JP5993939B2 - Ｐｏ切断及びハイブリダイゼーションによるターゲット核酸配列の検出 - Google Patents

Ｐｏ切断及びハイブリダイゼーションによるターゲット核酸配列の検出 Download PDF

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本発明は、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによるターゲット核酸配列の検出に関する。
ＤＮＡハイブリダイゼーションベースの技術は、特定核酸配列の決定に非常に有用な道具となり、臨床診断、遺伝子研究、及び法医学的な実験分析に明確に役に立つ。プローブハイブリダイゼーション過程以外にも、追加的に酵素的反応を利用した幾つかの接近法、例えば、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法が提示された。
ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法で、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた標識プローブは、アップストリームプライマー依存的ＤＮＡ重合酵素の５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、標識断片は放出される（米国特許第５，２１０，０１５号、第５，５３８，８４８号、及び第６，３２６，１４５号）。標識断片の放出は、プローブの切断を意味し、これは、最終的にターゲット配列の存在を示す。標識断片の検出は、ゲル電気泳動、勾配沈降、ゲル排除クロマトグラフィー、及びホモクロマトグラフィーのようなサイズ分析によって実施される。プローブの切断は、相互作用的二重標識を用いてリアルタイムで実施される。
ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法は、シグナル発生のための２つの接近法を提示する：重合依存的切断（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｅａｖａｇｅ）及び重合独立的切断（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｅａｖａｇｅ）。重合依存的切断で、アップストリームプライマーの延長は、必ず核酸重合酵素が標識プローブの５’−末端に接触する前に発生しなければならない。延長反応が進行しながら、重合酵素は、標識プローブの５’−末端を次第に切断する。重合独立的切断で、アップストリームプライマー及び標識プローブは、非常に近接してターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、アップストリームプライマーの３’−末端と核酸重合酵素の結合は、前記核酸重合酵素を標識プローブの５’−末端に接触させて、標識が放出される。また、ＴａｑＭａｎＴＭプローブ方法は、その５’−末端部位にターゲット配列とハイブリダイズ可能でない５’−テイル区域を有する標識プローブが切断されて、５’−テイル区域を含む断片が形成されることを開示している。
ターゲット配列に非相補的な５’−テイル区域を有するプローブが、５’ヌクレアーゼによって切断されて、５’−テイル区域を含む断片が放出される幾つかの方法が報告され、ターゲット検出は、５’−テイル区域を含む断片を用いて実施される。
例えば、特許文献１は、ＤＮＡ重合酵素の５’ヌクレアーゼ活性によって切断される切断構造を開示している。鋳型に対して非相補的な５’部位、及び鋳型に対して相補的な３’部位を含むオリゴヌクレオチドが鋳型にハイブリダイズされ、アップストリームオリゴヌクレオチドは、非常に近接して鋳型にハイブリダイズされる切断構造が例示されている。切断構造は、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素、または減少した合成活性を有する変形ＤＮＡ重合酵素によって切断されて、鋳型に非相補的な５’部位が放出される。次いで、放出された５’部位は、ヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされて切断構造を形成し、これにより、順次的な切断反応が誘導されてターゲット配列が検出される。
特許文献２は、３’−末端がブロッキングされたアップストリームオリゴヌクレオチドを有する切断構造が、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼによって切断されて、非相補的な５’フラップ（ｆｌａｐ）部位が放出され、該放出された５’フラップ部位は、サイズ分析または相互作用的二重標識によって検出される過程を開示している。
特許文献３は、ターゲットに非相補的な５’部位を有する単一標識プローブの切断及び固相基質上に固定化されたキャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅ）プローブを利用したターゲット検出方法を開示している。単一標識は、標識プローブの非相補的な５’部位に位置する。ターゲットにハイブリダイズされた標識プローブは、切断されて断片を放出し、以後、断片は、キャプチャープローブにハイブリダイズされてターゲット配列の存在が検出される。この方法で、非切断された／完全な（ｕｎｃｌｅａｖｅｄ／ｉｎｔａｃｔ）プローブは、キャプチャープローブにハイブリダイズされないことが必須的である。このような実施のために、前記方法は、固定化されたオリゴヌクレオチドの固定方向、及び固相基質の表面からの距離を調節して、非切断されたターゲットプローブが固定化されたキャプチャープローブとハイブリダイズされることを抑制する。しかし、このような制限は、固相基質でのハイブリダイゼーションの効率性を低め、また反応条件の最適化も難しくする。
また、特許文献４は、固相基質上に固定化されたキャプチャープローブだけではなく、ターゲットに非相補的な配列（タグまたはフラップ配列）を有するプローブを利用するターゲット検出方法を開示している。また、標識は、プローブの非相補的な部位に位置する。非切断されたプローブは、ヘアピン構造を形成してキャプチャープローブにハイブリダイズされない。一方、プローブが切断される場合、標識含有断片は、キャプチャープローブにハイブリダイズされてターゲット核酸配列の存在が検出される。しかし、ターゲット配列とプローブとの間のハイブリダイゼーションのＴｍ値を考慮し、また、切断された断片とキャプチャープローブとの間のハイブリダイゼーションのＴｍ値だけではなく、非切断されたプローブのヘアピン構造のＴｍ値を考慮して、反応条件を精巧に調節しなければならない深刻な問題がある。
したがって、固相でターゲット配列を検出するための、特に、タグ配列−運搬配列及び固相基質上に固定化されたキャプチャリングプローブを利用する従来技術の短所から自在な新規な接近法に対する開発要求が台頭しつつある。
本明細書の全般に亘って多数の特許及び文献が参照され、その引用がカッコで囲まれている。このような特許及び文献の公開は、その全体として本明細書に参照して含まれて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
米国特許第５，６９１，１４２号 米国特許第７，３８１，５３２号 米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号 米国出願公開番号第２００８−０１９３９４０号
本発明者らは、より改善された正確性及び便宜性を有し、特に、マルチプレックス方式でターゲット配列を検出する新規な接近法を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ＰＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）及びＣＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を用いてターゲット配列を検出するための新規なプロトコルを定立し、このようなターゲット検出は、プローブ切断反応及び追加的なプローブハイブリダイゼーション（すなわち、ＰＯの５’核酸切断反応及び切断／非切断ＰＯとＣＯとの間のハイブリダイゼーション反応）によって達成される。ターゲット特異性が劇的に向上した本発明のプロトコルは、固相反応に優れているように適用され、より改善された正確性及び便宜性を有し、複数のターゲット配列を検出させる。
したがって、本発明の目的は、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイを用いて、ＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイを用いて、ＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供することである。
本発明の他の目的及び利点は、添付した特許請求の範囲及び図面と共に下記の詳細な説明によってより明確になる。
本発明者らは、より改善された正確性及び便宜性を有し、特に、マルチプレックス方式でターゲット配列を検出する新規な接近法を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ＰＯ及びＣＯを用いてターゲット配列を検出するための新規なプロトコルを定立し、このようなターゲット検出は、プローブ切断反応及び追加的なプローブハイブリダイゼーション（すなわち、ＰＯの５’核酸切断反応及び切断／非切断ＰＯとＣＯとの間のハイブリダイゼーション反応）によって達成される。ターゲット特異性が劇的に向上した本発明のプロトコルは、固相反応に優れているように適用され、より改善された正確性及び便宜性を有し、複数のターゲット配列を検出させる。
本発明は、ＰＯ及びＣＯの組合せを用いて固相基質上からターゲット配列を検出する新規なプロトコルである。
本発明の基本原理は、固相基質上に固定化されたＣＯを用いてＰＯの切断の発生を検出することである。また、試料内のターゲット配列がない場合、非切断ＰＯが固相基質上に固定化されたＣＯにハイブリダイズされるということは注目すべきことである。本発明によれば、測定される最終シグナルは、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成の有無によって異なり、これは、ターゲット配列の存否を表すことができる。
本発明は、前述した実施原理によってターゲット配列を検出し、これは、適用される標識システムによって３つの具現例に分類される。
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明は、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＯが切断され、ＣＯとのハイブリダイゼーションによってＰＯの切断が検出されるものを利用することによって、ターゲット核酸配列を検出する。本発明で、非切断されたプローブは、固相基質上に固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。
ターゲットプローブ及び固定化されたキャプチャリングプローブを使う従来技術によれば、従来技術は、（ｉ）ヘアピン構造を有するようにターゲットプローブをデザインし、ターゲット配列とのハイブリダイゼーション条件及び固定化されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション条件のいずれをも調節するか、または（ｉｉ）固定化されたオリゴヌクレオチドの固定方向、及び固相基質の表面からの距離を考慮して、固定化されたオリゴヌクレオチドをデザインして、非切断されたターゲットプローブが固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされることを防止することが必要である。したがって、従来の方法は、ターゲットプローブ及び固定化されるオリゴヌクレオチドのデザイン及び反応条件の設定側面で非常に不便である。
一方、本発明は、このような不便と制約とから自在である。ＰＯ及びＣＯのデザインが便利であり、反応条件の最適化が容易である。
（ｂ）本発明で、ＰＯｓ切断の反復と共に固相基質上のシグナルの検出を連続して実施する場合、切断されたＰＯｓの数は、切断反応の反復数によって増加し、シグナルは、切断されたＰＯｓの数によって変化される。したがって、ターゲット核酸配列は、リアルタイム方式で検出されうる。
（ｃ）本発明は、一種の標識を利用するとしても、多数のターゲット核酸配列を同時的に検出することができる。ＰＯの切断は、固相基質上に固定化されたＣＯとのハイブリダイゼーションによって検出されるために、各ターゲット核酸配列に対するＰＯは、多数のターゲット核酸配列の検出時に異なる標識を有するように要求されない。
（ｄ）一般的に、ターゲット核酸配列と固相基質上に固定化されたプローブとの間の直接的なハイブリダイゼーションを利用するターゲット検出方法は、固相反応であるという制限された反応環境のために、効果的かつ正確なハイブリダイゼーション結果が得られないということは、当業者に知られている。これとは違って、本発明は、固相でターゲット核酸配列の関与なしにＰＯとＣＯとの間のハイブリダイゼーションを用いて、典型的な固相反応環境及び条件でより効果的かつ正確な結果を提供する。
（ｅ）本発明が、タギングＰＯ及びＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を有するＣＯを利用する場合、ターゲット核酸配列を考慮することもなく、ＰＯのタギング部位の配列及びＣＯの配列を選択することができる。これは、本発明で有用な配列のプール（ｐｏｏｌ）の事前デザイン（ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎ）を可能にする。特に、ＣＯは、ターゲット核酸配列に対する考慮または情報なしに既存の方式（ｒｅａｄｙ−ｍａｄｅｆａｓｈｉｏｎ）で製作することができる。このような特徴は、固相基質上に固定化されたＣＯを利用するマイクロアレイ上で顕著な利点を提供する。
ＰＯＣＨアッセイに利用されたＰＯ及びＣＯの図式的な構造を示す。ＰＯは、非タギング（ｎｏｎ−ｔａｇｇｅｄ）ＰＯ及びタギングＰＯ（３’−タギングＰＯ、及び５’−タギングＰＯ）を含む。望ましくは、ＰＯの３’−末端は、ブロッキングされて延長が防止される（図１Ａ）。 ＰＯＣＨアッセイに利用されたＰＯ及びＣＯの図式的な構造を示す。ＣＯは、ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。ＣＯは、その３’−末端または５’−末端を通じて固相基質上に固定化される。望ましくは、５’−末端を通じて固定化されたＣＯの３’−末端は、ブロッキングされて延長が防止される（図１Ｂ）。 ターゲッティング部位の５’−末端に単一蛍光標識を有する非タギングＰＯを利用するＰＯＣＨアッセイを図式的に示す。 ターゲッティング部位の３’−末端に単一蛍光標識を有する非タギングＰＯを利用するＰＯＣＨアッセイを図式的に示す。 ターゲッティング部位の５’−末端に単一蛍光標識を有する３’−タギングＰＯを利用するＰＯＣＨアッセイを図式的に示す。 ターゲッティング部位の３’−末端に単一蛍光標識を有する５’−タギングＰＯを利用するＰＯＣＨアッセイを図式的に示す。 ターゲッティング部位の３’−末端に単一蛍光標識を有する５’−タギングＰＯ及びＣＯ（ＣＯにハイブリダイズされるタギング部位の延長のための鋳型の役割をするテンプレーティング部位をさらに含む）を利用するＰＯＣＨアッセイを図式的に示す。 相互作用的二重標識の供与体分子及び受容体分子を有する非タギングＰＯを用いて受容体分子からのシグナルを測定するＰＯＣＨアッセイを図式的に示す。供与体分子及び受容体分子は、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される場合に、前記供与体分子からのシグナルが、前記受容体分子によってクエンチングされる位置に位置する。 相互作用的二重標識の供与体分子及び受容体分子を有する３’−タギングＰＯを用いて受容体分子からのシグナルを測定するＰＯＣＨアッセイを図式的に示す。供与体分子及び受容体分子は、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される場合に、前記供与体分子からのシグナルが、前記受容体分子によってクエンチングされる位置に位置する。 相互作用的二重標識の供与体分子及び受容体分子を有する５’−タギングＰＯを用いて受容体分子からのシグナルを測定するＰＯＣＨアッセイを図式的に示す。供与体分子及び受容体分子は、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される場合に、前記供与体分子からのシグナルが、前記受容体分子によってクエンチングされる位置に位置する。 相互作用的二重標識の供与体分子及び受容体分子を有する非タギングＰＯを用いて供与体分子からのシグナルを測定するＰＯＣＨアッセイを図式的に示す。供与体分子及び受容体分子は、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される場合に、前記供与体分子からのシグナルが、前記受容体分子によってクエンチングされない位置に位置する。 相互作用的二重標識の供与体分子及び受容体分子を有する３’−タギングＰＯを用いて供与体分子からのシグナルを測定するＰＯＣＨアッセイを図式的に示す。供与体分子及び受容体分子は、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される場合に、前記供与体分子からのシグナルが、前記受容体分子によってクエンチングされる位置に位置する。 相互作用的二重標識の供与体分子及び受容体分子を有する５’−タギングＰＯを用いて供与体分子からのシグナルを測定するＰＯＣＨアッセイを図式的に示す。供与体分子及び受容体分子は、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される場合に、前記供与体分子からのシグナルが、前記受容体分子によってクエンチングされる位置に位置する。 インターカレーティング剤を利用するＰＯＣＨアッセイを図式的に示す。 単一標識を有する非タギングＰＯを利用するＰＯＣＨアッセイによるターゲット検出結果を示す。 単一標識を有する３’−タギングＰＯを利用するＰＯＣＨアッセイによるターゲット検出結果を示す。 単一標識を有する５’−タギングＰＯを利用するＰＯＣＨアッセイによるターゲット検出結果を示す。 二重標識を有する３’−タギングＰＯを利用するＰＯＣＨアッセイによるターゲット検出結果を示す。 ＰＣＲ増幅を伴ったＰＯＣＨアッセイによるターゲット検出結果を示す。ＰＯは、単一標識を有する非タギングＰＯである。 ＰＣＲ増幅を伴ったＰＯＣＨアッセイによるターゲット検出結果を示す。ＰＯは、単一標識を有する３’−タギングＰＯである。 単一標識を有する３’−タギングＰＯを利用するＰＯＣＨアッセイによるターゲット核酸配列のリアルタイム検出結果を示す。図２０Ａは、ＰＯＣＨアッセイの間のサイクル数による蛍光イメージを示す。 単一標識を有する３’−タギングＰＯを利用するＰＯＣＨアッセイによるターゲット核酸配列のリアルタイム検出結果を示す。図２０Ｂは、ＰＯＣＨアッセイの間のサイクル数による蛍光強度の変化を示す。 ５’−タギングＰＯを利用するＰＯＣＨアッセイによる単一ヌクレオチド変異の検出を図式的に示す。 非塩基ペアリングモイエティで人為的なミスマッチヌクレオチドを有する５’−タギングＰＯを利用するＰＯＣＨアッセイによる単一ヌクレオチド変異の検出を図式的に示す。
本発明をより詳細に説明すれば、次の通りである：
Ｉ．単一標識を利用するＰＯＣＨによるターゲット検出過程
本発明の一様態によれば、本発明は、次の段階を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＯとハイブリダイズさせる段階であって、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記ＰＯは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、前記ＰＯは、単一標識を有し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＯのアップストリームに位置し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＯの切断を誘導し、
（ｂ）前記ＰＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、前記ＰＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて単一標識含有断片が生成され、
（ｃ）前記固相基質上に固定化されたＣＯに前記段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記単一標識含有断片は、前記ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、そして、
（ｄ）前記固相基質上の前記単一標識からのシグナルを測定して、前記ＰＯの切断の発生（ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）を検出する段階であって、前記ＰＯの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
ターゲットプローブの切断された断片と固相基質上に固定化されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによってターゲット配列の存在が決定されることが提示されたことがある（米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号、及び第２００８−０１９３９４０号参照）。従来の方法は、切断されたプローブのみが固相基質上に固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることによって、ターゲット配列の存否を検出する。非切断されたプローブは、固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされない。このような実施のために、従来の方法では、タギング部位があるターゲットプローブがヘアピン構造を有するようにデザインするか、または固定化されたオリゴヌクレオチドの固定方向、及び固相基質の表面からの距離を調節して、非切断されたターゲットプローブが、固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされることを抑制することが必要である。
ヘアピン構造を有するターゲットプローブを必要とする従来の方法は、ヘアピン構造を有するターゲットプローブとターゲット配列との間のハイブリダイゼーション条件、及びターゲットプローブと固定化されるオリゴヌクレオチドとの間の非ハイブリダイゼーション条件のいずれをも考慮して、ターゲットプローブ及び反応条件を決定しなければならない深刻な短所を有する。したがって、前記従来の方法は、ターゲットプローブ及び固定化されるオリゴヌクレオチドの製作及び反応条件の決定する側面で非常に不便であり、非実用的である。
前記従来の方法と対照的に、本発明は、非切断されたＰＯと固定化されたＣＯとの間のハイブリダイゼーションを利用し、これは、従来の方法と関連した短所から自在にする。
本発明によれば、ターゲット配列の存否を示す最終シグナルは、ＰＯの切断断片が固相基質上に固定化されたＣＯにハイブリダイズされるか、それとも非切断ＰＯが固定化されたＣＯにハイブリダイズされるか否かによって異なるように測定される。
したがって、本発明は、“ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション（ＰＯＣＨ）”アッセイと名付けられる。
本発明をより詳細に説明すれば、次の通りである：
段階（ａ）：ターゲット核酸配列とアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＯとのハイブリダイゼーション
本発明によれば、まず、ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＯとハイブリダイズさせる。
本明細書で使われる用語“ターゲット核酸”、“ターゲット核酸配列”、または“ターゲット配列”は、検出しようとする核酸配列を意味し、ハイブリダイゼーション、アニーリング、または増幅条件下でプローブまたはプライマーとアニーリングまたはハイブリダイズされる。
本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブである。
本発明で利用されるＰＯは、望ましくは、プローブである。
本明細書で使われる用語“プローブ（ｐｒｏｂｅ）”は、ターゲット核酸配列に実質的に相補的な部位または部位を含む一本鎖核酸分子を意味する。
本明細書で使われる用語“プライマー”は、オリゴヌクレオチドを意味するものであって、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件、すなわち、ヌクレオチドとＤＮＡ重合酵素のような重合剤の存在、そして、適した温度とｐＨの条件とで合成の開始点として作用する。望ましくは、プライマーは、一本鎖デオキシリボヌクレオチド分子である。
本発明で利用されるプローブまたはプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（すなわち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ、及びｄＴＭＰ）、変形ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含みうる。また、プローブまたはプライマーは、リボヌクレオチドを含みうる。
プライマーは、重合剤の存在下で延長産物の合成をプライミングさせることができる程度に十分に長くなければならない。プライマーの適した長さは、例えば、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）を含んだ複数の要素によって決定される。本明細書で使われる用語“アニーリング”または“プライミング”は、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチドまたは核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、前記並置は、重合酵素がヌクレオチドを重合させて、鋳型核酸またはその一部に相補的な核酸分子を形成させる。
本明細書で使われる用語“ハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）”は、相補的な一本鎖核酸が二本鎖核酸を形成することを意味する。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸鎖間の相補性が完全である場合（ｐｅｒｆｅｃｔｍａｔｃｈ）に起こるか、または一部のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても起こりうる。ハイブリダイゼーションに必要な相補性の程度は、ハイブリダイゼーション条件によって変わり、特に、温度によって調節される。
アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＯとターゲット核酸配列のハイブリダイゼーションは、最適化手続きによって一般的に決定される、適したハイブリダイゼーション条件下で実施される。温度、成分の濃度、ハイブリダイゼーション及び洗浄回数、バッファ成分、及びこれらのｐＨ及びイオン強度のような条件は、オリゴヌクレオチド（アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＯ）の長さ、ＧＣ量及びターゲットヌクレオチド配列を含んだ多様な因子によって変わりうる。例えば、相対的に短いオリゴヌクレオチドを利用する場合、低い厳格条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を選択することが望ましい。ハイブリダイゼーションのための詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＭ．Ｌ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９９）で確認することができる。
用語“アニーリング”と“ハイブリダイゼーション”は、差がなく、本明細書で混用される。
アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＯは、ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する。本明細書で使われる用語“相補的”は、所定のアニーリング条件または厳格条件下でプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイズする程度に十分に相補的であることを意味し、“実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”及び“完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”であることをいずれも包括する意味を有し、望ましくは、完全に相補的であることを意味する。
本明細書で使われるＰＯは、プローブの役割をするターゲッティング部位を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯは、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位がない非タギングＰＯ、及びターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位があるタギングＰＯを含む（図１Ａ）。
本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯは、その３’−部位にターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む３’−タギングＰＯであるか、またはその５’−部位にターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む５’−タギングＰＯである（図１Ａ）。
望ましくは、ＰＯのタギング部位は、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位を有する。本明細書で使われる用語“非相補的”は、所定のアニーリング条件または厳格条件下でプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイズされない程度に十分に非相補的であることを意味し、“実質的に非相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”及び“完全に非相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”であることをいずれも包括する意味を有し、望ましくは、完全に非相補的であることを意味する。
望ましくは、タギングされたＰＯは、タギング部位を通じてＣＯとの選択的なハイブリダイズに利用される。
ＰＯは、如何なる特定長さも要求しない。非タギングＰＯは、非タギングＰＯがターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされる限り、如何なる長さも有しうる。例えば、ＰＯの長さは、１０−６０ヌクレオチド、１０−５０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−５０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、２０−６０ヌクレオチド、２０−５０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチド、または２０−３０ヌクレオチドの長さを有しうる。タギングＰＯは、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−６０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチド、３０−８０ヌクレオチド、３０−６０ヌクレオチド、または３０−４０ヌクレオチドの長さを有しうる。ＰＯのターゲッティング部位は、ＰＯのターゲッティング部位がターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされる限り、如何なる長さも有しうる。例えば、ＰＯのターゲッティング部位は、１０−５０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１５−５０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、２０−５０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチド、または２０−３０ヌクレオチドの長さを有しうる。タギングＰＯのタギング部位は、タギングＰＯのタギング部位がＣＯに特異的にハイブリダイズされる限り、如何なる長さも有しうる。例えば、ＰＯのタギング部位は、５−５０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、５−２０ヌクレオチド、１０−５０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１０−２０ヌクレオチド、１５−５０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、または１５−２０ヌクレオチドの長さを有しうる。
ＰＯの３’−末端は、３’−ＯＨターミナル（ｔｅｒｍｉｎａｌ）を有しうる。望ましくは、ＰＯの３’−末端は、“ブロッキング”されて、その延長が防止される。
ブロッキングは、従来の方法によって達成されうる。例えば、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基に、ビオチン、標識、ホスフェート基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート、またはアルカンジオール残基のような化学的モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）を追加して実施することができる。択一的に、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか、またはジデオキシヌクレオチドのように、３’−ヒドロキシル基がないヌクレオチドを用いて実施することができる。
択一的に、ＰＯが、ヘアピン構造のように二次的な構造を有するようにデザインすることができる。本発明で、非切断ＰＯは、固相基質上に固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされるので、ヘアピン構造は、非切断ＰＯが固定化されたＣＯとハイブリダイズされることを妨害しないようにデザインされなければならない。望ましくは、ＰＯのヘアピン構造は、非切断ＰＯと固定化されたＣＯとの間の二量体のＴｍ値よりも低いＴｍ値を有する。
一方、タギング部位を有するターゲットプローブの切断反応及び固相基質上に固定化されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを用いてターゲット配列を検出する従来の方法によれば、非切断ターゲットプローブが固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされることを抑制するために、ターゲットプローブがヘアピン構造を有させることが要求される。
タギングＰＯを利用する場合、そのターゲッティング部位は、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、そのタギング部位は、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされない厳格条件下でターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションを実施する。表現“ＰＯのタギング部位は、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされない”は、特定厳格条件下でターゲット核酸配列と安定した二量体を形成しないことを意味する。望ましくは、タギングＰＯのタギング部位は、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、一本鎖を形成することである。
アップストリームオリゴヌクレオチドが、ターゲット核酸配列とハイブリダイズする場合、アップストリームオリゴヌクレオチドは、ＰＯのアップストリームに位置する。ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたアップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＯの切断を誘導する。
アップストリームオリゴヌクレオチドによるＰＯ切断の誘導は、２つの方式で達成されうる：（ｉ）アップストリームオリゴヌクレオチド延長（すなわち、重合）−独立的切断誘導；及び（ｉｉ）アップストリームオリゴヌクレオチド延長−依存的切断誘導。
アップストリームオリゴヌクレオチドが、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＯの切断を誘導するのに十分な程度にＰＯに近接して位置する場合、アップストリームオリゴヌクレオチドに結合した酵素は、延長反応なしにＰＯを切断する。一方、アップストリームオリゴヌクレオチドが、ＰＯから離隔している場合、重合酵素活性を有する酵素（例えば、鋳型−依存的重合酵素）は、アップストリームオリゴヌクレオチド（例えば、アップストリームプライマー）の延長を促進させ、延長産物に結合された５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、ＰＯを切断する。
したがって、アップストリームオリゴヌクレオチドは、２つの方式でＰＯに対して相対的に位置しうる。アップストリームオリゴヌクレオチドは、延長（すなわち、重合）−独立した方式でＰＯの切断を誘導するのに十分な程度にＰＯに近接した位置に位置しうる。択一的に、アップストリームオリゴヌクレオチドは、延長−依存的な方式でＰＯの切断を誘導するのに十分な程度にＰＯから離隔した位置に位置しうる。
本明細書で、地点（ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）または位置（ｌｏｃａｔｉｏｎｓ）を言及しながら使われる用語“近接（ａｄｊａｃｅｎｔ）”は、アップストリームオリゴヌクレオチドがＰＯのターゲッティング部位のすぐ近くに位置して、ニック（ｎｉｃｋ）を形成することを意味する。また、前記用語は、アップストリームオリゴヌクレオチドがＰＯのターゲッティング部位から１−３０ヌクレオチド、１−２０ヌクレオチド、または１−１５ヌクレオチド離隔して位置することを意味する。
本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームオリゴヌクレオチドは、延長−依存的な方式でＰＯの切断を誘導するのに十分な程度にＰＯから離隔して位置する。
本明細書で、地点または位置を言及しながら使われる用語“離隔（ｄｉｓｔａｎｔ）”は、用語“近接”による如何なる制限もなく、これは、延長反応が起こるのに十分な程度の如何なる地点または位置を含む。例えば、用語“離隔”は、ニックを形成する位置を含みうる。
本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブである。アップストリームプライマーは、延長−独立的切断誘導または延長−依存的切断に適し、アップストリームプローブは、延長−独立的切断誘導に適している。
択一的に、アップストリームオリゴヌクレオチドは、ＰＯのターゲッティング部位の一部と部分的に重なる配列（ｐａｒｔｉａｌ−ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有する。望ましくは、重なる配列は、１−１０ヌクレオチド長さであり、より望ましくは、１−５ヌクレオチド長さ、さらに望ましくは、１−３ヌクレオチド長さである。一部と部分的に重なる配列を有する５’−タギングＰＯを利用する場合、段階（ｂ）の切断反応で３’−ターゲッティング部位は、タギング部位の切断と共に部分的に切断される。また、重なる配列は、ターゲッティング部位の所望の特定位置を切断させる。
本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームプライマーは、その延長鎖を通じて５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＯの切断を誘導する。
アップストリームオリゴヌクレオチドがターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＯの切断を誘導する限り、アップストリームオリゴヌクレオチドによる切断反応のための従来技術は、本発明に適用可能である。例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号、第７，３８１，５３２号、及び米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号は、本発明に応用することができる。
本発明の望ましい具現例によれば、本方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施する。ダウンストリームプライマーは、ＰＯにハイブリダイズするターゲット核酸配列を追加的に生成させ、ターゲット検出の敏感度を向上させる。
ダウンストリームプライマーを追加的に利用する場合、ダウンストリームプライマーのダウンストリームに位置した第２次ＰＯを追加的に利用する。
本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーを利用する場合、プライマーの延長のために、鋳型−依存的核酸重合酵素を使う。鋳型−依存的核酸重合酵素は、ＰＯの切断のための５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素として作用する。
本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームオリゴヌクレオチド（アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブ）及び／またはダウンストリームプライマーは、本発明者によって開発された二重プライミングオリゴヌクレオチド（ｄｕａｌｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＤＰＯ）構造を有する。ＤＰＯ構造を有するオリゴヌクレオチドは、従来のプライマー及びプローブに比べて、非常に改善されたターゲット特異度を示す（参照：ＷＯ ２００６／０９５９８１；Ｃｈｕｎら、Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＣＹＰ２Ｃ１９ ｇｅｎｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：６ｅ４０（２００７））。
本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯのターゲッティング部位は、本発明者によって開発された変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する。変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ｍＤＳＯ）構造は、従来のプローブに比べて、非常に改善されたターゲット特異性を示す（参照：ＷＯ ２０１１／０２８０４１）。
用語“従来のオリゴヌクレオチド”は、ＤＳＯまたはｍＤＳＯ構造を有さないオリゴヌクレオチド（プライマーまたはプローブ）を意味する。
本発明で利用されるＰＯは、単一標識を有する。単一標識は、ターゲット核酸配列の存否を示すシグナルを提供する。標識は、段階（ｄ）でより詳しく説明される。
段階（ｂ）：ＰＯの切断
引き続き、ＰＯの切断のための条件下で段階（ａ）の結果物を、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させる。
ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって切断されて、単一標識含有断片を放出する（図２−６参照）。ターゲット核酸配列がない場合、ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって切断されない。
本明細書で使われる用語“ＰＯの切断のための条件”は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によってターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＯが切断されるのに十分な条件、例えば、温度、ｐＨ、イオン強度、及びバッファ、オリゴヌクレオチドの長さ及び配列、そして、酵素を意味する。例えば、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素としてＴａｑ ＤＮＡ重合酵素が利用される場合、ＰＯの切断のための条件は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、及び温度を含む。
ＰＯの切断反応のために、多数の従来技術を利用できる。ＰＯの切断位置は、アップストリームオリゴヌクレオチド（アップストリームプローブまたはアップストリームプライマー）の種類、アップストリームオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション位置及び切断条件によって多様になる（参照：米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号、及び第７，３８１，５３２号、または米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号）。
単一標識含有断片の長さ及び配列は、適用された切断技術によって多様になりうる。特に、タギングＰＯを利用する場合、タギング部位の一部または全体配列を含む断片が生成されうる。タギングＰＯ上の単一標識の位置を調節することによって、単一標識がタギング部位の一部または全体配列を含む断片上に残留されないようにできる。
一般的に、アップストリームプライマーの延長によるＰＯの切断が始まる位置は、ＰＯとターゲット核酸配列との間の二本鎖が始まる地点、またはその開始地点から１−３ヌクレオチド離隔した位置である。切断されたＰＯは、長さが短くなりながら、ターゲット核酸配列から解離される。３’−タギングＰＯまたは５’−タギングＰＯを利用する場合、タギング部位及びターゲッティング部位の一部を含む断片が生成されうる。アップストリームオリゴヌクレオチドの延長に独立した切断反応を利用する場合、ＰＯの切断位置は、アップストリームオリゴヌクレオチドの位置によって決定される。３’−タギングＰＯまたは５’−タギングＰＯを利用する場合、生成されるＰＯの断片は、（ｉ）タギング部位の一部、（ｉｉ）タギング部位、または（ｉｉｉ）タギング部位及びターゲッティング部位の一部を含みうる。
本明細書で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるタギングＰＯの切断を言及しながら使われる用語“タギング部位またはタギング部位の一部を含む断片”は、（ｉ）タギング部位、（ｉｉ）タギング部位及びターゲッティング部位の近接した一部の配列、及び（ｉｉｉ）タギング部位の一部を含む意味として使われる。
本明細書で、ＰＯの５’−タギング部位の一部、及びＰＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部のように、ＰＯを言及しながら使われる用語“一部（ｐａｒｔ）”は、１−４０、１−３０、１−２０、１−１５、１−１０、または１−５ヌクレオチドで構成されたヌクレオチド配列を意味し、望ましくは、１、２、３、または４ヌクレオチドである。
本明細書の望ましい具現例によれば、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼであり、より望ましくは、５’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼである。
本発明に適した５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素は、多様なバクテリア種から得た熱安定性ＤＮＡ重合酵素であり、これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ、Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ、及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓを含む。最も望ましくは、熱安定性ＤＮＡ重合酵素は、Ｔａｑ重合酵素である。
択一的に、本発明は、重合酵素活性をより少なく有するように変形された、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素を使うことができる。
使われるＦＥＮ（ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）ヌクレアーゼは、５’フラップ−特異的ヌクレアーゼ（５’ｆｌａｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅ）である。
本発明に適したＦＥＮヌクレアーゼは、多様なバクテリア種から得たＦＥＮヌクレアーゼを含み、これは、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ｂｒｉｅｒｌｙｉ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｇｎｅｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、及びＡｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓを含む。
段階（ａ）でアップストリームプライマーを利用する場合、ＰＯの切断のための条件は、アップストリームプライマーの延長反応を含むことが望ましい。
本発明の望ましい具現例によれば、段階（ａ）でアップストリームプライマーを利用し、前記アップストリームプライマーの延長のために、鋳型−依存的重合酵素を利用し、前記鋳型−依存的重合酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素と同一な酵素である。
選択的に、段階（ａ）でアップストリームプライマーを利用し、前記アップストリームプライマーの延長のために、鋳型−依存的重合酵素を利用し、前記鋳型−依存的重合酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素と異なる酵素である。
段階（ｃ）：固相でのＣＯとのハイブリダイゼーション
固相基質上に固定化されたＣＯに前記段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する。
本発明で、固相基質上に固定化されたＣＯを用いてＰＯの切断を検出する。段階（ｂ）でＰＯが切断されない場合、単一標識含有非切断ＰＯが固相基質上に固定化されたＣＯにハイブリダイズされて、単一標識によって固相基質上のシグナルが提供される。段階（ｂ）でＰＯが切断される場合、単一標識含有切断断片は、ＣＯにハイブリダイズされなくて、単一標識による固相基質上のシグナルが提供されない。
ＰＯの切断の発生は、ターゲット核酸配列の存在に依存するために、固相基質上の単一標識からのシグナルの消滅または減少を測定することによって、ターゲット核酸配列を検出することができる。
ＣＯは、ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。本明細書で、ＣＯを言及しながら使われる用語“ハイブリダイズ可能な配列（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）”は、段階（ｃ）で非切断ＰＯと安定した二量体を形成する配列を意味する。例えば、ＰＯにハイブリダイズ可能なＣＯのハイブリダイズ可能な配列は、ＰＯのターゲッティング部位の全体または一部；ＰＯのタギング部位の全体または一部；ＰＯのターゲッティング部位の全体及びタギング部位の一部；ＰＯのターゲッティング部位の一部及びタギング部位の全体；またはＰＯのターゲッティング部位の一部及びタギング部位の一部に相補的な配列を含みうる。
用語“ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列”と“相補的なヌクレオチド配列”は、差がなく、本明細書で混用される。
単一標識含有断片は、ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で段階（ｃ）でのハイブリダイゼーション反応を実施する。
本発明の一具現例で、ＣＯは、ＰＯのターゲッティング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。ＰＯのターゲッティング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列は、ＰＯのターゲッティング部位の全体または一部に相補的なヌクレオチド配列を含み、段階（ｃ）のハイブリダイゼーション反応で非切断ＰＯとＣＯとの間の二量体を安定して形成するのに十分な相補性及び長さを有する。
図２及び図３に示したように、ＣＯは、ＰＯのターゲッティング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。ターゲット核酸配列が存在する場合、切断反応によって生成された単一標識含有断片は、非切断されたＰＯよりも短い長さを有するようになって、特定厳格条件（特に、温度）下でＣＯにハイブリダイズできなくなる。最終的に、単一標識は、固相基質上に残留されない。
択一的に、単一標識含有断片が、ＣＯとハイブリダイズされることを抑制するために、ＣＯが単一標識含有断片にハイブリダイズ可能な配列を有さないようにデザインすることができる。
したがって、ターゲット核酸配列が存在する場合、非切断ＰＯとＣＯとの間の二量体が形成されず、単一標識からシグナルが提供されない。
ターゲット核酸配列がない場合、非切断ＰＯは、ＣＯと二量体を形成して、単一標識は、固相基質上に残留する。
５’ヌクレアーゼ活性がない重合酵素を用いて、図２及び図３に示された過程を実施する場合、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる非タギングＰＯは、切断されない。非タギングＰＯは、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされるために、精巧に調節された条件下でＣＯとのハイブリダイゼーションが防止されて、単一標識からシグナルが提供されないこともある。しかし、本発明のように、５’ヌクレアーゼ活性を有する重合酵素を利用する場合には、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＯが切断されて、容易に定立された条件下で切断の発生が測定されて、ターゲット核酸配列の存在が正確に検出される。
図４及び図５に示したように、ＣＯは、ＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。タギングＰＯ上の単一標識は、タギングＰＯの切断によって放出され、ＣＯにハイブリダイズされるタギング部位含有断片上に残留されないように位置する。タギング部位含有断片がＣＯにハイブリダイズされるとしても、タギング部位含有断片に単一標識が残留されないために、単一標識からシグナルが提供されない。シグナルは、非切断されたタギングＰＯとＣＯとのハイブリダイゼーションによって提供される。
ターゲット核酸配列が存在する場合、ＰＯの切断によって非切断ＰＯとＣＯとの間の二量体が形成されず、これは、ターゲット核酸配列の存在を示す固相基質上の単一標識からのシグナルの消滅（または、減少）を招く。
タギングＰＯを利用する本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なＣＯのヌクレオチド配列は、ＰＯのタギング部位の全体または一部に相補的な配列を含み、段階（ｃ）のハイブリダイゼーション反応で非切断タギングＰＯとＣＯとの間の二量体を安定して形成するのに十分な相補性及び長さを有する。
択一的に、タギングＰＯを利用する場合、ＣＯは、タギングＰＯのタギング部位の一部（または、全体）及びターゲッティング部位の一部（または、全体）にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含みうる。タギングＰＯ上の単一標識の位置は、切断方法、切断位置、及びＣＯの配列を考慮して決定され、タギングＰＯの切断は、単一標識含有断片がＣＯにハイブリダイズされない条件下で実施される。望ましくは、単一標識は、タギングＰＯの切断によって放出され、ＣＯにハイブリダイズされない断片上に残留されるように位置する。
５’−タギングＰＯを利用する本発明の望ましい具現例によれば、ＣＯは、ＣＯにハイブリダイズされるタギング部位の延長のための鋳型の役割をするテンプレーティング部位をさらに含む（図６参照）。延長産物は、より安定してＣＯとハイブリダイゼーションすることが可能となる。延長のために、追加的にＤＮＡ重合酵素を必要とする。
ＣＯは、その５’−末端または３’−末端を通じて固相基質上に固定化される。
本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯは、３’−タギングＰＯであり、ＣＯは、その５’−末端を通じて固相基質上に固定化される（図４）。望ましくは、ＰＯは、５’−タギングＰＯであり、ＣＯは、その３’−末端を通じて固相基質上に固定化される（図５）。
本発明の望ましい具現例によれば、ＣＯが固定化された固相基質は、マイクロアレイである。ＣＯは、その５’−末端または３’−末端を通じて固相基質の表面に直接的または間接的に（望ましくは、間接的）固定化される。また、ＣＯは、共有または非共有結合方式で固相基質表面上に固定化されうる。固定化されたＣＯが、固相基質表面に間接的に固定化される場合、適したリンカーを利用する。本発明で、有用なリンカーは、固相基質表面上のプローブ固定化に利用される如何なるリンカーも含みうる。例えば、アミン基を有するアルキルまたはアリール化合物、またはチオール基を有するアルキルまたはアリール化合物がリンカーとしてＣＯ固定化に利用されうる。また、ポリ（Ｔ）テイルまたはポリ（Ａ）テイルがリンカーとして使われる。ポリ（Ｔ）テイルまたはポリ（Ａ）テイルは、酵素作用（例えば、酵素的切断反応）において、空間的妨害（ｓｐａｃｅ ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）を減少させ、ハイブリダイゼーション効率を増加させることができる。ポリ（Ｔ）テイルまたはポリ（Ａ）テイルは、プローブの配列に含まれない。
本発明の反応環境を提供するマイクロアレイは、当業界に公知の如何なるものも含みうる。本発明のあらゆる過程、すなわち、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション、切断及び検出は、マイクロアレイ上で実施される。マイクロアレイ上に固定化されたＣＯは、ハイブリダイズ可能なアレイ要素（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ ａｒｒａｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）として利用される。マイクロアレイを製作するための固相基質は、金属（例えば、金、金と銅との合金、アルミニウム）、金属オキシド、ガラス、セラミック、石英、シリコン、半導体、Ｓｉ／ＳｉＯ２ウェーハ、ゲルマニウム、ガリウムアルセニド、カーボン、炭素ナノチューブ、ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、及びポリアクリルアミド）、セファロース、アガロース及びコロイドを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の多数の固定化されたＣＯは、固相基質上の１つのアドレサブル（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）部位または複数のアドレサブル部位に固定化され、固相基質は、２−１，０００，０００個のアドレサブル部位を含みうる。フォトリソグラフィー、インクジェッティング、機械的マイクロスポッティング、及びその類似方法のような従来の製作技術により、アレイまたは特定応用のためのアレイを生産するために、固定化されたＣＯが組み立て（ｆａｂｒｉｃａｔｅ）られうる。
固相で実施する本発明は、固定化されたＣＯ上の標識が物理的に離隔しているために、一種の標識を利用するとしても、多数のターゲット核酸配列を同時的に検出することができる。したがって、固相で、本発明によって検出可能なターゲット核酸配列の数は、制限されない。
固相で、共焦点検出（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）装備などを使うならば、反応液に存在する標識によるシグナルに影響を受けず、固相基質上でのみ表われるシグナルを測定することができる。
ＣＯの長さは、多様になりうる。ＣＯが、非切断ＰＯと二量体を形成することができる限り、ＣＯは、如何なる長さも有しうる。例えば、ＣＯは、５−８０ヌクレオチド、５−６０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、１０−８０ヌクレオチド、１０−６０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１０−２０ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、または１５−２０ヌクレオチドの長さである。
５’−タギングＰＯを利用する本発明の望ましい具現例によれば、ＣＯにハイブリダイズされるタギング部位の延長のために、ＣＯがテンプレーティング部位をさらに含む場合、ＣＯは、テンプレーティング部位に追加的な５−１００ヌクレオチドの長さをさらに含む。
本発明の望ましい具現例によれば、ＣＯは、その３’−末端がブロッキングされて延長が防止される。ＣＯの非延長ブロッキングは、従来の方法によって達成されうる。例えば、ブロッキングは、ＣＯの最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基に、ビオチン、標識、ホスフェート基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート、またはアルカンジオール残基のような化学的モイエティを追加して実施することができる。択一的に、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか、またはジデオキシヌクレオチド（ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のように、３’−ヒドロキシル基がないヌクレオチドを用いて実施することができる。
段階（ｃ）でのハイブリダイゼーションは、段階（ａ）でのハイブリダイゼーションについての説明を参照して詳細に説明される。
単一標識含有断片は、ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、ＣＯにハイブリダイズされて、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で段階（ｃ）でのハイブリダイゼーションを実施する。ハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知の従来の方法によって通常決定されうる。例えば、温度、成分の濃度、ハイブリダイゼーション時間、バッファ成分、及びこれらのｐＨ及びイオン強度によってハイブリダイゼーション条件を調整することができる。
本発明の望ましい具現例によれば、段階（ｃ）でのハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションのための温度によって調整される。択一的に、段階（ｃ）でのハイブリダイゼーション条件、特に、単一標識含有断片がＣＯにハイブリダイズされないようにする条件は、単一標識含有断片に安定してハイブリダイズされる可能性が高い配列をＣＯから排除することで提供されうる。
ＰＯ及びＣＯは、天然ｄＮＭＰｓで構成することができる。択一的に、ＰＯ及びＣＯは、変形ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチド、例えば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、参照：ＰＣＴ出願第ＷＯ ９２／２０７０２号）及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、参照：ＰＣＴ出願第ＷＯ ９８／２２４８９号、第ＷＯ ９８／３９３５２号、及び第ＷＯ ９９／１４２２６号）を含みうる。ＰＯ及びＣＯは、デオキシイノシン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、及び５−ニトロインドールのようなユニバーサル塩基を含みうる。用語“ユニバーサル塩基”は、天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれに対してほぼ区別なしに塩基対を形成できることを意味する。
段階（ｄ）：ターゲット配列の存在を示すＰＯ切断の検出
ハイブリダイゼーション反応に引き続き、ＰＯの切断の発生は、固相基質上の単一標識からのシグナルを測定して検出され、これにより、ＰＯの切断の発生は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
前述したように、ＣＯとＰＯとのハイブリダイゼーションパターンは、ＰＯの切断によって鮮明に異なる。ハイブリダイゼーションパターンのこのような差は、固相基質上のシグナルの差を招く。したがって、固相基質上の単一標識からのシグナルを検出することによって、ターゲット核酸配列の存否を決定することができる。
固相基質上のＰＯに結合された単一標識からのシグナルを測定することによって、段階（ｄ）を実施する。
ＰＯ上の単一標識は、レポーター分子として説明することができる。
利用される単一標識は、特に制限されず、化学的標識（例えば、ビオチン）、酵素的標識（例えば、アルカリホスファターゼ、ペロキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びβ−グルコシダーゼ）、蛍光標識、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）標識、化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）標識、または電気化学的（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ）標識を含む。望ましくは、単一標識は、蛍光標識を含む。
単一標識は、ＰＯの切断によって放出され、ＣＯにハイブリダイズされる断片上に残留されないように位置する。
非タギングＰＯを利用する場合、単一標識は、如何なる位置（ｓｉｔｅ）にも結合されうる。望ましくは、単一標識は、非タギングＰＯの５’−末端部位または３’−末端部位に結合される。より望ましくは、非タギングＰＯの５’−末端または３’−末端、または非タギングＰＯの５’−末端または３’−末端から１−２０ヌクレオチド（さらに望ましくは、１−１０ヌクレオチド）離隔した位置にあるものであり、さらに望ましくは、５’−末端または３’−末端である。
タギングＰＯを利用する本発明の望ましい具現例によれば、単一標識は、タギングＰＯの切断によって放出されるタギング部位含有断片上に残留されない位置に位置する。より望ましくは、単一標識は、タギングＰＯの切断によって放出され、ＣＯにハイブリダイズされるタギング部位含有断片上に残留されないように位置する。
単一標識の位置は、切断方法、切断位置、及びターゲット核酸配列からの切断ＰＯの放出を考慮して決定されうる。
より望ましくは、単一標識が、３’−タギングＰＯの５’−末端部位または５’−末端から１−２０ヌクレオチド離隔した位置に位置しており（さらに望ましくは、１−１０ヌクレオチド）、５’−タギングＰＯの３’−末端部位または３’−末端から１−２０ヌクレオチド離隔した位置に位置している（さらに望ましくは、１−１０ヌクレオチド）。さらに望ましくは、単一標識が、３’−タギングＰＯの５’−末端に位置しており、５’−タギングＰＯの３’−末端に位置している。
本発明の望ましい具現例によれば、タギングＰＯは、単一標識を有し、単一標識は、タギングＰＯのターゲッティング部位に位置し、単一標識は、段階（ｂ）でのＰＯの切断によって生成されたタギング部位含有断片上に残留されない位置に位置しており、そして、タギング部位含有断片及びＣＯ間の二量体は、単一標識を有さず、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体は、単一標識を有する（図４及び図５）。固相基質上に固定化されたタギング部位含有断片／ＣＯ二量体は、単一標識がないので、シグナルを提供しないが、しかし、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体は、非切断ＰＯ上に単一標識が存在するので、シグナルを提供する。
前述したように、ターゲット核酸配列の存在は、固相基質上の単一標識からのシグナルを測定して検出される。
単一標識を有するＰＯを利用する本発明の望ましい具現例によれば、最終的に測定されるシグナルをターゲット核酸配列がない陰性対照群からのシグナルと比較する。次いで、シグナルの消滅（または、減少）を確認してターゲット核酸配列を検出する。
単一標識を有するＰＯを利用する本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯｓ切断の反復と共に固相基質上の検出を連続して実施する場合、切断されたＰＯｓの数は、切断反応の反復数によって増加し、シグナルは、切断されたＰＯｓの数によって減少する。したがって、ターゲット核酸配列は、リアルタイム方式で検出されうる。一方、ターゲット核酸配列がない場合、シグナルの変化は観察されない。
本発明で、有用な単一蛍光標識は、当業界に公知の如何なる分子も含みうる。その例は、次の通りである：Ｃｙ２ＴＭ（５０６）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５０９）、ＹＯＹＯＴＭ−１（５０９）、Ｃａｌｃｅｉｎ（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸＴＭ（５１９）、ＡｌｅｘａＴＭ（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０（５２０）、Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ ＧｒｅｅｎＴＭ ４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＧｒｅｅｎＴＭ（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ ＧｒｅｅｎＴＭ（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−１（５３３）、ＴＯＴＯ１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３ＴＭ（５７０）、ＡｌｅｘａＴＭ ５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ＆Ｂ（５７５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ ＯｒａｎｇｅＴＭ（５７６）、Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ（５８０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ＲｅｄＴＭ（５９０）、Ｃｙ３．５ＴＭ（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ ＣｒｉｍｓｏｎＴＭ（６１５）、ＡｌｅｘａＴＭ ５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（６１５）、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６３１）、ＹＯＹＯＴＭ−３（６３１）、Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ−３（６６０）、ＴＯＴＯ３（６６０）、ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５ＴＭ（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）、Ｃｙ５．５（６９４）、ＨＥＸ（５５６）、ＴＥＴ（５３６）、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｂｌｕｅ（４４７）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０（５４４）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０（５５９）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０（５９１）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０（６１０）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５（６３７）、ＦＡＭ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３（５２０）、Ｐｕｌｓａｒ６５０（５６６）、Ｑｕａｓａｒ ５７０（６６７）、Ｑｕａｓａｒ ６７０（７０５）、及びＱｕａｓａｒ ７０５（６１０）。カッコの数字は、ナノメートル単位で表示した発光最大波長である。望ましくは、単一蛍光標識は、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、及びフルオレセインベースの標識（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｂａｓｅｄ ｌａｂｅｌ）を含む。
単一標識は、当業者に公知の多様な方法によってＰＯに結合されうる。望ましくは、単一標識は、少なくとも３つの炭素原子を含むスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）（例えば、３−カーボンスペーサ、６−カーボンスペーサ、及び１２−カーボンスペーサ）を介してＰＯに結合されうる。
ＩＩ．二重標識を利用するＰＯＣＨによるターゲット検出過程
本発明は、ターゲット核酸配列の検出において、相互作用的二重標識を用いて卓越した性能を示す。
本発明の他の様態によれば、本発明は、次の段階を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＯとハイブリダイズさせる段階であって、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記ＰＯは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、前記ＰＯは、供与体分子及び受容体分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＯのアップストリームに位置し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＯの切断を誘導し、
（ｂ）前記ＰＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、前記ＰＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて、前記相互作用的二重標識が離隔し、これにより、供与体含有断片及び受容体含有断片が生成され、
（ｃ）前記固相基質上に固定化されたＣＯに前記段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも１つは、前記ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体からのシグナルは、前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも１つが、前記ＣＯにハイブリダイズされない場合に提供されるシグナルと区別され、そして、
（ｄ）前記固相基質上の前記相互作用的二重標識からのシグナルを測定して、前記ＰＯの切断の発生を検出する段階であって、前記ＰＯの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明の二番目の具現例は、標識システムを除いては単一標識を利用する最初の具現例と同一であるために、これらの間の共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
供与体／受容体相互作用的二重標識は、ＰＯに結合される。
相互作用的二重標識は、供与体分子及び受容体分子の間にエネルギーが非放射能的（ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｉｖｅｌｙ）に伝達されるシグナル発生システムである。相互作用的標識システムの代表的な例として、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、蛍光レポーター分子（供与体分子）及びクエンチャー分子（受容体分子）を含む。ＦＲＥＴでエネルギー供与体は、蛍光性であるが、エネルギー受容体は、蛍光性または非蛍光性であり得る。相互作用的標識システムの他の形態で、エネルギー供与体は、非蛍光性、例えば、クロモフォア（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムのさらに他の形態で、エネルギー供与体は、発光性（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）、例えば、生物発光性、化学発光性、または電気化学発光性であり、受容体は、蛍光性である。
本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯは、相互作用的二重標識を有し、より望ましくは、ＦＲＥＴ標識であり、さらに望ましくは、供与体分子及び受容体分子を含む二重標識である（図７−図１３参照）。
本発明で、有用な供与体分子及び受容体分子は、当業者に公知の如何なる分子も含み、その例は、前述した蛍光標識の説明を参照して説明することができる。
適した供与体−受容体の組合せは、次のように多くの文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅら、ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｗｈｉｔｅら、ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７０）；Ｂｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃｏｌｏｒ ＡＮＤ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，１９９２）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９４９）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，１９９６）；米国特許第３，９９６，３４５号、及び第４，３５１，７６０号。
ＰＯに適用されたレポーター及びクエンチャーを含むシグナリングシステムで、レポーターは、ＦＲＥＴの供与体を含み、クエンチャーは、ＦＲＥＴの残りのパートナー（受容体）を含む。例えば、フルオレセイン色素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｙｅ）は、レポーターとして利用され、ローダミン色素（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｄｙｅ）は、クエンチャーとして利用される。
ＰＯに結合された供与体（レポーター）分子及び受容体（クエンチャー）分子は、蛍光性または非蛍光性であり得る。例えば、広範囲波長または特定波長の蛍光をクエンチングすることができる非蛍光ブラッククエンチャーを本発明に利用できる。受容体（クエンチャー）は、分子が蛍光性である場合、蛍光受容体（クエンチャー）分子からのシグナルを用いてターゲット核酸配列を検出することができる。
本発明をより詳細に説明すれば、次の通りである：
段階（ａ）：ターゲット核酸配列とアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＯとのハイブリダイゼーション
本発明の二番目の具現例の段階（ａ）は、最初の具現例の段階（ａ）についての説明を参照して説明される。
ＰＯは、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを提供する供与体分子及び受容体分子を含む相互作用的二重標識を有する。
段階（ｂ）：ＰＯの切断
本発明の二番目の具現例の段階（ｂ）は、最初の具現例の段階（ｂ）についての説明を参照して説明される。
段階（ａ）の結果物を、ＰＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させる。
ターゲット核酸配列にハイブリダイズされるＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって切断されて、相互作用的二重標識が離隔し、これにより、供与体含有断片及び受容体含有断片が生成される（図７−図１３参照）。
本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯ上の供与体分子及び受容体分子は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断位置によって離隔する。
ターゲット核酸配列がない場合、ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって切断されず、したがって、相互作用的二重標識は離隔しない。
段階（ｃ）：固相でのＣＯとのハイブリダイゼーション
固相基質上に固定化されたＣＯに段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する。
本発明の二番目の具現例の段階（ｃ）は、最初の具現例の段階（ｃ）についての説明を参照して説明される。供与体含有断片及び受容体含有断片のうち少なくとも１つは、ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、ＣＯにハイブリダイズされて、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下でハイブリダイゼーション反応を実施する。ハイブリダイゼーション条件は、当業者に公知の従来の方法によって通常決定されうる。例えば、温度、成分の濃度、ハイブリダイゼーション時間、バッファ成分、及びこれらのｐＨ及びイオン強度によってハイブリダイゼーション条件を調整することができる。
本発明の望ましい具現例によれば、供与体含有断片及び受容体含有断片のうち少なくとも１つは、ＣＯにハイブリダイズされないハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの温度によって調整される。択一的に、段階（ｃ）のハイブリダイゼーション条件は、標識含有断片に安定してハイブリダイズされる可能性が高い配列をＣＯから排除することで提供されうる。
ターゲット核酸配列が存在する場合、供与体含有断片及び受容体含有断片のうち少なくとも１つは、ＣＯにハイブリダイズされない。ターゲット核酸配列がない場合、相互作用的二重標識を有する非切断ＰＯは、ＣＯにハイブリダイズされる。
非切断ＰＯ／ＣＯ二量体（すなわち、ターゲット核酸配列がない場合）から提供されるシグナルは、供与体含有断片及び受容体含有断片のうち少なくとも１つが、ＣＯにハイブリダイズされない場合（すなわち、ターゲット核酸配列が存在する場合）に提供されるシグナルと鮮明に区別される。したがって、相互作用的二重標識からのシグナルは、ターゲット核酸配列の存否によって異なるように生成される。
段階（ｄ）：ターゲット配列の存在を示すＰＯ切断の検出
ハイブリダイゼーション反応に引き続き、ＰＯの切断の発生は、固相基質上の相互作用的二重標識からのシグナルを測定して検出され、これにより、ＰＯの切断の発生は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
前述したように、ＣＯとＰＯとのハイブリダイゼーションパターンは、ＰＯの切断によって鮮明に異なる。ハイブリダイゼーションパターンのこのような差は、固相基質上のシグナルの差を招く。したがって、固相基質上の相互作用的二重標識からのシグナルを検出することによって、ターゲット核酸配列の存否を決定することができる。
相互作用的二重標識を利用する場合、シグナルを２つの方式で測定する。最初の方式は、受容体分子から生成されたシグナルを測定することであり、二番目の方式は、供与体分子から生成されたシグナルを測定することである。
最初の測定方式は、図７ないし図９に示されている。
非タギングＰＯを利用する図７は、受容体分子からのシグナルを測定する具現例を示す。本発明の望ましい具現例によれば、ＣＯでのＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列は、ＰＯのターゲッティング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。このような場合、相互作用的二重標識は、望ましくは、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される場合、供与体分子からのシグナルが受容体分子によってクエンチングされる位置に位置し、受容体分子からのシグナルを検出して、段階（ｄ）を実施する。
図７に例示されたように、非タギングＰＯ上で供与体分子及び受容体分子が、供与体分子及び受容体分子の間にエネルギーが伝達される程度に互いに近接している場合（例えば、ＦＲＥＴ現象が起こる程度に近接）、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる非タギングＰＯは切断されて、供与体分子含有断片及び受容体分子含有断片を形成する。したがって、供与体分子含有断片及び受容体分子含有断片いずれもが、段階（ｃ）でＣＯにハイブリダイズされない限り、供与体分子及び受容体分子の間の相互作用は発生せず、最終的に、固相基質上でシグナルが提供されない。
本明細書で使われる表現“供与体分子及び受容体分子が近接した”は、供与体分子及び受容体分子が、プローブで供与体分子及び受容体分子の間にエネルギーが伝達される程度にヌクレオチド数ほど離隔していることを意味する。望ましくは、供与体分子及び受容体分子は、１−２０、１−１５、及び１−１０ヌクレオチドほど離隔している。
ターゲット核酸配列がない場合、非切断された非タギングＰＯは、ＣＯにハイブリダイズされ、供与体分子と受容体分子との間の相互作用が発生して、これにより、受容体分子からのシグナルが提供される。供与体分子に対する励起波長（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）を有する光（ｌｉｇｈｔ）の照射は、供与体分子からの蛍光を発生させ、以後、これは受容体分子によってクエンチングされて、最終的に、受容体からの蛍光シグナルが提供される。
ターゲット核酸配列が存在する場合、ＰＯの切断によって非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成されず、したがって、受容体からのシグナルは提供されない。固相基質上の受容体分子からのシグナルの消滅（または、減少）測定は、ターゲット核酸配列の存在を決定可能にする。
タギングＰＯを利用する図８及び図９は、受容体分子からのシグナルを測定する具現例を示す。本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯは、その３’−部位にターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む３’−タギングＰＯであるか、またはその５’−部位にターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む５’−タギングＰＯであり、ＣＯでのＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列は、ＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。相互作用的二重標識は、望ましくは、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される場合に、供与体分子からのシグナルが受容体分子によってクエンチングされる位置に位置し、受容体分子からのシグナルを検出して、前記段階（ｄ）を実施する。
３’−タギングＰＯを利用する図８に示したように、供与体分子及び受容体分子が、供与体分子及び受容体分子の間にエネルギーが伝達される程度に構造的に互いに近接している場合、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる３’−タギングＰＯは切断されて、供与体分子含有断片及び受容体分子含有断片を形成する。タギング部位を含む受容体分子含有断片は、３’−タギングＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチドを含むＣＯにハイブリダイズされるが、供与体分子含有断片は、ＣＯとのハイブリダイゼーションに関与しないので、したがって、受容体からのシグナルが提供されない。
本明細書で使われる表現“供与体分子及び受容体分子が構造的に近接した”は、ＰＯの一部またはＰＯの形態的構造、例えば、ランダムコイル（ｃｏｌｉ）及びヘアピン構造によって供与体分子及び受容体分子が３次元的に互いに隣接することを意味する。
ターゲット核酸配列がない場合、非切断された３’−タギングＰＯは、ＣＯにハイブリダイズされ、供与体分子と受容体分子との間の相互作用が発生して、これにより、受容体分子からのシグナルが提供される。
ターゲット核酸配列が存在する場合、３’−タギングＰＯの切断によって非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成されず、したがって、受容体からのシグナルは提供されない。固相基質上の受容体分子からのシグナルの消滅（または、減少）測定は、ターゲット核酸配列の存在を決定可能にする。
本発明の望ましい具現例によれば、供与体分子及び受容体分子の間にエネルギーが伝達される程度に３’−タギングＰＯ上の供与体分子及び受容体分子が互いに近接している。供与体分子及び受容体分子は、５’→３’方向または３’→５’方向に３’−タギングＰＯに位置している。
本発明の望ましい具現例によれば、供与体分子及び受容体分子は、いずれもが３’−タギングＰＯのターゲッティング部位に位置するか、またはこれらのうち１つは、３’−タギングＰＯのターゲッティング部位に位置し、残りの１つは、タギング部位に位置する。
５’−タギングＰＯを利用する図９に示したように、供与体分子及び受容体分子が、供与体分子及び受容体分子の間にエネルギーが伝達される程度に構造的に互いに近接している場合、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる５’−タギングＰＯは切断されて、供与体分子含有断片及び受容体分子含有断片を形成する。タギング部位を含む供与体分子含有断片は、５’−タギングＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチドを含むＣＯにハイブリダイズされるが、受容体分子含有断片は、ＣＯとのハイブリダイゼーションに関与しないので、したがって、受容体からのシグナルが提供されない。
ターゲット核酸配列がない場合、非切断された５’−タギングＰＯは、ＣＯにハイブリダイズされ、供与体分子と受容体分子との間の相互作用が発生して、これにより、受容体分子からのシグナルが提供される。
ターゲット核酸配列が存在する場合、５’−タギングＰＯの切断によって非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成されず、したがって、受容体からのシグナルは提供されない。固相基質上の受容体分子からのシグナルの消滅（または、減少）測定は、ターゲット核酸配列の存在を決定可能にする。
本発明の望ましい具現例によれば、５’−タギングＰＯ上の供与体分子及び受容体分子は、供与体分子及び受容体分子の間にエネルギーが伝達される程度に互いに近接している。供与体分子及び受容体分子は、５’→３’方向または３’→５’方向に５’−タギングＰＯに位置している。
本発明の望ましい具現例によれば、供与体分子及び受容体分子は、いずれもが５’−タギングＰＯのターゲッティング部位に位置するか、またはこれらのうち１つは、５’−タギングＰＯのターゲッティング部位に位置し、残りの１つは、タギング部位に位置する。
二番目の測定方式は、図１０ないし図１２に示されている。
非タギングＰＯを利用する図１０は、供与体分子からのシグナルを測定する具現例を示す。本発明の望ましい具現例によれば、ＣＯでのＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列は、ＰＯのターゲッティング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。供与体含有断片が、ＣＯにハイブリダイズされない条件下で段階（ｃ）のハイブリダイゼーション反応を実施し、相互作用的二重標識は、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される場合に、供与体分子からのシグナルが受容体分子によってクエンチングされない位置に位置し、供与体分子からのシグナルを検出して、前記段階（ｄ）を実施する。
図１０に例示されたように、非タギングＰＯ上で供与体分子及び受容体分子が、供与体分子及び受容体分子の間にエネルギーが伝達される程度に構造的に互いに近接している場合、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる非タギングＰＯは切断されて、供与体分子含有断片及び受容体分子含有断片を形成する。供与体分子含有断片が、ＣＯにハイブリダイズされない条件下で段階（ｃ）の前記ハイブリダイゼーション反応を実施する。したがって、供与体分子からのシグナルは、固相基質上で提供されない。
ターゲット核酸配列がない場合、非切断された非タギングＰＯは、ＣＯにハイブリダイズされて、供与体分子及び受容体分子が離隔し、これは、供与体分子と受容体分子との間の相互作用を防止する。供与体分子（例えば、レポーター分子）に対する励起波長を有する光の照射は、供与体分子からの蛍光を発生させるが、これは受容体分子によってクエンチングされないので、最終的に、供与体からの蛍光シグナルが提供される。
ターゲット核酸配列が存在する場合、ＰＯの切断によって非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成されず、供与体含有断片は、ＣＯにハイブリダイズされず、したがって、供与体からのシグナルは提供されない。固相基質上の供与体分子からのシグナルの消滅（または、減少）測定は、ターゲット核酸配列の存在を決定可能にする。
本発明の望ましい具現例によれば、供与体分子及び受容体分子は、５’→３’方向または３’→５’方向に非タギングＰＯに位置しており、より望ましくは、５’→３’方向である。
タギングＰＯを利用する図１１及び図１２は、供与体分子からのシグナルを測定する具現例を示す。本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯは、その３’−部位にターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む３’−タギングＰＯであるか、またはその５’−部位にターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む５’−タギングＰＯであり、ＣＯでのＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列は、ＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。供与体含有断片が、ＣＯにハイブリダイズ可能な前記タギング部位を含み、段階（ｃ）の前記ハイブリダイゼーション反応で前記供与体含有断片が、ＣＯにハイブリダイズされる。相互作用的二重標識は、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される場合に、供与体分子からのシグナルが受容体分子によってクエンチングされる位置に位置し、供与体分子からのシグナルを検出して、段階（ｄ）を実施する。
３’−タギングＰＯを利用する図１１に示したように、供与体分子及び受容体分子が、供与体分子及び受容体分子の間にエネルギーが伝達される程度に構造的に互いに近接している場合、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる３’−タギングＰＯは切断されて、供与体分子含有断片及び受容体分子含有断片を形成する。タギング部位を含む供与体分子含有断片は、３’−タギングＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチドを含むＣＯにハイブリダイズされるが、受容体分子含有断片は、ＣＯとのハイブリダイゼーションに関与しないので、したがって、供与体からのシグナルが提供される。
ターゲット核酸配列がない場合、非切断された３’−タギングＰＯは、ＣＯにハイブリダイズされ、供与体分子のエネルギーが受容体分子に伝達されるように、供与体分子と受容体分子との間の相互作用が発生し、これにより、供与体分子から如何なる蛍光も発生しない。
ターゲット核酸配列が存在する場合、３’−タギングＰＯは切断され、タギング部位を含む供与体分子含有断片は、ＣＯにハイブリダイズされて、供与体分子からのシグナルが提供される。固相基質上の供与体分子からのシグナルの発生（または、増加）測定は、ターゲット核酸配列の存在を決定可能にする。
本発明の望ましい具現例によれば、供与体分子及び受容体分子の間にエネルギーが伝達される程度に、３’−タギングＰＯ上の供与体分子及び受容体分子が互いに近接している。受容体分子及び供与体分子は、５’→３’方向に３’−タギングＰＯに位置している。
本発明の望ましい具現例によれば、供与体分子及び受容体分子は、いずれもが３’−タギングＰＯのターゲッティング部位に位置するか、または受容体分子は、３’−タギングＰＯのターゲッティング部位に位置し、供与体分子は、タギング部位に位置する。
５’−タギングＰＯを利用する図１２に示したように、供与体分子及び受容体分子が、供与体分子及び受容体分子の間にエネルギーが伝達される程度に構造的に互いに近接している場合、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる５’−タギングＰＯは切断されて、受容体分子含有断片及びタギング部位を含む供与体分子含有断片を形成する。タギング部位を含む供与体分子含有断片は、５’−タギングＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチドを含むＣＯにハイブリダイズされるが、受容体分子含有断片は、ＣＯとのハイブリダイゼーションに関与しないので、したがって、ターゲット核酸配列の存在を示す供与体からのシグナルが提供される。ターゲット核酸配列がない場合、非切断された５’−タギングＰＯは、ＣＯにハイブリダイズされ、供与体分子のエネルギーが受容体分子に伝達されるように、供与体分子と受容体分子との間の相互作用が発生し、これにより、供与体分子から蛍光が発生しない。
ターゲット核酸配列が存在する場合、５’−タギングＰＯは切断され、タギング部位を含む供与体分子含有断片は、ＣＯにハイブリダイズされて、供与体分子からのシグナルが提供される。固相基質上の供与体分子からのシグナルの発生（または、増加）測定は、ターゲット核酸配列の存在を決定可能にする。
本発明の望ましい具現例によれば、供与体分子及び受容体分子の間にエネルギーが伝達される程度に、５’−タギングＰＯ上の供与体分子及び受容体分子が互いに近接している。供与体分子及び受容体分子は、５’→３’方向に５’−タギングＰＯに位置している。
本発明の望ましい具現例によれば、供与体分子及び受容体分子は、いずれもが５’−タギングＰＯのターゲッティング部位に位置するか、または受容体分子は、５’−タギングＰＯのターゲッティング部位に位置し、供与体分子は、タギング部位に位置する。
タギングＰＯを利用する他の例としては、ＣＯは、タギングＰＯのタギング部位の一部（または、全体）及びターゲッティング部位の一部（または、全体）にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。ＰＯ上の相互作用的二重標識の位置は、ＣＯの配列だけではなく、切断方法及び切断位置を考慮して決定される。
ＩＩＩ．インターカレーション剤（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｏｎ Ａｇｅｎｔ）を利用するＰＯＣＨによるターゲット検出過程
本発明は、またターゲット核酸配列の検出において、インターカレーティング剤を用いて卓越した性能を示す。
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、次の段階を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＯとハイブリダイズさせる段階であって、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記ＰＯは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＯのアップストリームに位置し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＯの切断を誘導し、
（ｂ）前記ＰＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、前記ＰＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて切断断片が生成され、
（ｃ）インターカレーティング剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）の存在下で、前記固相基質上に固定化されたＣＯに前記段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記切断断片は、前記ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、そして、
（ｄ）前記固相基質上の前記インターカレーティング剤からのシグナルを測定して、前記ＰＯの切断の発生を検出する段階であって、前記ＰＯの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明の三番目の具現例は、標識システムを除いては単一標識を利用する最初の具現例と同一であるために、これらの間の共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯの切断によって生成された切断断片は、ＣＯにハイブリダイズされない条件下でハイブリダイゼーション反応を実施する。
本発明で、有用なインターカレーティング染料の例は、ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＰＯ−ＰＲＯＴＭ−１、ＢＯ−ＰＲＯＴＭ−１、ＳＹＴＯＴＭ４３、ＳＹＴＯＴＭ４４、ＳＹＴＯＴＭ４５、ＳＹＴＯＸＴＭＢｌｕｅ、ＰＯＰＯＴＭ−１、ＰＯＰＯＴＭ−３、ＢＯＢＯＴＭ−１、ＢＯＢＯＴＭ−３、ＬＯ−ＰＲＯＴＭ−１、ＪＯ−ＰＲＯＴＭ−１、ＹＯ−ＰＲＯＴＭ１、ＴＯ−ＰＲＯＴＭ１、ＳＹＴＯＴＭ１１、ＳＹＴＯＴＭ１３、ＳＹＴＯＴＭ１５、ＳＹＴＯＴＭ１６、ＳＹＴＯＴＭ２０、ＳＹＴＯＴＭ２３、ＴＯＴＯＴＭ−３、ＹＯＹＯＴＭ３、ＧｅｌＳｔａｒＴＭ、及びｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅを含む。インターカレーティング染料が、二本鎖核酸分子内に特異的に割り込んでシグナルを発生させる。
ターゲット核酸配列が存在する場合、ＰＯの切断によって非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成されず、したがって、インターカレーティング剤からのシグナルは提供されない。固相基質上のインターカレーティング剤からのシグナルの消滅（または、減少）測定は、ターゲット核酸配列の存在を決定可能にする（図１３参照）。
本発明の望ましい具現例によれば、前記方法は、反復サイクルの間に変性過程を含み、段階（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｃ）、または（ａ）−（ｄ）を繰り返す段階をさらに含む。このような繰り返しは、ターゲット核酸配列及び／またはターゲットシグナルを増幅させる。
本発明の望ましい具現例によれば、前記方法は、段階（ａ）−（ｄ）は、１つの反応容器または個別反応容器で実施される。より望ましくは、段階（ａ）−（ｂ）及び段階（ｃ）−（ｄ）は、１つの反応容器または個別反応容器で実施される。
望ましくは、段階（ａ）−（ｂ）及び段階（ｃ）−（ｄ）は、１つの反応容器内でも個別的に実施される。例えば、ＰＯのターゲッティング部位とターゲット核酸配列との間のハイブリダイゼーションが、ＰＯからの断片とＣＯとの間のハイブリダイゼーション条件よりもさらに厳格な条件下で起こる場合、段階（ａ）−（ｂ）の繰り返しは、段階（ｃ）−（ｄ）の進行なしに実施される。段階（ａ）−（ｂ）の繰り返し終了後、段階（ｃ）−（ｄ）は、連続して実施される。
段階（ａ）−（ｂ）及び段階（ｃ）−（ｄ）を個別的に実施する場合、反復サイクルの間に変性過程を含み、段階（ａ）−（ｂ）を繰り返して実施する。
アップストリームプライマーを利用する本発明が、反復サイクルの間に変性過程を含む繰り返す段階によって実施される場合、前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施することが望ましい。最も望ましくは、本方法は、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって実施される。
アップストリームプローブを利用する本発明が、反復サイクルの間に変性過程を含む繰り返す段階によって実施される場合、前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施することが望ましい。
本発明では、検出及び／または増幅しようとするターゲット核酸配列があらゆるＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を含み、如何なる特定配列または長さを有するように要求しない。
ｍＲＮＡを初期物質として利用する場合、アニーリング段階の実施以前に逆転写段階が必須的であり、その詳細な内容は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＮｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０３６６（１９８８）に開示されている。逆転写反応のためには、ランダムヘキサマーまたはｍＲＮＡにハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドｄＴプライマーが利用されうる。
本発明で、検出及び／または増幅することができるターゲット核酸配列は、如何なる天然の原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物と人間とを含む高等動物）核酸、またはウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、エプスタインバーウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸、またはウイロイド核酸もいずれも含む。
本発明によって検出されうるターゲット核酸配列は、多様な核酸配列、例えば、ゲノム内の配列、人為的に分離されるか、断片化された配列及び合成配列（例えば、ｃＤＮＡ配列及びバーコード配列）を含む。例えば、ターゲット核酸配列は、Ｉｍｍｕｎｏ−ＰＣＲ（ＩＰＣＲ）のための核酸マーカー配列を含む。ＩＰＣＲは、ＰＣＲと共に核酸マーカー配列及び抗体の間にコンジュゲートを使い、これは、タンパク質を含んだ多様な種類のターゲットの検出に広く適用される（Ｓａｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８ ｐｐ：１２０−１２２（１９９２）、米国出願番号第５，６６５，５３９号、Ｎｉｅｍｅｙｅｒら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３ ｐｐ：２０８−２１６（２００５）、米国出願公開番号第２００５／０２３９１０８号、及びＹｅら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２ ｐｐ：７９６−８００（２０１０））。
本明細書で使われる用語“ヌクレオチド変異”は、連続的ＤＮＡセグメント（ｓｅｇｍｅｎｔ）、または配列が類似したＤＮＡセグメントで特定位置のＤＮＡ配列でのあらゆる単一または複数のヌクレオチド置換、欠失または挿入を意味する。
このような連続的ＤＮＡセグメントは、１つの遺伝子または１つの染色体の如何なる他の部位も含む。このようなヌクレオチド変異は、突然変異（ｍｕｔａｎｔ）または多形成対立遺伝子変異（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ａｌｌｅｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）であり得る。例えば、本発明から検出されるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）、欠失、挿入、置換、及び転座を含む。ヌクレオチド変異の例は、ヒトゲノムにある多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、病原体の薬剤耐性と関連した変異及び癌発生−関連変異を含む。本明細書で使われる用語“ヌクレオチド変異”は、ＤＮＡ分子内の特定位置での如何なる変異も含む。すなわち、用語“ヌクレオチド変異”は、野生型及びそのＤＮＡ分子内の特定位置での如何なる突然変異類型も含む。
ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異を検出する本発明で、使われるプライマーまたはプローブが、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有する場合、前記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列は、本明細書で、マッチング鋳型（ｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ）で記載される。使われるプライマーまたはプローブが、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して非相補的な配列を有する場合、前記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列は、本明細書でミスマッチング鋳型（ｍｉｓｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ）で記載される。
ヌクレオチド変異の検出のために、アップストリームプライマーの３’−末端は、ターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異位置の対向側に位置するようにデザインすることができる。本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームプライマーの３’−末端は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有する。ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有するアップストリームプライマーの３’−末端は、マッチング鋳型にアニーリングされ、延長されてＰＴＯ切断を誘導する。一方、アップストリームプライマーの３’−末端が、ミスマッチング鋳型でヌクレオチド変異にミスマッチされる場合、アップストリームプライマーがミスマッチング鋳型にハイブリダイズされるとしても、延長反応のために、プライマーの３’−末端のアニーリングが必須的な条件下では、延長されず、これにより、ＰＴＯの切断が招かれない。
択一的に、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有するＰＯのハイブリダイゼーションに依存的なＰＯの切断を利用できる。例えば、調節された条件下で、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有するＰＯは、マッチング鋳型にハイブリダイズされた後に切断される。一方、調節された条件下で、ＰＯは、ヌクレオチド変異位置に非相補的な配列を有するミスマッチング鋳型には、ハイブリダイズされず、切断されない。このような場合、望ましくは、ＰＯのヌクレオチド変異に対する相補的な配列は、ＰＯの３’−ターゲッティング部位の中間に位置する。
択一的に、本発明は、特定ヌクレオチド変異に対するＰＯの選別性のために、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に位置するヌクレオチド変異区別位置（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を有するＰＯを利用する。ヌクレオチド変異の検出のために、ＰＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部が、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に位置し、ＰＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有する。
本明細書で、ＰＯを言及しながら使われる用語“ヌクレオチド変異区別位置”は、（ｉ）ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を含む位置、及び（ｉｉ）３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に位置する位置である。
ヌクレオチド変異区別位置に相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列（すなわち、マッチ鋳型（ｍａｔｃｈ ｔｅｍｐｌａｔｅ））にＰＯがハイブリダイズされる場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部が、マッチ鋳型と二本鎖を形成するが、ヌクレオチド変異区別位置に非相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列（すなわち、ミスマッチ鋳型（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｔｅｍｐｌａｔｅ））にＰＯがハイブリダイズされる場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部が、ミスマッチ鋳型と二本鎖を形成しない。
このように関心のあるヌクレオチド変異の明らかなハイブリダイゼーションパターンが、ＰＯの初期切断位置での差を提供するということは、注目すべきことである。
本発明で利用された５’ヌクレアーゼは、５’→３’方向に二本鎖核酸分子の単一鎖を核酸外部切断方式（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）または核酸内部切断方式（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）で切断することができる酵素である。一般的に、５’ヌクレアーゼによるＰＯ上の切断位置は、ＰＯの５’−末端部位のハイブリダイゼーションによって多様になる。
変異区別位置に相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列（すなわち、マッチ鋳型）にＰＯがハイブリダイズされる場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部が、ターゲット核酸配列と二本鎖を形成して、第１初期切断位置からの切断を誘導する。
変異区別位置に非相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列（すなわち、ミスマッチ鋳型）にＰＯがハイブリダイズされる場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部が、ターゲット核酸配列と二本鎖を形成せず、第１初期切断位置のダウンストリームに位置した第２初期切断位置からの切断を誘導する。
第２初期切断位置が、第１初期切断位置のダウンストリームに位置するということは、注目すべきことである。
本明細書で、ＰＯを言及しながら使われる用語“第１初期切断位置”は、変異区別位置に相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列にＰＯがハイブリダイズされる場合、最初に切断されるＰＯの切断位置を意味する。本明細書で、ＰＯを言及しながら使われる用語“第２初期切断位置”は、変異区別位置に非相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列にＰＯがハイブリダイズされる場合、最初に切断されるＰＯの切断位置を意味する。
本発明の望ましい具現例によれば、ヌクレオチド変異区別位置は、ＰＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端から１０以内のヌクレオチドほど離隔した位置に位置し、より望ましくは、８ヌクレオチド、さらに望ましくは、６ヌクレオチド、さらに望ましくは、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチド、または１ヌクレオチドである。望ましくは、ヌクレオチド変異区別位置は、ＰＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端に位置する。
本明細書で、プローブのヌクレオチド変異区別位置またはターゲット配列のヌクレオチド変異位置を言及しながら使われる用語“位置”は、単一ヌクレオチドだけではなく、多数のヌクレオチドも含む。
３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に位置したヌクレオチド変異区別位置を有するＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有するブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）と共にヌクレオチド変異の検出に使うことができる。
例えば、ＰＯは、ブロッカーであって、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも１つのヌクレオチドを含むブロッカー部位を有し、ブロッカー部位は、ミスマッチ鋳型とＰＯとのハイブリダイゼーション後、初めて切断される位置に位置する。ブロッカー部位を有するＰＯが、マッチ鋳型にハイブリダイズされる場合、第１初期切断位置からの切断は影響を受けない。しかし、ブロッカー部位を有するＰＯが、ミスマッチ鋳型にハイブリダイズされる場合、ブロッカー部位は、第２初期切断位置からの切断を防止する。
ブロッカー部位に含まれるブロッカーの個数は、制限されず、望ましくは、１−１０ブロッカー、より望ましくは、２−１０ブロッカー、さらに望ましくは、３−８ブロッカー、最も望ましくは、３−６ブロッカーである。プローブに存在するブロッカーは、連続して、または不連続した方式で存在し、望ましくは、連続した方式である。ブロッカーとしてのヌクレオチド、すなわち、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するバックボーンを含むヌクレオチドは、当業界に知られた如何なるものも含む。例えば、前記ヌクレオチドは、多様なホスホロチオエート連結、ホスホネート連結、ホスホロアミダート連結、及び２’−カーボーハイドレート変形を含む。本発明のより望ましい具現例によれば、５’→３’エキソヌクレアーゼに対して耐性を有するバックボーンを含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結、アルキルホスホトリエステル連結、アリールホスホトリエステル連結、アルキルホスホネート連結、アリールホスホネート連結、ハイドロゲンホスホネート連結、アルキルホスホロアミダート連結、アリールホスホロアミダート連結、ホスホロセレネート連結、２’−Ｏ−アミノプロピル変形、２’−Ｏ−アルキル変形、２’−Ｏ−アリル変形、２’−Ｏ−ブチル変形、α−アノマーオリゴデオキシヌクレオチド、及び１−（４’−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）変形である。
選択的に、ブロッカーの利用なしに第１初期切断位置及び第２初期切断位置の位置を考慮して、標識の位置を適切に選択することによって、ヌクレオチド変異の検出を果たすことができる。
単一標識を利用する場合、単一標識の適した位置は、次を可能にする：
マッチ鋳型にハイブリダイズされたＰＯの切断によって形成された単一標識含有断片は、ＣＯにハイブリダイズされないが、ミスマッチ鋳型にハイブリダイズされたＰＯの切断によって形成された単一標識含有断片は、ＣＯにハイブリダイズされる。ミスマッチ鋳型にハイブリダイズされたＰＯの切断によって形成された単一標識含有断片とＣＯとの間のハイブリダイゼーションは、非切断ＰＯとＣＯとの間のハイブリダイゼーションによって提供されるような同一のシグナルを提供し、これにより、ヌクレオチド変異を検出する。
本発明のより望ましい具現例によれば、ＰＯに結合された単一標識は、第１初期切断位置と第２初期切断位置との間のヌクレオチドに位置する。
相互作用的二重標識を利用する場合、二重標識の適した位置は、次を可能にする：（ｉ）マッチ鋳型にハイブリダイズされたＰＯが切断されながら、二重標識は互いに離隔し、供与体含有断片及び受容体含有断片のうち少なくとも１つは、ＣＯにハイブリダイズされない。（ｉｉ）ミスマッチ鋳型にハイブリダイズされたＰＯが切断されながら、二重標識は互いに離隔せず、二重標識含有断片は、ＣＯにハイブリダイズされる。ミスマッチ鋳型にハイブリダイズされたＰＯの切断によって形成された二重標識含有断片とＣＯとの間のハイブリダイゼーションは、非切断ＰＯとＣＯとの間のハイブリダイゼーションによって提供されるような同一のシグナルを提供し、これにより、ヌクレオチド変異を検出する。
本発明のより望ましい具現例によれば、二重標識を有するＰＯを利用する場合、二重標識のうちの１つは、第１初期切断位置のアップストリームに存在するヌクレオチドに結合されており、残りの１つは、第１初期切断位置と第２初期切断位置との間に存在するヌクレオチドに結合されている。
例えば、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に位置するヌクレオチド変異区別位置を有する５’−タギングＰＯと５’−タギング部位にハイブリダイゼーションされるＣＯとを共に使う場合、適した位置の標識は、ブロッカーの利用なしにヌクレオチド変異を可能にする。
単一標識を有する５’−タギングＰＯを利用する場合、５’−タギングＰＯに結合された単一標識は、望ましくは、第１初期切断位置と第２初期切断位置との間のヌクレオチドに位置する。
図２１は、単一標識を有する５’−タギングＰＯを用いてヌクレオチド変異を検出する具現例を示す。ヌクレオチド変異区別位置は、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部の５’−末端から１ヌクレオチドほど離隔した位置に位置している。単一標識は、第１初期切断位置と第２初期切断位置との間に位置しているヌクレオチドに結合されている。
単一標識を含有する５’−タギングＰＯが、マッチ配列にハイブリダイズされる場合、第１初期切断位置で切断されて、単一標識がない５’−タギング部位含有断片が生成される。ＣＯが、ＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むので、マッチ鋳型にハイブリダイズされたＰＯの切断によって形成された単一標識含有断片は、ＣＯにハイブリダイズされない。単一標識を含有する５’−タギングＰＯが、ミスマッチ配列にハイブリダイズされる場合、第２初期切断位置で切断されて、単一標識がある５’−タギング部位含有断片が生成される。ＣＯが、ＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むので、ミスマッチ鋳型にハイブリダイズされたＰＯの切断によって形成された単一標識含有断片は、ＣＯにハイブリダイズされる。ミスマッチ鋳型にハイブリダイズされたＰＯの切断によって形成された単一標識含有断片とＣＯとの間のハイブリダイゼーションは、非切断ＰＯとＣＯとの間のハイブリダイゼーションによって提供されるような同一のシグナルを提供する。
したがって、ヌクレオチド変異の存在によって異なるシグナルが提供されうる。
二重標識を有する５’−タギングＰＯを利用する場合、二重標識のうちの１つは、第１初期切断位置のアップストリームに存在するヌクレオチドに結合されており（例えば、ＰＯの５’−タギング部位の５’−末端）、残りの１つは、第１初期切断位置と第２初期切断位置との間に存在するヌクレオチドに結合されている。
二重標識を含有する５’−タギングＰＯが、マッチ配列にハイブリダイズされる場合、第１初期切断位置で切断されて、二重標識は離隔して供与体分子含有断片及び受容体分子含有断片を形成する。断片のうちの１つは、５’−タギング部位を含み、５’−タギングＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むＣＯにハイブリダイズされる。二重標識を含有する５’−タギングＰＯが、ミスマッチ配列にハイブリダイズされる場合、第２初期切断位置で切断されて、二重標識がある５’−タギング部位含有断片が生成される。二重標識がある５’−タギング部位含有断片は、ＣＯにハイブリダイズされ、ハイブリダイゼーション産物は、非切断５’−タギングＰＯとＣＯとの間のハイブリダイゼーションから提供されるような同一のシグナルを提供する。
したがって、ヌクレオチド変異の存在によって異なるシグナルが提供されうる。
本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部は、ヌクレオチド変異区別位置から１−１０以内のヌクレオチドほど離隔した位置に位置する非塩基ペアリングモイエティ（ｎｏｎ−ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を含むことが望ましい（より望ましくは、１−５以内のヌクレオチド）。
図２２は、非塩基ペアリングモイエティを用いてヌクレオチド変異を検出する具現例を示す。
変異区別位置に対して非相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列にＰＯがハイブリダイズされる場合、非塩基ペアリングモイエティは、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部がターゲット核酸配列と二本鎖を形成することを防止する。
非塩基ペアリングモイエティ（例えば、ミスマッチヌクレオチド）の利用は、ヌクレオチド変異に対するＰＯの区別能力を向上させる。
本発明の望ましい具現例によれば、ヌクレオチド変異区別位置に対して相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列にＰＯがハイブリダイズされる場合、非塩基ペアリングモイエティは、５’−末端の一部がターゲット核酸配列と二本鎖を形成することを抑制しない。
本発明の望ましい具現例によれば、非塩基ペアリングモイエティは、ＰＯとマッチング鋳型のハイブリッド上の第１初期切断位置、及びＰＯとミスマッチング鋳型のハイブリッド上の第２初期切断位置間の距離を拡大させる。
非塩基ペアリングモイエティは、ターゲット核酸配列間に塩基対を形成しない如何なるモイエティも含む。望ましくは、非塩基ペアリングモイエティは、（ｉ）人為的なミスマッチ塩基、塩基ペアリングができないように変形された非塩基ペアリング塩基またはユニバーサル塩基を含むヌクレオチド、（ｉｉ）塩基ペアリングができないように変形された非塩基ペアリングヌクレオチド、または（ｉｉｉ）非塩基ペアリング化合物である。
例えば、非塩基ペアリングモイエティは、アルキレン基、リボフラノシルナフタリン、デオキシリボフラノシルナフタリン、メタリン酸塩、ホスホロチオエート連結、アルキルホスホトリエステル連結、アリールホスホトリエステル連結、アルキルホスホネート連結、アリールホスホネート連結、ハイドロゲンホスホネート連結、アルキルホスホロアミダート連結、及びアリールホスホロアミダート連結を含む。従来のカーボンスペーサも非塩基ペアリングモイエティとして利用される。非塩基ペアリングモイエティとしてのユニバーサル塩基は、ＰＯの切断位置の調整に有用である。
５’−末端の一部に導入された非塩基ペアリングモイエティは、望ましくは、１−１０つのモイエティを有し、より望ましくは、１−５つのモイエティ、さらに望ましくは、１−２つのモイエティである。５’−末端の一部の多数の非塩基ペアリングモイエティは、連続して、または不連続して存在することができる。望ましくは、非塩基ペアリングモイエティは、２−５つの連続したモイエティを有する。
望ましくは、非塩基ペアリングモイエティは、非塩基ペアリング化合物である。
本発明の望ましい具現例によれば、ヌクレオチド変異区別位置及びＰＯの非塩基ペアリングモイエティは、３’−ターゲッティング部位の５’−末端から１０以内のヌクレオチドほど離隔した位置に位置する（より望ましくは、８ヌクレオチド、７ヌクレオチド、６ヌクレオチド、５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチド、または１ヌクレオチド、さらに望ましくは、１ヌクレオチド）。
本発明の望ましい具現例によれば、非塩基ペアリングモイエティは、第１初期切断位置のダウンストリームに位置する。
本発明の望ましい具現例によれば、本発明で利用されるターゲット核酸配列は、増幅プライマーによってプレ増幅された核酸配列である。
少なくとも２種のターゲット核酸配列が同時に検出（マルチプレックス検出）されるという点で、本発明の利点がさらに目立つ。本発明の望ましい具現例によれば、前記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するために実施される（より望ましくは、少なくとも３種、さらに望ましくは、少なくとも５種）。アップストリームオリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み（より望ましくは、少なくとも３種、さらに望ましくは、少なくとも５種）、ＰＯは、少なくとも２種のＰＯを含み（より望ましくは、少なくとも３種、さらに望ましくは、少なくとも５種）、ＣＯは、少なくとも２種のＣＯを含む（より望ましくは、少なくとも３種、さらに望ましくは、少なくとも５種）。
タギングＰＯを利用する具現例で、少なくとも２種のＰＯのタギング部位は、互いに同一な配列または互いに異なる配列を有しうる。例えば、本発明をターゲット核酸配列のスクリーニングに実施する場合（例えば、多数のターゲット核酸配列のうちから１つの核酸配列検出）、同一な配列のタギング部位を有するＰＯを利用できる。
さらに、一種のＣＯを多数のターゲット核酸配列の検出に利用できる。例えば、タギング部位が同一な配列を有するＰＯをターゲット核酸配列のスクリーニングに利用する場合、一種のＣＯを利用できる。
本発明の望ましい具現例によれば、本発明は、少なくとも２種のダウンストリームプライマーを用いて実施される。
本発明の望ましい具現例
本発明の望ましい一具現例で、本発明は、次の段階を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列をアップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーを含む一対のプライマー及びＰＯとハイブリダイズさせる段階であって、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーのそれぞれは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記ＰＯは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、前記ＰＯは、単一標識を有し、前記ＰＯは、その３’−末端がブロッキングされて延長が防止され、前記ＰＯの前記ターゲッティング部位は、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーの間に位置し、前記アップストリームプライマーの延長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素による前記ＰＯの切断を誘導し、
（ｂ）前記プライマーの延長及び前記ＰＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、前記ＰＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記鋳型−依存的核酸重合酵素によって切断されて単一標識含有断片が生成され、
（ｃ）前記固相基質上に固定化されたＣＯに前記段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記単一標識含有断片は、前記ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物を変性させる段階；
（ｅ）前記段階（ａ）−（ｄ）を少なくとも２回繰り返す段階；及び
（ｆ）前記固相基質上の前記単一標識からのシグナルを測定して、前記ＰＯの切断の発生を検出する段階であって、前記ＰＯの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
択一的に、段階（ｂ）は、段階（ｂ）の結果物を変性させる（ｂ−１）及び段階（ａ）−（ｂ−１）を少なくとも２回繰り返す（ｂ−２）が起こる。このような場合、段階（ｄ）及び（ｅ）は、選択事項である。
単一標識からのシグナルの測定は、段階（ｄ）の繰り返しの各サイクルで、段階（ｄ）の繰り返し後に、または段階（ｄ）の繰り返し間の指定時間間隔で実施することができる。
本発明の望ましい他の具現例で、本発明は、次の段階を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列をアップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーを含む一対のプライマー及びＰＯとハイブリダイズさせる段階であって、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーのそれぞれは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記ＰＯは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、前記ＰＯは、供与体分子及び受容体分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記ＰＯは、その３’−末端がブロッキングされて延長が防止され、前記ＰＯの前記ターゲッティング部位は、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーの間に位置し、前記アップストリームプライマーの延長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素による前記ＰＯの切断を誘導し、
（ｂ）前記プライマーの延長及び前記ＰＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、前記ＰＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて、前記相互作用的二重標識が分離され、これにより、供与体含有断片及び受容体含有断片が生成され、
（ｃ）前記固相基質上に固定化されたＣＯに前記段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも１つは、前記ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体からのシグナルは、前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも１つが、前記ＣＯにハイブリダイズされない場合に提供されるシグナルと区別され、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物を変性させる段階；
（ｅ）前記段階（ａ）−（ｄ）を少なくとも２回繰り返す段階；
（ｆ）前記固相基質上の前記相互作用的二重標識からのシグナルを測定して、前記ＰＯの切断の発生を検出する段階であって、前記ＰＯの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
択一的に、段階（ｂ）は、段階（ｂ）の結果物を変性させる（ｂ−１）及び段階（ａ）−（ｂ−１）を少なくとも２回繰り返す（ｂ−２）が起こる。このような場合、段階（ｄ）及び（ｅ）は、選択事項である。
本発明の望ましいさらに他の具現例で、本発明は、次の段階を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列をアップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーを含む一対のプライマー及びＰＯとハイブリダイズさせる段階であって、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーのそれぞれは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記ＰＯは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、前記ＰＯは、その３’−末端がブロッキングされて延長が防止され、前記ＰＯの前記ターゲッティング部位は、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーの間に位置し、前記アップストリームプライマーの延長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素による前記ＰＯの切断を誘導し、
（ｂ）前記プライマーの延長及び前記ＰＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、前記ＰＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記鋳型−依存的核酸重合酵素によって切断されて単一標識含有断片が生成され、
（ｃ）インターカレーティング剤の存在下で、前記固相基質上に固定化されたＣＯに前記段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記単一標識含有断片が、前記ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、
（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物を変性させる段階；
（ｅ）前記段階（ａ）−（ｄ）を少なくとも２回繰り返す段階；
（ｆ）前記固相基質上の前記インターカレーティング剤からのシグナルを測定して、前記ＰＯの切断の発生を検出する段階であって、前記ＰＯの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
択一的に、段階（ｂ）は、段階（ｂ）の結果物を変性させる（ｂ−１）及び段階（ａ）−（ｂ−１）を少なくとも２回繰り返す（ｂ−２）が起こる。このような場合、段階（ｄ）及び（ｅ）は、選択事項である。
ＩＶ．アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性を基盤としたＰＯＣＨアッセイによるターゲット検出過程
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、次の段階を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列をＰＯとハイブリダイズさせる段階であって、前記ＰＯは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、前記ＰＯは、単一標識を有し、
（ｂ）前記ＰＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、前記ＰＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて単一標識含有断片が生成され、
（ｃ）前記固相基質上に固定化されたＣＯに前記段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記単一標識含有断片は、前記ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、そして、
（ｄ）前記固相基質上の前記単一標識からのシグナルを測定して、前記ＰＯの切断の発生を検出する段階であって、前記ＰＯの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、次の段階を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列をＰＯとハイブリダイズさせる段階であって、前記ＰＯは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、前記ＰＯは、供与体分子及び受容体分子を含む相互作用的二重標識を有し、
（ｂ）前記ＰＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、前記ＰＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて、前記相互作用的二重標識が分離され、これにより、供与体含有断片及び受容体含有断片が生成され、
（ｃ）前記固相基質上に固定化されたＣＯに前記段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも１つは、前記ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体からのシグナルは、前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも１つが、前記ＣＯにハイブリダイズされない場合に提供されるシグナルと区別され、そして、
（ｄ）前記固相基質上の前記相互作用的二重標識からのシグナルを測定して、前記ＰＯの切断の発生を検出する段階であって、前記ＰＯの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、次の段階を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列をＰＯとハイブリダイズさせる段階であって、前記ＰＯは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、
（ｂ）前記ＰＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、前記ＰＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて切断断片が生成され、
（ｃ）インターカレーティング剤の存在下で、前記固相基質上に固定化されたＣＯに前記段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記切断断片は、前記ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、そして、
（ｄ）前記固相基質上の前記インターカレーティング剤からのシグナルを測定して、前記ＰＯの切断の発生を検出する段階であって、前記ＰＯの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明は、アップストリームオリゴヌクレオチドなしに実施される。ＰＯは、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性によって切断されうる。このような場合、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性を有する従来の酵素を利用できる。
例えば、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性、及び／または５’エンドヌクレアーゼ活性を有する５’−ＦＥＮヌクレアーゼを利用できる。
鋳型−依存的重合酵素のうちでは、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性（５’エキソヌクレアーゼ活性、及び／または５’エンドヌクレアーゼ活性）を有する一部の酵素、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素（ｌａｗｙｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２ ｐｐ：２７５−２８７（１９９３），ＷＯ ２００８／０１１００４、及びＬｙａｍｉｃｈｅｖら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０ ｐｐ：７７８−７８３（１９９３）参照）がある。
本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的重合酵素によるＰＯの切断は、ＰＯに存在する標識の位置または標識の結合類型に影響を受ける。望ましくは、非タギングＰＯの５’−末端に標識が結合された場合、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的重合酵素による非タギングＰＯの切断は、非タギングＰＯの５’−末端のホスフェート基に標識が連結された場合、特に、カーボンスペーサ（ｃａｒｂｏｎ ｓｐａｃｅｒ）を介して連結された場合によりも効率的である。標識が、非タギングＰＯの５’−末端の塩基に連結されるか、カーボンスペーサを利用しない場合、非タギングＰＯの切断が起こらないこともある。
アップストリームオリゴヌクレオチド−依存的５’ヌクレアーゼ活性に対する切断効率は、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性に対する切断効率よりも高い。
前記アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性は、反応条件（例えば、酵素の種類、バッファ組成、及びＰＯの配列）により敏感である。
ターゲット核酸配列の増幅及びＰＯの切断効率を考慮して、望ましくは、本発明のＰＯＣＨアッセイは、アップストリームオリゴヌクレオチドを用いて実施する。
ターゲット検出のためのキット
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、次を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含むＰＯ；
（ｂ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアップストリームオリゴヌクレオチド；前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＯのアップストリームに位置し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＯの切断を誘導し、及び、
（ｃ）前記固相基質上に固定化されたＣＯ；前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、これにより、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって非切断されたＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される。
本発明のキットは、前述した本発明の方法を実施するために構成されたものであって、この２つの間に共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯは、単一標識または相互作用的二重標識を有する。
本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯは、その３’−部位にターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む３’−タギングＰＯであるか、またはその５’−部位にターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む５’−タギングＰＯであり、ＣＯでのＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列は、ＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。
本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯは、その３’−部位にターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む３’−タギングＰＯであるか、またはその５’−部位にターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む５’−タギングＰＯであり、ＣＯでのＰＯにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、ＰＯのタギング部位の一部、及びＰＯのターゲッティング部位の一部にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。
本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯは、その３’−部位にターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む３’−タギングＰＯであり、ＣＯは、その５’−末端を通じて前記基質上に固定化される。
本発明の望ましい具現例によれば、ＰＯは、その５’−部位にターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む５’−タギングＰＯであり、ＣＯは、その３’−末端を通じて前記基質上に固定化される。
本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブである。
本発明の望ましい具現例によれば、キットは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含み、より望ましくは、５’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼである。
本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームオリゴヌクレオチドは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によってＰＯの切断を誘導する程度にＰＯに近接している。
本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームオリゴヌクレオチドは、ＰＯのターゲッティング部位と部分的に重なる配列を有する。
本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームプライマーは、その延長鎖を通じて５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＯの切断を誘導する。
本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーであり、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素である。
本発明の望ましい具現例によれば、キットは、インターカレーティング剤をさらに含む。
本発明の望ましい具現例によれば、キットは、少なくとも２種のターゲット核酸配列の検出に利用される。アップストリームオリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のアップストリームオリゴヌクレオチドを含み、前記ＰＯは、少なくとも２種のＰＯを含み、前記ＣＯは、少なくとも２種のＣＯを含む。
本発明の望ましい具現例によれば、キットは、ダウンストリームプライマーをさらに含む。
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、次を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含むＰＯ；及び、
（ｂ）前記固相基質上に固定化されたＣＯ；前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、これにより、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって非切断されたＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
実施例１：単一標識非タギングＰＯを利用するＰＯＣＨアッセイの評価
新規なアッセイであるＰＯＣＨアッセイが、単一標識非タギングＰＯを用いてターゲット核酸配列を検出できるか否かについて評価した（図２参照）。ＰＯ切断は、チューブで実施し、キャプチャリングオリゴヌクレオチド（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＣＯ）が固定化されたマイクロアレイで前記結果物の一部を移した。
アップストリームプライマーの延長及びＰＯの切断のために、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を利用した。非タギングＰＯは、ターゲット核酸配列に相補的なターゲッティング部位を含み、その５’−末端に蛍光レポーター分子であるＱｕａｓａｒ５７０を有する。ＣＯは、ＰＯのターゲッティング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。ＰＯ及びＣＯの３’−末端は、カーボンスペーサでブロッキングした。ＣＯは、リンカーアーム（ｌｉｎｋｅｒ ａｒｍ）としてポリ（Ｔ）１０を有し、その５’−末端にあるアミノ基（ＡｍｉｎｎｏＣ６）を用いてガラススライドの表面に固定した。その５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有するマーカープローブは、その３’−末端にあるアミノ基を用いてガラススライドの表面に固定した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。
本実施例で利用された合成鋳型、アップストリームプライマー、ＰＯ、ＣＯ、及びマーカーの配列は、次の通りである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＯ−１ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
ＮＧ−ＣＯ−１ ５’−［ＡｍｉｎｏＣ６］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
Ｍａｒｋｅｒ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
ＮＳＢ９ ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ，Ｋｏｒｅａ）をＣＯ及びマーカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及び５）の製作に利用した。ＮＳＢスポッティングバッファ（ＮＳＢ ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で最終濃度５０μＭになるように溶解させたＣＯ及びマーカーを、ＰｅｒｓｏｎａｌＡｒｒａｙｅｒＴＭ１６ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｐｏｔｔｅｒ（ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ，Ｃｈｉｎａ）を用いてＮＳＢ９ ＮＨＳスライド上にプリンティングした。ＣＯ及びマーカーを２×１フォーマット（ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓｐｏｔｓ）で平行にスポッティング（ｓｐｏｔｔｉｎｇ）し、このようにして製作されたマイクロアレイを約８５％湿度で保持されるチャンバに一晩インキュベーティングした。非特異的に結合されたＣＯ及びマーカーを除去するために、前記スライドを、２×ＳＳＰＥ（０．３Ｍ 塩化ナトリウム、０．０２Ｍ リン酸水素二ナトリウム、及び２．０ｍＭ ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４及び７．０ｍＭ ＳＤＳを含有したバッファ溶液に３７℃で３０分間洗浄し、蒸留水で洗浄した。次いで、スライド遠心分離機を用いて、前記ＤＮＡ−機能化された（ＤＮＡ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）スライドを乾燥させ、使用前まで４℃の暗室で保管した。
ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、アップストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）１ｐｍｏｌｅ、及び２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、及びＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素４ｕｎｉｔを含有した２×マスターミックス（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）２５μｌを含有した５０μｌの最終体積で切断反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブを実時間熱循環器（ＣＦＸ９６，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒の過程を３０回繰り返した。
ＣＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）が交互結合（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ）されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに、前記結果物である混合物３０μｌを適用した。スライドをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ブロック方式で熱循環器（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ，Ｃｈｉｎａ）に位置させた。ハイブリダイゼーション反応を５５℃で３０分間実施した。イメージ獲得は、共焦点レーザスキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を用いて、５μｍピクセル解像度のスキャニングで実施した。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ７．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を用いて分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値（ｓｐｏｔ−ｍｅｄｉａｎｓ）で表現した。再現性を調査するために、各スポットは、２つずつスポッティングした。蛍光強度を反復されたスポットの平均値で表わした。
図１４で示したように、ターゲット核酸配列がある場合、ターゲット核酸配列がない場合の蛍光シグナル（ＲＦＵ：６５，４８４±０．７）と比較して、減少した蛍光シグナル（ＲＦＵ：９，００６±２０．５）が検出された。
このような結果は、ＰＯＣＨアッセイがターゲット核酸配列の検出に適用可能であるということを表わす。
実施例２：単一標識３’−タギングＰＯを利用するＰＯＣＨアッセイの評価
本発明者らは、ＰＯＣＨアッセイが単一標識３’−タギングＰＯを用いてターゲット核酸配列を検出できるか否かについてさらに評価した（図４参照）。ＰＯ切断は、チューブで実施し、ＣＯが、固定化されたマイクロアレイで前記結果物の一部を移した。
アップストリームプライマーの延長及びＰＯの切断のために、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を利用した。３’−タギングＰＯは、ターゲット核酸配列に相補的なターゲッティング部位、及びターゲット核酸配列に非相補的な３’−タギング部位を含む。３’−タギングＰＯは、その５’−末端に蛍光レポーター分子であるＱｕａｓａｒ５７０を有する。ＣＯは、ＰＯの３’−タギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。３’−タギングＰＯ及びＣＯの３’−末端は、カーボンスペーサでブロッキングした。ＣＯは、リンカーアームとしてポリ（Ｔ）５を有し、その５’−末端にあるアミノ基（ＡｍｉｎｎｏＣ６）を用いてガラススライドの表面に固定した。その５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有するマーカープローブは、その３’−末端にあるアミノ基を用いてガラススライドの表面に固定した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。
本実施例で利用された合成鋳型、アップストリームプライマー、３’−タギングＰＯ、ＣＯ、及びマーカーの配列は、次の通りである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＯ−２ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＧＡ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
ＮＧ−ＣＯ−２ ５’−［ＡｍｉｎｏＣ６］ＴＴＴＴＴＴＣＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴＣ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｍａｒｋｅｒ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
（下線を引いた文字は、ＰＯの３’−タギング部位を示す）
配列リスト第４配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の代わりに、配列リスト第７配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を利用したものを除いては、実施例１で利用されたものと同一のプロトコルでスライド製作を実施した。
ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、アップストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）１ｐｍｏｌｅ、及び２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、及びＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素４ｕｎｉｔを含有した２×マスターミックス（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）２５μｌを含有した５０μｌの最終体積で切断反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブを実時間熱循環器（ＣＦＸ９６，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒の過程を３０回繰り返した。
ＣＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）が交互結合されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに、前記結果物である混合物３０μｌを適用した。スライドをインサイチュブロック方式で熱循環器（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ，Ｃｈｉｎａ）に位置させた。ハイブリダイゼーション反応を５５℃で３０分間実施した。イメージ獲得は、共焦点レーザスキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を用いて、５μｍピクセル解像度のスキャニングで実施した。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ７．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を用いて分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。再現性を調査するために、各スポットは、２つずつスポッティングした。蛍光強度を反復されたスポットの平均値で表わした。
図１５で示したように、ターゲット核酸配列がある場合、ターゲット核酸配列がない場合の蛍光シグナル（ＲＦＵ：６５，４６４±６．４）と比較して、減少した蛍光シグナル（ＲＦＵ：１０，２１７±７３．５）が検出された。
このような結果は、単一標識３’−タギングＰＯを利用したＰＯＣＨアッセイがターゲット核酸配列の検出に適用可能であるということを表わす。
実施例３：単一標識５’−タギングＰＯを利用するＰＯＣＨアッセイの評価
本発明者らは、単一標識５’−タギングＰＯを利用したＰＯＣＨアッセイに対してさらに評価した（図５参照）。ＰＯ切断は、チューブで実施し、ＣＯが、固定化されたマイクロアレイで前記結果物の一部を移した。
アップストリームプライマーの延長及びＰＯの切断のために、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を利用した。５’−タギングＰＯは、ターゲット核酸配列に相補的なターゲッティング部位、及びターゲット核酸配列に非相補的な５’−タギング部位を含む。５’−タギングＰＯは、その３’−末端に蛍光レポーター分子であるＱｕａｓａｒ５７０を有する。ＣＯは、ＰＯの５’−タギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。ＣＯは、リンカーアームとしてポリ（Ｔ）１０を有し、その３’−末端にあるアミノ基（ＡｍｉｎｎｏＣ７）を用いてガラススライドの表面に固定した。その５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有するマーカープローブは、その３’−末端にあるアミノ基を用いてガラススライドの表面に固定した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。
本実施例で利用された合成鋳型、アップストリームプライマー、５’−タギングＰＯ、ＣＯ、及びマーカーの配列は、次の通りである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＯ−３ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｑｕａｓａｒ５７０］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）
ＮＧ−ＣＯ−３ ５’−ＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）
Ｍａｒｋｅｒ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
（下線を引いた文字は、ＰＯの５’−タギング部位を示す）
配列リスト第４配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の代わりに、配列リスト第９配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）を利用したものを除いては、実施例１で利用されたものと同一のプロトコルでスライド製作を実施した。
ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、アップストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）１ｐｍｏｌｅ、及び２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、及びＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素４ｕｎｉｔを含有した２×マスターミックス（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）２５μｌを含有した５０μｌの最終体積で切断反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブを実時間熱循環器（ＣＦＸ９６，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒の過程を３０回繰り返した。
ＣＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）が交互結合されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに、前記結果物である混合物３０μｌを適用した。スライドをインサイチュブロック方式で熱循環器（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ，Ｃｈｉｎａ）に位置させた。ハイブリダイゼーション反応を５５℃で３０分間実施した。イメージ獲得は、共焦点レーザスキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を用いて、５μｍピクセル解像度のスキャニングで実施した。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ７．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を用いて分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。再現性を調査するために、各スポットは、２つずつスポッティングした。蛍光強度を反復されたスポットの平均値で表わした。
図１６で示したように、ターゲット核酸配列がある場合、ターゲット核酸配列がない場合の蛍光シグナル（ＲＦＵ：６５，４５５±０．７）と比較して、減少した蛍光シグナル（ＲＦＵ：１７，５８６±１５２．０）が検出された。
このような結果は、単一標識５’−タギングＰＯを利用したＰＯＣＨアッセイがターゲット核酸配列の検出に適用可能であるということを表わす。
実施例４：二重標識３’−タギングＰＯを利用するＰＯＣＨアッセイの評価
本発明者らは、ＰＯＣＨアッセイが二重標識３’−タギングＰＯを用いてターゲット核酸配列を検出できるか否かについてさらに評価した（図１１参照）。ＰＯ切断は、チューブで実施し、ＣＯが、固定化されたマイクロアレイで前記結果物の一部を移した。
アップストリームプライマーの延長及びＰＯの切断のために、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を利用した。３’−タギングＰＯは、ターゲット核酸配列に相補的なターゲッティング部位、及びターゲット核酸配列に非相補的な３’−タギング部位を含む。３’−タギングＰＯは、その５’−末端に受容体分子であるＢＨＱ−２を有し、そのターゲッティング部位の３’−末端に供与体分子であるＱｕａｓａｒ５７０を有する。ＣＯは、ＰＯの３’−タギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。ターゲット核酸配列を検出するために、供与体分子からのシグナルを測定した。３’−タギングＰＯ及びＣＯの３’−末端は、カーボンスペーサでブロッキングした。ＣＯは、リンカーアームとしてポリ（Ｔ）５を有し、その５’−末端にあるアミノ基（ＡｍｉｎｎｏＣ６）を用いてガラススライドの表面に固定した。その５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有するマーカープローブは、その３’−末端にあるアミノ基を用いてガラススライドの表面に固定した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。
本実施例で利用された合成鋳型、アップストリームプライマー、３’−タギングＰＯ、ＣＯ、及びマーカーの配列は、次の通りである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＯ−４ ５’−［ＢＨＱ−２］ＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｔ（Ｑｕａｓａｒ５７０）］ＧＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＧＡ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）
ＮＧ−ＣＯ−２ ５’−［ＡｍｉｎｏＣ６］ＴＴＴＴＴＴＣＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴＣ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｍａｒｋｅｒ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
（下線を引いた文字は、ＰＯの３’−タギング部位を示す）
配列リスト第４配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）の代わりに、配列リスト第７配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）を利用したものを除いては、実施例１で利用されたものと同一のプロトコルでスライド製作を実施した。
ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、アップストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）１ｐｍｏｌｅ、及び２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、及びＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素４ｕｎｉｔを含有した２×マスターミックス（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）２５μｌを含有した５０μｌの最終体積で切断反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブを実時間熱循環器（ＣＦＸ９６，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒の過程を３０回繰り返した。
ＣＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）が交互結合されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに、前記結果物である混合物３０μｌを適用した。スライドをインサイチュブロック方式で熱循環器（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ，Ｃｈｉｎａ）に位置させた。ハイブリダイゼーション反応を５５℃で３０分間実施した。イメージ獲得は、共焦点レーザスキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を用いて、５μｍピクセル解像度のスキャニングで実施した。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ７．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を用いて分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。再現性を調査するために、各スポットは、２つずつスポッティングした。蛍光強度を反復されたスポットの平均値で表わした。
受容体が供与体からの蛍光シグナルをクエンチングするので、非切断された３’−タギングＰＯ／ＣＯ二量体では、供与体から蛍光シグナルが提供されない。一方、ＣＯにハイブリダイズされる切断された３’−タギングＰＯの供与体含有断片は、蛍光シグナルを提供することができる。
図１７で示したように、ターゲット核酸配列がある場合、ターゲット核酸配列がない場合の蛍光シグナル（ＲＦＵ：１３，３４９±４４１．２）と比較して、増加した蛍光シグナル（ＲＦＵ：６５，４６９±０．７）が観察された。
このような結果は、二重標識３’−タギングＰＯを利用したＰＯＣＨアッセイがターゲット核酸配列の検出に適用可能であるということを表わす。
実施例５：ＰＯＣＨアッセイによるターゲット核酸配列の検出
本発明者らは、ターゲット配列の増幅を伴うターゲット核酸配列の検出にＰＯＣＨアッセイを応用した。本応用を実験するために、単一標識非タギングＰＯ及び単一標識３’−タギングＰＯのそれぞれを利用した。ＰＣＲ過程によるターゲット増幅の間のＰＯ切断は、チューブで実施し、ＣＯが、固定化されたマイクロアレイで前記結果物の一部を移した。
アップストリームプライマーは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＯ切断に関与し、またダウンストリームプライマーと共にＰＣＲ過程によるターゲット核酸配列の増幅にも関与する。アップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーの延長、及びＰＯの切断のために、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を利用した。
非タギングＰＯは、ターゲット核酸配列に相補的なターゲッティング部位を含む。非タギングＰＯに対するＣＯは、ＰＯのターゲッティング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。３’−タギングＰＯは、ターゲット核酸配列に相補的なターゲッティング部位、及びターゲット核酸配列に非相補的な３’−タギング部位を含む。３’−タギングＰＯに対するＣＯは、ＰＯの３’−タギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。
非タギングＰＯ及び３’−タギングＰＯは、それらの５’−末端に蛍光レポーター分子であるＱｕａｓａｒ５７０を有する。ＰＯ及びＣＯの３’−末端は、カーボンスペーサでブロッキングした。非タギングＰＯに対するＣＯは、リンカーアームとしてポリ（Ｔ）１０を有し、その５’−末端にあるアミノ基（ＡｍｉｎｎｏＣ６）を用いてガラススライドの表面に固定した。３’−タギングＰＯに対するＣＯは、リンカーアームとしてポリ（Ｔ）５を有し、その５’−末端にあるアミノ基（ＡｍｉｎｎｏＣ６）を用いてガラススライドの表面に固定した。その５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有するマーカープローブは、その３’−末端にあるアミノ基を用いてガラススライドの表面に固定した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡをターゲット鋳型として利用した。
５−１．単一標識非タギングＰＯを利用したＰＯＣＨアッセイ
本実施例で利用されたアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、ＰＯ、ＣＯ、及びマーカーの配列は、次の通りである：
ＮＧ−Ｆ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＯ−１ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
ＮＧ−ＣＯ−１ ５’−［ＡｍｉｎｏＣ６］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
Ｍａｒｋｅｒ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
実施例１で利用されたものと同一のプロトコルでスライド製作を実施した。
ＮＧゲノムＤＮＡ １００ｐｇ、ダウンストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）１０ｐｍｏｌｅ、アップストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）１ｐｍｏｌｅ、及び２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、及びＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素４ｕｎｉｔを含有した２×マスターミックス（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）２５μｌを含有した５０μｌの最終体積で切断反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブを実時間熱循環器（ＣＦＸ９６，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒の過程を６０回繰り返した。ＣＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）が交互結合されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに、前記結果物である混合物３０μｌを適用した。スライドをインサイチュブロック方式で熱循環器（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ，Ｃｈｉｎａ）に位置させた。ハイブリダイゼーション反応を５５℃で３０分間実施した。イメージ獲得は、それぞれ洗浄後、共焦点レーザスキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を用いて、５μｍピクセル解像度のスキャニングで実施した。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ７．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を用いて分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。再現性を調査するために、各スポットは、２つずつスポッティングした。蛍光強度を反復されたスポットの平均値で表わした。
図１８で示したように、ターゲット核酸配列がある場合、ターゲット核酸配列がない場合の蛍光シグナル（ＲＦＵ：６４，４７４±０．０）と比較して、減少した蛍光シグナル（ＲＦＵ：１，６５０±９７．６）が観察された。
５−２．単一標識３’−タギングＰＯを利用したＰＯＣＨアッセイ
本実施例で利用されたアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、３’−タギングＰＯ、ＣＯ、及びマーカーの配列は、次の通りである：
ＮＧ−Ｆ ５’−ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＣＡＣＧＣＴ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＯ−２ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧＧＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＴＴＴＡＣＧＡ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
ＮＧ−ＣＯ−２ ５’−［ＡｍｉｎｏＣ６］ＴＴＴＴＴＴＣＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴＣ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）
Ｍａｒｋｅｒ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
（下線を引いた文字は、ＰＯの３’−タギング部位を示す）
実施例２で利用されたものと同一のプロトコルでスライド製作を実施した。
ＮＧゲノムＤＮＡ １００ｐｇ、ダウンストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）１０ｐｍｏｌｅ、アップストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）１ｐｍｏｌｅ、及び２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、及びＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素４ｕｎｉｔを含有した２×マスターミックス（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）２５μｌを含有した５０μｌの最終体積で切断反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブを実時間熱循環器（ＣＦＸ９６，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒の過程を６０回繰り返した。ＣＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）が交互結合されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに、前記結果物である混合物３０μｌを適用した。スライドをインサイチュブロック方式で熱循環器（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ，Ｃｈｉｎａ）に位置させた。ハイブリダイゼーション反応を５５℃で３０分間実施した。イメージ獲得は、それぞれ洗浄後、共焦点レーザスキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を用いて、５μｍピクセル解像度のスキャニングで実施した。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ７．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を用いて分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。再現性を調査するために、各スポットは、２つずつスポッティングした。蛍光強度を反復されたスポットの平均値で表わした。
図１９で示したように、ターゲット核酸配列がある場合、ターゲット核酸配列がない場合の蛍光シグナル（ＲＦＵ：６５，４７０±１．４）と比較して、減少した蛍光シグナル（ＲＦＵ：９，９６９±２１７．１）が観察された。
このような結果は、ＰＣＲ過程によってターゲット増幅が伴われるＰＯＣＨアッセイを用いてターゲット核酸配列を検出できるということを表わす。
実施例６：ＰＯＣＨアッセイによるターゲット核酸配列のリアルタイム検出
本発明者らは、ターゲット核酸配列のリアルタイム検出にＰＯＣＨアッセイを応用した。本応用を実験するために、３’−タギングＰＯを利用した。ＣＯが、固定化されたマイクロアレイ上でＰＣＲ過程によるターゲット増幅と共にＰＯの切断及びＰＯのハイブリダイゼーションを実施した。サイクル数による蛍光シグナルの変化を測定した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）のゲノムＤＮＡをターゲット鋳型として利用した。
実施例５−２で利用されたものと同一のオリゴヌクレオチド（アップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、３’−タギングＰＯ、ＣＯ、及びマーカー）を本実施例に利用した。実施例２で利用されたものと同一のプロトコルでスライド製作を実施した。
ＮＧゲノムＤＮＡ １００ｐｇ、ダウンストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）１０ｐｍｏｌｅ、アップストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）１ｐｍｏｌｅ、及び２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、及びＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素４ｕｎｉｔを含有した２×マスターミックス（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）２５μｌを含有した３０μｌの最終体積でＰＯＣＨアッセイ混合物を準備した；ＣＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）が交互結合されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに、前記全体混合物を適用した。前記スライドをインサイチュブロック方式で熱循環器（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ，Ｃｈｉｎａ）に位置させた。サイクリング分析のために、５つの同一のスライドを製作した。ＰＯＣＨ反応を次のように実施した：９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒の過程を０、２０、３０、４０、または６０サイクル、そして、５５℃で３０分実施した。各サイクル数による反応以後、イメージ獲得は、共焦点レーザスキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を用いて、５μｍピクセル解像度のスキャニングで実施した。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ７．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を用いて分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。再現性を調査するために、各スポットは、２つずつスポッティングした。蛍光強度を反復されたスポットの平均値で表わした。
図２０Ａ及び図２０Ｂで示したように、鋳型がある場合、３０サイクル以後から蛍光シグナルが減少した（０サイクル＿ＲＦＵ：６５，４３８±０．０；２０サイクル＿ＲＦＵ：６５，４４５±２．１；３０サイクル＿ＲＦＵ：６５，４８０±０．０；４０サイクル＿ＲＦＵ：８，８４４±１，４８５．６；及び６０サイクル＿ＲＦＵ：４，８７８±１６９．７）。鋳型がない場合には、サイクル数による蛍光シグナルの変化がなかった。
このような結果は、ＰＯＣＨアッセイを用いてリアルタイム方式でターゲット核酸配列を検出できるということを表わす。
実施例７：ＰＯのアップストリームオリゴヌクレオチド−独立的切断を利用したＰＯＣＨアッセイの評価
本発明者らは、追加的にアップストリームオリゴヌクレオチドなしに、ターゲット核酸配列の検出でのＰＯＣＨアッセイを評価した。アップストリームオリゴヌクレオチドなしに、ＰＯのアップストリームオリゴヌクレオチド−独立的切断をチューブで実施し、ＣＯが、固定化されたマイクロアレイで前記結果物の一部を移した。
ＰＯのアップストリームオリゴヌクレオチド−独立的切断のために、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を利用した。非タギングＰＯは、ターゲット核酸配列に相補的なターゲッティング部位を含み、その５’−末端に蛍光レポーター分子であるＦＡＭを有する。ＣＯは、ＰＯのターゲッティング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含む。ＰＯ及びＣＯの３’−末端は、カーボンスペーサでブロッキングした。ＣＯは、リンカーアームとしてポリ（Ｔ）１０を有し、その５’−末端にあるアミノ基（ＡｍｉｎｎｏＣ６）を用いてガラススライドの表面に固定した。その５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｑｕａｓａｒ５７０）を有するマーカープローブは、その３’−末端にあるアミノ基を用いてガラススライドの表面に固定した。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）に対する合成オリゴヌクレオチドを鋳型として利用した。
本実施例で利用された合成鋳型、ＰＯ、ＣＯ、及びマーカーの配列は、次の通りである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＮＧ−ＰＯ−５ ５’−［ＦＡＭ］ＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）
ＮＧ−ＣＯ−１ ５’−［ＡｍｉｎｏＣ６］ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
Ｍａｒｋｅｒ ５’−［Ｑｕａｓａｒ５７０］ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ［ＡｍｉｎｏＣ７］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
ＮＳＢ９ ＮＨＳスライド（ＮＳＢＰＯＳＴＥＣＨ，Ｋｏｒｅａ）をＣＯ及びマーカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及び５）の製作に利用した。ＮＳＢスポッティングバッファで最終濃度５０μＭになるように溶解させたＣＯ及びマーカーを、ＰｅｒｓｏｎａｌＡｒｒａｙｅｒＴＭ１６ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｐｏｔｔｅｒ（ＣａｐｉｔａｌＢｉｏ，Ｃｈｉｎａ）を用いてＮＳＢ９ ＮＨＳスライド上にプリンティングした。ＣＯ及びマーカーを２ｘ１フォーマット（ｄｕｐｌｉｃａｔｅｓｐｏｔｓ）で平行にスポッティングし、このようにして製作されたマイクロアレイを約８５％湿度で保持されるチャンバに一晩インキュベーティングした。非特異的に結合されたＣＯ及びマーカーを除去するために、前記スライドを、２×ＳＳＰＥ（０．３Ｍ 塩化ナトリウム、０．０２Ｍ リン酸水素二ナトリウム、及び２．０ｍＭ ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．４及び７．０ｍＭ ＳＤＳを含有したバッファ溶液に３７℃で３０分間洗浄し、蒸留水で洗浄した。次いで、スライド遠心分離機を用いて前記ＤＮＡ−機能化されたスライドを乾燥させ、使用前まで４℃の暗室で保管した。
ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、ＰＯ（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１２）１ｐｍｏｌｅ、及び２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰｓ ２００μＭ、及びＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素４ｕｎｉｔを含有した２×マスターミックス（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）２５μｌを含有した５０μｌの最終体積で切断反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブを実時間熱循環器（ＣＦＸ９６，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６０秒の過程を３０回繰り返した。
ＣＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）が交互結合されたＮＳＢガラススライドの表面上に組み立てられたチャンバに、前記結果物である混合物３０μｌを適用した。スライドをインサイチュブロック方式で熱循環器（Ｇｅｎｅｐｒｏ Ｂ４Ｉ，Ｃｈｉｎａ）に位置させた。ハイブリダイゼーション反応を５５℃で３０分間実施した。イメージ獲得は、共焦点レーザスキャナーＡｘｏｎ ＧｅｎｅＰｉｘ４１００Ａ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を用いて、５μｍピクセル解像度のスキャニングで実施した。蛍光強度は、定量的なマイクロアレイ分析ソフトウェア、ＧｅｎｅＰｉｘ ｐｒｏ７．０ソフトウェア（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，ＵＳ）を用いて分析した。蛍光強度は、周辺バックグラウンドを除去した後、スポット−中央値で表現した。再現性を調査するために、各スポットは、２つずつスポッティングした。蛍光強度を反復されたスポットの平均値で表わした。
ターゲット核酸配列がある場合、ターゲット核酸配列がない場合の蛍光シグナルと比較して、減少した蛍光シグナルが観察された。
このような結果は、ＰＯのアップストリームオリゴヌクレオチド−独立的切断を利用するＰＯＣＨアッセイがターゲット核酸配列の検出に適用可能であるということを表わす。
本発明の望ましい具現例を詳しく記述し、本発明の原理による変形及び修正が可能であり、本発明の範囲は、添付の請求項とその均等物とによって定義されるということは、当業者によく認識される。

Claims (40)

  1. 次の段階を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法：
    （ａ）前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びプロービングオリゴヌクレオチド（ＰＯ）とハイブリダイズさせる段階であって、
    前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、
    前記ＰＯは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、
    前記ＰＯは、単一標識を有し、
    前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＯのアップストリームに位置し、
    前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素により延長され、前記延長された延長鎖が、前記ＰＯに到達したとき、前記５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素は、前記ＰＯを切断し、
    （ｂ）前記ＰＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、
    前記ＰＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて単一標識含有断片が生成され、
    （ｃ）前記固相基質上に固定化されたキャプチャリングオリゴヌクレオチド（ＣＯ）に前記段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、
    前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、
    前記単一標識含有断片は、前記ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、そして、
    （ｄ）前記固相基質上の前記単一標識からのシグナルを測定して、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成の有無を確認する段階であって、
    前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成が確認された場合、前記ターゲット核酸配列は存在せず、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成が確認されなかった場合、前記ターゲット核酸配列が存在する。
  2. 前記ＣＯでの前記ＰＯにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記ＰＯのターゲッティング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記ＰＯは、その３’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む３’−タギングＰＯであるか、またはその５’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む５’−タギングＰＯであり、前記ＣＯでの前記ＰＯにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記ＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 前記単一標識は、ＰＯの切断によって放出されるタギング部位含有断片上に残留されない位置に位置することを特徴とする請求項３に記載の方法。
  5. 前記ＰＯは、その３’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む３’−タギングＰＯであるか、またはその５’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む５’−タギングＰＯであり、前記ＣＯでの前記ＰＯにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記ＰＯのタギング部位の一部、及び前記ＰＯのターゲッティング部位の一部にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  6. 前記ＰＯ及び／またはＣＯは、その３’−末端がブロッキングされて延長が防止されたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  7. 前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＯのターゲッティング部位と部分的に重なる配列を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  8. 前記５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡ重合酵素であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  9. 前記方法は、反復サイクルの間に変性過程を含み、前記段階（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｃ）、または（ａ）−（ｄ）を繰り返す段階をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  10. 前記段階（ａ）−（ｄ）は、１つの反応容器または個別反応容器で実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  11. 前記ターゲット核酸配列は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  12. 前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  13. 前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施することを特徴とする請求項１ないし請求項１２のうち何れか一項に記載の方法。
  14. 次の段階を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法：
    （ａ）前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びプロービングオリゴヌクレオチド（ＰＯ）とハイブリダイズさせる段階であって、
    前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、
    前記ＰＯは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、
    前記ＰＯは、供与体分子及び受容体分子を含む相互作用的二重標識を有し、
    前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＯのアップストリームに位置し、
    前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素により延長され、前記延長された延長鎖が、前記ＰＯに到達したとき、前記５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素は、前記ＰＯを切断し、
    （ｂ）前記ＰＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、
    前記ＰＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて、前記相互作用的二重標識が分離され、これにより、供与体含有断片及び受容体含有断片が生成され、
    （ｃ）前記固相基質上に固定化されたキャプチャリングオリゴヌクレオチド（ＣＯ）に前記段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、
    前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、
    前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも１つは、前記ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、
    前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体からのシグナルは、前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも１つが、前記ＣＯにハイブリダイズされない場合に提供されるシグナルと区別され、そして、
    （ｄ）前記固相基質上の前記相互作用的二重標識からのシグナルを測定して、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成の有無を確認する段階であって、
    前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成が確認された場合、前記ターゲット核酸配列は存在せず、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成が確認されなかった場合、前記ターゲット核酸配列が存在する。
  15. 前記ＣＯでの前記ＰＯにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記ＰＯのターゲッティング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記相互作用的二重標識は、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される場合に、前記供与体分子からのシグナルが、前記受容体分子によってクエンチングされる位置に位置し、前記受容体分子からのシグナルを検出して、前記段階（ｄ）を実施することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
  16. 前記ＰＯは、その３’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む３’−タギングＰＯであるか、またはその５’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む５’−タギングＰＯであり、前記ＣＯでの前記ＰＯにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記ＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記相互作用的二重標識は、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される場合に、前記供与体分子からのシグナルが、前記受容体分子によってクエンチングされる位置に位置し、前記受容体分子からのシグナルを検出して、前記段階（ｄ）を実施することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
  17. 前記ＣＯでの前記ＰＯにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記ＰＯのターゲッティング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記供与体含有断片が、前記ＣＯにハイブリダイズされない条件下で、前記段階（ｃ）の前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、前記相互作用的二重標識は、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される場合に、前記供与体分子からのシグナルが、前記受容体分子によってクエンチングされない位置に位置し、前記供与体分子からのシグナルを検出して、前記段階（ｄ）を実施することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
  18. 前記ＰＯは、その３’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む３’−タギングＰＯであるか、またはその５’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む５’−タギングＰＯであり、前記ＣＯでの前記ＰＯにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記ＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記供与体含有断片が、前記ＣＯにハイブリダイズ可能な前記タギング部位を含み、前記段階（ｃ）の前記ハイブリダイゼーション反応で前記供与体含有断片が、前記ＣＯにハイブリダイズされ、前記相互作用的二重標識は、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される場合に、前記供与体分子からのシグナルが、前記受容体分子によってクエンチングされる位置に位置し、前記供与体分子からのシグナルを検出して、前記段階（ｄ）を実施することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
  19. 前記ＰＯは、その３’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む３’−タギングＰＯであるか、またはその５’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む５’−タギングＰＯであり、前記ＣＯでの前記ＰＯにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記ＰＯのタギング部位の一部、及び前記ＰＯのターゲッティング部位の一部にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
  20. 前記方法は、反復サイクルの間に変性過程を含み、前記段階（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｃ）、または（ａ）−（ｄ）を繰り返す段階をさらに含むことを特徴とする請求項１４に記載の方法。
  21. 前記段階（ａ）−（ｄ）は、１つの反応容器または個別反応容器で実施することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
  22. 前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施することを特徴とする請求項１４ないし請求項２１のうち何れか一項に記載の方法。
  23. 次の段階を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法：
    （ａ）前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びプロービングオリゴヌクレオチド（ＰＯ）とハイブリダイズさせる段階であって、
    前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、
    前記ＰＯは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、
    前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＯのアップストリームに位置し、
    前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素により延長され、前記延長された延長鎖が、前記ＰＯに到達したとき、前記５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素は、前記ＰＯを切断し、
    （ｂ）前記ＰＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、
    前記ＰＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて切断断片が生成され、
    （ｃ）インターカレーティング剤の存在下で、前記固相基質上に固定化されたキャプチャリングオリゴヌクレオチド（ＣＯ）に前記段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、
    前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、
    前記切断断片は、前記ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、そして、
    （ｄ）前記固相基質上の前記インターカレーティング剤からのシグナルを測定して、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成の有無を確認する段階であって、
    前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成が確認された場合、前記ターゲット核酸配列は存在せず、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成が確認されなかった場合、前記ターゲット核酸配列が存在する。
  24. 前記ＣＯでの前記ＰＯにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記ＰＯのターゲッティング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
  25. 前記方法は、反復サイクルの間に変性過程を含み、前記段階（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｃ）、または（ａ）−（ｄ）を繰り返す段階をさらに含むことを特徴とする請求項２３に記載の方法。
  26. 前記段階（ａ）−（ｄ）は、１つの反応容器または個別反応容器で実施することを特徴とする請求項２３に記載の方法。
  27. 前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施することを特徴とする請求項２３ないし請求項２６のうち何れか一項に記載の方法。
  28. 次の段階を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法：
    （ａ）前記ターゲット核酸配列をプロービングオリゴヌクレオチド（ＰＯ）とハイブリダイズさせる段階であって、
    前記ＰＯは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、
    前記ＰＯは、単一標識を有し、
    （ｂ）前記ＰＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、
    前記ＰＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて単一標識含有断片が生成され、
    前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、ＤＮＡ重合酵素であり、
    （ｃ）前記固相基質上に固定化されたキャプチャリングオリゴヌクレオチド（ＣＯ）に前記段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、
    前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、
    前記単一標識含有断片は、前記ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、そして、
    （ｄ）前記固相基質上の前記単一標識からのシグナルを測定して、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成の有無を確認する段階であって、
    前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成が確認された場合、前記ターゲット核酸配列は存在せず、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成が確認されなかった場合、前記ターゲット核酸配列が存在する。
  29. 次の段階を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法：
    （ａ）前記ターゲット核酸配列をプロービングオリゴヌクレオチド（ＰＯ）とハイブリダイズさせる段階であって、
    前記ＰＯは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、
    前記ＰＯは、供与体分子及び受容体分子を含む相互作用的二重標識を有し、
    （ｂ）前記ＰＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、
    前記ＰＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて、前記相互作用的二重標識が分離され、これにより、供与体含有断片及び受容体含有断片が生成され、
    前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、ＤＮＡ重合酵素であり、
    （ｃ）前記固相基質上に固定化されたキャプチャリングオリゴヌクレオチド（ＣＯ）に前記段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、
    前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、
    前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも１つは、前記ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、
    前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体からのシグナルは、前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも１つが、前記ＣＯにハイブリダイズされない場合に提供されるシグナルと区別され、そして、
    （ｄ）前記固相基質上の前記相互作用的二重標識からのシグナルを測定して、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成の有無を確認する段階であって、
    前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成が確認された場合、前記ターゲット核酸配列は存在せず、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成が確認されなかった場合、前記ターゲット核酸配列が存在する。
  30. 次の段階を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法：
    （ａ）前記ターゲット核酸配列をプロービングオリゴヌクレオチド（ＰＯ）とハイブリダイズさせる段階であって、
    前記ＰＯは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、
    （ｂ）前記ＰＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、
    前記ＰＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記ＰＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて切断断片が生成され、
    前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、ＤＮＡ重合酵素であり、
    （ｃ）インターカレーティング剤の存在下で、前記固相基質上に固定化されたキャプチャリングオリゴヌクレオチド（ＣＯ）に前記段階（ｂ）の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、
    前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、
    前記切断断片は、前記ＣＯにハイブリダイズされず、非切断ＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、そして、
    （ｄ）前記固相基質上の前記インターカレーティング剤からのシグナルを測定して、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成の有無を確認する段階であって、
    前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成が確認された場合、前記ターゲット核酸配列は存在せず、前記非切断ＰＯ／ＣＯ二量体の形成が確認されなかった場合、前記ターゲット核酸配列が存在する。
  31. 請求項１、１４、及び２３のいずれかに記載の方法の実施における使用のためのキットであって、
    次を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキット：
    （ａ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含むプロービングオリゴヌクレオチド（ＰＯ）；
    （ｂ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアップストリームオリゴヌクレオチド；
    前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＯのアップストリームに位置し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素により延長され、前記延長された延長鎖が、前記ＰＯに到達したとき、前記５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素は、前記ＰＯを切断し、及び、
    （ｃ）前記固相基質上に固定化されたキャプチャリングオリゴヌクレオチド（ＣＯ）；
    前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、これにより、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって非切断されたＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成される。
  32. 前記ＰＯは、単一標識または相互作用的二重標識を有することを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  33. 前記ＰＯは、その３’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む３’−タギングＰＯであるか、またはその５’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む５’−タギングＰＯであり、前記ＣＯでの前記ＰＯにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記ＰＯのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  34. 前記ＰＯは、その３’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む３’−タギングＰＯであるか、またはその５’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む５’−タギングＰＯであり、前記ＣＯでの前記ＰＯにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記ＰＯのタギング部位の一部、及び前記ＰＯのターゲッティング部位の一部にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  35. 前記キットは、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素をさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  36. 前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＯのターゲッティング部位と部分的に重なる配列を有することを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  37. 前記キットは、インターカレーティング剤をさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  38. 前記キットは、少なくとも２種のターゲット核酸配列の検出に利用され、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のアップストリームオリゴヌクレオチドを含み、前記ＰＯは、少なくとも２種のＰＯを含み、前記ＣＯは、少なくとも２種のＣＯを含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  39. 前記キットは、ダウンストリームプライマーをさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  40. 請求項２８から３０のいずれかに記載の方法の実施における使用のためのキットであって、
    次を含み、固相基質上におけるＰＯＣＨ（ＰＯ切断及びハイブリダイゼーション）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキット：
    （ａ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含むプロービングオリゴヌクレオチド（ＰＯ）；及び、
    （ｂ）前記固相基質上に固定化されたキャプチャリングオリゴヌクレオチド（ＣＯ）；
    前記ＣＯは、前記ＰＯにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、これにより、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって非切断されたＰＯは、前記ＣＯにハイブリダイズされて、非切断ＰＯ／ＣＯ二量体が形成され、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、ＤＮＡ重合酵素である。
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