド変異区別サイトの位置に差がある。 ＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイによるＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００Ｅ突然変異の検出結果を示す。４種のＰＴＯ−ＮＶを試験し、上記ＰＴＯ−ＮＶは３’ターゲッティング部位の５’末端の一部での単一ヌクレオチド変異区別サイトの位置に差がある。 非塩基対部分である人為的なミスキャッチヌクレオチドを持つＰＴＯ−ＮＶを用いたＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイでＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００Ｅ突然変異を検出した結果を示す。単一ヌクレオチド変異区別サイトは３’ターゲッティング部位の５’末端から４番目のヌクレオチドに位置する。人為的なミスマッチを含まない一つのＰＴＯ−ＮＶ及び非塩基対部分である人為的なミスマッチヌクレオチドを持つ３種類のＰＴＯ−ＮＶを試験した。 非塩基対部分である人為的なミスキャッチヌクレオチドを持つＰＴＯ−ＮＶを用いたＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイでＢＲＡＦ遺伝子のＶ６００Ｅ突然変異を検出した結果を示す。単一ヌクレオチド変異区別サイトは３’ターゲッティング部位の５’末端から４番目のヌクレオチドに位置する。人為的なミスマッチを含まない一つのＰＴＯ−ＮＶ及び非塩基対部分である人為的なミスマッチヌクレオチドを持つ３種類のＰＴＯ−ＮＶを試験した。 上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性を用いたＰＴＯＣＥアッセイでＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子を検出した結果を示す。図３５Ａは上流オリゴヌクレオチドを用いない指定温度でのリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイの結果を示す。 上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性を用いたＰＴＯＣＥアッセイでＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子を検出した結果を示す。図３５Ｂは上流オリゴヌクレオチドを用いない融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイの結果を示す。
本発明は次の連続的なイベントを用いる；プローブハイブリダイゼーション；ＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）の切断及び伸長；ターゲット依存的な伸長二重体の形成；及び伸長二重体の検出。よって、本発明は、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイと命名される。
本発明において、伸長二重体は、融解分析又は指定温度（ｐｒｅ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）での検出によって伸長二重体の存在を示すシグナルを提供する標識を持つ特徴がある。また、伸長二重体は調節可能なＴｍ値を持つ特徴を有し、これは複数のターゲット検出又は非ターゲットシグナルとの区別において重要な役割をする。
ターゲット核酸が存在する場合にのみ伸長二重体が生成するので、伸長二重体の存在はターゲット核酸の存在を示す。
融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイをより詳細に説明すれば、次のとおりである：
ステップ（ａ）：ターゲット核酸配列と上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯとのハイブリダイゼーション
本発明によれば、まず、ターゲット核酸配列を上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイゼーションさせる。
本明細書において使用される用語「ターゲット核酸」、「ターゲット核酸配列」又は「ターゲット配列」とは、検出しようとする核酸配列を意味し、ハイブリダイゼーション、アニーリング又は増幅条件下でプローブ又はプライマーとアニーリング又はハイブリダイゼーションされる。
本明細書において使用される用語「プローブ（ｐｒｏｂｅ）」とは、ターゲット核酸配列に実質的に相補的な部位又は部位を含む一本鎖の核酸分子を意味する。
本明細書において使用される用語「プライマー」とは、オリゴヌクレオチドを意味するものであって、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件、すなわち、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼのような重合剤の存在、そして好適な温度とｐＨの条件で合成の開始点として作用することができる。
好ましくは、プローブ及びプライマーは、一本鎖デオキシリボヌクレオチド分子である。本発明において用いられるプローブ又はプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（すなわち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ及びｄＴＭＰ）、修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドを含むことができる。また、プローブ又はプライマーはリボヌクレオチドを含むことができる。
プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングさせることができる程度に十分長くなければならない。プライマーの好適な長さは、例えば、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）を含んだ複数の要素によって決定される。本明細書において使用される用語「アニーリング」又は「プライミング」は、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチド又は核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、上記並置は、ポリメラーゼがヌクレオチドを重合させて鋳型核酸又はそれの一部分に相補的な核酸分子を形成させる。
本明細書において使用される用語「ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」とは、相補的な一本鎖の核酸が二本鎖の核酸を形成することを意味する。ハイブリダイゼーションは、２本の核酸鎖間の相補性が完全な場合（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）に起こるか、又は一部のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても起こることができる。ハイブリダイゼーションに必要な相補性の程度は、ハイブリダイゼーション条件によって変わることができ、特に温度によって調節されることができる。
上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯとターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションは、最適化の手順によって通常決定される好適なハイブリダイゼーション条件下で行われることができる。温度、成分の濃度、ハイブリダイゼーション及び洗浄回数、緩衝液の成分及びこれらのｐＨ及びイオン強度のような条件は、オリゴヌクレオチド（上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯ）の長さ及びＧＣ量及びターゲットヌクレオチド配列を含んだ多様な因子によって変わり得る。例えば、相対的に短いオリゴヌクレオチドを用いる場合、低い厳しい条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を選択することが好ましい。ハイブリダイゼーションのための詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ など、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＭ．Ｌ．Ｍ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ．（１９９９）から確認することができる。
用語「アニーリング」と「ハイブリダイゼーション」とは違いがなく、本明細書において混用される。
上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯは、ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を持つ。本明細書において使用される用語「相補的」とは、所定のアニーリング条件又は厳しい条件の下でプライマー又はプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイゼーションする程度に充分に相補的であることを意味し、「実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」及び「完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」であることをいずれも包括する意味を有し、好ましくは完全に相補的であることを意味する。
ＰＴＯの５’タギング部位は、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を持つ。ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のテンプレーティング部位はＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を持つ。本明細書において使用される用語「非相補的」とは、所定のアニーリング条件又は厳しい条件の下でプライマー又はプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイゼーションされない程度に充分に非相補的であることを意味し、「実質的に非相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」及び「完全に非相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」であることをいずれも包括する意味を有し、好ましくは完全に非相補的であることを意味する。
例えば、ＰＴＯの５’タギング部位を言及しながら使用される用語「非相補的」とは、所定のアニーリング又は厳しい条件の下で上記５’タギング部位がターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイゼーションされない程度に充分に非相補的であることを意味し、「実質的に非相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」及び「完全に非相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」であることをいずれも包括する意味を有し、好ましくは完全に非相補的であることを意味する。
本明細書において使用される用語「ＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」とは、（ｉ）プローブとしての役割をする３’ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション後に切断されてＰＴＯから放出され、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を持つ５’タギング部位を含むオリゴヌクレオチドを意味する。ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位は、必ず５’→３’の順序で位置する。図１にＰＴＯを図式的に示す。
好ましくは、３’ターゲッティング部位がターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、５’タギング部位はターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされない厳しい条件の下でステップ（ａ）のハイブリダイゼーションが行われる。
ＰＴＯはある特定の長さを要求しない。例えば、ＰＴＯの長さは、１５〜１５０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、２０〜１５０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチド、３０〜１５０ヌクレオチド、３０〜１００ヌクレオチド、３０〜８０ヌクレオチド、３０〜６０ヌクレオチド、３０〜５０ヌクレオチド、３５〜１００ヌクレオチド、３５〜８０ヌクレオチド、３５〜６０ヌクレオチド又は３５〜５０ヌクレオチドの長さを持つことができる。ＰＴＯの３’ターゲッティング部位がターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイゼーションされる限り、いずれの長さであってもよい。例えば、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位は１０〜１００ヌクレオチド、１０〜８０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜５０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜５０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチド又は２０〜３０ヌクレオチドの長さを持つことができる。５’タギング部位は、ＣＴＯのテンプレーティング部位に特異的にハイブリダイゼーションされた後に伸長される限り、いずれの長さであってもよい。例えば、ＰＴＯの５’タギング部位は、５〜５０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、５〜２０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド、１５〜５０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド又は１５〜２０ヌクレオチドの長さを持つことができる。
ＰＴＯの３’末端は３’−ＯＨターミナル（ｔｅｒｍｉｎａｌ）を持つこともできる。好ましくは、ＰＴＯの３’末端は「ブロッキング」されてそれの伸長が防止される。
ブロッキングは、従来の方法によって達成されることができる。例えば、ブロッキングは最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にビオチン、標識、リン酸基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート又はアルカンジオール残基のような化学的部分（ｍｏｉｅｔｙ）を追加して行うことができる。または、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか又はジデオキシヌクレオチドのように３’−ヒドロキシル基のないヌクレオチドを用いて行うことができる。
または、ＰＴＯがヘアピン構造を持つようにデザインすることができる。
ＰＴＯの５’タギング部位とターゲット核酸配列との非ハイブリダイゼーションは、特定のハイブリダイゼーション条件下でそれら間で安定した二本鎖が非形成されることを意味する。好ましい一実現例によれば、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションに関与しないＰＴＯの５’タギング部位は、一本鎖を形成する。
上流オリゴヌクレオチドは、ＰＴＯの上流に位置する。
また、ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされた上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によるＰＴＯの切断を誘導する。
上流オリゴヌクレオチドによるＰＴＯ切断の誘導は、二つの方式で達成されることができる：（ｉ）上流オリゴヌクレオチド伸長独立的な切断の誘導；及び（ｉｉ）上流オリゴヌクレオチド伸長依存的な切断の誘導。
上流オリゴヌクレオチドが５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による上記ＰＴＯの切断反応を誘導するのに十分な程度にＰＴＯに近接して位置する場合、上流オリゴヌクレオチドに結合した上記酵素は伸長反応なくＰＴＯを切断する。一方、上流オリゴヌクレオチドがＰＴＯから離隔している場合、ポリメラーゼ活性を持つ酵素（例えば、鋳型依存的ポリメラーゼ）は、上流オリゴヌクレオチド（例えば、上流プライマー）の伸長を促進させ、伸長産物に結合された５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素はＰＴＯを切断する。
したがって、上流オリゴヌクレオチドは二つの方式でＰＴＯに対して相対的に位置することができる。上流オリゴヌクレオチドは、伸長独立的な方式でＰＴＯの切断を誘導するのに十分な程度にＰＴＯに近接した位置に位置することができる。または、上流オリゴヌクレオチドは、伸長依存的な方式でＰＴＯ切断を誘導するのに十分な程度にＰＴＯから離隔した位置に位置することができる。
本明細書において地点（ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）又は位置（ｌｏｃａｔｉｏｎｓ）を言及しながら使用される用語「近接（ａｄｊａｃｅｎｔ）」とは、上流オリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’ターゲッティング部位のすぐ近くに位置して切れ目（ｎｉｃｋ）を形成することを意味する。また、上記用語は、上流オリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’ターゲッティング部位から１〜３０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド又は１〜１５ヌクレオチド離隔して位置することを意味する。
本明細書において地点又は位置を言及しながら使用される用語「離隔（ｄｉｓｔａｎｔ）」とは、伸長反応が起こるのに十分な程度のある位置又は場所を含む。
好ましい一実現例によれば、上流オリゴヌクレオチドは、伸長依存的な方式でＰＴＯの切断を誘導するのに十分な程度にＰＴＯから離隔して位置することができる。
好ましい一実現例によれば、上流オリゴヌクレオチドは、上流プライマー又は上流プローブである。上流プライマーは伸長独立的な切断の誘導又は伸長依存的な切断に適しており、上流プローブは伸長独立的な切断の誘導に適している。
または、上流オリゴヌクレオチドは、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’の一部と部分的に重なる配列（ｐａｒｔｉａｌ−ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を持つことができる。好ましくは、重なる配列は１〜１０ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは１〜５ヌクレオチド、さらに好ましくは１〜３ヌクレオチドである。上流オリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’の一部と部分的に重なる配列（ｐａｒｔｉａｌ−ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を持つ場合、ステップ（ｂ）の切断反応で３’ターゲッティング部位は５’タギング部位とともに部分的に切断される。また、重なる配列は３’ターゲッティング部位の所望の特定位置が切断されるようにする。
好ましい一実現例によれば、上流プライマーは、それの伸長鎖によって５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によるＰＴＯの切断を誘導する。
上流オリゴヌクレオチドがターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされたＰＴＯの切断を誘導してＰＴＯの５’タギング部位又はＰＴＯの５’タギング部位の一部を含む断片が放出される限り、上流オリゴヌクレオチドによる切断反応に係る従来の技術は、本発明に適用されることができる。例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号、第７，３８１，５３２号及び米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号は本発明に応用することができる。
好ましい一実現例によれば、上記方法は、下流プライマーの存在下で行う。下流プライマーは、ＰＴＯにハイブリダイゼーションされるターゲット核酸配列を追加で生成させ、ターゲット検出の敏感度を向上する。
好ましい一実現例によれば、上流プライマー及び下流プライマーを用いる場合、プライマーの伸長のために鋳型依存的な核酸ポリメラーゼをさらに使用する。
好ましい一実現例によれば、上流オリゴヌクレオチド（上流プライマー又は上流プローブ）、下流プライマー及び／又はＰＴＯの５’タギング部位は、本発明者によって開発された二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する。ＤＰＯ構造を有するオリゴヌクレオチドは、従来のプライマー及びプローブに比べてかなり改善したターゲット特異度を示す（参照 ＷＯ ２００６／０９５９８１； Ｃｈｕｎなど、Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＣＹＰ２Ｃ１９ ｇｅｎｅ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３５：６ｅ４０（２００７））．
好ましい一実現例によれば、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位は、本発明者によって開発された変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する。変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造は、従来のプローブに比べてかなり改善したターゲット特異性を示す（参照 ＷＯ ２０１１／０２８０４１）。
ステップ（ｂ）：ＰＴＯからの断片の放出
次に、ＰＴＯの切断のための条件下でステップ（ａ）の結果物を５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に接触させる。ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされたＰＴＯは、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によって切断されてＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出する。
本明細書において使用される用語「ＰＴＯの切断のための条件」とは、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によってターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされたＰＴＯの切断が発生するのに十分な条件、例えば、温度、ｐＨ、イオン強度及び緩衝液、オリゴヌクレオチドの長さ及び配列、そして酵素を意味する。例えば、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素としてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼが用いられる場合、ＰＴＯの切断のための条件はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２及び温度を含む。
ＰＴＯがターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされる場合、それの３’ターゲッティング部位はハイブリダイゼーションに含まれるが、５’タギング部位はターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされずに一本鎖を形成する（参照：図２）。このように、一本鎖及び二本鎖の構造いずれを含むオリゴヌクレオチドは、当業界に知られている多様な技術によって５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素を用いて切断されることができる。
ＰＴＯの切断位置は、上流オリゴヌクレオチド（上流プローブ又は上流プライマー）の種類、上流オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション位置及び切断条件によって多様になる（参照 米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号及び第７，３８１，５３２号又は米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号）。
ＰＴＯの切断反応のために多数の従来の技術を用いることができ、５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出する。
総合すれば、ステップ（ｂ）の切断反応で三つの切断位置があり得る。第一の切断位置は、ＰＴＯのハイブリダイゼーション部位（３’ターゲッティング部位）と非ハイブリダイゼーション部位（５’タギング部位）との結合位置（ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）である。第二の切断位置は、ＰＴＯの５’タギング部位の３’末端から３’の方向に一部ヌクレオチド離隔した位置である。第二の切断位置は、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置することができる。第三の切断位置は、ＰＴＯの５’タギング部位の３’末端から５’の方向に一部ヌクレオチド離隔した位置である。
好ましい一実現例によれば、上流プライマーが伸長されながら５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的ポリメラーゼによってＰＴＯの切断が開始される位置は、ＰＴＯ及びターゲット核酸配列間の二本鎖が開始される地点又はその開始地点から１〜３ヌクレオチド離隔した位置である。
したがって、本明細書において、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によるＰＴＯの切断を言及しながら使用される用語「ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片」は、（ｉ）５’タギング部位、（ｉｉ）５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の５’末端の一部、及び（ｉｉｉ）５’タギング部位の一部を含む意味で使用される。また、本明細書において用語「ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片」は、「ＰＴＯ断片」と表現される。
一実現例によれば、ＰＴＯは５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による切断に対して耐性を持つ一つのブロッカーを含むブロッカー部位を持ち、上記ブロッカー部位は、初期切断位置及び／又は連続的な切断を調節するのに用いられる。
一実現例によれば、ＰＴＯはブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）として５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による切断に対して耐性を持つ少なくとも一つのヌクレオチドを含むブロッカー部位を持つ。
例えば、ＰＴＯのハイブリダイゼーション部位（３’ターゲッティング部位）と非ハイブリダイゼーション部位（５’タギング部位）との結合位置（ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）で切断を誘導するために、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はブロッカーでブロッキングされることができる。
ブロッカー部位に含まれるブロッカーの個数は制限されず、好ましくは１〜１０ブロッカー、より好ましくは２〜１０ブロッカー、さらに好ましくは３〜８ブロッカー、最も好ましくは３〜６ブロッカーである。プローブに存在するブロッカーは連続的又は不連続的な方式で存在することができ、好ましくは連続的な方式である。ブロッカーとしてのヌクレオチド、すなわち５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を持つ骨格を含むヌクレオチドは、当業界に知られているいずれのものも含む。例えば、上記ヌクレオチドは、多様なホスホロチオエート結合、ホスホネート結合、ホスホロアミダート結合及び２’−炭水化物修飾を含む。本発明のより好ましい一実現例によれば、５’→３’エキソヌクレアーゼに対して耐性を持つ骨格を含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合、アルキルホスホトリエステル結合、アリールホスホトリステル結合、アルキルホスホネート結合、アリールホスホネート結合、ハイドロゲンホスホネート結合、アルキルホスホロアミダート結合、アリールホスホロアミダート結合、ホスホロセレナート結合、２’−Ｏ−アミノプロピル修飾、２’−Ｏ−アルキル修飾、２’−Ｏ−アリル修飾、２’−Ｏ−ブチル修飾、α−アノメリックオリゴデオキシヌクレオチド及び１−（４’−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）修飾である。
一実現例によれば、ブロッカーとしてヌクレオチドはＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｌｃｅｉｃ ａｃｉｄ）を含む。
本明細書においてＰＴＯの５’タギング部位の一部、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部及びＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部のように、ＰＴＯ又はＣＴＯを言及しながら使用される用語「一部（ｐａｒｔ）」とは、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０又は１〜５ヌクレオチドで構成されたヌクレオチド配列を意味し、好ましくは１、２、３又は４ヌクレオチドである。
好ましい一実現例によれば、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素は５’ヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼ又はＦＥＮヌクレアーゼであり、より好ましくは、５’ヌクレアーゼ活性を持つ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ又はＦＥＮヌクレアーゼである。
本発明の好適な５’ヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼは、多様なバクテリア種から得た熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これはＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ， Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ， Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ， Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓを含む。最も好ましくは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼである。
または、本発明は、ポリメラーゼ活性が減少するように変形された、５’ヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
使用されるＦＥＮ（ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）ヌクレアーゼは、５’フラップ特異的なヌクレアーゼ（５’ｆｌａｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅ）である。
本発明に好適なＦＥＮヌクレアーゼは多様なバクテリア種から得たＦＥＮ ヌクレアーゼを含み、これはＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ， Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ， Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ， Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ， Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ｂｒｉｅｒｌｙｉ， Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ， Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ， Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ， Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ， Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ， Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｇｎｅｕｓ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ， Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ及びＡｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓを含む。
ステップ（ａ）で上流プライマーを用いる場合、ＰＴＯの切断のための条件は上流プライマーの伸長反応を含むことが好ましい。
好ましい一実現例によれば、ステップ（ａ）で上流プライマーを用い、上記上流プライマーの伸長のために鋳型依存的なポリメラーゼを用い、上記鋳型依存的なポリメラーゼは５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素と同一な酵素である。
または、ステップ（ａ）で上流プライマーを用い、上記上流プライマーの伸長のために鋳型依存的なポリメラーゼを用い、上記鋳型依存的なポリメラーゼは５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素と異なる酵素である。
ステップ（ｃ）：ＰＴＯから放出された断片とＣＴＯとのハイブリダイゼーション
ＰＴＯから放出された断片は、ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイゼーションされる。
ＣＴＯは３’→５’の方向に、（ｉ）ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含む。
ＣＴＯは、ＰＴＯから放出された断片の伸長のための鋳型の役割をする。プライマーとしての役割をする上記断片はＣＴＯにハイブリダイゼーションされ、伸長されて二重体を形成する。
テンプレーティング部位がＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的な配列を持つ限り、いずれの配列でも含むことができる。また、テンプレーティング部位がＰＴＯから放出された断片の伸長のための鋳型の役割ができる限り、いずれの配列でも含むことができる。
上述したように、ＰＴＯの５’タギング部位を持つ断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることが好ましい。５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の５’末端の一部を持つ断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることが好ましい。ＰＴＯの５’タギング部位の一部を持つ断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることが好ましい。
一方、ＰＴＯの切断位置を予想することでＣＴＯのキャプチャリング部位をデザインすることができる。例えば、ＣＴＯのキャプチャリング部位が５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインする場合、５’タギング部位の一部を持つ断片又は５’タギング部位を持つ断片はキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされることができ、その後、伸長される。５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の５’末端の一部を含む断片が放出される場合、上記断片は５’タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインされたＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされることができ、上記断片の３’末端部位にミスマッチヌクレオチドが存在するにもかかわらず、成功的に伸長されることができる。これはプライマーの３’末端が一部のミスマッチヌクレオチド（例えば、１〜３ミスマッチヌクレオチド）を含むにもかかわらず、プライマーが反応条件によって伸長されることができるからだ。
５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の５’末端の一部を含む断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部は上記切断された３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に相補的なヌクレオチド配列を持つようにデザインすることで、ミスマッチヌクレオチドに係る問題を解決することができる（参照：図１）。
好ましくは、切断された３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に相補的なＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部のヌクレオチド配列は、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位上の予想される切断位置によって選択されることができる。切断された３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に相補的なＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部のヌクレオチド配列は１〜１０ヌクレオチドであることが好ましく、より好ましくは１〜５ヌクレオチド、さらに好ましくは１〜３ヌクレオチドである。
ＣＴＯの３’末端は断片とのハイブリダイゼーションに含まれない追加のヌクレオチドを含むことができる。また、ＣＴＯが上記断片と安定してハイブリダイゼーションされる限り、ＣＴＯのキャプチャリング部位は上記断片の一部（例えば、断片の３’末端部位を含む断片の一部）にのみ相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。
本明細書において使用される用語「５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位」は、上述したようにＣＴＯのキャプチャリング部位の多様なデザイン及び構成を含んで説明する。
ＣＴＯは、ヘアピン構造を持つようにデザインすることができる。
ＣＴＯの長さは多様であってもよい。例えば、ＣＴＯは、７〜１０００ヌクレオチド、７〜５００ヌクレオチド、７〜３００ヌクレオチド、７〜１００ヌクレオチド、７〜８０ヌクレオチド、７〜６０ヌクレオチド、７〜４０ヌクレオチド、１５〜１０００ヌクレオチド、１５〜５００ヌクレオチド、１５〜３００ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、２０〜１０００ヌクレオチド、２０〜５００ヌクレオチド、２０〜３００ヌクレオチド、２０〜１００ヌクレオチド、２０〜８０ヌクレオチド、２０〜６０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチド、３０〜１０００ヌクレオチド、３０〜５００ヌクレオチド、３０〜３００ヌクレオチド、３０〜１００ヌクレオチド、３０〜８０ヌクレオチド、３０〜６０ヌクレオチド又は３０〜４０ヌクレオチドの長さである。ＣＴＯのキャプチャリング部位は、ＰＴＯから放出された断片に特異的にハイブリダイゼーションされる限り、いずれの長さであってもよい。例えば、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５〜１００ヌクレオチド、５〜６０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、５〜２０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチド、１０〜６０ヌクレオチド、１０〜４０ヌクレオチド、１０〜３０ヌクレオチド、１０〜２０ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド又は１５〜２０ヌクレオチドの長さを持つことができる。また、ＣＴＯのテンプレーティング部位はＰＴＯから放出された断片の伸長反応で鋳型の役割ができる限り、いずれの長さであってもよい。例えば、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、１〜９００ヌクレオチド、１〜４００ヌクレオチド、１〜３００ヌクレオチド、１〜１００ヌクレオチド、１〜８０ヌクレオチド、１〜６０ヌクレオチド、１〜４０ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド、２〜９００ヌクレオチド、２〜４００ヌクレオチド、２〜３００ヌクレオチド、２〜１００ヌクレオチド、２〜８０ヌクレオチド、２〜６０ヌクレオチド、２〜４０ヌクレオチド、２〜２０ヌクレオチド、５〜９００ヌクレオチド、５〜４００ヌクレオチド、５〜３００ヌクレオチド、５〜１００ヌクレオチド、５〜８０ヌクレオチド、５〜６０ヌクレオチド、５〜４０ヌクレオチド、５〜３０ヌクレオチド、１０〜９００ヌクレオチド、１０〜４００ヌクレオチド、１０〜３００ヌクレオチド、１５〜９００ヌクレオチド、１５〜１００ヌクレオチド、１５〜８０ヌクレオチド、１５〜６０ヌクレオチド、１５〜４０ヌクレオチド又は１５〜２０ヌクレオチドの長さを持つことができる。
ＣＴＯの３’末端は３’−ＯＨターミナルを持つことができる。好ましくは、ＣＴＯの３’末端はそれの伸長が防止されるようにブロッキングされる。ＣＴＯの非伸長ブロッキングは従来の方法によって達成されることができる。例えば、ブロッキングは、ＣＴＯの最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基にビオチン、標識、リン酸基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート又はアルカンジオール残基のような化学的部分（ｍｏｉｅｔｙ）を追加して行うことができる。または、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか又はジデオキシヌクレオチドのように３’−ヒドロキシル基のないヌクレオチドを用いて行うことができる。
ＰＴＯから放出された断片はＣＴＯとハイブリダイゼーションされ、断片の伸長に適した形態を提供する。また、非切断ＰＴＯがそれの５’タギング部位を通じてＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされても、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位はＣＴＯにハイブリダイゼーションされず、伸長二重体の形成が防止される。
ステップ（ｃ）でのハイブリダイゼーションは、ステップ（ａ）でのハイブリダイゼーションに関する説明を参照して詳細に説明されることができる。
ステップ（ｄ）：断片の伸長
鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及びステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行う。ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた断片は伸長され、伸長二重体を形成する。一方、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた非切断ＰＴＯは伸長されず、これによって伸長二重体も形成されない。
本明細書において使用される用語「伸長二重体」とは、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた断片が、鋳型依存的な核酸ポリメラーゼとＣＴＯのテンプレーティング部位を鋳型として用いて伸長される伸長反応によって形成された二重体を意味する。
伸長二重体は、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）のＴｍ値と異なるＴｍ値を持つ。
好ましくは、伸長二重体は、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドのＴｍ値より高いＴｍ値を持つ。
伸長二重体のＴｍ値は、（ｉ）断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）ＣＴＯの配列及び／又は長さ、又は（ｉｉｉ）断片の配列及び／又は長さとＣＴＯの配列及び／又は長さによって調節可能である。
ステップ（ｅ）で伸長二重体の融解によって伸長二重体の存在を示すターゲットシグナルが提供されるように伸長二重体の調節可能なＴｍ値を使用することは、本発明の大きな特徴である。
本明細書において使用される用語「Ｔｍ」は、二本鎖の核酸分子のポピュレーション（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の半分が一本鎖の分子に解離される融解温度を意味する。Ｔｍ値はハイブリダイゼーションされるヌクレオチドの長さ及びＧ／Ｃ含量によって決定される。Ｔｍ値はＷａｌｌａｃｅ ｒｕｌｅ（Ｒ．Ｂ． Ｗａｌｌａｃｅなど， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６：３５４３−３５４７（１９７９））及びｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ法（ＳａｎｔａＬｕｃｉａ Ｊ． Ｊｒ． など， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３５：３５５５−３５６２（１９９６））； Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｎ．など， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２４：４５０１−４５０５（１９９６））のような従来の方法によって計算されることができる。
好ましい一実現例によれば、Ｔｍ値は、実際使用する反応条件下での実際のＴｍ値を意味する。
ステップ（ｄ）で用いられる鋳型依存的な核酸ポリメラーゼはいずれの核酸ポリメラーゼも含まれ、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼＩの「クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）」断片、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びバクテリオファージＴ７ ＤＮＡポリメラーゼである。好ましくは、ポリメラーゼは多様なバクテリア種から得ることができる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、これはＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ， Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７， Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ， Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ， Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ， Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ， Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ， Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ， Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓを含む。最も好ましくは、鋳型依存的な核酸ポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼである。
好ましい一実現例によれば、ステップ（ｂ）で用いられる５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素は、ステップ（ｄ）で用いられる鋳型依存的な核酸ポリメラーゼと同一である。より好ましくは、ステップ（ｂ）で用いられる５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素、上流プライマー伸長のために用いられる鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ、及びステップ（ｄ）で用いられる鋳型依存的な核酸ポリメラーゼは、互いに同一である。
伸長二重体は、（ｉ）ＰＴＯ断片及び／又はＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）伸長反応中に伸長二重体内に挿入された標識、（ｉｉｉ）伸長反応中に伸長二重体内に挿入された標識及びＰＴＯ断片及び／又はＣＴＯに連結された標識、又は（ｉｖ）インターカレーティング標識（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｌａｂｅｌ）に由来する標識を持つ。
ターゲット核酸配列が存在する場合、伸長二重体が形成されるから、伸長二重体の存在はターゲット核酸配列の存在を示すことができる。直接的な方式で伸長二重体の存在を検出するためには、検出可能なシグナルを提供する標識を持つ伸長二重体がステップ（ｄ）で形成される。伸長二重体に用いられる標識は、伸長二重体が二本鎖又は一本鎖であるかによってシグナル変化を提供し、最終的に伸長二重体の融解によって伸長二重体の存在を示すターゲットシグナルを提供する。
ステップ（ｅ）：伸長二重体の融解
伸長反応に続き、伸長二重体は一定の範囲の温度で融解された伸長二重体の存在を示すターゲットシグナルを提供する。
ターゲットシグナルは、（ｉ）上記断片及び／又は上記ＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）上記伸長反応中に上記伸長二重体内に挿入された標識、（ｉｉｉ）上記伸長反応中に上記伸長二重体内に挿入された標識及び上記断片及び／又は上記ＣＴＯに連結された標識、又は（ｉｖ）インターカレーティング標識（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｌａｂｅｌ）によって提供される。
本明細書において使用される用語「ターゲットシグナル」とは、伸長二重体の存在を示すことができる全てのシグナルを意味する。例えば、ターゲットシグナルは標識からのシグナル（シグナル発生又は消滅）、標識からのシグナルの変化（シグナル増加又は減少）、融解曲線、融解パターン及び融解温度（又はＴｍ値）を含む。
好ましい一実現例によれば、ターゲットシグナルは、融解ステップで伸長二重体の標識からのシグナルの変化である。シグナルの変化は、少なくとも二つの異なる温度でシグナルを測定することで得ることができる。または、ターゲットシグナルは一定温度の範囲で伸長二重体の標識からのシグナルを測定することで得る融解曲線、融解パターン及び融解温度（又はＴｍ値）である。好ましくは、温度の範囲は、融解曲線分析のための温度の範囲又は伸長二重体のＴｍ値の周囲温度である。
伸長二重体は、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドより高いＴｍ値を持つ。よって、伸長二重体とハイブリッドとは互いに異なる融解パターンを示す。このような異なる融解パターンは非ターゲットシグナルとターゲットシグナルとを区別させる。異なる融解パターン又は融解温度は、好適な標識システムとともにターゲットシグナルを発生させる。
本発明に使用される好適な標識システムはこれらの種類、位置及びシグナル発生方式の側面において多様である。
本発明に有用な標識システムは、次のように詳細に説明されることができる：
（ｉ） 断片及び／又はＣＴＯに連結された標識
好ましい一実現例によれば、上記シグナルは、断片及び／又はＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識によって提供される。伸長二重体はＰＴＯ断片とＣＴＯとで形成されるので、ＰＴＯ断片又はＣＴＯの標識は伸長二重体に存在して融解ステップでターゲットシグナルを提供する。
標識は相互作用的な二重標識及び単一標識を含む。
（ｉ−１） 相互作用的な二重標識
相互作用的な標識システムは、ドナー分子及びアクセプター分子間でエネルギーが非放射性（ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｉｖｅｌｙ）で伝達されるシグナル発生システムである。相互作用的な標識システムの代表的な例として、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、蛍光レポーター分子（ドナー分子）及びクエンチャー分子（アクセプター分子）を含む。ＦＲＥＴで、エネルギー供与体は蛍光性であるが、エネルギー受容体は蛍光性又は非蛍光性であってもよい。相互作用的な標識システムの他の形態において、エネルギー供与体は非蛍光性、例えば発色団（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体は蛍光性である。相互作用的な標識システムのまた他の形態において、エネルギー供与体は発光性（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）、例えば、生物発光性、化学発光性又は電気化学発光性であり、受容体は蛍光性である。ドナー分子及びアクセプター分子は、本発明においてそれぞれレポーター分子及びクエンチャー分子として説明されることができる。
好ましくは、伸長二重体の存在（すなわち、ターゲット核酸配列の存在）を示すシグナルは相互作用的な標識システムによって発生され、より好ましくはＦＲＥＴ標識システム（すなわち、相互作用的な二重標識システム）である。
実現例１（鎖内の相互作用的な二重標識）
相互作用的な二重標識システムの実現例１において、断片又はＣＴＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識を持ち；上記ステップ（ｅ）での伸長二重体の融解は、相互作用的な二重標識からのシグナルの変化を誘導してステップ（ｅ）でターゲットシグナルを提供する。相互作用的な二重標識システムの実現例１は、図２、６及び９に図式的に示す。実現例１は鎖内の相互作用的な二重標識と命名される。
図２における実現例１（鎖内の相互作用的な二重標識）
例示された実現例は図２を参考にして説明される。ＣＴＯのテンプレーティング部位はレポーター分子及びクエンチャー分子を持つ。ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされたＰＴＯは切断されて断片を放出し、上記断片は、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされて伸長されて伸長二重体を形成する。
ステップ（ｄ）で伸長二重体が形成される場合、ＣＴＯのレポーター分子及びクエンチャー分子は構造的（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ）に離隔してクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングせず；ステップ（ｅ）で伸長二重体が融解される場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は構造的に互いに近接するようになってクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングし、これによってターゲットシグナルが提供されてステップ（ｅ）で伸長二重体の存在を示す。
本明細書において使用される表現「レポーター分子及びクエンチャー分子は構造的に近接した」とは、断片又はＣＴＯの形態的構造、例えばランダムコイル（ｃｏｉｌ）及びヘアピン構造によってレポーター分子及びクエンチャー分子が三次元的に互いに隣接するようになることを意味する。
本明細書において使用される表現「レポーター分子及びクエンチャー分子は構造的に離隔して」とは、二本鎖の形成による断片又はＣＴＯの形態的構造の変化によってレポーター分子及びクエンチャー分子が三次元的に離隔することを意味する。
好ましくは、ステップ（ｅ）で提供されるターゲットシグナルは、ステップ（ｄ）で発生される蛍光シグナルの変化を測定して得る融解曲線、融解パターン又はＴｍ値を含む。
好ましい一実現例によれば、伸長二重体の融解に依存的にレポーター分子からのシグナルがクエンチングされるか又はクエンチングされない限り、レポーター分子及びクエンチャー分子はＣＴＯのいずれの位置にも位置することができる。
好ましい一実現例によれば、レポーター分子及びクエンチャー分子はいずれもＣＴＯのテンプレーティング部位又はキャプチャリング部位に連結される。
好ましい一実現例によれば、レポーター分子及びクエンチャー分子はＣＴＯの５’末端及び３’末端に位置する。
好ましい一実現例によれば、ＣＴＯのレポーター分子及びクエンチャー分子のうち一つはそれの５’末端又はそれの５’末端から１〜５ヌクレオチド離隔した位置にあり、残りの一つはＣＴＯの形態によってレポーター分子からのシグナルをクエンチングする及びクエンチングしない位置に位置する。
好ましい一実現例によれば、ＣＴＯのレポーター分子及びクエンチャー分子のうち一つはそれの３’末端又はそれの３’末端から１〜５ヌクレオチド離隔した位置にあり、残りの一つはＣＴＯの形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によってレポーター分子からのシグナルをクエンチングする及びクエンチングしない位置に位置する。
好ましい一実現例によれば、レポーター分子及びクエンチャー分子は互いに最大８０ヌクレオチドだけ離隔した位置に位置し、より好ましくは最大６０ヌクレオチド、さらに好ましくは最大３０ヌクレオチド、最も好ましくは最大２５ヌクレオチドである。好ましい一実現例によれば、レポーター分子及びクエンチャー分子は少なくとも４ヌクレオチドだけ離隔した位置に位置し、より好ましくは少なくとも６ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドである。
本発明において、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドが形成されることができる。
図２に示すように、ＣＴＯのテンプレーティング部位が相互作用的な二重標識で標識される場合、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドの標識からのシグナルの変化は誘導されない。よって、ハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供しない。
ＣＴＯのキャプチャリング部位が相互作用的な二重標識で標識される場合、融解ステップで非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供する。このような場合、伸長二重体とハイブリッドとのＴｍ値の差で、伸長二重体のターゲットシグナルとハイブリッドの非ターゲットシグナルとを区別することができる。
図６における実現例１（鎖内の相互作用的な二重標識）
例示された実現例は図６を参考にして説明される。ＰＴＯの５’タギング部位はレポーター分子及びクエンチャー分子を持つ。ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされたＰＴＯは切断されて、レポーター分子及びクエンチャー分子がある５’タギング部位を含む断片を放出する。上記断片はＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされる。
ステップ（ｄ）で伸長二重体が形成される場合、断片のレポーター分子及びクエンチャー分子は構造的に離隔してクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングせず；ステップ（ｅ）で伸長二重体が融解される場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は構造的に互いに近接するようになってクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングし、これによってターゲットシグナルが提供されてステップ（ｅ）で伸長二重体の存在を示す。
好ましい一実現例によれば、伸長二重体の融解によってレポーター分子からのシグナルがクエンチングされるか及びクエンチングされない限り、レポーター分子及びクエンチャー分子は断片のいずれの位置にも位置することができる。
好ましい一実現例によれば、断片のレポーター分子及びクエンチャー分子のうち一つはそれの５’末端又はそれの５’末端から１〜５ヌクレオチド離隔した位置にあり、残りの一つは断片の形態（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によってレポーター分子からのシグナルをクエンチングする及びクエンチングしない位置に位置する。
好ましい一実現例によれば、レポーター分子及びクエンチャー分子は互いに最大５０ヌクレオチドだけ離隔した位置に位置し、より好ましくは最大４０ヌクレオチド、さらに好ましくは最大３０ヌクレオチド、最も好ましくは最大２０ヌクレオチドである。好ましい一実現例によれば、レポーター分子及びクエンチャー分子は少なくとも４ヌクレオチドだけ離隔した位置に位置し、より好ましくは少なくとも６ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドである。
図６に示すように、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは融解ステップで非ターゲットシグナルを提供する。このような場合、伸長二重体とハイブリッドとのＴｍ値の差で、伸長二重体のターゲットシグナルとハイブリッドの非ターゲットシグナルとを区別することができる。
実現例２（鎖間の相互作用的な二重標識）
相互作用的な標識システムの実現例２において、断片はレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識のうち一つを持ち、ＣＴＯは相互作用的な二重標識の残りの一つを持ち；上記ステップ（ｅ）での伸長二重体の融解は相互作用的な二重標識からのシグナルの変化を誘導して、ステップ（ｅ）でターゲットシグナルを提供する。
例示された実現例は図８を参考にして説明される。
ステップ（ｄ）で伸長二重体が形成される場合、ＰＴＯに連結されたクエンチャー分子によってＣＴＯに連結されたレポーター分子からのシグナルがクエンチングされる。ステップ（ｅ）で伸長二重体が融解される場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は互いに離隔してクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングせず、これによってターゲットシグナルが提供されてステップ（ｅ）で伸長二重体の存在を示す。
好ましくは、ステップ（ｅ）で提供されるターゲットシグナルは、相互作用的な二重標識からの蛍光シグナルの変化を測定して得る融解曲線、融解パターン又はＴｍ値を含む。
伸長二重体のクエンチャー分子によってレポーター分子からのシグナルがクエンチングされる限り、レポーター分子及びクエンチャー分子はＰＴＯ断片及びＣＴＯのいずれの位置にも位置することができる。
好ましい一実現例によれば、ＰＴＯのレポーター分子又はクエンチャー分子は５’タギング部位の５’末端に位置する。
好ましい一実現例によれば、ＣＴＯのレポーター分子又はクエンチャー分子はそれの３’末端に位置する。
図８に示すように、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは、融解ステップで非ターゲットシグナルを提供する。このような場合、伸長二重体とハイブリッドとのＴｍ値の差で、伸長二重体のターゲットシグナルとハイブリッドの非ターゲットシグナルとを区別することができる。
本発明において有用なレポーター分子及びクエンチャー分子は、当業界に知られているいずれの分子でも含むことができる。その例は次のとおりである： Ｃｙ２ＴＭ （５０６）， ＹＯ−ＰＲＯＴＭ −１ （５０９）， ＹＯＹＯＴＭ −１ （５０９）， Ｃａｌｃｅｉｎ （５１７）， ＦＩＴＣ （５１８）， ＦｌｕｏｒＸＴＭ （５１９）， ＡｌｅｘａＴＭ （５２０）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０ （５２０）， Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ５００ （５２２）， Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ４８８ （５２４）， ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ （５２５）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ （５２７）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３ （５２９）， Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ （５３１）， Ｃａｌｃｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ （５３３）， ＴＯ−ＰＲＯＴＭ −１ （５３３）， ＴＯＴＯ１ （５３３）， ＪＯＥ （５４８）， ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０ （５５０）， Ｄｉｌ （５６５）， ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ （５６８）， ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８ （５６８）， ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０ （５７０）， Ｃｙ３ＴＭ （５７０）， ＡｌｅｘａＴＭ ５４６ （５７０）， ＴＲＩＴＣ （５７２）， Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ＯｒａｎｇｅＴＭ （５７５）， Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ＆Ｂ （５７５）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ （５７５）， Ｃａｌｃｉｕｍ ＯｒａｎｇｅＴＭ （５７６）， Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ （５８０）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ （５８０）， ＴＡＭＲＡ （５８２）， Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ （５９０）， Ｃｙ３．５ＴＭ （５９６）， ＲＯＸ （６０８）， Ｃａｌｃｉｕｍ ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ （６１５）， ＡｌｅｘａＴＭ ５９４ （６１５）， Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（６１５）， Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ （６２８）， ＹＯ−ＰＲＯＴＭ −３ （６３１）， ＹＯＹＯＴＭ −３ （６３１）， Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ （６４２）， Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ （６４８）， ＴＯ−ＰＲＯＴＭ −３ （６６０）， ＴＯＴＯ３ （６６０）， ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５） （６６５）， Ｃｙ５ＴＭ （６７０）， Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ （６７１）， Ｃｙ５．５ （６９４）， ＨＥＸ （５５６）， ＴＥＴ （５３６）， Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｂｌｕｅ （４４７）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０ （５４４）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０ （５５９）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０ （５９１）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０ （６１０）， ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５ （６３７）， ＦＡＭ （５２０）， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ （５２０）， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３ （５２０）， Ｐｕｌｓａｒ ６５０ （５６６）， Ｑｕａｓａｒ ５７０ （６６７）， Ｑｕａｓａｒ ６７０ （７０５）及びＱｕａｓａｒ ７０５ （６１０）。カッコの数字はナノメートル単位で表示した発光最大波長である。好ましくは、レポーター分子及びクエンチャー分子は、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ及びフルオレセイン基盤標識を含む。
好適なレポーター−クエンチャー対は多くの文献に開示されている： Ｐｅｓｃｅなど， ｅｄｉｔｏｒｓ， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７１）； Ｗｈｉｔｅ など， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７０）； Ｂｅｒｌｍａｎ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７１）； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｃｏｌｏｒ ＡＮＤ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７６）； Ｂｉｓｈｏｐ， ｅｄｉｔｏｒ， Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ （Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９７２）； Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， １９９２）； Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ， Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ （Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９４９）； Ｈａｕｇｌａｎｄ， Ｒ． Ｐ．， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， ６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， Ｏｒｅｇ．， １９９６）； 米国特許第３，９９６，３４５号及び第４，３５１，７６０号。
本発明において、広範囲な波長又は特定波長の蛍光をクエンチングできる非蛍光ブラッククエンチャー分子が使用されることができるということは注目に値する。非蛍光ブラッククエンチャー分子の例は、ＢＨＱ及びＤＡＢＣＹＬである。
ＣＴＯに適用されるＦＲＥＴ標識で、レポーターはＦＲＥＴのドナーを含み、クエンチャーはＦＲＥＴの残りのパートナー（アクセプター）を含む。例えば、フルオレセイン色素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｙｅ）はレポーターとして用いられ、ローダミン色素（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｄｙｅ）はクエンチャーとして使用される。
上記標識は、従来の方法によってＣＴＯ又はＰＴＯに連結されることができる。好ましくは、炭素原子を含むスペーサー（例えば、３−カーボンスペーサー、６−カーボンスペーサー又は１２−カーボンスペーサー）を介してＣＴＯ又はＰＴＯに連結される。
（ｉ−２）単一標識
また、本発明は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを提供する単一標識システムを用いて優秀に行われる。
好ましい一実現例によれば、断片又はＣＴＯは単一標識を持ち、ステップ（ｅ）での伸長二重体の融解は単一標識からのシグナルの変化を誘導して、ステップ（ｅ）でターゲットシグナルを提供する。
図３における実現例１（単一標識システム）
例示された実現例は図３を参考にして説明される。ＣＴＯのテンプレーティング部位は単一蛍光標識を持つ。ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされたＰＴＯは切断されて断片を放出する。上記断片はＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされ伸長されて、伸長二重体を形成する。伸長二重体の形成によって、単一蛍光標識から出る蛍光の強度は増加する。伸長二重体がステップ（ｅ）で融解される場合、単一蛍光標識から出る蛍光の強度は減少し、これによってターゲットシグナルが提供されてステップ（ｅ）で伸長二重体の存在を示す。
好ましい一実現例によれば、伸長二重体の融解によって単一標識からのシグナルの水準に変化がある限り、単一標識はＣＴＯのいずれの位置にも位置することができる。
好ましい一実現例によれば、単一標識はＣＴＯのテンプレーティング部位又はキャプチャリング部位に連結される。
図３に示すように、ＣＴＯのテンプレーティング部位が単一標識で標識される場合、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドの標識からのシグナルの変化が誘導されない。よって、ハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供しない。
ＣＴＯのキャプチャリング部位が単一標識で標識される場合、融解ステップで非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供する。このような場合、伸長二重体とハイブリッドとのＴｍ値の差で、伸長二重体のターゲットシグナルとハイブリッドの非ターゲットシグナルとを区別することができる。
図７における実現例２（単一標識システム）
例示された実現例は図７を参考にして説明される。ＰＴＯの５’タギング部位は単一蛍光標識を持つ。ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされたＰＴＯは切断されて、単一蛍光標識がある５’タギング部位を含む断片を放出する。ハイブリダイゼーションによって、５’タギング部位の単一蛍光標識から出る蛍光の強度は増加する。伸長二重体がステップ（ｅ）で融解される場合、単一蛍光標識から出るシグナル強度は減少し、これによってターゲットシグナルが提供されてステップ（ｅ）で伸長二重体の存在を示す。
好ましい一実現例によれば、伸長二重体の融解によって単一標識からのシグナルの水準に変化がある限り、単一標識はＰＴＯ断片のいずれの位置にも位置することができる。
図７に示すように、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは、融解ステップで非ターゲットシグナルを提供する。このような場合、伸長二重体とハイブリッドとのＴｍ値の差で、伸長二重体のターゲットシグナルとハイブリッドの非ターゲットシグナルとを区別する。
本明細書において使用される単一標識は、二本鎖上又は一本鎖上に存在するのかによって異なるシグナルを提供しなければならない。単一標識は蛍光標識、発光標識、化学発光標識、電気化学的標識及び金属標識を含む。好ましくは、単一標識は蛍光標識を含む。
本発明において使用される単一蛍光標識の種類及び好ましい結合位置は、米国特許第７，５３７，８８６号及び第７，３４８，１４１号に開示されており、それの教示事項は本明細書に参照として組み込まれる。好ましくは、単一蛍光標識は、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ及びフルオレセイン基盤標識を含む。標識されるヌクレオチドの残基は、５’末端又は３’末端よりオリゴヌクレオチド内の内部ヌクレオチド残基に位置することが好ましい。
本発明において有用な単一蛍光標識は、上述したレポーター及びクエンチャー分子に関する説明を参照して説明することができる。
特に、固相で本発明が単一標識を用いて行われる場合、通常の蛍光標識を用いることができ、二本鎖上又は一本鎖上に存在するのかによって異なる強度を持つ蛍光シグナルを提供することができる特定の蛍光標識を必要としない。固相基質で提供されるターゲットシグナルが測定される。固定化されたＣＴＯを使用する単一標識システムの実現例は、図１２に図式的に示す。
固相基質上に固定化されたＣＴＯを用いる場合、化学的標識（例えば、ビオチン）又は酵素的標識（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ）を用いることができる。
「断片及び／又はＣＴＯに連結された標識」を用いる標識システムにおいて、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドが形成される場合に、標識は上記ハイブリッドがステップ（ｅ）で非ターゲットシグナルを提供しない範囲内に位置する。または、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドが形成される場合に、標識は上記ハイブリッドがステップ（ｅ）で非ターゲットシグナルを提供する範囲内に位置することができ；上記伸長二重体のＴｍ値は非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドのＴｍ値より高い。
特に、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドが非ターゲットシグナルを提供しない範囲内に位置する場合、上記ハイブリッドのＴｍ値を含んでいる区間は、ターゲット核酸配列の検出のための伸長二重体のＴｍ値を選択するのに用いられることができる。
（ｉｉ）伸長二重体内に挿入された標識
本発明は、伸長二重体の存在を示すターゲットシグナルを提供するために、伸長反応中に伸長二重体内に挿入された標識を用いることができる。
たとえＰＴＯ断片又はＣＴＯが標識を持たなくても、伸長反応中に伸長二重体内に挿入された標識を用いて成功的に伸長二重体を標識させる。図１０及び１１は、単一標識ヌクレオチドが伸長反応中に伸長二重体内に挿入された実現例を図式的に示す（参照：図１０及び１１のＣ及びＤ）。また、本実現例は、融解分析を用いる他の実現例にも適用することができる。
好ましい一実現例によれば、ターゲットシグナルは伸長反応中に伸長二重体内に挿入された単一標識によって提供され；上記挿入された単一標識は伸長反応中に挿入されるヌクレオチドに連結されており；ステップ（ｅ）での上記伸長二重体の融解は単一標識からのシグナルの変化を誘導して、ステップ（ｅ）でターゲットシグナルを提供する。
例示された実現例は図１０を参考にして説明される。ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされたＰＴＯは切断されて断片を放出する。上記断片は固相基質上に固定化されたＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされ、単一蛍光標識で標識されたヌクレオチドの存在下で伸長されて伸長二重体を形成する。伸長二重体からの蛍光シグナルは、ＣＴＯが固定化された固相基質のスポット上で検出することができる。伸長二重体が融解される場合、蛍光標識を持つ鎖は放出され、スポット上ではこれ以上蛍光シグナルが検出されない（図１０には示されていない）。よって、シグナルの変化が伸長二重体の融解によってスポット上で提供されることができる。すなわち、ターゲットシグナルが提供されてステップ（ｅ）で伸長二重体の存在を示す。
ステップ（ｅ）で提供されるターゲットシグナルは、ＣＴＯ固定化スポット上で蛍光強度の変化を測定して得る融解曲線、融解パターン又はＴｍ値を含む。
好ましい一実現例によれば、伸長反応中に挿入（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）されるヌクレオチドはｄｄＮＴＰである。
好ましい一実現例によれば、図１１に図式的に示すように、伸長反応中に挿入されたヌクレオチドは第１の非天然型塩基（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅ）を持ち、ＣＴＯは上記第１の非天然型塩基に対して特異的な結合親和性のある第２の非天然型塩基を持つ。好ましくは、第２の非天然型塩基を持つヌクレオチドは、ＣＴＯのテンプレーティング部位のいずれの位置にも位置する。
本明細書において使用される用語「非天然型塩基」とは、水素結合塩基対を形成することができるアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）のような天然型塩基の誘導体を意味する。本明細書において使用される用語「非天然型塩基」は、母化合物（ｍｏｔｈｅｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として天然的塩基と異なる塩基対パターンを持つ塩基を含み、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号、第５，９６５，３６４号、第６，００１，９８３号及び第６，０３７，１２０号に記載されている。非天然型塩基間の塩基対は天然型塩基と類似に二つ又は三つの水素結合を含む。また、非天然型塩基間の塩基対は特定の方式でも形成される。
非天然型塩基の特定の例は、次の塩基の塩基対の組み合わせを含む： ｉｓｏ−Ｃ／ｉｓｏ−Ｇ、ｉｓｏ−ｄＣ／ｉｓｏ−ｄＧ、Ｋ／Ｘ、Ｈ／Ｊ及びＭ／Ｎ（参照 米国特許第７，４２２，８５０号）。
例示された実現例は、図１１を参考にして説明される。第１の非天然型塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＧ）に対して特異的な結合親和性のある第２の非天然型塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＣ）を持つヌクレオチドを含むＣＴＯに断片がハイブリダイゼーションされる。単一蛍光標識で標識された第１の非天然型塩基を持つヌクレオチドの存在下で伸長が行われ、伸長二重体を形成する。伸長反応で、第１の非天然型塩基を持つヌクレオチドは第２の非天然型塩基を持つヌクレオチドの向かい側の位置に挿入される。
伸長二重体から出る蛍光シグナルは固定化されたＣＴＯがある固相基質のスポット上で検出されることができる。伸長二重体が融解される場合、蛍光標識を持つ鎖は放出され、スポット上ではこれ以上蛍光シグナルが検出されない（図１１には示されていない）。よって、シグナルの変化が伸長二重体の融解によってスポット上で提供されることができる。すなわち、ターゲットシグナルが提供されてステップ（ｅ）で伸長二重体の存在を示す。
伸長反応中に伸長二重体内に挿入された標識を用いる場合、標識は非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッド内に含まれない。これは、ハイブリッドが伸長されないからだ。よって、ハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供しない。
使用される単一標識の種類及び特徴は、本明細書において上述した「断片及び／又はＣＴＯに連結された標識」を用いる標識システムに関する説明を参照して説明されることができる。
（ｉｉｉ）伸長二重体内に挿入された標識と断片又はＣＴＯに連結された標識
図４及び５に図式的に示すように、本発明は、伸長反応中に伸長二重体内に挿入された標識と断片及び／又はＣＴＯに連結された標識との組み合わせを用いた標識システムを用いることができる。
好ましい一実現例によれば、ターゲットシグナルは、伸長反応中に伸長二重体内に挿入された標識と断片及び／又はＣＴＯに連結された標識によって提供され、挿入された標識は上記伸長反応中に挿入されたヌクレオチドに連結されており；上記二つの標識はレポーター分子及びクエンチャー分子の相互作用的な二重標識であり；上記ステップ（ｅ）での伸長二重体の融解は相互作用的な二重標識からのシグナルの変化を誘導して、ステップ（ｅ）でのターゲットシグナルを提供する。
より好ましくは、伸長反応中に挿入されたヌクレオチドは第１の非天然型塩基を持ち、ＣＴＯは第１の非天然型塩基に対して特異的な結合親和性のある第２の非天然型塩基を持つ。
例示された実現例は、図４を参考にして説明される。レポーター又はクエンチャー分子及び第１の非天然型塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＧ）に対して特異的な結合親和性のある第２の非天然塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＣ）を持つヌクレオチドを含むＣＴＯに断片がハイブリダイゼーションされる。クエンチャー又はレポーター分子で標識された第１の非天然型塩基を持つヌクレオチドの存在下で伸長が行われて、伸長二重体が形成され、レポーター分子からのシグナルがクエンチャー分子によってクエンチングされる。伸長反応で、第１の非天然型塩基を持つヌクレオチドは第２の非天然型塩基を持つヌクレオチドの向かい側の位置に挿入される。
ステップ（ｅ）で伸長二重体が融解される場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は互いに離隔してクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングせず、これによってターゲットシグナルが提供されてステップ（ｅ）で伸長二重体の存在を示す。
好ましくは、ステップ（ｅ）で提供されるターゲットシグナルは、相互作用的な二重標識からのシグナルの変化を測定して得る融解曲線、融解パターン又はＴｍ値を含む。
ＣＴＯ上での標識位置及び挿入される標識の挿入位置は、融解ステップで上記二つの標識がシグナルの変化を誘導する相互作用的な二重標識として作用する範囲内で決定される。
より好ましくは、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、レポーター又はクエンチャー分子及び第２の非天然型塩基を持つヌクレオチドを持つ。ステップ（ｄ）での伸長反応は、クエンチャー又はレポーター分子及びＣＴＯ内の第２の非天然型塩基に対して特異的な結合親和性のある第１の非天然型塩基を持つヌクレオチドの存在下で行われる。ステップ（ｄ）の伸長二重体の二つの非天然型塩基は、塩基対を形成しながらクエンチャー分子によってレポーター分子からのシグナルをクエンチングしてシグナルの変化を誘導し、これによってターゲットシグナルが提供される。または、断片はレポーター又はクエンチャー分子を持ち、ＣＴＯのテンプレーティング部位は第２の非天然型塩基を持つヌクレオチドを持つ。ステップ（ｄ）での伸長反応は、クエンチャー又はレポーター分子及びＣＴＯ内の第２の非天然型塩基に対して特異的な結合親和性のある第１の非天然型塩基を持つヌクレオチドの存在下で行われる。ステップ（ｄ）の伸長二重体の二つの非天然型塩基は塩基対を形成しながらクエンチングによってレポーター分子からのシグナルの変化を誘導し、これによってターゲットシグナルが提供される。
また他の例示された実現例は、図５を参考にして説明される。本実現例では、レポーター又はクエンチャー分子を含む断片が第１の非天然型塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＧ）に対して特異的な結合親和性のある第２の非天然型塩基（例えば、ｉｓｏ−ｄＣ）を持つヌクレオチドを含むＣＴＯにハイブリダイゼーションされる。クエンチャー又はレポーター分子で標識された第１の非天然型塩基を持つヌクレオチドの存在下で伸長が行われて、伸長二重体が形成され、レポーター分子からのシグナルがクエンチャー分子によってクエンチングされる。伸長反応で、第１の非天然型塩基を持つヌクレオチドは、第２の非天然型塩基を持つヌクレオチドの向かい側の位置に挿入される。
ステップ（ｄ）で伸長二重体が形成される場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は構造的に互いに離隔してクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングせず；上記ステップ（ｅ）で伸長二重体が融解される場合、レポーター分子及びクエンチャー分子は構造的に互いに近接することになってクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングし、これによってターゲットシグナルが提供されてステップ（ｅ）で伸長二重体の存在を示す。
好ましくは、ステップ（ｅ）で提供されるターゲットシグナルは、相互作用的な二重標識からのシグナルの変化を測定して得る融解曲線、融解パターン又はＴｍ値を含む。
ＰＴＯの標識位置及び挿入される標識の挿入位置は、融解ステップで二つの標識がシグナルの変化を誘導する相互作用的な二重標識として作用する範囲内で決定される。
伸長反応中に伸長二重体内に挿入された標識を用いる場合、標識は非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッド内に含まれない。これは、ハイブリッドが伸長されないからだ。よって、ハイブリッドは融解ステップで非ターゲットシグナルを提供しない。
（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｌａｂｅｌ）
本発明は、伸長二重体の存在を示すターゲットシグナルを提供するインターカレーティング標識を使用することができる。試料内の二本鎖の核酸分子がシグナルを発生させることができるから、固定化されたＣＴＯを用いる固相反応ではインターカレーティング標識がより有用である。
本発明で有用なインターカレーティング標識の例は、ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｉ， ＰＯ−ＰＲＯＴＭ−１， ＢＯ−ＰＲＯＴＭ−１， ＳＹＴＯＴＭ４３， ＳＹＴＯＴＭ４４， ＳＹＴＯＴＭ４５， ＳＹＴＯＸＴＭＢｌｕｅ， ＰＯＰＯＴＭ−１， ＰＯＰＯＴＭ−３， ＢＯＢＯＴＭ−１， ＢＯＢＯＴＭ−３， ＬＯ−ＰＲＯＴＭ−１， ＪＯ−ＰＲＯＴＭ−１， ＹＯ−ＰＲＯＴＭ１， ＴＯ−ＰＲＯＴＭ１， ＳＹＴＯＴＭ１１， ＳＹＴＯＴＭ１３， ＳＹＴＯＴＭ１５， ＳＹＴＯＴＭ１６， ＳＹＴＯＴＭ２０， ＳＹＴＯＴＭ２３， ＴＯＴＯＴＭ−３， ＹＯＹＯＴＭ３， ＧｅｌＳｔａｒＴＭ及びチアゾールオレンジ（ｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅ）を含む。インターカレーティング染料が二本鎖の核酸分子内に特異的に入り込んでシグナルを発生させる。
伸長二重体の塩基対の間にインターカレーティング染料が入り込む実現例を、図１３に図式的に示す（図１３のＣ及びＤ）。また、本実現例は、融解分析を用いる他の実現例にも適用することができる。
例示された実現例は、図１３を参考にして説明される。固相基質上に固定化されたＣＴＯのキャプチャリング部位に断片がハイブリダイゼーションされる。インターカレーティング染料（例えば、ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ）の存在下で伸長を行って、インターカレーティング染料を含む伸長二重体を生成する。固定化されたＣＴＯがある固相基質のスポット上の伸長二重体から出る蛍光シグナルは、インターカレーティング蛍光染料を用いて検出されることができる。伸長二重体が融解される場合、インターカレーティング蛍光染料が放出されてスポット上でそれ以上蛍光シグナルが検出されない（図１３には示されていない）。よって、ターゲットシグナルが提供されてステップ（ｅ）で伸長二重体の存在を示す。
非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは融解ステップで非ターゲットシグナルを提供する。このような場合、伸長二重体とハイブリッドとのＴｍ値の差で、伸長二重体のターゲットシグナルとハイブリッドの非ターゲットシグナルとを区別することができる（図１３には示されていない）。
好ましくは、ステップ（ｅ）で提供されるターゲットシグナルは、ステップ（ｅ）で発生される蛍光シグナルの変化を測定して得る融解曲線、融解パターン又はＴｍ値を含む。
ステップ（ｆ）：ターゲットシグナルの検出
最終的に、伸長二重体はステップ（ｅ）で提供されるターゲットシグナルを測定することで検出され、これによって伸長二重体の存在はターゲット核酸配列の存在を示す。
ターゲットシグナルの種類によって多様な方法で検出を行うことができる。
好ましい一実現例によれば、ターゲットシグナルの検出は融解分析によって行われる。
本明細書において使用される用語「融解分析」とは、伸長二重体の融解によって伸長二重体の存在を示すターゲットシグナルを得る方法を意味し、二つの異なる温度でシグナルを測定する方法、融解曲線分析、融解パターン分析、及び融解ピーク分析を含む。好ましくは、融解分析は融解曲線分析である。
好ましい一実現例によれば、ステップ（ｅ）で伸長鎖の存在の検出は融解分析を通じて行い、伸長二重体は伸長二重体の存在を示すターゲットシグナルを提供する一定範囲の温度で融解される。
または、ステップ（ｅ）で伸長鎖の存在の検出はハイブリダイゼーション分析を通じて行う。好ましくは、ステップ（ｅ）で伸長鎖の存在の検出はハイブリダイゼーション分析を通じて行い、伸長二重体は融解され、その結果物は伸長二重体の存在を示すターゲットシグナルを提供する一定範囲の温度でハイブリダイゼーションされる。
本明細書における好ましい一実現例によれば、ステップ（ｅ）の融解後にハイブリダイゼーションを行って上記伸長二重体の存在を示すターゲットシグナルを提供する。このような場合、伸長二重体の存在はハイブリダイゼーション曲線分析によって検出される。
融解曲線又はハイブリダイゼーション曲線は、従来の技術、例えば、米国特許第６，１７４，６７０号及び第５，７８９，１６７号、Ｄｒｏｂｙｓｈｅｖなど、Ｇｅｎｅ １８８： ４５（１９９７）； Ｋｏｃｈｉｎｓｋｙ ａｎｄ Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ １９：３４３（２００２）； Ｌｉｖｅｈｉｔｓなど、Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｄｙｎａｍ． １１：７８３（１９９４）；及びＨｏｗｅｌｌなど、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８７（１９９９）で説明するとおり得ることができる。例えば、融解曲線又はハイブリダイゼーション曲線は、ハイブリダイゼーション厳格度（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）のパラメータに対する出力シグナル（ｏｕｔｐｕｔ ｓｉｇｎａｌ）の変化のグラフィックプロット（ｇｒａｐｈｉｃ ｐｌｏｔ）又はディスプレイ（ｄｉｓｐｌａｙ）で構成されることができる。出力シグナルはハイブリダイゼーションパラメータに対して直接にプロッティングすることができる。典型的に、融解曲線又はハイブリダイゼーション曲線は、例えば、Ｙ軸には二重体構造の程度（すなわち、ハイブリダイゼーション程度）を示す蛍光が、Ｘ軸にはハイブリダイゼーションパラメータがプロッティング（ｐｌｏｔｔｉｎｇ）された出力シグナルを持つ。
蛍光ｖｓ．温度の一次導関数（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）のプロット、すなわち、蛍光ｖｓ．温度（ｄＦ／ｄＴ ｖｓ． Ｔ）又は（−ｄＦ／ｄＴ ｖｓ． Ｔ）で変化率プロットは融解ピークを提供する。
ＰＴＯ及びＣＴＯは天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰｓから構成されることができる。または、ＰＴＯ及びＣＴＯは、修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチド、例えば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、参照 ＰＣＴ出願第ＷＯ ９２／２０７０２号）及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、参照 ＰＣＴ出願第ＷＯ ９８／２２４８９号、第ＷＯ ９８／３９３５２号及び第ＷＯ ９９／１４２２６号）を含むことができる。ＰＴＯ及びＣＴＯは、デオキシイノシン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール及び５−ニトロインドールのようなユニバーサル塩基を含むことができる。用語「ユニバーサル塩基」とは、天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基それぞれに対してほとんど区別なく塩基対を形成できることを意味する。
上述したように、ＰＴＯは、ＰＴＯの５’タギング部位の３’末端から３’方向に離隔した一位置で切断されることができる。切断位置は、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置することができる。ＰＴＯ断片がＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部を含む場合、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部にハイブリダイゼーションされるＣＴＯの位置は、ユニバーサル塩基、縮重配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）又はそれらの組み合わせを含むことができる。例えば、ＰＴＯがＰＴＯの５’タギング部位の３’末端から ３’方向に一つのヌクレオチドだけ離隔した一位置で切断されると、上記ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのためにＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端の一部はユニバーサル塩基を含むことが有利である。仮に、ＰＴＯがＰＴＯの５’タギング部位の３’末端から３’方向に二つのヌクレオチドだけ離隔した一位置で切断されると、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’末端は縮重配列を含み、それの３’方向に隣接したヌクレオチドはユニバーサル塩基を含むのが有利である。このように、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部の多様な位置でＰＴＯの切断が起こる場合、ＣＴＯにユニバーサル塩基及び縮重配列を用いるのが有用である。また、上流プライマー伸長依存的な切断誘導下で、同一の５’タギング部位を持つＰＴＯを複数のターゲット核酸配列スクリーニングに用いる場合、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部が互いに異なるＰＴＯ断片を生成することができる。このような場合、ユニバーサル塩基及び縮重配列はＣＴＯに有用に使用される。ＣＴＯにユニバーサル塩基及び縮重配列を用いる戦略は、複数のターゲット核酸配列のスクリーニングのために一つのタイプのＣＴＯ又は最小限のタイプのＣＴＯを使用できるようにする。
好ましい一実現例によれば、本発明の方法は、繰り返しサイクルの間に変性過程を含んでステップ（ａ）〜（ｅ）の全部又は一部を繰り返し行うことをさらに含む。
好ましい一実現例によれば、本発明の方法は、上記繰り返しサイクルの間に変性過程を含んで上記ステップ（ａ）〜（ｂ）、（ａ）〜（ｄ）又は（ａ）〜（ｆ）を繰り返すステップをさらに含み、好ましくは下流プライマーを共に用いる。このような繰り返しは、ターゲット核酸配列及び／又はターゲットシグナルを増幅させる。
変性は、熱、アルカリ、ホルムアミド、ウレア及びグリオキサール処理、酵素的方法（例、ヘリカーゼ作用）及び結合タンパク質を含む公知の技術を通じて行うことができるが、これに限定されるものではない。例えば、変性は８０〜１０５℃の温度範囲で熱処理して達成されることができる。このような処理を達成するための一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）に開示されている。
好ましい一実現例によれば、本発明は、一連の融解分析を行ってターゲット核酸配列を定性的又は定量的に検出することができる。
より好ましくは、本発明は、（ｉ）伸長二重体生成のために繰り返しサイクルの間に変性過程を含んで（ａ）〜（ｄ）ステップを繰り返すステップ；（ｉｉ）融解分析を行うステップ；及び（ｉｉｉ）上記ステップ（ｉ）と（ｉｉ）を少なくとも２回繰り返すステップを含む。この場合、融解分析はある間隔（ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｉｎｔｅｒｖａｌ）を持って少なくとも２回繰り返し行われる。
好ましい一実現例によれば、上記（ａ）〜（ｄ）ステップの繰り返し回数は任意に調節されることができる。一連の融解分析を行うにあたって、ある一つの融解分析のために行われる（ａ）〜（ｄ）ステップの繰り返し回数は、他の一つの融解分析のために行われる（ａ）〜（ｄ）ステップの繰り返し回数と同一か異なっていてもよい。
上記（ａ）〜（ｄ）ステップの繰り返しは、伸長二重体の生成に関する一例であることは当業者に明確である。例えば、本発明は、ステップ（ａ）〜（ｂ）を繰り返し、ステップ（ｃ）及び（ｄ）を行って伸長二重体を生成した後、融解分析を行うことができる。
好ましい一実現例によれば、ステップ（ａ）〜（ｆ）は一つの反応容器又は個別の反応容器で行う。例えば、ステップ（ａ）〜（ｂ）、（ｃ）〜（ｄ）又は（ｅ）〜（ｆ）を個別の反応容器で行うことができる。
好ましい一実現例によれば、ステップ（ａ）〜（ｂ）及び（ｃ）〜（ｆ）は反応条件（特に、温度）によって一つの反応容器でも同時に又は個別に進行されることができる。
好ましい一実現例によれば、本発明において少なくとも２回の融解分析は、ターゲット核酸配列の定量分析を可能にする。
融解分析を通じて得られた融解ピークの面積及び高さは伸長二重体の量に影響され、これはターゲット核酸配列の最初の量に関する情報を提供する。
好ましい一実現例によれば、本発明は、（ｉ）繰り返しサイクルの間に変性過程を含んで（ａ）〜（ｄ）ステップを繰り返すことで伸長二重体の数を増加させるステップ；（ｉｉ）融解分析を行うステップ；及び（ｉｉｉ）上記ステップ（ｉ）と（ｉｉ）を少なくとも２回繰り返すステップを含む。所定の閾値以上の融解ピーク面積及び／又は高さが到達される融解分析のサイクル数を測定することで、ターゲット核酸配列の量を決定することができる。
または、ターゲット核酸配列の定量は、伸長二重体の量を増加させるための繰り返しサイクル数に関する融解分析情報（例えば、ピークの面積又は高さ）をプロッティングすることで達成することができる。
本発明においては検出及び／又は増幅しようとするターゲット核酸配列が全てのＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を含んで、ある特定の配列又は長さを持つように要求しない。
ｍＲＮＡを初期物質として用いる場合、アニーリングステップ実施の以前に逆転写ステップが必須であり、これの詳細な内容は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋなど、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＮｏｏｎａｎ， Ｋ． Ｆ． など， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：１０３６６ （１９８８）に開示されている。逆転写反応のためには、ランダムヘキサマー又はｍＲＮＡにハイブリダイゼーションされるオリゴヌクレオチドｄＴプライマーが用いられることができる。
検出及び／又は増幅できるターゲット核酸配列はある天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）の原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物及び哺乳動物と人間を含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、エプスタイン・バール・ウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸又はウイロイド核酸もいずれも含む。
本発明によって検出できるターゲット核酸配列は、多様な核酸配列、例えば、ゲノム内の配列、人為的に分離されるか断片化された配列及び合成配列（例えば、ｃＤＮＡ配列及びバーコード配列）を含む。例えば、ターゲット核酸配列はＩｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）のための核酸マーカー配列を含む。ＩＰＣＲはＰＣＲと共に核酸マーカー配列及び抗体間のコンジュゲートを使用し、これはタンパク質を含んだ多様な種類のターゲットを検出するのに広く適用される（Ｓａｎｏなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８ ｐｐ：１２０−１２２（１９９２）、米国特許第５，６６５，５３９号、Ｎｉｅｍｅｙｅｒなど、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３ ｐｐ：２０８−２１６（２００５）、米国出願公開番号第２００５／０２３９１０８号及びＹｅなど、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２ ｐｐ：７９６−８００（２０１０））。
また、本発明はヌクレオチド変異の検出に有用である。好ましくは、ターゲット核酸配列はヌクレオチド変異を含む。本明細書において使用される用語「ヌクレオチド変異」とは、連続的なＤＮＡセグメント又は配列が類似するＤＮＡセグメントで特定位置のＤＮＡ配列での全ての単一又は複数のヌクレオチド置換、欠失又は挿入を意味する。このような連続的なＤＮＡセグメントは一つの遺伝子又は一つの染色体のある他の部位を含む。このようなヌクレオチド変異は、突然変異（ｍｕｔａｎｔ）又は多型対立遺伝子変異（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ａｌｌｅｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）であってもよい。例えば、本発明において検出されるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）、欠失、挿入、置換及び転座を含む。ヌクレオチド変異の例は、ヒトゲノムにある多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、病原体の薬剤耐性に係る変異及びがん発生関連変異を含む。上記使用された用語「ヌクレオチド変異」は、核酸配列の特定位置にあるいずれの変異も含む。すなわち、用語「ヌクレオチド変異」は、野生型及び核酸配列の特定位置にあるいずれの突然変異型も含む。
ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異を検出する本発明において、使用されるプライマー又はプローブがターゲット核酸配列の上記ヌクレオチド変異に対して相補的な配列を持つ場合、上記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列は本明細書においてマッチングテンプレート（ｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ）と記載される。使用されるプライマー又はプローブがターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して非相補的な配列を持つ場合、上記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列は、本明細書においてミスマッチングテンプレート（ｍｉｓｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ）と記載される。
ヌクレオチド変異の検出のために、上流プライマーの３’末端はターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異位置の向かい側に位置するようにデザインすることができる。好ましい一実現例によれば、上流プライマーの３’末端はターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を持つ。ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を持つ上流プライマーの３’末端は、マッチングテンプレートにアニーリングされ伸長されてＰＴＯ切断を誘導する。結果物としてのＰＴＯ断片はＣＴＯにハイブリダイゼーションされてターゲットシグナルを提供する。逆に、上流プライマーの３’末端がミスマッチングテンプレートでヌクレオチド変異にミスマッチされる場合、上流プライマーがミスマッチングテンプレートにハイブリダイゼーションされても、伸長反応のためにプライマーの３’末端のアニーリングが必須な条件の下では伸長されず、よって、ターゲットシグナルが発生されない。
または、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を持つＰＴＯのハイブリダイゼーションに依存的なＰＴＯ切断を用いることができる。例えば、調節された条件下で、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を持つＰＴＯは、マッチングテンプレートにハイブリダイゼーションされた後、切断される。結果物としてのＰＴＯ断片はＣＴＯにハイブリダイゼーションされてターゲットシグナルを提供する。一方、調節された条件下で、ＰＴＯはヌクレオチド変異位置に非相補的な配列を持つミスマッチングテンプレートにはハイブリダイゼーションされず、切断されない。このような場合、好ましくはＰＴＯのヌクレオチド変異に対する相補的な配列はＰＴＯの３’ターゲッティング部位の中間に位置する。
一実現例によれば、人為的なミスマッチヌクレオチドの使用は、ヌクレオチド変異に対するＰＴＯの区別可能性を向上する。
または、ヌクレオチド変異の検出のために、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部がターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に位置し、ＰＴＯの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を持つことが好ましい。
ヌクレオチド変異の検出効率を改善させるために、本発明は、ＰＣＲクランピング法で行われることができる。ＰＮＡを使用する代表的なＰＣＲクランピング法は、Ｈｅｎｒｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：５３３２−５３３６（１９９３）及びＬｕｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ． ３４， Ｎｏ ２ ｅ１２ （２００６）に開示されている。例えば、ＰＮＡを使用するＰＣＲクランピング技術は、変異型ヌクレオチド変異を持つ核酸配列は増幅するが、野生型ヌクレオチド変異を持つ核酸配列は増幅しない。ＰＣＲクランピングに続き、ＰＴＯＣＥアッセイを行うと、ヌクレオチド変異をより効果的に検出することができる。特に、ＰＣＲクランピング技術は、特異的なタイプのヌクレオチド変異を持つ核酸配列のみを増幅させるから、ＰＣＲクランピング技術と本発明の方法とを結合すれば、より効果的な方式で少数の変異体（ｍｉｎｏｒｉｔｙ−ｖａｒｉａｎｔ）を検出することができる。
５’末端部位にヌクレオチド変異区別部位を持つプローブがミスマッチテンプレートとハイブリダイゼーションされる場合、これの５’末端部位は特定の条件下で一本鎖を形成することができる。上記プローブはＰＴＯに該当することができる。上記シグナルは本発明のＰＴＯアッセイによって生成されることができる。このような接近は、プローブのヌクレオチド変異区別サイトに非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列の検出に有用である。
好ましい一実現例によれば、本発明に用いられるターゲット核酸配列は前増幅された核酸配列である。前増幅された核酸配列の利用は、本発明のターゲット検出の敏感度及び特異性をかなり高く増加させる。
好ましい一実現例によれば、上記方法は、下流プライマーの存在下で行われる。
少なくとも２種のターゲット核酸配列が同時に検出（マルチプレックス）されるという点で、本発明の利点が一層目立つ。
好ましい一実現例によれば、上記方法は、少なくとも２種（より好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも５種）のターゲット核酸配列を検出するために行われる。
好ましい一実現例によれば、上記方法は、少なくとも２種（より好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも５種）のターゲット核酸配列を検出するために行われ；上記上流オリゴヌクレオチドは少なくとも２種（より好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも５種）のオリゴヌクレオチドを含み、ＰＴＯは少なくとも２種（より好ましくは少なくとも３種、さらに好ましくは少なくとも５種）のＰＴＯを含み、ＣＴＯは少なくとも１種（より好ましくは少なくとも２種、さらに好ましくは少なくとも３種、最も好ましくは少なくとも５種）のＣＴＯを含み；上記少なくとも２種のターゲット核酸配列が存在する場合、上記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列に該当する少なくとも２種のターゲットシグナルを提供する。
少なくとも二つのＰＴＯの５’タギング部位は互いに同一の配列を持つことができる。例えば、本発明がターゲット核酸配列のスクリーニングに行われる場合、ＰＴＯの５’タギング部位は同一の配列を持つことができる。
さらに、一種類のＣＴＯを多数のターゲット核酸配列の検出に用いることができる。例えば、５’タギング部位に同一の配列を持つＰＴＯをターゲット核酸配列のスクリーニングに用いる場合、一種類のＣＴＯを用いることができる。
好ましい一実現例によれば、少なくとも２種のターゲット核酸配列に該当する伸長二重体は、互いに異なるＴｍ値を持つ。
好ましい一実現例によれば、少なくとも２種のターゲット核酸配列に該当する少なくとも２種のターゲットシグナルは、互いに異なる種類の標識から提供される。
好ましい一実現例によれば、少なくとも２種のターゲット核酸配列に該当する少なくとも２種のターゲットシグナルは、互いに同一の種類の標識から提供される。
好ましい一実現例によれば、少なくとも２種のターゲット核酸配列に該当する少なくとも２種のターゲットシグナルは、互いに同一の種類の標識から提供され；少なくとも２種のターゲット核酸配列に該当する上記伸長二重体は互いに異なるＴｍ値を持つ。
本明細書において使用される用語「異なる種類の標識」とは、検出可能なシグナルが異なる特徴を持つ標識を意味する。例えば、蛍光レポーター標識としてのＦＡＭ及びＴＡＭＲＡが異なる種類の標識として考慮されるが、これはこれらの励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）及び放出波長が互いに異なるからだ。
融解曲線分析によって少なくとも２種のターゲット核酸配列を同時に検出するために本発明を行って、少なくとも２種のターゲット核酸配列に該当する伸長二重体が互いに異なるＴｍ値を持つ場合、一種類の標識（例えば、ＦＡＭ）を用いても少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出することができる。
固相に固定化されたＣＴＯを用いたターゲット検出
本発明の著しい利点は、マイクロアレイのような固相でもターゲット核酸配列の検出が効果的であるということである。
好ましい一実現例によれば、本発明は固相で行われ、ＣＴＯはそれの５’末端又は３’末端を通じて固相基質上に固定化される。固相では、固相基質上で提供されるターゲットシグナルを測定する。
固定化されたＣＴＯを用いる場合、上述した標識システムを用いた融解分析は本発明の固相反応に適用されることができる。
好ましい一実現例によれば、ターゲットシグナルは、断片に連結された単一標識又は上記伸長反応中に上記伸長二重体内に挿入された単一標識によって提供される。特に、固相で本発明が単一標識を用いて行われる場合、一般的な蛍光標識を用いることができ、二本鎖上又は一本鎖上に存在するのかによって異なる強度を持つ蛍光シグナルを提供することができる特定の蛍光標識を必要としない。
固相基質上に固定化されたＣＴＯを用いる場合、化学的標識（例えば、ビオチン）又は酵素的標識（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ）を用いることができる。
固相反応のために、ＣＴＯはそれの５’末端又は３’末端（好ましくは、３’末端）を通じて固相基質の表面に直接又は間接に（好ましくは間接）固定化される。また、ＣＴＯは共有又は非共有結合方式で固相基質の表面上に固定化されることができる。固定化されたＣＴＯが固相基質の表面に間接に固定化される場合、適当なリンカーを用いる。本発明において有用なリンカーは、固相基質表面上のプローブ固定化に用いられるいずれのリンカーも含むことができる。例えば、アミン基を持つアルキル又はアリール化合物、又はチオール基を持つアルキル又はアリール化合物がリンカーとしてＣＴＯの固定化に用いられることができる。また、ポリ（Ｔ）テール又はポリ（Ａ）テールがリンカーとして使用されることができる。
好ましい一実現例によれば、本発明において用いられる固相基質はマイクロアレイである。本発明の反応環境を提供するマイクロアレイは、当業界に公知されたいずれのものでも含むことができる。本発明の全ての過程、すなわち、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション、切断、伸長、融解及び蛍光検出はマイクロアレイ上で行われる。マイクロアレイ上に固定化されたＣＴＯは、ハイブリダイゼーションアレイ要素（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ ａｒｒａｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）として用いられる。マイクロアレイを作製するための固相基質は、金属（例えば、金、金と銅の合金、アルミニウム）、金属オキシド、ガラス、セラミック、石英、シリコーン、半導体、Ｓｉ／ＳｉＯ２ウエハ、ゲルマニウム、ヒ化ガリウム、カーボン、カーボンナノチューブ、ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン及びポリアクリルアミド）、セファロース、アガロース及びコロイドを含むが、これに限定されるものではない。本発明の多数の固定化されたＣＴＯは、固相基質上の一つのアドレス可能（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）な部位又は複数のアドレス可能な部位に固定化されることができ、固相基質は２〜１，０００，０００個のアドレス可能な部位を含むことができる。フォトリソグラフィー、インクジェット、機械的なマイクロスポッティング及びこれと類似する方法のような従来の作製技術によって、アレイ又は特定応用のためのアレイを生産するために固定化されたＣＴＯが作製（ｆａｂｒｉｃａｔｅ）されることができる。
固相で行う本発明は、固定化されたＣＴＯ上の標識は物理的に離隔しているから、一種類の標識を用いても多数のターゲット核酸配列を同時に検出することができる。よって、固相で本発明によって検出可能なターゲット核酸配列の数は制限されない。
本発明においてＰＴＯ断片は、ターゲット核酸とハイブリダイゼーションされたＰＴＯの切断によって生成され、アニーリングされた後、ＣＴＯ上で伸長されて結果として伸長鎖を生成する。
伸長鎖の数を増加させるために、追加のＰＴＯを用いた追加の５’ヌクレアーゼ切断反応によって、ＣＴＯ上で伸長可能な追加の断片を提供することができる。上記追加のＰＴＯは、（ｉ）伸長鎖に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）伸長鎖には非相補的であるが、ＣＴＯのキャプチャリング部位には相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含む。伸長鎖に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチドを含み、５’ヌクレアーゼ切断反応のために追加のＰＴＯを上流に位置するようにする追加の上流オリゴヌクレオチドを使用することが好ましい。
上記好ましい一実現例は、追加の断片形成が伸長鎖形成に依存的な特徴を示す。
または、上記追加の断片は、次の追加のＰＴＯの使用によって提供されることができる。上記追加のＰＴＯは、（ｉ）ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）ＣＴＯのテンプレーティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含み、ＣＴＯのキャプチャリング部位に相補的な配列を含む５’タギング部位を含む。
好ましい一実現例によれば、追加の伸長二重体は伸長鎖の追加の生成によって作られ、固相基質でターゲットシグナルを増幅できるようにする。
ＩＩ． ターゲット核酸配列の増幅を伴う好ましい実現例
好ましくは、本発明は、ターゲット核酸配列を合成することができる上流プライマー及び下流プライマーで構成されたプライマー対を用いてターゲット核酸配列を増幅する。
本発明のまた他の様態によれば、本発明は、次のステップを含み、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイによってＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ） 上記ターゲット核酸配列を、上流プライマー及び下流プライマーを含むプライマー対及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記上流プライマー及び上記下流プライマーそれぞれは上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み；上記ＰＴＯは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；上記３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記５’タギング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；上記ＰＴＯは上記上流プライマーと上記下流プライマーとの間に位置し；上記ＰＴＯはそれの３’末端がブロッキングされて伸長が防止され；
（ｂ） 上記プライマーの伸長及び上記ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的な核酸ポリメラーゼに上記ステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって；上記ＰＴＯが上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされる場合、上記上流プライマーは伸長され、上記伸長鎖は上記５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的な核酸ポリメラーゼによる上記ＰＴＯの切断を誘導し、このような上記切断は、上記ＰＴＯの上記５’タギング部位又は上記５’タギング部位の一部を含む断片を放出し；
（ｃ） 上記ＰＴＯから放出された上記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記ＣＴＯは３’→５’の方向に、（ｉ）上記ＰＴＯの上記５’タギング部位又は上記５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記５’タギング部位及び上記３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；上記ＰＴＯから放出された上記断片は、上記ＣＴＯの上記キャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされ；
（ｄ） 上記ステップ（ｃ）の結果物及び鋳型依存的な核酸ポリメラーゼを用いて伸長反応を行うステップであって；上記ＣＴＯの上記キャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた上記断片は伸長されて伸長二重体を形成し；上記伸長二重体は、（ｉ）上記断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）上記ＣＴＯの配列及び／又は長さ、又は（ｉｉｉ）上記断片の上記配列及び／又は長さと上記ＣＴＯの上記配列及び／又は長さによって調節可能なＴｍ値を持ち；
（ｅ） 一定範囲の温度で上記伸長二重体を融解（ｍｅｌｔｉｎｇ）して上記伸長二重体の存在を示すターゲットシグナルを提供するステップであって；上記ターゲットシグナルは、（ｉ）上記断片及び／又は上記ＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）上記伸長反応中に上記伸長二重体内に挿入された標識、（ｉｉｉ）上記伸長反応中に上記伸長二重体内に挿入された標識と上記断片及び／又は上記ＣＴＯに連結された標識、又は（ｉｖ）インターカレーティング標識（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｌａｂｅｌ）によって提供され；そして
（ｆ） 上記ターゲットシグナルを測定することで上記伸長二重体を検出するステップであって；上記伸長二重体の存在は上記ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明の好ましい一実現例は上述された本発明のステップを行うため、これら間で共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
好ましい一実現例によれば、上記方法は、繰り返しサイクルの間に変性過程を含んで上記ステップ（ａ）〜（ｂ）、（ａ）〜（ｄ）又は（ａ）〜（ｆ）を繰り返すステップをさらに含み、反応の繰り返しはターゲット核酸配列の増幅を伴う。好ましくは、上記増幅は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号に開示されたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって行う。
好ましい一実現例によれば、上記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するために行われる。
好ましい一実現例によれば、少なくとも２種のターゲット核酸配列に該当する少なくとも２種のターゲットシグナルは同一の種類の標識から提供され；少なくとも２種のターゲット核酸配列に該当する上記伸長二重体は互いに異なるＴｍ値を持つ。
ＩＩＩ． 指定温度での検出過程を含むＰＴＯＣＥによるターゲット検出方法
本発明は、伸長二重体の形成に関連して発生するターゲットシグナルを用いるために、変形させることができる。
本発明のまた他の様態によれば、本発明は、次のステップを含み、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイによってＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ） 上記ターゲット核酸配列を上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記上流オリゴヌクレオチドは上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み；上記ＰＴＯは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；上記３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記５’タギング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；上記上流オリゴヌクレオチドは上記ＰＴＯの上流に位置し；
（ｂ） 上記ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に上記ステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって；上記上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖は上記５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による上記ＰＴＯの切断を誘導し、このような上記切断は、上記ＰＴＯの上記５’タギング部位又は上記５’タギング部位の一部を含む断片を放出し；
（ｃ） 上記ＰＴＯから放出された上記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記ＣＴＯは３’→５’の方向に、（ｉ）上記ＰＴＯの上記５’タギング部位又は上記５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯの上記５’タギング部位及び上記３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；上記ＰＴＯから放出された上記断片は、上記ＣＴＯの上記キャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされ；
（ｄ） 上記ステップ（ｃ）の結果物及び鋳型依存的な核酸ポリメラーゼを用いて伸長反応を行うステップであって；上記ＣＴＯの上記キャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた上記断片は伸長されて伸長二重体を形成し；上記伸長二重体は、（ｉ）上記断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）上記ＣＴＯの配列及び／又は長さ、又は（ｉｉｉ）上記断片の上記配列及び／又は長さと上記ＣＴＯの上記配列及び／又は長さによって調節可能なＴｍ値を持ち；上記伸長二重体は、（ｉ）上記断片及び／又はＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）上記伸長反応中に上記伸長二重体内に挿入された標識、（ｉｉｉ）上記断片及び／又は上記ＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識と上記伸長反応中に上記伸長二重体内に挿入された標識、又は（ｉｖ）インターカレーティング標識（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｌａｂｅｌ）によってターゲットシグナルを提供し；そして
（ｅ） 上記伸長二重体がそれの二本鎖形態を維持する指定温度で上記ターゲットシグナルを測定することで上記伸長二重体を検出するステップであって、これによって上記伸長二重体の存在は上記ターゲット核酸配列の存在を示す。
好ましい一実現例は、融解ステップを除いて上述した本発明のステップを行うため、これら間で共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
ターゲットシグナルは伸長二重体の融解で提供されるシグナル変化を測定して提供されるため、上述した融解分析を用いる本発明は、少なくとも二つの異なる温度で標識から出るシグナルの検出を必要とする。
これとは違って、本発明の一様態において、伸長二重体自体が伸長二重体が形成された場合と形成されていない場合とを区別させるシグナルを提供し、上記シグナルは伸長二重体が二本鎖形態を維持する指定温度（ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）で検出され、これによってターゲット核酸配列の存在が決定される。
本発明は、ターゲット核酸配列の存在を検出するために伸長二重体の形成に関連したターゲットシグナルを測定するものである。
本発明において、伸長二重体は標識を持ち、これによって伸長二重体はターゲットシグナルを提供する。
好ましくは、ターゲットシグナルは、指定温度で伸長二重体の標識から出るシグナル（シグナル発生又はシグナル消滅）を含む。
本発明の標識は、上述した融解分析を用いた方法と同一の方式で行うことができる。図２〜１３は、指定温度での検出のために少し変形された本発明の一様態を説明することができる。
伸長二重体から出るターゲットシグナルを基本とした作動原理は次のとおりである：（ｉ）断片の伸長は、標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し；又は
（ｉｉ） 断片とＣＴＯとのハイブリダイゼーションは、標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し、上記伸長二重体はターゲットシグナルを維持する。
作動原理（ｉ）の実現例は、図９を参照して説明されることができる。固定化されたＣＴＯを用いる場合、本発明はより効果的な方式で多数のターゲット核酸配列を検出する。固定化されたＣＴＯのテンプレーティング部位は、レポーター分子及びクエンチャー分子を持つ。レポーター分子及びクエンチャー分子は構造的に互いに近接してクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングする。断片がＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされる場合、クエンチャー分子はレポーター分子からのシグナルをクエンチングする。上記伸長二重体の形成によって、レポーター分子及びクエンチャー分子は構造的に互いに離隔してクエンチャー分子はレポーター分子からのシグナルをクエンチングしない。ターゲットシグナルは伸長ステップで提供される（図９のＣ及びＤ）。
図９において、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）は、伸長二重体を形成しない。よって、クエンチャー分子は依然としてレポーター分子からのシグナルをクエンチングする。ハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供しない。
作動原理（ｉｉ）の実現例は、図６を参照して説明されることができる。図面は融解分析を用いた方法だけでなく、本発明の様態も示す。ＰＴＯの５’タギング部位はレポーター分子及びクエンチャー分子を持つ。レポーター分子及びクエンチャー分子は構造的に互いに近接してクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをクエンチングする。ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされたＰＴＯは切断されて、レポーター分子及びクエンチャー分子を持つ５’タギング部位を含む断片を放出し、上記断片はＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされる。上記ハイブリダイゼーションによって、レポーター分子及びクエンチャー分子は構造的に互いに離隔してクエンチャー分子はレポーター分子からのシグナルをクエンチングしない。ターゲットシグナルは断片ハイブリダイゼーションステップで提供され、伸長二重体はターゲットシグナルを維持する（図６のＣ及びＤ）。
図６において、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供し（図６のＣ及びＤ）、非ターゲットシグナルを除去するためにハイブリッドを解離させることを必要とする。よって、ターゲットシグナルを測定する温度は、ハイブリッドが解離されるように決定される。好ましい一実現例によれば、上記温度はハイブリッドのＴｍ値を考慮して追加で決定される。
好ましい一実現例によれば、ハイブリッドが部分的に解離される温度で伸長二重体は検出されることができる。
指定温度はハイブリッドのＴｍ値から１０℃を引いた温度より高く、好ましくはハイブリッドのＴｍ値から５℃を引いた温度より高く、より好ましくはハイブリッドのＴｍ値より高い温度であり、さらに好ましくはハイブリッドのＴｍ値から５℃を加えた温度より高い。
好ましい一実現例によれば、伸長二重体によって提供されるターゲットシグナルは、ステップ（ｄ）の伸長中に提供され；図２〜４及び９〜１１に示すように、上記非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供しない。
一実現例によれば、伸長二重体によって提供されたターゲットシグナルは、上記ステップ（ｃ）で上記断片とＣＴＯとのハイブリダイゼーションによって提供され、伸長二重体の生成はステップ（ｄ）でターゲットシグナルを維持させる。上記非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供し；上記指定温度はハイブリッドを分離して非ターゲットシグナルを除去するのに十分である。
好ましい一実現例によれば、伸長二重体によって提供されるターゲットシグナルは、ステップ（ｃ）での断片とＣＴＯとのハイブリダイゼーションによって提供され、ステップ（ｄ）で上記伸長二重体の形成はターゲットシグナルを維持し；非切断ＰＴＯとＣＴＯとの上記ハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供し；図５〜８及び１２〜１３に示されるように、上記指定温度はハイブリッドのＴｍ値より高い。
非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドが非ターゲットシグナルを提供する場合（図６のパネルＤ）、非ターゲットシグナルを除去するためにハイブリッドを解離させることを必要とする。よって、ターゲットシグナルを測定する温度は、ハイブリッドが解離されるように決定される。
本発明に有用な標識システムは、次のように説明されることができる：
（ｉ）断片及び／又はＣＴＯに連結された標識
（ｉ−１） 相互作用的な二重標識
相互作用的な二重標識システムの実現例において、ＣＴＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識を持ち；ステップ（ｄ）での上記断片の伸長は相互作用的な二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供する。相互作用的な二重標識システムの実現例１は図２に図式的に示す。ターゲットシグナルは伸長同期化（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ）シグナルの発生で提供される。
好ましい一実現例によれば、レポーター分子及びクエンチャー分子はＣＴＯのテンプレーティング部位に位置することができる。
好ましい一実現例によれば、ＣＴＯのレポーター分子及びクエンチャー分子のうち一つはそれの５’末端又はそれの５’末端から１〜５ヌクレオチド離隔した位置にあり、残りの一つはＣＴＯの形態によってレポーター分子からのシグナルをクエンチングする及びクエンチングしない位置に位置する。
相互作用的な二重標識システムの実現例において、ＣＴＯはレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識を持ち；ステップ（ｃ）での断片とＣＴＯとのハイブリダイゼーションは相互作用的な二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し、上記伸長二重体はターゲットシグナルを維持する。
好ましい一実現例によれば、レポーター分子及びクエンチャー分子はＣＴＯのキャプチャリング部位に位置することができる。
好ましい一実現例によれば、ＣＴＯのレポーター分子及びクエンチャー分子のうち一つはそれの３’末端又はそれの３’末端から１〜５ヌクレオチド離隔した位置にあり、残りの一つはＣＴＯの形態によってレポーター分子からのシグナルをクエンチングする及びクエンチングしない位置に位置する。
一実現例において非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供し；上記ターゲットシグナルを測定する温度はハイブリッドのＴｍ値を考慮して決定される。
相互作用的な二重標識システムの実現例において、断片はレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識を持ち；ステップ（ｃ）での上記断片とＣＴＯとのハイブリダイゼーションは相互作用的な二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し、上記伸長二重体はターゲットシグナルを維持する。相互作用的な二重標識システムの実現例１は図６に図式的に示す。
好ましい一実現例によれば、断片のレポーター分子及びクエンチャー分子のうち一つはそれの５’末端又はそれの５’末端から１〜５ヌクレオチド離隔した位置にあり、残りの一つは断片の形態によってレポーター分子からのシグナルをクエンチングする位置に位置する。
一実現例において非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供し；上記ターゲットシグナルを測定する温度はハイブリッドのＴｍ値を考慮して決定される。
相互作用的な二重標識システムの実現例において、上記断片はレポーター分子及びクエンチャー分子を含む相互作用的な二重標識うち一つを持ち、ＣＴＯは上記相互作用的な二重標識のうち残りの一つを持ち；ステップ（ｃ）での上記断片とＣＴＯとのハイブリダイゼーションは相互作用的な二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し、上記伸長二重体はターゲットシグナルを維持する。相互作用的な二重標識システムの実現例は図８に図式的に示す。
レポーター分子からのシグナルがクエンチャー分子によってクエンチングされる限り、レポーター分子及びクエンチャー分子はＰＴＯ断片及びＣＴＯのいずれの位置にも位置することができる。
好ましい一実現例によれば、好ましくは、ＰＴＯ断片のレポーター分子又はクエンチャー分子はＰＴＯの５’末端に位置する。
好ましい一実現例によれば、好ましくは、ＣＴＯのレポーター分子又はクエンチャー分子はＣＴＯの５’末端に位置する。
本実現例において、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供し；上記ターゲットシグナルを測定する温度はハイブリッドのＴｍ値を考慮して決定される。
（ｉ−２）単一標識
単一標識システムの実現例において、ＣＴＯは単一標識を持ち、ステップ（ｄ）での断片の伸長は単一標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供する。単一標識システムの実現例は、図３に図式的に示す。ターゲットシグナルは伸長同期化（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ）シグナルの発生で提供される。
好ましい一実現例によれば、ＣＴＯのテンプレーティング部位は単一標識で標識される。
単一標識システムの実現例において、ＣＴＯは単一標識を持ち、ステップ（ｃ）での断片とＣＴＯとのハイブリダイゼーションは相互作用的な二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し、上記伸長二重体はターゲットシグナルを維持する。
好ましい一実現例によれば、ＣＴＯのキャプチャリング部位は単一標識で標識される。
本実現例において、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供し；上記ターゲットシグナルを測定する温度はハイブリッドのＴｍ値を考慮して決定される。
単一標識システムの実現例において、断片は単一標識を持ち、ステップ（ｃ）での断片とＣＴＯとのハイブリダイゼーションは相互作用的な二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供し、上記伸長二重体はターゲットシグナルを維持する。単一標識システムの実現例は、図１２に図式的に示す。
本実現例において、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供し；上記ターゲットシグナルを測定する温度はハイブリッドのＴｍ値を考慮して決定される。
本明細書において使用される単一標識は、二本鎖上に又は一本鎖上に存在するのかによって異なるシグナルを提供しなければならない。単一標識は蛍光標識、発光標識、化学発光標識、電気化学的標識及び金属標識を含む。好ましくは、単一標識は蛍光標識を含む。本発明において使用される単一蛍光標識の種類及び選好される結合位置は、米国特許番号第７，５３７，８８６号及び第７，３４８，１４１号に開示されており、これは本明細書の全体において参照として組み込まれる。好ましくは、単一蛍光標識は、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ及びフルオレセイン基盤標識を含む。標識されるヌクレオチドの残基は５’末端又は３’末端よりオリゴヌクレオチド内の内部ヌクレオチド残基に位置することが好ましい。
本発明において有用な単一蛍光標識は、上述したようにレポーター及びクエンチャー分子に関する説明を参照して説明することができる。
特に、固相で本発明が単一標識を用いて行われる場合、一般的な蛍光標識を用いることができ、二本鎖上に又は一本鎖上に存在するのかによって異なる強度を持つ蛍光シグナルを提供することができる特定の蛍光標識を必要としない。
固相基質上に固定化されたＣＴＯを用いる場合、化学的標識（例えば、ビオチン）又は酵素的標識（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ）を用いることができる。
好ましい一実現例によれば、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドが形成される場合、図２〜３及び９に示すように、上記ハイブリッドがステップ（ｄ）で非ターゲットシグナルを提供しない範囲内に断片及び／又はＣＴＯに連結された標識が位置する。
または、図６〜８及び１２に示すように、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドが形成される場合、上記ハイブリッドがステップ（ｄ）で非ターゲットシグナルを提供する範囲内に標識が位置することができ；上記伸長二重体のＴｍ値は非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドのＴｍ値より高い。
（ｉｉ）伸長二重体内に挿入された標識
特に、本発明が固定化されたＣＴＯを用いて固相で行われる場合、図１０及び１１に図式的に示すように、本標識システムがターゲットシグナルを提供するのにより有用である。
好ましい一実現例によれば、ターゲットシグナルは伸長反応中に伸長二重体内に挿入された単一標識によって提供され；挿入された単一標識は伸長反応中に挿入されたヌクレオチドに連結されており；ステップ（ｄ）での断片の伸長は、単一標識からのシグナルの変化を誘導してステップ（ｄ）でのターゲットシグナルを提供する。
好ましい一実現例によれば、伸長反応中に挿入（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）されるヌクレオチドはｄｄＮＴＰである。
好ましい一実現例によれば、図１１に図式的に示すように、伸長反応中に挿入されたヌクレオチドは第１の非天然型塩基を持ち、ＣＴＯは第１の非天然型塩基に対して特異的な結合親和性のある第２の非天然型塩基を持つヌクレオチドを持つ。好ましくは、第２の非天然型塩基を持つヌクレオチドは、ＣＴＯのテンプレーティング部位のいずれの位置にも位置することができる。
伸長反応中に伸長二重体内に挿入された標識を用いる場合、標識は非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッド内に含まれない。これは、ハイブリッドが伸長されないからである。よって、ハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供しない。
（ｉｉｉ）伸長二重体内に挿入された標識と断片又はＣＴＯに連結された標識
図４及び５に図式的に示すように、本発明は、伸長反応中に伸長二重体内に挿入された標識と断片及び／又はＣＴＯに連結された標識との組み合わせを用いた標識システムを用いることができる。
好ましい一実現例によれば、ターゲットシグナルは伸長反応中に伸長二重体内に挿入された標識と断片及び／又はＣＴＯに連結された標識によって提供され；上記挿入された標識は伸長反応中に挿入されたヌクレオチドに連結されており；上記二つの標識はレポーター分子及びクエンチャー分子の相互作用的な二重標識であり；上記ステップ（ｄ）での断片の伸長は、相互作用的な二重標識からのシグナルの変化を誘導してターゲットシグナルを提供する。
より好ましくは、伸長反応中に挿入されたヌクレオチドは第１の非天然型塩基を持ち、ＣＴＯは第１の非天然型塩基に対して特異的な結合親和性のある第２の非天然型塩基を持つヌクレオチドを持つ。
好ましくは、ステップ（ｅ）で提供されるターゲットシグナルは、ステップ（ｄ）の相互作用的な二重標識からのシグナルである。
伸長反応中に伸長二重体内に挿入された標識を用いる場合、標識は非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッド内に含まれない。これは、ハイブリッドが伸長されないからだ。よって、ハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供しない。
（ｉｖ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｌａｂｅｌ）
本発明は、伸長二重体の存在を示すターゲットシグナルを提供するインターカレーティング標識を使用することができる。試料内の二本鎖の核酸分子がシグナルを発生させることができるため、固定化されたＣＴＯを用いる固相反応ではインターカレーティング標識がより有用である。
例示された実現例は、図１３を参考にして説明される。ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされたＰＴＯは切断されて断片を放出する。上記断片はＣＴＯにハイブリダイゼーションされる。インターカレーティング染料（例えば、ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ）の存在下で伸長を行ってインターカレーティング染料を含む伸長二重体を生成する。
図１３において、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供し（図１３のＣ及びＤ）、非ターゲットシグナルを除去するためにハイブリッドを解離させることが必要である。よって、ターゲットシグナルを測定する温度はハイブリッドのＴｍ値を考慮して決定される。
好ましくは、ステップ（ｅ）で提供されるターゲットシグナルはインターカレーティング染料から出るシグナルである。
好ましい一実現例によれば、ＰＴＯ及び／又はＣＴＯは、それの３’末端がブロッキングされて伸長が防止される。
好ましい一実現例によれば、上流オリゴヌクレオチドは、上流プライマー又は上流プローブである。
好ましい一実現例によれば、上流オリゴヌクレオチドは、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によるＰＴＯの切断を誘導する程度にＰＴＯに近接して位置する。
好ましい一実現例によれば、上流プライマーは、それの伸長鎖を通じて５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によるＰＴＯの切断を誘導する。
好ましい一実現例によれば、上記方法は、繰り返しサイクルの間に変性過程を含んでステップ（ａ）〜（ｂ）、（ａ）〜（ｄ）又は（ａ）〜（ｅ）を繰り返すステップをさらに含む。
好ましい一実現例によれば、ステップ（ａ）〜（ｂ）又は（ｃ）〜（ｅ）は一つの反応容器又は個別の反応容器で行う。
好ましい一実現例によれば、上記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するために行われ；上記上流オリゴヌクレオチドは少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、ＰＴＯは少なくとも２種のＰＴＯを含み、ＣＴＯは少なくとも１種のＣＴＯを含み；上記少なくとも２種のターゲット核酸配列が存在する場合、上記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列に該当する少なくとも２種のターゲットシグナルを提供する。
好ましい一実現例によれば、上流オリゴヌクレオチドは上流プライマーであり、上記上流プライマーの伸長のためにステップ（ｂ）では鋳型依存的な核酸ポリメラーゼを用いる。
好ましい一実現例によれば、ＣＴＯはそれの５’末端又は３’末端を通じて固相基質上に固定化され、上記固相基質で提供されるターゲットシグナルを測定する。
好ましい一実現例によれば、ターゲットシグナルは断片に連結された単一標識又は伸長反応中に伸長二重体内に挿入された単一標識によって提供される。
好ましい一実現例によれば、上記方法は、下流プライマーの存在下で行われる。
ステップ（ｅ）の検出はリアルタイム方式、エンドポイント方式又は指定時間間隔方式で行われることができる。本発明がステップ（ａ）〜（ｂ）、（ａ）〜（ｄ）又は（ａ）〜（ｅ）を繰り返すステップをさらに含む場合、指定温度での上記繰り返しの各サイクルで（すなわち、リアルタイム方式）、指定温度での上記繰り返しの終了時点で（すなわち、エンドポイント方式）、又は指定温度での上記繰り返し中に指定時間間隔それぞれでシグナル検出が行われるのが好ましい。好ましくは、上記検出は、リアルタイム方式で上記繰り返しの各サイクルで行って検出の正確性と定量化を改善することができる。
ＩＶ． 上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性に基づくＰＴＯＣＥアッセイによるターゲット検出過程
本発明の他の一様態によれば、本発明は次のステップを含み、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイによってＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ） 上記ターゲット核酸配列をＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記ＰＴＯは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；上記３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記５’タギング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；
（ｂ） 上記ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に上記ステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって；上記ＰＴＯは上記５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によって切断され、このような上記切断は、上記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出し；
（ｃ） 上記ＰＴＯから放出された上記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記ＣＴＯは３’→５’の方向に、（ｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；上記ＰＴＯから放出された上記断片は、上記ＣＴＯの上記キャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされ；
（ｄ） 上記ステップ（ｃ）の結果物及び鋳型依存的な核酸ポリメラーゼを用いて伸長反応を行うステップであって；上記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた上記断片は伸長されて伸長二重体を形成し、上記伸長二重体は、（ｉ）上記断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）上記ＣＴＯの配列及び／又は長さ、又は（ｉｉｉ）上記断片の配列及び／又は長さと上記ＣＴＯの配列及び／又は長さによって調節可能なＴｍ値を持ち；
（ｅ） 一定範囲の温度で上記伸長二重体を融解（ｍｅｌｔｉｎｇ）して上記伸長二重体の存在を示すターゲットシグナルを提供するステップであって；上記ターゲットシグナルは、（ｉ）上記断片及び／又は上記ＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）上記伸長反応中に上記伸長二重体内に挿入された標識、（ｉｉｉ）上記伸長反応中に上記伸長二重体内に挿入された標識と上記断片及び／又は上記ＣＴＯに連結された標識、又は（ｉｖ）インターカレーティング標識（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｌａｂｅｌ）によって提供され；そして
（ｆ） 上記ターゲットシグナルを測定することで上記伸長二重体を検出するステップであって；上記伸長二重体の存在は上記ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明の他の一様態によれば、本発明は次のステップを含み、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイによってＤＮＡ又は核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ） 上記ターゲット核酸配列をＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記ＰＴＯは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位を含み；上記３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記５’タギング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；
（ｂ） 上記ＰＴＯの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に上記ステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって；上記ＰＴＯは上記５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によって切断され、このような上記切断は、上記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む断片を放出し；
（ｃ） 上記ＰＴＯから放出された上記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記ＣＴＯは３’→５’の方向に、（ｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；上記ＰＴＯから放出された上記断片は、上記ＣＴＯの上記キャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされ；
（ｄ） 上記ステップ（ｃ）の結果物及び鋳型依存的な核酸ポリメラーゼを用いて伸長反応を行うステップであって；上記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされた上記断片は伸長されて伸長二重体を形成し、上記伸長二重体は、（ｉ）上記断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）上記ＣＴＯの配列及び／又は長さ、又は（ｉｉｉ）上記断片の配列及び／又は長さと上記ＣＴＯの配列及び／又は長さによって調節可能なＴｍ値を持ち；上記伸長二重体は、（ｉ）上記断片及び／又はＣＴＯに結合された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）上記伸長反応中に上記伸長二重体に挿入される一つの標識、（ｉｉｉ）上記断片及び／又はＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識及び上記伸長反応中に上記伸長二重体に挿入される一つの標識、又は（ｉｖ）インターカレーティング標識によってターゲットシグナルを提供し；及び
（ｅ） 上記伸長二重体が二本鎖形態を維持する指定温度で上記ターゲットシグナルを測定することで上記伸長二重体を検出するステップであって；上記伸長二重体の存在は上記ターゲット核酸配列の存在を示す。
上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性に基づく本発明の方法は、上流オリゴヌクレオチドを使用しないことを除いて上流オリゴヌクレオチドを用いたＰＴＯＣＥアッセイと同一であるため、これら間で共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
興味深いことに、上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性に基づく本発明の方法は、実際に上流オリゴヌクレオチドを使用しなくてもＰＴＯＣＥアッセイを通じてターゲットシグナルを提供する（図３５Ａ及び３５Ｂ参照）。
本発明の方法のために上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性を持つ従来の酵素が使用されることができる。５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的なポリメラーゼのうちいくつかの酵素は、上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性を持つ（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）。
ターゲット核酸配列の増幅及びＰＴＯの切断効率を考慮するとき、本発明のＰＴＯＣアッセイは、好ましくは上流オリゴヌクレオチドを用いて行う。
Ｖ． ＰＴＯＣＥアッセイによるヌクレオチド変異の検出過程
本発明の他の一様態によれば、本発明は、次のステップを含み、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイによってターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異を検出する方法を提供する：
（ａ） 上記ターゲット核酸配列を上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯ−ＮＶ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記上流オリゴヌクレオチドは上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み；上記ＰＴＯ−ＮＶは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位；及び（ｉｉｉ）上記ターゲット核酸上のヌクレオチド変異に相補的な配列を含み、上記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置するヌクレオチド変異区別サイト（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を含み；上記３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記５’タギング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；上記上流オリゴヌクレオチドは上記ＰＴＯ−ＮＶの上流に位置し；上記上流オリゴヌクレオチド又はこれの伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によるＰＴＯ−ＮＶの切断を誘導し；
（ｂ） 上記ＰＴＯ−ＮＶの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に上記ステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって、上記ＰＴＯ−ＮＶが上記ヌクレオチド変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つ上記ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、上記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は上記ターゲット核酸配列と二本鎖を形成して、第１の初期切断位置から切断を誘導すると、第１断片を放出し；上記ＰＴＯ−ＮＶが上記ヌクレオチド変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、上記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は上記ターゲット核酸配列と二本鎖を形成しなくて、上記第１の初期切断位置の下流に位置する第２の初期切断位置から切断を誘導すると、第２断片を放出し；上記第２断片は追加の３’末端部位を含み、これは上記第２断片を上記第１断片と異ならせ；
（ｃ） 上記ＰＴＯ−ＮＶから放出された上記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、上記ＣＴＯは、３’→５’の順序で、（ｉ）上記ＰＴＯ−ＮＶの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯ−ＮＶの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；上記ＰＴＯ−ＮＶから放出された上記第１断片又は上記第２断片は、上記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ；
（ｄ） 鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及び上記ステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行うステップであって、上記第１断片が上記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされると、上記第１断片は伸長されて上記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成され；上記第２断片が上記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされると、伸長されず；及び
（ｅ） 上記伸長鎖を検出するステップであって、上記伸長鎖の存在は、上記ＰＴＯ−ＮＶのヌクレオチド区別サイトに相補的なヌクレオチド変異の存在を示す。
本発明者らは、より改善した正確性及び便宜性を有し、特に、マルチプレックス方式でヌクレオチド変異を検出する新規な接近法を開発すべく鋭意研究努力した。その結果、本発明者らは、ヌクレオチド変異を検出するための新規なプロトコルを定立し、この新規なプロトコルによれば、ヌクレオチド変異の検出は、プローブハイブリダイゼーション、酵素的なプローブ切断、伸長及び伸長鎖の検出によって達成される。特に、本発明者らは、興味深いことに、関心のあるヌクレオチド変異の存在又は不在によって上記プローブ切断位置が調節できるようにし、互いに異なる位置で切断されて放出された断片は、人為的なテンプレート上での伸長可能性によって区別される。本発明のプロトコルは、固相反応だけでなく液相反応でもよく適用され、より改善した正確性及び便宜性を持って複数のヌクレオチド変異を検出できるようにする。
本発明は、プローブハイブリダイゼーション；ＰＴＯ−ＮＶ（ＰＴＯ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）の切断及び伸長；ヌクレオチド変異依存的な伸長鎖の生成；及び伸長鎖の検出の連続的なステップを用いる。よって、本発明は、ＰＴＯ切断及び伸長による変異検出（Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ： ＶＤ−ＰＴＯＣＥ）アッセイと命名される。
好ましい一実現例によれば、本発明によって検出されるヌクレオチド変異は置換変異、欠失変異又は挿入変異であり、より好ましくはＳＮＰのような単一ヌクレオチドによる変異である。
本発明においてＰＴＯ−ＮＶのヌクレオチド変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列は、「マッチテンプレート（ｍａｔｃｈ ｔｅｍｐｌａｔｅ）」と記載する。ＰＴＯのヌクレオチド変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列は、「ミスマッチテンプレート（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｔｅｍｐｌａｔｅ）」と記載する。
好ましい一実現例によれば、ヌクレオチド変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異に関連して使用される用語「非相補的」は、挿入又は欠失による非相補性を含む。
本発明のＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイは、特定のヌクレオチド変異に対するＰＴＯ選択性のために、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置するヌクレオチド変異区別サイトを持つＰＴＯ−ＮＶを使用する。上記ＰＴＯ−ＮＶがヌクレオチド変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列（すなわち、マッチテンプレート）とハイブリダイゼーションされると、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はマッチテンプレートと二本鎖を形成する。一方、上記ＰＴＯ−ＮＶがヌクレオチド変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列（すなわち、ミスマッチテンプレート）とハイブリダイゼーションされると、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はミスマッチテンプレートと二本鎖を形成しない。
このように関心のあるヌクレオチド変異に対する区別されるハイブリダイゼーションパターンは、ＰＴＯ−ＮＶの初期切断位置での差を提供し、これによって２種のＰＴＯ−ＮＶ断片が生成され、関心のあるヌクレオチド変異の存在有無によってシグナル差が発生するということは注目に値する。
第１断片は、ＰＴＯとマッチングテンプレートとのハイブリッドの切断によって生成され、第２断片は、ＰＴＯとミスマッチングテンプレートとのハイブリッドの切断によってそれぞれ生成される。上記第２断片は、３’末端部位に第１断片より追加のヌクレオチドをさらに含む。
第１断片又は第２断片の生成は、ＣＴＯ上の伸長反応によって確実に検出されることができる。
通常、厳しい条件でプライマーの３’末端の一部及びテンプレートのハイブリダイゼーションは、プライマー伸長に非常に重要である。本発明において第１断片及び第２断片は、それぞれＣＴＯの同一位置にハイブリダイゼーションされる。上述したように、第１断片に比べて、第２断片は追加の３’末端部位を含む。ハイブリダイゼーション条件及び第２断片の追加の３’末端部位の向かい側のＣＴＯ配列を調節することで、上記第１断片のみを伸長させることができる。
好ましい一実現例によれば、上記第２断片がＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされる場合、ＣＴＯが上記第２断片の上記追加の３’末端部位とハイブリダイゼーションされず、上記第２断片の伸長が防止されるようにＣＴＯの配列を選択する。
好ましい一実現例によれば、第２断片の追加の３’末端部位の向かい側のＣＴＯの配列は、上記追加の３’末端部位に非相補的である。
上記第１断片の伸長による伸長鎖の生成は、多様な方法によって検出されることができる。
ヌクレオチド変異検出のために５’ヌクレアーゼ活性を用いる従来の技術によると、使用されたプローブのハイブリダイゼーションはプローブ全体の配列によって影響を受けるか決定される。このような従来の技術において、プローブデザイン及び作製、そして反応条件の最適化は容易ではなく、これはヌクレオチド変異の存在に依存するプローブのハイブリダイゼーションが単一ヌクレオチドの差によって主に決定されるからだ。
ＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイによれば、ヌクレオチド変異区別サイトはプローブのハイブリダイゼーション関与部位の５’末端の一部に位置し、これはハイブリダイゼーション条件の最適化を便利にする。また、ＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイは、プローブの全体配列よりはプローブの一部部位を通じてヌクレオチド変異を区別して検出し、ＳＮＰのような単一ヌクレオチドによる差も正確に検出することができる。
ＳＮＰに対する向かい側の配列に隣接したプローブ配列がプローブのハイブリダイゼーションに大きな影響を及ぼすということが当業界に知られている。従来のプローブは一般にそれらの中央部位にＳＮＰに対する向かい側の配列を持つ。この点で従来のプローブは、ハイブリダイゼーションに関与するＳＮＰ周辺の配列を選択することができない。従来の技術はＳＮＰ周辺の配列のため、深刻な限界点を有する。
これと違って、本発明においては、ＳＮＰ向かい側のヌクレオチド変異区別サイトはプローブのハイブリダイゼーション関与部位の５’末端の一部に位置し、ＳＮＰ ５’隣接配列に対するプローブ配列は調節可能になる。本発明においては、ハイブリダイゼーションに対するＳＮＰ周辺配列の影響を正確に調節できるため、従来の方法ではＳＮＰ周辺配列の影響のため検出できないかほとんど検出できないＳＮＰに対する分析が可能である。
本発明のＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイを詳細に説明すれば、次のとおりである：
本発明のＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイは、上述したＰＴＯＣＥアッセイであって、ＰＴＯの切断及びＣＴＯ上のＰＴＯ断片の伸長に基づくので、これら間で共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
ステップ（ａ）：ターゲット核酸配列と上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯ−ＮＶとのハイブリダイゼーション
本発明の方法によれば、まず、ターゲット核酸配列を上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯ−ＮＶ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とハイブリダイゼーションさせる。
使用される用語「ＰＴＯ−ＮＶ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」とは、（ｉ）プローブの役割をする３’ターゲッティング部位、（ｉｉ）ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位、及び（ｉｉｉ）ターゲット核酸上のヌクレオチド変異に相補的な配列を含み、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置するヌクレオチド変異区別サイトを含むオリゴヌクレオチドを意味する。５’タギング部位はターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされた後、ＰＴＯから核酸分解切断（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）方式で解離される。上記ＰＴＯで５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位は必ず５’→３’の順序で位置する。ＰＴＯ−ＮＶは、図２５に図示的に例示されている。ＰＴＯ−ＮＶはヌクレオチド変異検出のためのＰＴＯの一適用形態とされ、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部にヌクレオチド変異区別サイトを導入することで作製される。
ＰＴＯ−ＮＶはヌクレオチド変異に相補的な配列を含むヌクレオチド変異区別サイトを含み、上記サイトは３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置する。
ＰＴＯ−ＮＶが変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされる場合、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はターゲット核酸配列と二本鎖を形成する。ＰＴＯ−ＮＶが変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされる場合、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はターゲット核酸配列と二本鎖を形成しない。このように、関心のあるヌクレオチド変異に対する区別されるハイブリダイゼーションパターンは、ＰＴＯ−ＮＶの切断位置での差を提供し、これによって２種のＰＴＯ−ＮＶ断片が生成され、関心のあるヌクレオチド変異の存在有無によってシグナル差が発生する。また、上記ＰＴＯ−ＮＶの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は別に表現すれば、変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチドを持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされる場合に一本鎖を形成する（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ−ｆｏｒｍｉｎｇ）上記ＰＴＯ−ＮＶの３’ターゲッティング部位の５’末端部分であると言える。
上記ＰＴＯ−ＮＶの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置したヌクレオチド変異区別サイトは、ヌクレオチド変異に相補的な配列を含む。例えば、検出されるヌクレオチド変異がＳＮＰの場合、ヌクレオチド変異区別サイトは上記ＳＮＰに相補的なヌクレオチドを含む。
好ましい一実現例によれば、上記ヌクレオチド変異区別サイトは、ＰＴＯ−ＮＶの３’ターゲッティング部位の５’末端から１０ヌクレオチド、より好ましくは８ヌクレオチド、さらに好ましくは６ヌクレオチド、更により好ましくは４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチド又は１ヌクレオチド離隔した位置以内に位置する。好ましくは、ヌクレオチド変異区別サイトは、ＰＴＯ−ＮＶの３’ターゲッティング部位の５’末端に位置する。
ヌクレオチド変異区別サイトの位置は、検出される配列、ヌクレアーゼタイプ及び反応条件を考慮して決定されることができる。
プローブのヌクレオチド変異区別サイト又はターゲット配列上のヌクレオチド変異サイトを言及しながら使用される用語「サイト（ｓｉｔｅ）」は、単一ヌクレオチドだけでなく多数のヌクレオチドも含む。
好ましくは、ステップ（ａ）でハイブリダイゼーションは、３’ターゲッティング部位はターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、５’タギング部位はターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされない厳しい条件下で行われる。
好ましい一実現例によれば、ＰＴＯ−ＮＶ及び／又はＣＴＯは、それの伸長が防止されるように３’末端がブロッキングされる。
好ましい一実現例によれば、上流オリゴヌクレオチドは、上流プライマー又は上流プローブである。
好ましい一実現例によれば、上流オリゴヌクレオチドは、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によってＰＴＯ−ＮＶ切断を誘導する程度にＰＴＯ−ＮＶに近接して位置する。
好ましい一実現例によれば、上流プライマーは、それの伸長鎖を通じて５’ヌクレアーゼ活性を持つ上記酵素による上記ＰＴＯ−ＮＶの切断反応を誘導する。
ステップ（ｂ）：ＰＴＯ−ＮＶからの断片の放出
次に、ＰＴＯ−ＮＶの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素にステップ（ａ）の結果物を接触させる。
ＰＴＯ−ＮＶが上記変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列（すなわち、マッチテンプレート）にハイブリダイゼーションされ、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はターゲット核酸配列と二本鎖を形成して、第１の初期切断位置から切断を誘導すると、第１断片を放出する（参照：図２５）。
ＰＴＯ−ＮＶが上記変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列（すなわち、ミスマッチテンプレート）にハイブリダイゼーションされ、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部はターゲット核酸配列と二本鎖を形成しなくて、第１の初期切断位置の下流に位置した第２の初期切断位置から切断を誘導すると、第２断片を放出する。上記第２断片は追加の３’末端部位を含み、これは第２断片を第１断片と異ならせる（参照：図２５）。
試料内にターゲット核酸配列が存在しない場合、ＰＴＯ−ＮＶ切断が発生しない。
このように、ターゲット核酸配列上の関心のあるヌクレオチド変異の存在有無による切断位置の差及び生成されたＰＴＯ−ＮＶ断片の差は、異なる伸長パターンを示し、ターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異を区別して検出できるようにする。
ＰＴＯ−ＮＶの初期切断位置は、５’ヌクレアーゼの種類、上流オリゴヌクレオチド（上流プローブ又は上流プライマー）の種類、上流オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション位置及び切断条件によって影響される。
上流プライマーの伸長とともに５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的なポリメラーゼによる初期切断位置は、一般に５’→３’の方向に一本鎖及び二本鎖を含む構造で二本鎖の開始ヌクレオチド（すなわち、分岐点（ｂｉｆｕｒｃａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ））及び開始ヌクレオチドから１〜２ヌクレオチド離隔した地点に位置する。切断反応によって５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位の一部を含む断片が生成される。本発明が上流オリゴヌクレオチド伸長独立的な切断誘導によって行われると、ＰＴＯ−ＮＶの切断位置は上流オリゴヌクレオチド（例えば、上流プローブ）の位置によって調節される。
ＰＴＯ−ＮＶを言及しながら使用される用語「第１の初期切断位置（ａ ｆｉｒｓｔ ｉｎｉｔｉａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）」とは、変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列にＰＴＯ−ＮＶがハイブリダイゼーションされる場合、一番目に切断されるＰＴＯ−ＮＶの切断位置を意味する。ＰＴＯ−ＮＶを言及しながら使用される用語「第２の初期切断位置（ａ ｓｅｃｏｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）」とは、変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列にＰＴＯがハイブリダイゼーションされる場合、一番目に切断されるＰＴＯの切断位置を意味する。
本発明において使用される用語「第１断片（ａ ｆｉｒｓｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、第１の初期切断位置で切断によって生成された断片を意味する。「第１断片」は「第１セグメント（ａ ｆｉｒｓｔ ｓｅｇｍｅｎｔ）」及び「ＰＴＯ−ＮＶ第１断片（ａ ＰＴＯ−ＮＶ ｆｉｒｓｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」と入れ替えて使用することができる。用語 「第２断片（ａ ｓｅｃｏｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、第２の初期切断位置で切断によって生成された断片を意味する。「第２断片」は「第２セグメント（ａ ｓｅｃｏｎｄ ｓｅｇｍｅｎｔ）」及び「ＰＴＯ−ＮＶ第２断片（ａ ＰＴＯ−ＮＶ ｓｅｃｏｎｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」と入れ替えて使用することができる。
好ましくは、上記第１断片及び第２断片は、それぞれ５’タギング部位又は５’タギング部位の一部を含む。
上記切断は、用いられる切断方法によって上記第１の初期切断位置（又は第２の初期切断位置）の切断以後にも連続的に起こることができる。例えば、上流プライマーの伸長とともに５’ヌクレアーゼ切断反応を用いる場合、初期切断位置及びこれに連続した配列が切断される。上流プローブを使用し、切断反応は上記プローブが位置した地点から離れている特定位置で起こる場合、上記切断反応は上記位置でのみ起こり、連続した切断は起こらない。
好ましい一実現例によれば、上流プライマー伸長に依存的な初期切断位置は、５’→３’の方向に二本鎖の開始ヌクレオチド（すなわち、分岐点）に位置することができる。
本発明の一例として図２５に示すように、上記ヌクレオチド変異区別サイトは３’ターゲッティング部位の５’末端の一部の５’末端に位置する。このような場合に、第１の初期切断位置は、５’→３’の方向に３’ターゲッティング部位の５’末端の一部にすぐ隣接して位置する。すなわち、上記第１の初期切断位置は、３’方向にヌクレオチド変異区別サイトにすぐ隣接して位置する。第２の初期切断位置は通常、ヌクレオチド変異区別サイトから３’方向に１ヌクレオチド離隔した位置に位置する。
本発明の他の一例として図２６に示すように、ヌクレオチド変異区別サイトは、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部の５’末端から１ヌクレオチド離隔した位置に位置する。このような場合、第１の初期切断位置は、５’方向にヌクレオチド変異区別サイトにすぐ隣接して位置する。第２の初期切断位置は通常、ヌクレオチド変異区別サイトから３’方向に１ヌクレオチド離隔した位置に位置する。
ヌクレオチド変異区別サイトを含む５’末端の一部は、ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションできる配列を含むことができる。または、５’末端の一部は部分的に非ハイブリダイゼーション配列を含むことができる（参照：図２７）。上記ＰＴＯ−ＮＶがヌクレオチド変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされる場合、上記５’末端の一部に非ハイブリダイゼーション配列を導入することは、上記５’末端の一部に一本鎖を形成させることに非常に有用である。
好ましい一実現例によれば、上記ＰＴＯ−ＮＶの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は、ヌクレオチド変異区別サイトから１〜１０ヌクレオチド（より好ましくは１〜５ヌクレオチド）離隔した位置以内に位置した非塩基対部分（ｎｏｎ−ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を含む。
ＰＴＯ−ＮＶが変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされる場合、上記非塩基対部分は、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部がターゲットヌクレオチド配列と二本鎖を形成することを防止する。
好ましい一実現例によれば、ヌクレオチド変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列にＰＴＯ−ＮＶがハイブリダイゼーションされる場合、非塩基対部分は、５’末端の一部がターゲット核酸配列と二本鎖を形成することを抑制しない。
一実現例によれば、非塩基対部分は、第１の初期切断位置と第２の初期切断位置との差（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を拡大させる。例えば、ＰＴＯ−ＮＶの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部のハイブリダイゼーションパターンで差がなくて、変異区別サイトでの差によるマッチテンプレート及びミスマッチテンプレートでの切断位置に差がない場合、非塩基対部分の使用はハイブリダイゼーションパターンに差を持たせる。また、ＰＴＯ−ＮＶの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部が、変異区別サイトでの差によるマッチテンプレート及びミスマッチテンプレートでのハイブリダイゼーションパターンの差がある場合にも、非塩基対部分の使用は第１断片の３’末端部位より第２断片の３’末端部位をより長くすることができ、それによってＣＴＯ上で第２断片の伸長は完璧に防止される。
非塩基対部分の使用は、ＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイを改善させる。
好ましい一実現例によれば、非塩基対部分（例えば、人為的なミスマッチヌクレオチド）はヌクレオチド変異に対するＰＴＯ−ＮＶの区別可能性を増加させる。
一実現例によれば、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による第１の初期切断位置と第２の初期切断位置との差の識別は、非塩基対部分によって付与された差によって改善する。上記差は、非塩基対部分による第１の初期切断位置と第２の初期切断位置との距離によって拡大されることができる。好ましい一実現例によれば、非塩基対部分は、第１の初期切断位置と第２の初期切断位置との距離を拡大させる。
好ましい一実現例によれば、非塩基対部分配列の導入は、第２の初期切断位置を調節することができる。
好ましくは、非塩基対部分は、ヌクレオチド変異区別サイトの下流に位置する。
例えば、非塩基対部分であるミスマッチヌクレオチドが３’方向にヌクレオチド変異区別サイトから２ヌクレオチド離隔した部位に導入される場合、第２の初期切断位置はヌクレオチド変異区別サイトから２ヌクレオチド離隔した位置に調整される（参照：図２７）。ミスマッチヌクレオチドを使用しない場合、第２の初期切断位置はヌクレオチド変異区別サイトから１ヌクレオチド離隔した位置に位置する。すなわち、非塩基対部分は、第１の初期切断位置と第２の初期切断位置との距離を拡大させる。
非塩基対部分は、ターゲット核酸配列間で塩基対を形成しないいずれの部分も含む。好ましくは、非塩基対部分は、（ｉ）人為的なミスマッチ塩基、塩基対を形成できないように修飾された非塩基対塩基又はユニバーサル塩基を含むヌクレオチド、（ｉｉ）塩基対を形成できないように修飾された非塩基対ヌクレオチド、又は（ｉｉｉ）非塩基対形成化合物（ｎｏｎ−ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）である。
例えば、非塩基対部分は、アルキレン基、リボフラノシルナフタレン、デオキシリボフラノシルナフタレン、メタリン酸塩、ホスホロチオエート結合、アルキルホスホトリエステル結合、アリールホスホトリエステル結合、アルキルホスホネート結合、アリールホスホネート結合、ハイドロゲンホスホネート結合、アルキルホスホロアミダート結合及びアリールホスホロアミダート結合を含む。従来のカーボンスペーサーもまた非塩基対部分として用いられる。非塩基対部分としてのユニバーサル塩基は、ＰＴＯ−ＮＶの切断位置を調整するのに有用である。
デオキシイノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール及び５’−ニトロインドールのようなユニバーサル塩基を含む塩基対は、天然型塩基間の結合力より低い結合力を有し、ユニバーサル塩基は特定のハイブリダイゼーション条件下で非塩基対部分として用いられることができる。
５’末端の一部に導入された非塩基対部分は、好ましくは１〜５個の部分、より好ましくは１〜２個の部分を持つ。５’末端の一部の多数の非塩基対部分は連続的又は不連続的に存在することができる。好ましくは、非塩基対部分は２〜５個の連続的な部分を持つ。
好ましくは、非塩基対部分は非塩基対形成化合物である。
好ましい一実現例によれば、ＰＴＯ−ＮＶのヌクレオチド変異区別サイト及び非塩基対部分は、３’ターゲッティング部位の５’末端から１０ヌクレオチド（より好ましくは８ヌクレオチド、７ヌクレオチド、６ヌクレオチド、５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチド又は１ヌクレオチド、さらに好ましくは１ヌクレオチド）離隔した位置以内に位置する。
または、切断反応は上記第２初期切断位置では行われず、上記第１の初期切断位置でのみ行われることができる。例えば、上流プローブが使用され、上記切断反応が上記プローブが位置した地点から離れている特定位置で起こる場合には、ＰＴＯ−ＮＶがマッチテンプレートとハイブリダイゼーションされるとき、第１の初期切断位置でのみ切断反応が起こることができる。ＰＴＯ−ＮＶとミスマッチテンプレートとがハイブリダイゼーションされる場合、分岐点（第２の初期切断位置）は上流プローブから遠く離れているから切断されることができない。
好ましい一実現例によれば、ＰＴＯ−ＮＶとミスマッチテンプレートとがハイブリダイゼーションされる場合、第２の初期切断位置は一本鎖及び二本鎖を含む構造で二本鎖の開始位置（すなわち、分岐点）を含む。
一実現例によれば、ＰＴＯ−ＮＶはブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）として５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による切断に対して耐性を持つ少なくとも１個のヌクレオチドを含むブロッカー部位を持ち、上記ブロッカー部位は、初期切断位置を調節するか一つの位置又は位置等で切断を防止するために位置する。
ステップ（ｃ）：ＰＴＯから放出された断片とＣＴＯとのハイブリダイゼーション
ＰＴＯから放出された断片は、ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイゼーションされる。
第１断片及び第２断片は通常、ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションできる配列を含み、それによって第１断片及び第２断片のうち一つはＣＴＯとハイブリダイゼーションされる。
ミスマッチテンプレートとハイブリダイゼーションされて生成される第２断片は、マッチテンプレートとハイブリダイゼーションされて生成される第１断片と違って、追加の３’末端部位を含む。
好ましい一実現例によれば、上記第２断片がＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされる場合、ＣＴＯが上記第２断片の上記追加の３’末端部位とハイブリダイゼーションされず、上記第２断片の伸長が防止されるようにＣＴＯの配列を選択する。例えば、ＣＴＯの配列は第２断片の追加の３’末端部位の向かい側にミスマッチヌクレオチドを持つように選択されることができる。または、ユニバーサル塩基は、反応条件によってミスマッチヌクレオチドの代わりに使用されることができる。
第１の初期切断位置（又は第２の初期切断位置）はある条件では固定されておれず、多数であってもよい。例えば、初期切断位置が５’→３’の方向に一本鎖及び二本鎖を含む構造で二本鎖の開始ヌクレオチド（すなわち、分岐点）及び開始ヌクレオチドから１〜２ヌクレオチド離隔した位置に位置することができる。このような場合、好ましくは、ＣＴＯの配列は、本発明において第１の初期切断によって放出される断片のうち最も短い断片が選択的に伸長されて、ヌクレオチド変異の存在を示す伸長鎖を生成するように選択される。
ステップ（ｄ）：断片の伸長
ＣＴＯのキャプチャリング部位と第１断片とがハイブリダイゼーションされると、上記断片は伸長されてＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成される。第２断片がＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされる場合、上記第２断片は伸長されない。
通常、プライマーの伸長は、プライマーの３’末端の一部とテンプレートとのハイブリダイゼーションによって調節されることができる。プライマーの配列及び反応条件（例えば、アニーリング温度）を調節することで、３’末端の一部に１〜３ミスマッチヌクレオチドを持つプライマーの伸長を可能にすることができる。または、プライマーの伸長は、プライマーがターゲット配列に完全に相補的な配列を持つときにのみ可能になるようにすることができる。
好ましい一実現例によれば、ＣＴＯの配列は、第１断片又は第２断片のうちいずれか一つが選択的に伸長されるように選択される。
好ましい一実現例によれば、断片の伸長は、断片の３’末端の一部に一つのミスマッチでも存在する場合には伸長されない条件下で行われる。
ステップ（ｅ）： 伸長鎖の検出
伸長鎖は伸長反応後に検出される。伸長鎖の存在は、ＰＴＯ−ＮＶのヌクレオチド区別サイトに相補的なヌクレオチド変異の存在を示す。
好ましい一実現例によれば、ステップ（ｅ）で検出は、上述した融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイ又は伸長鎖とＣＴＯとの伸長二重体のシグナルを用いた指定温度での検出を含むＰＴＯＣＥによって行われる。
好ましい一実現例によれば、第１断片とＣＴＯの伸長鎖とはステップ（ｄ）で伸長二重体を形成し；上記伸長二重体は、（ｉ）上記第１断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）上記ＣＴＯの配列及び／又は長さ、又は（ｉｉｉ）上記第１断片の配列及び／又は長さ及び上記ＣＴＯの配列及び／又は長さによって調節可能なＴｍ値を持ち、上記伸長二重体は、（ｉ）第１断片及び／又はＣＴＯに結合されている少なくとも一つの標識、（ｉｉ）伸長反応中に上記伸長二重体に挿入される一つの標識、（ｉｉｉ）第１断片及び／又はＣＴＯに結合されている少なくとも一つの標識及び伸長反応中に上記伸長二重体に挿入される一つの標識、又は（ｉｖ）インターカレーティング標識によるターゲットシグナルを提供し；上記伸長鎖の存在は、伸長二重体に対する融解分析又はハイブリダイゼーション分析によって伸長二重体からターゲットシグナルを測定することで検出される。
好ましい一実現例によれば、第１断片とＣＴＯの伸長鎖とはステップ（ｄ）で伸長二重体を形成し；上記伸長二重体は、（ｉ）上記第１断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）上記ＣＴＯの配列及び／又は長さ、又は（ｉｉｉ）上記第１断片の配列及び／又は長さ及び上記ＣＴＯの配列及び／又は長さによって調節可能なＴｍ値を持ち、上記伸長二重体は、（ｉ）第１断片及び／又はＣＴＯに結合されている少なくとも一つの標識、（ｉｉ）伸長反応中に上記伸長二重体に挿入される一つの標識、（ｉｉｉ）第１断片及び／又はＣＴＯに結合されている少なくとも一つの標識及び伸長反応中に上記伸長二重体に挿入される一つの標識、又は（ｉｖ）インターカレーティング標識によるターゲットシグナルを提供し；上記伸長鎖の存在は、伸長二重体の二本鎖を維持するのに十分な指定温度で伸長二重体からターゲットシグナルを測定することで検出される。
好ましい一実現例によれば、第１断片の伸長鎖は、第１断片の伸長でＣＴＯとハイブリダイゼーションされる標識されたプローブの切断から発生するシグナルを測定することで検出することができる。
好ましい一実現例によれば、第１断片の伸長鎖は、伸長鎖のサイズ又は配列に基づいて検出することができる。例えば、伸長鎖は電気泳動又は質量分析（例えば、電子衝撃（ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｉｍｐａｃｔ； ＥＩ）、化学イオン化（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ； ＣＩ）、電解脱離（Ｆｉｅｌｄ Ｄｅｓｏｐｔｉｏｎ； ＦＤ）、２５２Ｃｆ−プラズマ脱離（２５２Ｃｆ−Ｐｌａｓｍａ ｄｅｓｏｐｒｔｉｏｎ； ＰＤ）、脱離化学イオン化（ｄｅｓｏｐｒｔｉｏｎ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ； ＤＣＩ）、二次イオン質量分析（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ； ＳＩＭＳ）、高速原子衝撃（ｆａｓｔ ａｔｏｍ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ； ＦＡＢ）、エレクトロスプレーイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ； ＥＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｐｒｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ； ＭＡＬＤＩ）及びタンデム質量分析（Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ））を用いて測定することができる。
好ましい一実現例によれば、本発明の方法は、繰り返しサイクル（ｒｅｐｅａｔｉｎｇ ｃｙｃｌｅ）の間に変性過程を含んでステップ（ａ）〜（ｅ）の全部又は一部を繰り返し行うことをさらに含む。
好ましい一実現例によれば、上記方法は、少なくとも２種のヌクレオチド変異を検出するために行われ；上記上流オリゴヌクレオチドは少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、上記ＰＴＯ−ＮＶは少なくとも２種のＰＴＯ−ＮＶを含む。
好ましい一実現例によれば、上記上流オリゴヌクレオチドは上流プライマーであり、上記ステップ（ｂ）は、上流プライマーの伸長のために鋳型依存的な核酸ポリメラーゼを使用し；上記鋳型依存的な核酸ポリメラーゼは上記５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素と同一である。
好ましい一実現例によれば、上流オリゴヌクレオチドは上流プライマーであり、上記ステップ（ｂ）は、上流プライマーの伸長のために鋳型依存的な核酸ポリメラーゼを使用し；上記鋳型依存的な核酸ポリメラーゼは上記５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素と互いに異なる酵素である。
好ましい一実現例によれば、上記５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を持つ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ又はＦＥＮヌクレアーゼである。
好ましい一実現例によれば、上記方法は、下流プライマーの存在下で行われる。
本発明の方法は、ＰＮＡを用いたＰＣＲクランピング法で行われることができる。上記方法で使用されるＰＮＡ及びＰＴＯ−ＮＶは、ＤＮＡの二本鎖で同一鎖又はそれぞれ異なる鎖とハイブリダイゼーションされるようにデザインされることができる。
一実現例によれば、本発明は、上流オリゴヌクレオチドを使用することなく行われることができる。このような場合、上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性を持つ従来の酵素が用いられることができる。５’ヌクレアーゼ活性を持つ鋳型依存的なポリメラーゼのうち上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性を持ついくつかの酵素、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼがある。
ターゲット核酸配列の増幅、反応条件及び５’ヌクレアーゼ活性を考慮して、本発明は、好ましくは上流オリゴヌクレオチド、より好ましくは上流プライマーを使用して行う。
上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性に基づくＰＴＯＣＥアッセイによるヌクレオチド変異の検出方法は、次のステップを含む：
（ａ） 上記ターゲット核酸配列をＰＴＯ−ＮＶ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；上記ＰＴＯ−ＮＶは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位；及び（ｉｉｉ）上記ターゲット核酸上のヌクレオチド変異に相補的な配列を含み、上記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置するヌクレオチド変異区別サイト（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を含み；上記３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記５’タギング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；
（ｂ） 上記ＰＴＯ−ＮＶの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に上記ステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって、上記ＰＴＯ−ＮＶが上記ヌクレオチド変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つ上記ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、上記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は上記ターゲット核酸配列と二本鎖を形成して、第１の初期切断位置から切断を誘導すると、第１断片を放出し；上記ＰＴＯ−ＮＶが上記ヌクレオチド変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、上記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は上記ターゲット核酸配列と二本鎖を形成しなくて、上記第１の初期切断位置の下流に位置する第２の初期切断位置から切断を誘導すると、第２断片を放出し；上記第２断片は追加の３’末端部位を含み、これは上記第２断片を上記第１断片と異ならせ；
（ｃ） 上記ＰＴＯ−ＮＶから放出された上記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、上記ＣＴＯは、３’→５’の順序で、（ｉ）上記ＰＴＯ−ＮＶの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯ−ＮＶの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；上記ＰＴＯ−ＮＶから放出された上記第１断片又は上記第２断片は、上記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ；
（ｄ） 鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及び上記ステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行うステップであって、上記第１断片が上記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされると、上記第１断片は伸長されて上記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成され；上記第２断片が上記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされると、伸長されず；及び
（ｅ） 上記伸長鎖を検出するステップであって、上記伸長鎖の存在は、上記ＰＴＯ−ＮＶのヌクレオチド区別サイトに相補的なヌクレオチド変異の存在を示す。
上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性に基づく本発明の方法は、上流オリゴヌクレオチドを使用しないことを除いて上流オリゴヌクレオチドを用いたＰＴＯＣＥアッセイと同一であるため、これら間で共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
本発明の他の一様態によれば、本発明は、次を含み、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイを用いてターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異を検出するためのキットを提供する：
（ａ） ＰＴＯ−ＮＶ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）；上記ＰＴＯ−ＮＶは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位；及び（ｉｉｉ）上記ターゲット核酸上のヌクレオチド変異に相補的な配列を含み、上記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置するヌクレオチド変異区別サイトを含み；上記３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記５’タギング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；
（ｂ） 上流オリゴヌクレオチド（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；上記上流オリゴヌクレオチドは上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み；上記上流オリゴヌクレオチドは上記ＰＴＯ−ＮＶの上流に位置し、上記上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による上記ＰＴＯ−ＮＶの切断を誘導し；
（ｃ） ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；上記ＣＴＯは、３’→５’の順序で、（ｉ）上記ＰＴＯ−ＮＶの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯ−ＮＶの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、
上記ＰＴＯ−ＮＶが上記変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つ上記ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、上記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は上記ターゲット核酸配列と二本鎖を形成して、第１の初期切断位置から切断を誘導すると、第１断片を放出し；
上記ＰＴＯ−ＮＶが上記変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、上記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は上記ターゲット核酸配列と二本鎖を形成しなくて、上記第１の初期切断位置の下流に位置する第２の初期切断位置から切断を誘導すると、第２断片を放出し；上記第２断片は追加の３’末端部位を含み、これは上記第２断片を上記第１断片と異ならせ；上記ＰＴＯ−ＮＶから放出された上記第１断片又は上記第２断片は、上記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされる。
本発明の他の一様態によれば、本発明は、次を含み、上流オリゴヌクレオチド独立的な５’ヌクレアーゼ活性に基づくＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイを用いてターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異を検出するためのキットを提供する：
（ａ） ＰＴＯ−ＮＶ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）；上記ＰＴＯ−ＮＶは、（ｉ）上記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）上記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位；及び（ｉｉｉ）上記ターゲット核酸上のヌクレオチド変異に相補的な配列を含み、上記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置するヌクレオチド変異区別サイトを含み；上記３’ターゲッティング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、上記５’タギング部位は上記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；
（ｂ） ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；上記ＣＴＯは、３’→５’の順序で、（ｉ）上記ＰＴＯ−ＮＶの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）上記ＰＴＯ−ＮＶの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、
上記ＰＴＯ−ＮＶが上記ヌクレオチド変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つ上記ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、上記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は上記ターゲット核酸配列と二本鎖を形成して、第１の初期切断位置から切断を誘導すると、第１断片を放出し；
上記ＰＴＯ−ＮＶが上記ヌクレオチド変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、上記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は上記ターゲット核酸配列と二本鎖を形成しなくて、上記第１の初期切断位置の下流に位置する第２の初期切断位置から切断を誘導すると、第２断片を放出し；上記第２断片は追加の３’末端部位を含み、これは上記第２断片を上記第１断片と異ならせ；上記ＰＴＯ−ＮＶから放出された上記第１断片又は上記第２断片は、上記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされる。
本発明のキットは、上述した本発明の検出方法を行うために製造されるため、これら間で共通する内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例によって制限されないということは、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
実施例１：ＰＴＯＣＥ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ ＆ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）アッセイの評価
伸長二重体がターゲット核酸配列の検出のためのターゲットシグナルを提供できる否かを実験して、本発明の新規なアッセイであるＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイを評価した。
この評価のために、融解分析によって伸長二重体の存在を検出するＰＴＯＣＥアッセイ（融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイ）を行った。本発明者らは、上流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長のために５’ヌクレアーゼ活性を持つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いた。
アッセイを行う間に形成された伸長二重体は、相互作用的な二重標識を持つようにデザインした。伸長二重体の相互作用的な二重標識は、（ｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子で標識されたＣＴＯ（二重標識ＣＴＯ）、又は（ｉｉ）クエンチャー分子を持つＰＴＯ及びレポーター分子を持つＣＴＯ（クエンチャー標識ＰＴＯ及びレポーター標識ＣＴＯ）によって提供した。ＰＴＯ及びＣＴＯの３’末端はカーボンスペーサー（ｃａｒｂｏｎ ｓｐａｃｅｒ）でブロッキングした。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドをターゲット鋳型として用いた。
１−１．二重標識ＣＴＯを用いたＰＴＯＣＥアッセイ
ＰＴＯは標識を持たない。ＣＴＯはそれのテンプレーティング（ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ）部位にクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）及び蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）を持つ。本実施例で用いられた合成鋳型、上流プライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＰＴＯ−１ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）
ＮＧ−ＣＴＯ−１ ５’−［ＢＨＱ−１］ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ Ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す。）
ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １） ２ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３） ５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４） ２ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、１．６ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ）１０μＬを含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒の過程を３０回繰り返した。反応後、反応混合物を３５℃に冷却させ、３５℃で３０秒間維持させた後、３５℃から９０℃にゆっくり加熱させることで融解曲線を得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定して二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。融解ピークは融解曲線データから得た。
図１４に示すように、鋳型がある場合、伸長二重体の予想Ｔｍ値に該当する７６．５℃でピークが検出された。鋳型がない場合には何のピークも検出されなかった。本標識方法で非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）はいずれのシグナルも提供しないから、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドに該当するピークは検出されなかった。ＰＴＯが存在しないか又はＣＴＯが存在しない場合、何のピークも観察されなかった。
１−２．クエンチャー標識ＰＴＯ及びレポーター標識ＣＴＯを用いたＰＴＯＣＥアッセイ
ＰＴＯはそれの５’末端をクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）で標識した。ＣＴＯはそれの３’末端を蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）で標識した。
本実施例で用いられた合成鋳型、上流プライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＰＴＯ−２ ５’−［ＢＨＱ−１］ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）
ＮＧ−ＣＴＯ−２ ５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［ＦＡＭ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング部位を示す。）
ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １） ２ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５） ５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６） ２ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、１．６ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ） １０μＬを含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒及び７２℃で３０秒の過程を３０回繰り返した。反応後、反応混合物を３５℃に冷却させ、３５℃で３０秒間維持させた後、３５℃から９０℃にゆっくり加熱させることで融解曲線を得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定して二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。融解ピークは融解曲線データから得た。
図１５に示すように、鋳型がある場合、伸長二重体の予想Ｔｍ値に該当する７７℃でピークが検出された。本標識方法で非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供するから、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドの予想Ｔｍ値に該当する６４．０℃〜６４．５℃でピークが現れた。ＰＴＯが存在しないか又はＣＴＯが存在しない場合、何のピークも観察されなかった。
このような結果は、ターゲット依存的な伸長二重体が生成され、上記伸長二重体はターゲット核酸配列の存在を示すターゲットシグナルを提供するということを示す。
実施例２：伸長二重体のＴｍ値の調節
本発明者らは、ＰＴＯＣＥアッセイで伸長二重体のＴｍ値がＣＴＯの配列によって調節可能か否かを追加で実験した。
本実験のために、本発明者らは、テンプレーティング（ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ）部位に互いに異なる配列を持つ３種のＣＴＯを用いた。ＰＴＯは標識を持たない。３種のＣＴＯはそれのテンプレーティング部位にクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）及び蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）を持つ。ＰＴＯ及びＣＴＯの３’末端はカーボンスペーサー（ｃａｒｂｏｎ ｓｐａｃｅｒ）でブロッキングした。
３種のＣＴＯそれぞれを用いて融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを行った。
本実施例で用いられた合成鋳型、上流プライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＰＴＯ−３ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）
ＮＧ−ＣＴＯ−１ ５’−［ＢＨＱ−１］ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ Ｓｐａｃｅｒ］−３ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）
ＮＧ−ＣＴＯ−３ ５’−［ＢＨＱ−１］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ Ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）
ＮＧ−ＣＴＯ−４ ５’−［ＢＨＱ−１］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ Ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング部位を示す。）
ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １） ２ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７） ５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４， ８又は９） ２ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、１．６ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ）１０μＬを含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒の過程を３０回繰り返した。反応後、反応混合物を３５℃に冷却させ、３５℃で３０秒間維持させた後、３５℃から９０℃にゆっくり加熱させることで融解曲線を得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定して二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。融解ピークは融解曲線データから得た。
図１６に示すように、鋳型がある場合、７６．０℃、６９．０℃又は６４．５℃でピークが検出された。それぞれのピークは実験対象のＣＴＯによる伸長二重体の予想Ｔｍ値に該当する。鋳型がない場合には、何のピークも検出されなかった。
このような結果は、伸長二重体のＴｍ値がＣＴＯの配列によって調節可能であるということを示す。
実施例３：リアルタイム検出又は融解分析を含むＰＴＯＣＥを用いたターゲット核酸配列の検出
本発明者らは、ＰＴＯＣＥアッセイがリアルタイムＰＣＲ方式（ｉ）又はポストＰＣＲ 融解分析方式（ｉｉ）でターゲット核酸配列を検出できる否かを実験した：（ｉ）ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長はＰＣＲ過程によってターゲット核酸の増幅を伴い、伸長二重体の存在は各サイクルの指定温度で検出した（指定温度でのリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイ）；又は（ｉｉ）ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長はＰＣＲ過程によってターゲット核酸の増幅を伴い、伸長二重体の存在はポストＰＣＲ融解分析によって検出した（融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイ）。
上流プライマーは５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によるＰＴＯの切断に関与して、また下流プライマーとともにＰＣＲ過程によるターゲット核酸配列の増幅にも関与する。上流プライマーと下流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長に５’ヌクレアーゼ活性を持つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いた。
伸長二重体は相互作用的な二重標識を持つようにデザインした。伸長二重体の相互作用的な二重標識は、（ｉ）レポーター分子及びクエンチャー分子で標識されたＣＴＯ、（ｉｉ）伸長反応中に挿入されたクエンチャー−ｉｓｏ−ｄＧＴＰ及びレポーター分子とｉｓｏ−ｄＣ残基を持つＣＴＯ、又は（ｉｉｉ）クエンチャー分子を持つＰＴＯ及びレポーター分子を持つＣＴＯによって提供された。ＰＴＯ及びＣＴＯの３’末端はカーボンスペーサー（ｃａｒｂｏｎ ｓｐａｃｅｒ）でブロッキングした。
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡをターゲット核酸として用いた。
３−１．二重標識ＣＴＯを用いたＰＴＯＣＥアッセイ
ＰＴＯは標識を持たず、ＣＴＯはそれのテンプレーティング（ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ）部位にクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）及び蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）を持つ。
本実施例で用いられた上流プライマー、下流プライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｆ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＰＴＯ−３ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）
ＮＧ−ＣＴＯ−１ ５’−［ＢＨＱ−１］ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ Ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す。）
３−１−１．指定温度でのリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイ
ＮＧのゲノムＤＮＡ １００ｐｇ、下流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０） １０ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７） ５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４） ２ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、１．６ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ）１０μＬを含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒の過程を６０回繰り返した。各サイクルの６０℃でシグナルを検出した。伸長二重体が二本鎖形態を維持する範囲で検出温度を決定した。
図１７Ａに示すように、鋳型がある場合、ターゲットシグナル（Ｃｔ ３１．３６）が検出された。鋳型がない場合には、何のシグナルも検出されなかった。
３−１−２．融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイ
実施例３−１−１の反応後、反応混合物を３５℃に冷却させ、３５℃で３０秒間維持させた後、３５℃から９０℃にゆっくり加熱させることで融解曲線を得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定して二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。融解ピークは融解曲線データから得た。
図１７Ｂに示すように、鋳型がある場合、伸長二重体の予想Ｔｍ値に該当する７６．０℃でピークが検出された。鋳型がない場合には、何のピークも検出されなかった。本標識方法で非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは何のシグナルも提供しないから、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドに該当するピークは検出されなかった。
３−２．クエンチャー−ｉｓｏ−ｄＧＴＰ及びｉｓｏ−ｄＣ残基を持つレポーター標識ＣＴＯを用いたＰＴＯＣＥアッセイ
ＰＴＯは標識を持たない。ＣＴＯはそれの５’末端にレポーター分子（ＦＡＭ）及びｉｓｏ−ｄＣ残基を持つ。ＰＴＯ断片の伸長反応中に、クエンチャー分子（ｄａｂｃｙｌ）で標識されたｉｓｏ−ｄＧＴＰは、ｉｓｏ−ｄＣ残基に対して相補的な位置に挿入される。
本実施例で用いられた上流プライマー、下流プライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｆ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＰＴＯ−１ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）
ＮＧ−ＣＴＯ−５ ５’−［ＦＡＭ］［Ｉｓｏ−ｄＣ］ＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す。）
３−２−１．指定温度でのリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイ
ＮＧのゲノムＤＮＡ １００ｐｇ、下流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０） １０ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３） ５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１） ２ｐｍｏｌｅ及び２Ｘ Ｐｌｅｘｏｒ（登録商標）マスターミックス（Ｃａｔ． Ｎｏ． Ａ４１００， Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ） １０μＬを含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分間変性させて、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒の過程を６０回、及び７２℃で３０秒、５５℃で３０秒の過程を５回繰り返した。各サイクルの６０℃でシグナルを検出した。伸長二重体が二本鎖形態を維持する範囲で検出温度を決定した。
Ｐｌｅｘｏｒ（登録商標）マスターミックス内の５’ヌクレアーゼ活性を持つＤＮＡポリメラーゼは、上流プライマーと下流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長に用いた。
図１８Ａに示すように、鋳型がある場合、ターゲットシグナル（Ｃｔ ３３．０３）が検出された。鋳型がない場合には、何のシグナルも検出されなかった。
３−２−２．融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイ
実施例３−２−１の反応後、反応混合物を３５℃に冷却させ、３５℃で３０秒間維持させた後、３５℃から９０℃にゆっくり加熱させることで融解曲線を得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定して二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。融解ピークは融解曲線データから得た。
図１８Ｂに示すように、鋳型がある場合、伸長二重体の予想Ｔｍ値に該当する７０．０℃でピークが検出された。鋳型がない場合には、何のピークも検出されなかった。本標識方法で非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは何のシグナルも提供しないから、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドに該当するピークは検出されなかった。
３−３．クエンチャー標識ＰＴＯ及びレポーター標識ＣＴＯを用いたＰＴＯＣＥアッセイ
ＰＴＯの５’末端はクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）で標識した。ＣＴＯの３’末端は蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）で標識した。
本実施例で用いられた上流プライマー、下流プライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｆ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＰＴＯ−４ ５’−［ＢＨＱ−１］ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２）
ＮＧ−ＣＴＯ−２ ５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［ＦＡＭ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す。）
３−３−１．指定温度でのリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイ
ＮＧゲノムＤＮＡ １００ｐｇ、下流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０） １０ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２） ５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６） ２ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、１．６ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ）１０μＬを含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒の過程を６０回繰り返した。各サイクルの６０℃でシグナルを検出した。伸長二重体が二本鎖形態を維持する範囲で検出温度を決定し、上記温度は非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドのＴｍ値より高い。
図１９Ａに示すように、鋳型がある場合、ターゲットシグナル（Ｃｔ ２９．７９）が検出された。鋳型がない場合には、何のシグナルも検出されなかった。
３−３−２．融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイ
実施例３−３−１の反応後、反応混合物を３５℃に冷却させ、３５℃で３０秒間維持させた後、３５℃から９０℃にゆっくり加熱させることで融解曲線を得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定して二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。融解ピークは融解曲線データから得た。
図１９Ｂに示すように、鋳型がある場合、伸長二重体の予想Ｔｍ値に該当する７６．５℃でピークが検出された。本標識方法で非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドは非ターゲットシグナルを提供するから、鋳型がない場合、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドのＴｍ値に該当するピークが４８．０℃で検出された。
このような結果は、リアルタイム検出又は融解分析を含むＰＴＯＣＥによってターゲット核酸配列を検出することができるということを示す。
実施例４：融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイによる複数のターゲット核酸配列の検出
また、本発明者らは、融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイが同一の種類のレポーター分子を用いて複数のターゲット核酸配列を検出できるか否かを実験した。
ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長はＰＣＲ過程によるターゲット核酸の増幅とともに伴われ、伸長二重体の存在はポストＰＣＲ融解分析（融解分析を含むＰＴＯＣアッセイ）によって検出した。
アッセイ中に形成された伸長二重体は、相互作用的な二重標識を持つようにデザインした。伸長二重体の相互作用的な二重標識はそれのテンプレーティング部位のレポーター分子及びクエンチャー分子で標識されたＣＴＯによって提供された。ＣＴＯは同一の種類の蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）を持つが、異なる配列を持ってＴｍ値が異なる伸長二重体が生成される。ＰＴＯ及びＣＴＯの３’末端はカーボンスペーサーでブロッキングした。
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）のゲノムＤＮＡをターゲット核酸として用いた。
本実施例で用いられた上流プライマー、下流プライマー、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｆ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＰＴＯ−３ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）
ＮＧ−ＣＴＯ−１ ５’−［ＢＨＱ−１］ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ Ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）
ＳＡ−Ｆ ５’−ＴＧＴＴＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＴＴＴＡＡＴＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）
ＳＡ−Ｒ ５’−ＧＡＴＡＡＧＴＴＴＡＡＡＧＣＴＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４）
ＳＡ−ＰＴＯ−１ ５’−ＡＡＴＣＣＧＡＣＣＡＣＧＣＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＡＣＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５）
ＳＡ−ＣＴＯ−１ ５’−［ＢＨＱ−１］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＣＡ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＧＡＴＴ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １６）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す。
ＮＧのゲノムＤＮＡ １００ｐｇ、ＳＡのゲノムＤＮＡ １００ｐｇ、それぞれの下流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０及び１３） １０ｐｍｏｌｅ、それぞれの上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２及び１４） １０ｐｍｏｌｅ、それぞれのＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７及び１５） ５ｐｍｏｌｅ、それぞれのＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４及び１６） ２ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、１．６ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ）１０μＬを含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒、７２℃で３０秒の過程を６０回繰り返した。反応後、反応混合物を３５℃に冷却させ、３５℃で３０秒間維持させた後、３５℃から９０℃にゆっくり加熱させることで融解曲線を得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定して二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。融解ピークは融解曲線データから得た。
図２０に示すように、鋳型がある場合、複数のターゲットシグナル（ＮＧのＴｍ：７５．５℃及びＳＡのＴｍ：６３．５℃）が検出された。鋳型がない場合には、何のシグナルも検出されなかった。
このような結果は、融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイは、ターゲット核酸に該当する伸長二重体が異なるＴｍ値を持つ条件で同一の種類のレポーター分子（例えば、ＦＡＭ）を用いることで、複数のターゲット核酸を検出することができるということを示す。
実施例５：マイクロアレイでの融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイの評価
本発明者らは、マイクロアレイでの融解分析を含むＰＴＯＣＥアッセイを追加で実験した。ＰＴＯの切断は個別容器で行い、ＣＴＯが固定化されたマイクロアレイに上記反応結果物の一部分を移した。伸長反応後、伸長二重体の存在を融解分析によって検出した。
５’ヌクレアーゼ活性を持つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、上流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長に用いた。アッセイ中に形成された伸長二重体は単一標識を持つようにデザインした。伸長二重体の単一標識はそれの５’末端が蛍光レポーター分子であるＱｕａｓａｒ５７０で標識されたＰＴＯによって提供された。ＰＴＯ及びＣＴＯの３’末端はカーボンスペーサーでブロッキングした。ＣＴＯはリンカーとしてポリ（Ｔ）５を持ち、それの５’末端にあるアミノ基（ＡｍｉｎｎｏＣ７）を用いてガラススライドの表面に固定した。それの５’末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を持つマーカープローブはそれの３’末端にあるアミノ基を用いてガラススライドの表面に固定した。
本実施例で用いられた合成鋳型、上流プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びマーカーの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＰＴＯ−５ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）
ＮＧ−ＣＴＯ−Ｓ１ ５’−［ＡｍｉｎｏＣ７］ＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ Ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８）
Ｍａｒｋｅｒ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す。）
ＮＳＢ９ ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ， Ｋｏｒｅａ）をＣＴＯ及びマーカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８及び１９）の作製に用いた。ＮＳＢスポッティングバッファー（ＮＳＢ ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で最終濃度１０μＭになるように溶解させたＣＴＯ及びマーカーをＰｅｒｓｏｎａｌＡｒｒａｙｅｒＴＭ１６ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｐｏｔｔｅｒ（ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ， Ｃｈｉｎａ）を用いて ＮＳＢ９ ＮＨＳスライド上にプリントした。ＣＴＯ及びマーカーを２ｘ１フォーマット（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ｓｐｏｔｓ）で並んでスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）し、このようにして作製されたマイクロアレイを約８５％湿度に維持されるチャンバに一晩インキュベートした。非特異的に結合されたＣＴＯ及びマーカーを除去するために、上記スライドを２ｘＳＳＰＥ（０．３Ｍ 塩化ナトリウム、０．０２Ｍ リン酸水素ナトリウム及び２．０ｍＭ ＥＤＴＡ）、ｐＨ ７．４及び７．０ｍＭ ＳＤＳを含有した緩衝液に３７℃で３０分間洗浄して蒸溜水で洗浄した。その後、スライド遠心分離機を用いて上記ＤＮＡ機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥させ、使用前まで４℃の暗室で保管した。
ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １） ２ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７） １ｐｍｏｌ及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、４ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ）２５μＬを含有した５０μＬの最終体積で切断反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６３℃で６０秒の過程を３０回繰り返した。
ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８）が交差結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに、上記結果物である混合物３０μＬを適用した。スライドをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ブロック方式でサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ， Ｃｈｉｎａ）に位置させた。融解分析のために、６個の同一のスライドを作製した。伸長反応を５５℃で２０分間行った。その後、このようにして作製されたスライドを１分間室温でインキュベートした。最終的に、各スライドを４４℃、５２℃、６０℃、６８℃、７６℃又は８４℃で蒸溜水で１分間洗浄させた。イメージの獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ， ＵＳ）を用いて５μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ６．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ， ＵＳ）を用いて分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット中央値（ｓｐｏｔ−ｍｅｄｉａｎｓ）で表現した。再現性を調べるために、各スポットは２個ずつスポッティングした。蛍光強度を、繰り返されたスポットの平均値で示した。
図２１Ａ及２１Ｂに示すように、異なる洗浄温度によって作製されたスポットからの蛍光強度を測定することで融解曲線を得た。上記融解曲線データから伸長二重体の存在を決定した。
実施例６：マイクロアレイでのリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイの評価
本発明者らは、マイクロアレイで指定温度でのリアルタイム検出を含むＰＴＯＣＥアッセイを実験した。
ＣＴＯが固定化されたマイクロアレイ上でＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長を繰り返した。所定のサイクルごとに指定温度で伸長二重体の存在を検出した。
５’ヌクレアーゼ活性を持つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、上流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長に用いた。
アッセイ中に形成された伸長二重体は、単一標識又は相互作用的な二重標識を持つようにデザインした。伸長二重体の単一標識は、レポーター分子で標識されたＰＴＯ（レポーター標識ＰＴＯ）によって提供された。伸長二重体の相互作用的な二重標識は、レポーター分子及びクエンチャー分子で標識されたＣＴＯ（二重標識ＣＴＯ）によって提供された。ＰＴＯ及びＣＴＯの３’末端は、カーボンスペーサーでブロッキングした。
ＣＴＯはリンカーとしてポリ（Ｔ）を持つ。ＣＴＯはそれの５’末端又は３’末端にあるアミノ基（ＡｍｉｎｎｏＣ７）を用いてガラススライドに固定した。それの５’末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を持つマーカープローブは、それの３’末端にあるアミノ基を用いてガラススライドに固定した。ガラススライド上の蛍光強度は指定温度で測定した。伸長二重体が二本鎖形態を維持する範囲で検出温度を決定した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として用いた。
６−１．レポーター標識ＰＴＯを用いたＰＴＯＣＥアッセイ
ＰＴＯはそれの５’末端に蛍光レポーター分子としてＱｕａｓａｒ５７０を持つ。ＣＴＯはそれの５’末端を通じて固定化させた。本標識方法では、伸長二重体が二本鎖形態を維持する範囲で検出温度を決定し、上記温度は、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドのＴｍ値より高い。
本実施例で用いられた合成鋳型、上流プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びマーカーの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＰＴＯ−５ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）
ＮＧ−ＣＴＯ−Ｓ１ ５’−［ＡｍｉｎｏＣ７］ＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣ ＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ Ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８）
Ｍａｒｋｅｒ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す。）
実施例５で用いられたものと同一のプロトコルでスライドを作製した。
ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １） ２ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７） １ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、２．４ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ）１５μＬを含有した３０μＬの最終体積でＰＴＯＣＥ反応を行った；ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８）が交差結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに上記全体混合物を適用した。スライドをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ブロック方式でサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ， Ｃｈｉｎａ）に位置させた。サイクリング分析のために、５個の同一のスライドを作製した。ＰＴＯＣＥ反応を次のように行った：９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒及び５５℃で６０秒の過程を０、５、１０、２０又は３０サイクル行った。各サイクル数による反応後、上記スライドを６４℃で蒸溜水で１分間洗浄した。各洗浄後、イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ， ＵＳ）を用いて５μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ６．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ， ＵＳ）を用いて分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット中央値で表現した。再現性を調べるために、各スポットは２個ずつスポッティングした。蛍光強度を、繰り返されたスポットの平均値で示した。
図２２Ａ及び２２Ｂに示すように、鋳型がある場合、ターゲット核酸配列に対する蛍光強度はサイクル数によって増加した（０サイクル＿ＲＦＵ： １，３０４±０．７；５サイクル＿ＲＦＵ： １８，９３９±１，３４２．１；１０サイクル＿ＲＦＵ： ３０，６１９±２８５．０；２０サイクル＿ＲＦＵ： ５６，２４８±２，２０８．３；及び３０サイクル＿ＲＦＵ： ６４，６４５±１，１１０．２）。鋳型がない場合には、サイクル数による蛍光強度の変化がなかった。
６−２．二重標識ＣＴＯを用いたＰＴＯＣＥアッセイ
ＣＴＯはそれの３’末端を通じて固定化され、テンプレーティング部位にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）及び蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を持つ。
本実施例で用いられた合成鋳型、上流プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びマーカーの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＰＴＯ−６ ５’− ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０）
ＮＧ−ＣＴＯ−Ｓ２ ５’−［ＢＨＱ−２］ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ５７０）］ＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１）
Ｍａｒｋｅｒ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す。）
実施例５で用いられたものと同一のプロトコルでスライドを作製した。
ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １） ２ｐｍｏｌｅ、上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２０） １ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、２．４ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ）１５μＬを含有した３０μＬの最終体積でＰＴＯＣＥ反応を行った；ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２１）が交差結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに上記全体混合物を適用した。スライドをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ブロック方式でサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ， Ｃｈｉｎａ）に位置させた。サイクリング分析のために、５個の同一のスライドを作製した。ＰＴＯＣＥ反応を次のように行った：９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒及び５０℃で６０秒の過程を０、５、１０、２０又は３０サイクル行った。各サイクル数による反応後、イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナー Ａｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ， ＵＳ）を用いて５μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ６．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ， ＵＳ）を用いて分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット中央値で表現した。再現性を調べるために、各スポットは２個ずつスポッティングした。蛍光強度を、繰り返されたスポットの平均値で示した。
図２３Ａ及び２３Ｂに示すように、鋳型がある場合、ターゲット核酸配列に対する蛍光強度はサイクル数によって増加した（０サイクル＿ＲＦＵ： ２８，０７８±４６０．３；５サイクル＿ＲＦＵ： ３５，９６７±５５５．１；１０サイクル＿ＲＦＵ： ４４，６７４±１８６．０；２０サイクル＿ＲＦＵ： ６５，４２３±２．１；及び３０サイクル＿ＲＦＵ： ６５，４２６±２．８）。鋳型がない場合には、サイクル数による蛍光強度の変化がなかった。
実施例７：マイクロアレイで指定温度でのエンドポイント検出を含むＰＴＯＣＥアッセイを用いた複数のターゲット核酸配列の検出
本発明者らは、マイクロアレイで指定温度でのエンドポイント検出を含むＰＴＯＣＥアッセイを用いて複数のターゲット検出を追加で実験した。
ＰＴＯの切断は個別容器でＰＣＲ過程を用いて行い、ＣＴＯが固定化されたマイクロアレイに上記結果物の適正量を移す。伸長反応後、伸長二重体の存在を指定温度でのエンドポイント検出によって検出した。
５’ヌクレアーゼ活性を持つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、上流プライマーと下流プライマーの伸長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の伸長に用いた。
アッセイ中に形成された伸長二重体は、単一標識を持つようにデザインした。伸長二重体の単一標識は、５’末端が蛍光レポーター分子であるＱｕａｓａｒ５７０で標識されたＰＴＯによって提供された。ＰＴＯ及びＣＴＯの３’末端は、カーボンスペーサーでブロッキングした。
ＣＴＯはリンカーとしてポリ（Ｔ）５を持ち、それの５’末端にあるアミノ基（ＡｍｉｎｎｏＣ７）を用いてガラススライドに固定した。それの５’末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を持つマーカープローブは、それの３’末端にあるアミノ基を用いてガラススライドに固定した。
ガラススライド上の蛍光強度は指定温度で測定した。伸長二重体が二本鎖形態を維持する範囲で検出温度を決定し、上記温度は、非切断ＰＴＯとＣＴＯとのハイブリッドのＴｍ値より高い。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡを用いた。
本実施例で用いられた上流プライマー、下流プライマー、ＰＴＯ、ＣＴＯ及びマーカーの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｆ ５’− ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）
ＮＧ−ＰＴＯ−５ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７）
ＮＧ−ＣＴＯ−Ｓ１ ５’−［ＡｍｉｎｏＣ７］ＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ Ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８）
ＳＡ−Ｆ ５’−ＴＧＴＴＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＣＡＡＧＧＡＴＴＴＡＡＴＣ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３）
ＳＡ−Ｒ２ ５’−ＴＴＡＧＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＡＡＣＣＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２）
ＳＡ−ＰＴＯ−２ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＡＴＣＣＧＡＣＣＡＣＧＣＴＡＴＧＣＴＣＡＴＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＧＴＴＴＡＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２３）
ＳＡ＿ＣＴＯ−Ｓ１ ５’−［ＡｍｉｎｏＣ７］ＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＣＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＧＴＧＧＴＣＧＧＡＴＴ［Ｃ３ Ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２４）
Ｍａｒｋｅｒ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １９）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す。）
実施例５で用いられたものと同一のプロトコルでスライドを作製した。
それぞれのＳＡ及び／又はＮＧのゲノムＤＮＡ １００ｐｇ、それぞれの下流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０及び／又は１３） １０ｐｍｏｌｅ、それぞれの上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２及び／又は２２） １０ｐｍｏｌｅ、それぞれのＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １７及び／又は２３） １ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、４ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ）２５μＬを含有した５０μＬの最終体積で切断反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６３℃で６０秒の過程を６０回繰り返した。ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １８及び２４）が交差結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに上記結果物である混合物３０μＬを適用した。スライドをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ブロック方式でサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ， Ｃｈｉｎａ）に位置させた。伸長反応を５５℃で２０分間行った。その後、このようにして作製されたスライドを６４℃で蒸溜水で１分間洗浄させた。各洗浄後、イメージ獲得は、共焦点レーザースキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ， ＵＳ）を用いて、１０μｍピクセル解像度のスキャニングで行った。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ６．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ， ＵＳ）を用いて分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット中央値で表現した。再現性を調べるために、各スポットは２個ずつスポッティングした。蛍光強度を、繰り返されたスポットの平均値で示した。
図２４に示すように、ＳＡ鋳型がある場合、ＳＡに対するターゲットシグナル（ＲＦＵ： ６５，１９２±１９８．７）が検出された。ＮＧ鋳型がある場合、ＮＧに対するターゲットシグナル（ＲＦＵ： ６５，３３２±１．４）が検出された。ＳＡ及びＮＧの鋳型がいずれもある場合、ＳＡに対するターゲットシグナル（ＲＦＵ： ６５，３０２±０．７）及びＮＧ（ＲＦＵ ６５，３０２±０．７）に対するターゲットシグナルもいずれも検出された。
実施例８：ＰＴＯＣＥ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ ＆ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）アッセイを用いたターゲット核酸配列の単一ヌクレオチド変異の検出
本発明者らは、ＰＴＯ−ＮＶ（ＰＴＯ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を用いたＰＴＯＣＥアッセイでターゲット核酸配列の単一ヌクレオチド変異を区別できるかを評価した。
ＰＴＯ−ＮＶの切断及びＰＴＯ−ＮＶ断片の伸長はＰＣＲ過程によるターゲット核酸増幅を伴い、伸長二重体の存在はポストＰＣＲ融解分析（融解分析）によって検出された。上流プライマーは５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によるＰＴＯ−ＮＶの切断に関与し、ＰＣＲ過程による下流プライマーとともにターゲット核酸配列の増幅にも関与する。５’ヌクレアーゼ活性を持つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、上流プライマー及び下流プライマーの伸長、ＰＴＯ−ＮＶの切断及びＰＴＯ−ＮＶ断片の伸長のために使用した。
ＰＴＯ−ＮＶ及びＣＴＯは、それの３’末端をカーボンスペーサーでブロッキングした。ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）野生型（ｗｉｌｅ−ｔｙｐｅ）（Ｔ）及び変異型（ｍｕｔａｎｔ−ｔｙｐｅ）（Ａ）のヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用した。
ＰＴＯ−ＮＶは標識を持たず、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部での単一ヌクレオチド変異区別サイトは、変異型（Ａ）テンプレートに相補的なヌクレオチドを持つ。４種のＰＴＯ−ＮＶを試験し、上記ＰＴＯ−ＮＶは、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部での単一ヌクレオチド変異区別サイトの位置に差がある。
単一ヌクレオチド変異区別サイトは、３’ターゲッティング部位の５’末端からそれぞれ一番目のヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７）、二番目のヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８）、三番目のヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９）及び四番目のヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０）に位置する。
ＣＴＯは、それのテンプレーティング部位にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）及び蛍光レポーター分子（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）で標識される。上記ＰＴＯ−ＮＶ及びＣＴＯの組み合わせは次のとおりである：（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７のＰＴＯ−ＮＶ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１のＣＴＯ、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８のＰＴＯ−ＮＶ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２のＣＴＯ、（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９のＰＴＯ−ＮＶ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１のＣＴＯ、（ｉｖ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０のＰＴＯ−ＮＶ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３のＣＴＯ。
本実施例で用いられた上流プライマー、下流プライマー、ＰＴＯ−ＮＶ及びＣＴＯの配列は次のとおりである：
ＢＲＡＦ−Ｆ ５’−ＣＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＴＧＣＴＣＴＧＡＴＡＧＧＩＩＩＩＩＧＡＧＡＴＣＴＡＣＴ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５）
ＢＲＡＦ−Ｒ ５’−ＡＴＡＧＣＣＴＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＣＡＴＣＣＡＩＩＩＩＩＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６）
ＢＲＡＦ−ＰＴＯ−ＮＶ−１ ５’−ＣＡＣＡＡＧＧＧＴＧＧＧＴ｛Ａ｝ＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２７）
ＢＲＡＦ−ＰＴＯ−ＮＶ−２ ５’−ＣＡＣＡＡＧＧＧＴＧＧＧＴＧ｛Ａ｝ＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８）
ＢＲＡＦ−ＰＴＯ−ＮＶ−３ ５’−ＣＡＣＡＡＧＧＧＴＧＧＧＴＡＧ｛Ａ｝ＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９）
ＢＲＡＦ−ＰＴＯ−ＮＶ−４ ５’−ＣＡＣＡＡＧＧＧＴＧＧＧＴＣＡＧ｛Ａ｝ＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０）
ＢＲＡＦ−ＣＴＯ−１ ５’−［ＢＨＱ−２］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ［Ｔ（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ６１０）］ＣＴＣＣＧＡＧＴＴＡＣＣＣＡＣＣＣＴＴＧＴＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３１）
ＢＲＡＦ−ＣＴＯ−２ ５’−［ＢＨＱ−２］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ［Ｔ（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ６１０）］ＧＣＴＧＡＧＴＡＣＡＣＣＣＡＣＣＣＴＴＧＴＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３２）
ＢＲＡＦ−ＣＴＯ−３ ５’−［ＢＨＱ−２］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ［Ｔ（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ６１０）］ＣＧＡＧＴＡＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＣＴＴＧＴＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３）
（Ｉ ： デオキシイノシン）
（下線を引いた文字はＰＴＯ−ＮＶの５’タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す。）
（｛ ｝内の文字はヌクレオチド変異区別サイトを示す。）
ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）野生型（Ｔ）又は変異型（Ａ）のヒトゲノムＤＮＡ １０ｎｇ、上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５） １０ｐｍｏｌｅ、下流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ−ＮＶ（ＳＥＱ ＩＤｓ ＮＯ： ２７、２８、２９又は３０） ５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤｓ ＮＯ： ３１、３２、３１又は３３） １ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、１．６ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ）１０μＬを含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、５５℃で６０秒及び７２℃で３０秒の過程を５０回繰り返した。反応後、反応混合物を５５℃に冷却させ、５５℃で３０秒間維持させた後、５５℃から８５℃にゆっくり加熱させることで融解曲線を得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定して二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。融解ピークは融解曲線データから得た。
図３３Ａ及びＢに示すように、変異型（Ａ）テンプレートがある場合、伸長二重体に対する予想Ｔｍ値に該当するピークが全てのＰＴＯ−ＮＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ２７、２８、２９及び３０）で検出された。
野生型（Ｔ）テンプレートがある場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ２７、２８及び２９のＰＴＯ−ＮＶに対してピークが検出されなかった。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０のＰＴＯ−ＮＶで低い高さを持つピークが検出されたが、これは野生型（Ｔ）テンプレートの存在下で得られるピークとは区別されることができる。
このような結果は、ＰＴＯ−ＮＶを用いたＰＴＯＣＥアッセイ（すなわち、ＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイ）が単一ヌクレオチド変異を区別できるということを示す。
実施例９：非塩基対部分を持つＰＴＯ−ＮＶを用いたＰＴＯＣＥアッセイによるターゲット核酸配列の単一ヌクレオチド変異の検出
本発明者らは、ＰＴＯ−ＮＶで非塩基対部分の使用がＶＤ−ＰＴＯＣＥアッセイを改善するかを評価した。
５’ヌクレアーゼ活性を持つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、上流プライマー及び下流プライマーの伸長、ＰＴＯ−ＮＶの切断及びＰＴＯ−ＮＶ断片の伸長のために使用した。
伸長二重体は相互作用的な二重標識を持つようにデザインされた。伸長二重体で相互作用的な二重標識は、レポーター分子及びクエンチャー分子で標識されたＣＴＯによって提供される。ＰＴＯ−ＮＶ及びＣＴＯは、それの３’末端をカーボンスペーサーでブロッキングした。
ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）野生型（Ｔ）及び変異型（Ａ）のヒトゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用した。
ＰＴＯ−ＮＶは標識を持たず、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部での単一ヌクレオチド変異区別サイトは、変異型（Ａ）テンプレートに相補的なヌクレオチドを持つ。単一ヌクレオチド変異区別サイトは、３’ターゲッティング部位の５’末端の一部で四番目のヌクレオチドに位置する。
３種類のＰＴＯ−ＮＶは、それぞれ単一ヌクレオチド変異区別サイトから３’方向に二番目のヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４）、三番目のヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５）及び四番目のヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６）に非塩基対部分である人為的なミスマッチヌクレオチドを持つように用意される。
ＣＴＯは、それのテンプレーティング部位にクエンチャー分子（ＢＨＱ−２）及び蛍光レポーター分子（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０）で標識される（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３）。
非塩基対部分を持たないＰＴＯ−ＮＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０）は比較のために使用された。
本実施例で用いられた上流プライマー、下流プライマー、ＰＴＯ−ＮＶ及びＣＴＯの配列は次のとおりである：
ＢＲＡＦ−Ｆ ５’−ＣＴＴＣＡＴＡＡＴＧＣＴＴＧＣＴＣＴＧＡＴＡＧＧＩＩＩＩＩＧＡＧＡＴＣＴＡＣＴ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５）
ＢＲＡＦ−Ｒ ５’−ＡＴＡＧＣＣＴＣＡＡＴＴＣＴＴＡＣＣＡＴＣＣＡＩＩＩＩＩＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６）
ＢＲＡＦ−ＰＴＯ−ＮＶ−４ ５’−ＣＡＣＡＡＧＧＧＴＧＧＧＴＣＡＧ｛Ａ｝ＧＡＡＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＧ［Ｃ３ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０）
ＢＲＡＦ−ＰＴＯ−ＮＶ−５ ５’−ＣＡＣＡＡＧＧＧＴＧＧＧＴＣＡＧ｛Ａ｝Ｇ「Ｔ」ＡＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３４）
ＢＲＡＦ−ＰＴＯ−ＮＶ−６ ５’−ＣＡＣＡＡＧＧＧＴＧＧＧＴＣＡＧ｛Ａ｝ＧＡ「Ｔ」ＡＴＣＴＣＧＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３５）
ＢＲＡＦ−ＰＴＯ−ＮＶ−７ ５’−ＣＡＣＡＡＧＧＧＴＧＧＧＴＣＡＧ｛Ａ｝ＧＡＡ「Ｔ」ＴＣＴＣＧＡＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３６）
ＢＲＡＦ−ＣＴＯ−３ ５’−［ＢＨＱ−２］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ［Ｔ（ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ６１０）］ＣＧＡＧＴＡＧＡＧＡＣＣＣＡＣＣＣＴＴＧＴＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３３）
（Ｉ： デオキシイノシン）
（下線を引いた文字はＰＴＯ−ＮＶの５’タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す。）
（｛ ｝内の文字はヌクレオチド変異区別サイトを示す。）
（「 」内の文字は非塩基対部分として機能する人為的なミスマッチヌクレオチドを示す。）
ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）野生型（Ｔ）又は変異型（Ａ）のヒトゲノムＤＮＡ １０ｎｇ、上流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２５） １０ｐｍｏｌｅ、下流プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２６） １０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ−ＮＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ３０、３４、３５又は３６） ５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤｓ ＮＯ： ３３） １ｐｍｏｌｅ及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、１．６ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ）１０μＬを含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、５５℃で６０秒及び７２℃で３０秒の過程を５０回繰り返した。反応後、反応混合物を５５℃に冷却させ、５５℃で３０秒間維持させた後、５５℃から８５℃にゆっくり加熱させることで融解曲線を得た。温度が上昇する間、蛍光を連続的に測定して二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。融解ピークは融解曲線データから得た。
図３４Ａ及びＢに示すように、伸長二重体に対する予想Ｔｍ値に該当するピークが検出され、上記ピークは、変異型（Ａ）が存在する場合、非塩基対部分の位置及び存在に関わらず全てのＰＴＯ−ＮＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ３０、３４、３５及び３６）で類似する高さを見せた。
野生型（Ｔ）テンプレートが存在する場合、ピークが検出されたが、非塩基対部分を持つＰＴＯ−ＮＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ： ３４、３５及び３６）のピークは、非塩基対部分を持たないＰＴＯ−ＮＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３０）の高さより減少した。テンプレートが存在しない場合には、ピークが検出されなかった。
このような結果は、非塩基対部分の使用がＰＴＯ−ＮＶの区別能力を向上するということを示す。
実施例１０：ＰＴＯの上流オリゴヌクレオチド独立的な切断を用いたＰＴＯＣＥアッセイの評価
ＰＴＯＣＥアッセイを用いて上流オリゴヌクレオチドを使用せず、（ｉ）指定温度でリアルタイム検出又は（ｉｉ）融解分析方式でターゲット核酸配列を検出できるかを追加で評価した。
５’ヌクレアーゼ活性を持つＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ 断片の伸長のために使用した。
アッセイ中に生成された伸長二重体が相互作用的な二重標識を持つようにデザインした。ＰＴＯは標識を持たない。ＣＴＯはそれのテンプレーティング部位にクエンチャー分子（ＢＨＱ−１）及び蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）を持つ。ＰＴＯ及びＣＴＯは、それの３’末端をカーボンスペーサーでブロッキングした。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドはターゲットテンプレートとして使用された。
本実施例で用いられた合成テンプレート、ＰＴＯ及びＣＴＯの配列は次のとおりである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）
ＮＧ−ＰＴＯ−１ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）
ＮＧ−ＣＴＯ−１ ５’−［ＢＨＱ−１］ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣ［Ｔ（ＦＡＭ）］ＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ Ｓｐａｃｅｒ］−３’ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）
（下線を引いた文字はＰＴＯの５’タギング（ｔａｇｇｉｎｇ）部位を示す。）
１０−１．指定温度でリアルタイム検出
２ｐｍｏｌｅのＮＧ遺伝子に対する合成テンプレート（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）、５ｐｍｏｌｅ ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）、２ｐｍｏｌｅ ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）及び２×マスターミックス（２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰｓ、１．６ｕｎｉｔのＨ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）（Ｓｏｌｇｅｎｔ， Ｋｏｒｅａ）１０μＬを含有した２０μＬの最終体積で反応を行った；上記反応混合物を含有しているチューブをリアルタイムサーマルサイクラー（ＣＦＸ９６， Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；上記反応混合物を９５℃で１５分変性させた後、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒の過程を３０回繰り返した。発生されたシグナルの検出は毎サイクルごとに６０℃で行った。検出温度は伸長二重体が二本鎖形態を維持できる範囲で決定した。
図３５Ａに示すように、蛍光シグナル（Ｃｔ １．１５）はテンプレートが存在する場合、検出された。テンプレートがない場合、シグナルは検出されなかった。
１０−２．融解分析
実施例１０−１の反応後、反応混合物を５５℃に冷却し、５５℃で３０秒維持した後、５５℃から９０℃まで徐々に加熱して融解曲線を得た。温度が増加する間、連続的に蛍光を測定して二本鎖ＤＮＡの解離をモニタリングした。融解ピークは融解曲線データから得た。
図３５Ｂに示すように、テンプレートが存在する場合には、伸長二重体の予想Ｔｍ値に該当する７６．０℃でピークが検出された。テンプレートがない場合には、ピークが観察されなかった。
以上、好ましい一実現例を詳細に記述し、本発明の原理による変形及び修正が可能であり、本発明の範囲は、添付の請求項とそれの均等物によって定義されるということは、当業界における通常の知識を持つ者によく認識される。

Claims (21)

  1. 次のステップを含み、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイを用いてターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異を検出する方法：
    （ａ） 前記ターゲット核酸配列を上流オリゴヌクレオチド及びＰＴＯ−ＮＶ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；前記上流オリゴヌクレオチドは前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み；前記ＰＴＯ−ＮＶは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に
    相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；（
    ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位；及び（ｉｉｉ）前記ターゲット核酸上のヌクレオチド変異に相補的な配列を含み、前記３
    ’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置するヌクレオチド変異区別サイト（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を含み；前記３’ターゲッティング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、前記５’タギング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；前記上流オリゴヌクレオチドは前記ＰＴＯ−ＮＶの上流に位置し；前記上流オリゴヌクレオチド又はこれの伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素によるＰＴＯ−ＮＶの切断を誘導し；
    （ｂ） 前記ＰＴＯ−ＮＶの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に前記ステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって、前記ＰＴＯ−ＮＶが前記ヌクレオチド変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つ前記ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、前記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は前記ターゲット核酸配列と二本鎖を形成して、第１の初期切断位置から切断を誘導すると
    、第１断片を放出し；前記ＰＴＯ−ＮＶが前記ヌクレオチド変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、前記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は前記ターゲット核酸配列と二本鎖を形成しなくて、前記第１の初期切断位置の下流に位置する第２の初期切断位置から切断を誘導すると、第２断片を放出し；前記第２断片は追加の３’末端部位を含み、これは前記第２断片を前記第１断片と異ならせ；
    （ｃ） 前記ＰＴＯ−ＮＶから放出された前記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、前記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）前記ＰＴＯ−
    ＮＶの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯ−ＮＶの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；前記ＰＴＯ−ＮＶから放出された前記第１断片又は前記第２断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ；
    （ｄ） 鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及び前記ステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行うステップであって、前記第１断片が前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされると、前記第１断片は伸長されて前記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成され；前記第２断片が前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされると、伸長されず；及び
    （ｅ） 前記伸長鎖の存在を検出するステップであって、前記伸長鎖の存在は、前記ＰＴＯ−ＮＶのヌクレオチド区別サイトに相補的なヌクレオチド変異の存在を示す。
  2. 前記ＣＴＯは、前記第２断片が前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされる場合、前記ＣＴＯが前記第２断片の前記追加の３’末端部位とハイブリダイゼーションされず、前記第２断片の伸長が防止されるように選択した配列を持つことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記ヌクレオチド変異区別サイトは、前記ＰＴＯ−ＮＶの３’ターゲッティング部位の５’末端から１０ヌクレオチド離隔した位置以内に位置することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 前記ＰＴＯ−ＮＶの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は、前記ヌクレオチド変異区別サイトから１ないし５ヌクレオチド離隔した位置以内に位置する非塩基対部分を含み、前記非塩基対部分は、前記第１の初期切断位置と前記第２の初期切断位置との差（
    ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を増加させることを特徴とする請求項１に記載の方法
    。
  5. 前記非塩基対部分は、前記第１の初期切断位置と前記第２の初期切断位置との距離を拡大させることを特徴とする請求項４に記載の方法。
  6. 前記非塩基対部分は、（ｉ）人為的なミスマッチ塩基、塩基対を形成できないように修
    飾された非塩基対塩基又はユニバーサル塩基を含むヌクレオチド、（ｉｉ）塩基対を形成
    できないように修飾された非塩基対ヌクレオチド、又は（ｉｉｉ）非塩基対形成化合物（
    ｎｏｎ−ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
  7. 前記非塩基対部分の数は、１ないし５個であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
  8. 前記ＰＴＯ−ＮＶのヌクレオチド変異区別サイト及び非塩基対部分は、前記３’ターゲッティング部位の５’末端から１０ヌクレオチド離隔した位置以内に位置することを特徴とする請求項４に記載の方法。
  9. 前記ヌクレオチド変異は、置換変異、欠失変異又は挿入変異であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  10. 前記第１断片と前記ＣＴＯの伸長鎖とは前記ステップ（ｄ）で伸長二重体を形成し；前記伸長二重体は、（ｉ）前記第１断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）前記ＣＴＯの配列
    及び／又は長さ、又は（ｉｉｉ）前記第１断片の配列及び／又は長さと前記ＣＴＯの配列及び／又は長さによって調節可能なＴｍ値を持ち、前記伸長二重体は、（ｉ）前記第１断
    片及び／又は前記ＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）前記伸長反応中に
    前記伸長二重体内に挿入された標識、（ｉｉｉ）前記第１断片及び／又は前記ＣＴＯに連
    結された少なくとも一つの標識及び前記伸長反応中に前記伸長二重体内に挿入された標識
    、又は（ｉｖ）インターカレーティング標識（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｌａｂｅｌ
    ）によるターゲットシグナルを提供し；前記伸長鎖の存在は、前記伸長二重体に対する融解分析又はハイブリダイゼーション分析によって前記伸長二重体から前記ターゲットシグナルを測定することで検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  11. 前記第１断片と前記ＣＴＯの前記伸長鎖とは前記ステップ（ｄ）で伸長二重体を形成し
    ；前記伸長二重体は、（ｉ）前記第１断片の配列及び／又は長さ、（ｉｉ）前記ＣＴＯの
    配列及び／又は長さ、又は（ｉｉｉ）前記第１断片の配列及び／又は長さと前記ＣＴＯの配列及び／又は長さによって調節可能なＴｍ値を持ち；前記伸長二重体は、（ｉ）前記第
    １断片及び／又はＣＴＯに連結された少なくとも一つの標識、（ｉｉ）前記伸長反応中に
    前記伸長二重体内に挿入された標識、（ｉｉｉ）前記第１断片及び／又はＣＴＯに連結さ
    れた少なくとも一つの標識及び前記伸長反応中に前記伸長二重体内に挿入された標識、又は（ｉｖ）インターカレーティング標識（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｌａｂｅｌ）によるターゲットシグナルを提供し；前記伸長鎖の存在は、前記伸長二重体が二本鎖を維持する指定温度で前記伸長二重体からターゲットシグナルを測定することで検出することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  12. 前記ＰＴＯ−ＮＶ及び／又はＣＴＯの３’末端は、それの伸長が防止されるようにブロッキングされることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  13. 前記方法は、繰り返しサイクルの間に変性過程を含んでステップ（ａ）〜（ｅ）の全部又は一部を繰り返し行うことをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  14. 前記方法は、少なくとも２種のヌクレオチド変異を検出するために行われ；前記上流オリゴヌクレオチドは少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＰＴＯ−ＮＶは少なくとも２種のＰＴＯ−ＮＶを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  15. 前記方法は、下流プライマーの存在下で行われることを特徴とする請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 次のステップを含み、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ； ＰＴＯＣＥ）アッセイを用いてターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異を検出する方法：
    （ａ） 前記ターゲット核酸配列をＰＴＯ−ＮＶ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とハイブリダイゼーションさせるステップであって；前記ＰＴＯ−ＮＶは、（
    ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含む３’ターゲッティング部位；（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド
    配列を含む５’タギング部位；及び（ｉｉｉ）前記ターゲット核酸上のヌクレオチド変異に相補的な配列を含み、前記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置するヌクレオチド変異区別サイト（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を含み；前記３’ターゲッティング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、前記５’タギング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；
    （ｂ） 前記ＰＴＯ−ＮＶの切断のための条件下で５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素に前記ステップ（ａ）の結果物を接触させるステップであって、前記ＰＴＯ−ＮＶが前記ヌクレオチド変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つ前記ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、前記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は前記ターゲット核酸配列と二本鎖を形成して、第１の初期切断位置から切断を誘導すると
    、第１断片を放出し；前記ＰＴＯ−ＮＶが前記ヌクレオチド変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、前記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は前記ターゲット核酸配列と二本鎖を形成しなくて、前記第１の初期切断位置の下流に位置する第２の初期切断位置から切断を誘導すると、第２断片を放出し；前記第２断片は追加の３’末端部位を含み、これは前記第２断片を前記第１断片と異ならせ；
    （ｃ） 前記ＰＴＯ−ＮＶから放出された前記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイゼーションさせるステップであって、前記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）前記ＰＴＯ−
    ＮＶの５’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯ−ＮＶの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み；前記ＰＴＯ−ＮＶから放出された前記第１断片又は前記第２断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされ；
    （ｄ） 鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ及び前記ステップ（ｃ）の結果物を用いて伸長反応を行うステップであって、前記第１断片が前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされると、前記第１断片は伸長されて前記ＣＴＯのテンプレーティング部位と相補的な伸長配列を含む伸長鎖が生成され；前記第２断片が前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされると、伸長されず；及び
    （ｅ） 前記伸長鎖の存在を検出するステップであって、前記伸長鎖の存在は、前記ＰＴＯ−ＮＶのヌクレオチド区別サイトに相補的なヌクレオチド変異の存在を示す。
  17. 次を含み、請求項１から１５のいずれかに記載の方法の実施における使用のための、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）アッセイを用いてターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異を検出するためのキット：
    （ａ） ＰＴＯ−ＮＶ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）；前記ＰＴＯ−ＮＶは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド
    配列を含む３’ターゲッティング部位；（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌ
    クレオチド配列を含む５’タギング部位；及び（ｉｉｉ）前記ターゲット核酸上のヌクレオチド変異に相補的な配列を含み、前記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置するヌクレオチド変異区別サイトを含み；前記３’ターゲッティング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、前記５’タギング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；
    （ｂ） 上流オリゴヌクレオチド（ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；前記上流オリゴヌクレオチドは前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド配列を含み；前記上流オリゴヌクレオチドは前記ＰＴＯ−ＮＶの上流に位置し、前記上流オリゴヌクレオチド又はそれの伸長鎖は５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素による前記ＰＴＯ−ＮＶの切断を誘導し；及び
    （ｃ） ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；前記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）前記ＰＴＯ−ＮＶの５
    ’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯ−ＮＶの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、
    前記ＰＴＯ−ＮＶが前記変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つ前記ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、前記３’ターゲッティング部位の５
    ’末端の一部は前記ターゲット核酸配列と二本鎖を形成して、第１の初期切断位置から切断を誘導すると、第１断片を放出し；
    前記ＰＴＯ−ＮＶが前記変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、前記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は前記ターゲット核酸配列と二本鎖を形成しなくて、前記第１の初期切断位置の下流に位置する第２の初期切断位置から切断を誘導すると、第２断片を放出し；前記第２断片は追加の３’末端部位を含み、これは前記第２断片を前記第１断片と異ならせ；前記ＰＴＯ−ＮＶから放出された前記第１断片又は前記第２断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされる。
  18. 前記キットは、５’ヌクレアーゼ活性を持つ酵素、鋳型依存的な核酸ポリメラーゼ又はこれの組み合わせをさらに含み、前記第１断片が前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされると、伸長されて前記ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的な伸長配列を含む伸長鎖を形成し、前記第２断片が前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされると、伸長されないことを特徴とする請求項１７に記載のキット。
  19. 前記ＣＴＯは、前記第２断片が前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイゼーションされる場合、前記ＣＴＯが前記第２断片の前記追加の３’末端部位とハイブリダイゼーションされず、前記第２断片の伸長が防止されるように選択した配列を持つことを特徴とする請求項１７に記載のキット。
  20. 前記ＰＴＯ−ＮＶの３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は、前記ヌクレオチド変異区別サイトから１ないし５ヌクレオチド離隔した位置以内に位置する非塩基対部分を含み；前記非塩基対部分は、前記第１の初期切断位置と前記第２の初期切断位置との差（
    ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を増加させることを特徴とする請求項１７に記載のキット。
  21. 次を含み、請求項１６に記載の方法の実施における使用のための、ＰＴＯ切断及び伸長（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）アッセイを用いてターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異を検出するためのキット：
    （ａ） ＰＴＯ−ＮＶ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ）；前記ＰＴＯ−ＮＶは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイゼーションヌクレオチド
    配列を含む３’ターゲッティング部位；及び（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’タギング部位；及び（ｉｉｉ）前記ターゲット核酸上のヌクレオチド変異に相補的な配列を含み、前記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部に位置するヌクレオチド変異区別サイトを含み；前記３’ターゲッティング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされ、前記５’タギング部位は前記ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず；及び
    （ｂ） ＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；前記ＣＴＯは３’→５’の順序で、（ｉ）前記ＰＴＯ−ＮＶの５
    ’タギング部位又は５’タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位、及び（ｉｉ）前記ＰＴＯ−ＮＶの５’タギング部位及び３’ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位を含み、
    前記ＰＴＯ−ＮＶが前記変異区別サイトに対して相補的なヌクレオチド変異を持つ前記ターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、前記３’ターゲッティング部位の５
    ’末端の一部は前記ターゲット核酸配列と二本鎖を形成して、第１の初期切断位置から切断を誘導すると、第１断片を放出し；
    前記ＰＴＯ−ＮＶが前記変異区別サイトに対して非相補的なヌクレオチド変異を持つターゲット核酸配列とハイブリダイゼーションされ、前記３’ターゲッティング部位の５’末端の一部は前記ターゲット核酸配列と二本鎖を形成しなくて、前記第１の初期切断位置の下流に位置する第２の初期切断位置から切断を誘導すると、第２断片を放出し；前記第２断片は追加の３’末端部位を含み、これは前記第２断片を前記第１断片と異ならせ；前記ＰＴＯ−ＮＶから放出された前記第１断片又は前記第２断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイゼーションされる。
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