RU2013152434A - Определение целевых нуклеиновокислотных последовательностей путем расщепления зондирующего олигонуклеотида и гибридизации - Google Patents

Определение целевых нуклеиновокислотных последовательностей путем расщепления зондирующего олигонуклеотида и гибридизации Download PDF

Info

Publication number
RU2013152434A
RU2013152434A RU2013152434/10A RU2013152434A RU2013152434A RU 2013152434 A RU2013152434 A RU 2013152434A RU 2013152434/10 A RU2013152434/10 A RU 2013152434/10A RU 2013152434 A RU2013152434 A RU 2013152434A RU 2013152434 A RU2013152434 A RU 2013152434A
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
nucleic acid
target nucleic
hybridization
nucleotide sequence
acid sequence
Prior art date
Application number
RU2013152434/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2588457C2 (ru
Inventor
Джон Йоон ЧУН
Янг Джо ЛИ
Original Assignee
Сиджен, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сиджен, Инк. filed Critical Сиджен, Инк.
Publication of RU2013152434A publication Critical patent/RU2013152434A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2588457C2 publication Critical patent/RU2588457C2/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/50—Detection characterised by immobilisation to a surface

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

1. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет одиночную метку; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РО; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью;(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5-нуклеазной активностью, с получением содержащего одиночную метку фрагмента;(с) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях,

Claims (46)

1. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет одиночную метку; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РО; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5-нуклеазной активностью, с получением содержащего одиночную метку фрагмента;
(с) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что содержащий одиночную метку фрагмент не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от одиночной метки на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
2. Способ по п. 1, где нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком РО.
3. Способ по п. 1, где РО представляет собой 3'-тегированный РО,
дополнительно содержащий в своей 3'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком РО.
4. Способ по п. 3, где одиночная метка располагается таким образом, что она не остается на содержащем тегирующий участок фрагменте, который высвобождается в результате расщепления РО.
5. Способ по п. 1, где РО представляет собой 3'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с частью тегирующего участка и частью узнающего мишень участка РО.
6. Способ по п. 1, где РО и/или СО блокирован по своему 3'-концу, чтобы не допустить его удлинения.
7. Способ по п. 1, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд.
8. Способ по п. 1, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид имеет частично перекрывающуюся последовательность с узнающим мишень участком РО.
9. Способ по п. 1, где фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN.
10. Способ по п. 1, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер, а фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, представляет собой матричную полимеразу нуклеиновых кислот, обладающую 5'-нуклеазной
активностью.
11. Способ по п. 1, дополнительно включающий повторение стадий (а)-(b), (а)-(с) или (а)-(d) с денатурацией между повторяющимися циклами.
12. Способ по п. 1, где стадии (а)-(d) осуществляют в реакционном сосуде или в отдельных реакционных сосудах.
13. Способ по п. 1, где нуклеиновокислотная последовательность-мишень, содержит по меньшей мере два типа нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней.
14. Способ по п. 1, где нуклеиновокислотная последовательность-мишень содержит нуклеотидную вариацию.
15. Способ по любому из п.п. 1-14, который осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера.
16. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую донорную молекулу и акцепторную молекулу; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РО; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, с разделением системы двух взаимодействующих меток, в результате чего образуются содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент;
(с) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; при этом сигнал от дуплекса нерасщепленный РО/СО отличается от сигнала, поступающего тогда, когда по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от системы двух взаимодействующих меток на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
17. Способ по п. 16, где нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком РО, и система двух взаимодействующих меток локализована таким образом, что сигнал от донорной молекулы гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО, при этом при проведении стадии (d) осуществляют детекцию сигнала от акцепторной молекулы.
18. Способ по п. 16, где РО представляет собой 3'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком РО, и система двух взаимодействующих меток локализована таким образом, что сигнал от донорной молекулы гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО, при этом при проведении стадии (d) осуществляют детекцию сигнала от акцепторной молекулы.
19. Способ по п. 16, где нуклеотидная последовательность в СО,
способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком РО, и реакцию гибридизации на стадии (с) проводят в таких условиях, что фрагмент, содержащий донорную молекулу, не гибридизуется с СО; при этом система двух взаимодействующих меток локализована таким образом, что сигнал от донорной молекулы не гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО, и при проведении стадии (d) осуществляют детекцию сигнала от донорной молекулы.
20. Способ по п. 16, где РО представляет собой 3'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком РО; содержащий донорную молекулу фрагмент содержит тегирующий участок, способный к гибридизации с СО, и в реакции гибридизации на стадии (с) фрагмент, содержащий донорную молекулу, гибридизуется с СО; при этом система двух взаимодействующих меток локализована таким образом, что сигнал от донорной молекулы гасится акцепторной молекулой при образовании дуплекса нерасщепленный РО/СО, при этом при проведении стадии (d) осуществляют детекцию сигнала от донорной молекулы.
21. Способ по п. 16, где РО представляет собой 3'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с частью тегирующего участка или частью узнающего мишень участка РО.
22. Способ по п. 16, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер,
и на стадии (b) для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера используют матричную полимеразу нуклеиновых кислот.
23. Способ по п. 16, дополнительно включающий повторение стадий (а)-(b), (а)-(с) или (а)-(d) с денатурацией между повторяющимися циклами.
24. Способ по п. 16, где стадии (а)-(d) осуществляют в реакционном сосуде или в отдельных реакционных сосудах.
25. Способ по любому из п.п. 16-24, который осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера.
26. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РО; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью с получением отщепленного фрагмента;
(с) осуществление реакции гибридизации в присутствии интеркалируюшего агента путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что отщепленный фрагмент не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от интеркалирующего агента на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
27. Способ по п. 26, где нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с узнающим мишень участком РО.
28. Способ по п. 26, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер, и на стадии (b) для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера используют матричную полимеразу нуклеиновых кислот.
29. Способ по п. 26, дополнительно включающий повторение стадий (а)-(b), (а)-(с) или (а)-(d) с денатурацией между повторяющимися циклами.
30. Способ по п. 26, где стадии (а)-(d) осуществляют в реакционном сосуде или в отдельных реакционных сосудах.
31. Способ по любому из п.п. 26-30, который осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера.
32. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет одиночную метку;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, с получением содержащего одиночную метку фрагмента;
(с) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что содержащий одиночную метку фрагмент не гибридизуется
с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от одиночной метки на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
33. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую донорную молекулу и акцепторную молекулу;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, с разделением системы двух взаимодействующих меток, в результате чего образуются содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент; (с) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; при этом сигнал от дуплекса нерасщепленный РО/СО отличается от сигнала, поступающего тогда, когда по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от системы двух взаимодействующих меток на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
34. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью с получением отщепленного фрагмента;
(с) осуществление реакции гибридизации в присутствии интеркалируюшего агента путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что отщепленный фрагмент не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от интеркалирующего агента на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
35. Набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО), на твердой подложке, содержащий:
(а) зондирующий олигонуклеотид (РО), содержащий узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;
(b) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РО; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или
его удлиненная цепь индуцирует расщепление РО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, и
(с) захватывающий олигонуклеотид (СО), иммобилизованный на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО, в результате чего РО, не расщепленный под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО.
36. Набор по п. 35, где РО имеет одиночную метку или систему двух взаимодействующих меток.
37. Набор по п. 35, где РО представляет собой 3'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с тегирующим участком РО.
38. Набор по п. 35, где РО представляет собой 3'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 3'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, или 5'-тегированный РО, дополнительно содержащий в своей 5'-концевой части тегирующий участок, имеющий нуклеотидную последовательность, некомплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и нуклеотидная последовательность в СО, способная к гибридизации с РО, содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с частью тегирующего участка и частью узнающего мишень участка РО.
39. Набор по п. 35, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд.
40. Набор по п. 35, дополнительно содержащий фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью.
41. Набор по п. 35, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид имеет частично перекрывающуюся последовательность с узнающим мишень участком РО.
42. Набор по п. 40, где фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN.
43. Набор по п. 35, дополнительно содержащий интеркалирующий агент.
44. Набор по п. 35, где указанный набор используют для детекции по меньшей мере двух типов нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней, причем располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит по меньшей мере два типа располагающихся "вверх по течению" олигонуклеотидов, РО содержит по меньшей мере два типа РО, и СО содержит по меньшей мере два типа СО.
45. Набор по п. 35, где указанный набор дополнительно содержит располагающийся "вниз по течению" праймер.
46. Набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО), на твердой подложке, содержащий:
(а) зондирующий олигонуклеотид (РО), содержащий узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; и
(b) захватывающий олигонуклеотид (СО), иммобилизованный на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО, в результате чего РО, не расщепленный под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО.
RU2013152434/10A 2011-05-04 2012-05-03 Определение целевых нуклеиновокислотных последовательностей путем расщепления зондирующего олигонуклеотида и гибридизации RU2588457C2 (ru)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2011-0042332 2011-05-04
KR20110042332 2011-05-04
KR20110068888 2011-07-12
KR10-2011-0068888 2011-07-12
KRPCT/KR2011/009317 2011-12-02
PCT/KR2011/009317 WO2012150749A1 (en) 2011-05-04 2011-12-02 Detection of target nucleic acid sequences by po cleavage and hybridization
PCT/KR2012/003497 WO2012150835A2 (en) 2011-05-04 2012-05-03 Detection of target nucleic acid sequences by po cleavage and hybridization

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016104218A Division RU2016104218A (ru) 2011-05-04 2012-05-03 Определение целевых нуклеиновокислотных последовательностей путем расщепления зондирующего олигонуклеотида и гибридизации

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2013152434A true RU2013152434A (ru) 2015-06-10
RU2588457C2 RU2588457C2 (ru) 2016-06-27

Family

ID=

Also Published As

Publication number Publication date
JP5993939B2 (ja) 2016-09-21
CN103620056B (zh) 2016-06-01
JP2016195603A (ja) 2016-11-24
RU2016104218A3 (ru) 2018-11-22
MX2013012901A (es) 2014-07-28
CA2834030C (en) 2017-03-28
ES2657906T3 (es) 2018-03-07
KR101622780B1 (ko) 2016-05-19
BR112013027876B1 (pt) 2021-06-08
RU2016104218A (ru) 2018-11-22
CA2834030A1 (en) 2012-11-08
JP2014515616A (ja) 2014-07-03
BR112013027876A2 (pt) 2016-11-29
CN103620056A (zh) 2014-03-05
KR20130137703A (ko) 2013-12-17
WO2012150749A1 (en) 2012-11-08
AU2012251222A1 (en) 2013-11-14
EP2705163A4 (en) 2014-12-31
IL229132A0 (en) 2013-12-31
JP6529934B2 (ja) 2019-06-12
WO2012150835A3 (en) 2013-03-21
IL229132B (en) 2018-03-29
EP2705163B1 (en) 2017-11-01
EP2705163A2 (en) 2014-03-12
NO2705163T3 (ru) 2018-03-31
MX342067B (es) 2016-09-09
AU2012251222B2 (en) 2016-02-11
WO2012150835A2 (en) 2012-11-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2014133695A (ru) Детекция нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с гибридизацией сигнального олигонуклеотида, зависящей от расщепления и удлинения зондирующего и метящего олигонуклеотида
RU2012142160A (ru) Детекция нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней в анализе с расщеплением и удлинением рто
RU2015130335A (ru) Детекция нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения зондирующего и метящего олигонуклеотида (рто)
JP6633514B2 (ja) 標的核酸の多重化分析
AU2012251027B2 (en) Quantitative nuclease protection Assay (qNPA) and sequencing (qNPS) improvements
RU2542478C2 (ru) Дискриминирующий мишень зонд, способ его конструирования и способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени (варианты)
RU2016104218A (ru) Определение целевых нуклеиновокислотных последовательностей путем расщепления зондирующего олигонуклеотида и гибридизации
US11371082B2 (en) Cleavable hairpin primers
RU2014138951A (ru) Детекция нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с расщеплением и удлинением зондирующего и метящего олигонуклеотида (рто)
RU2012129362A (ru) Обнаружение мишени tsg праймером
CA2766351A1 (en) Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same
JP2013509871A5 (ru)
KR20130094324A (ko) 이중-표지 고정화 프로브를 이용한 고상에서의 타겟 핵산서열 검출
KR20140066782A (ko) 가수분해 프로브
US20210403990A1 (en) Digital amplification for protein detection
CA3140512A1 (en) Array and method for detecting spatial information of nucleic acids
EP2619317B1 (en) Detection of target nucleic acid sequences by exonucleolytic activity using single-labeled immobilized probes on solid phase
ES2575538T3 (es) Ensayo para Trichomonas vaginalis mediante amplificación y detección del gen AP65-1 de Trichomonas vaginalis
CN115948604A (zh) 一种基于DNAzyme与PER扩增的病毒检测试剂盒
US20120100526A1 (en) Identification and differentiation of nucleic acid sequence using temperature-dependent hybridization
RU2016117929A (ru) Мультиплексные зонды
JP2020533974A5 (ru)
CN105705657B (zh) 基于利用杂交-捕捉和模板化寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割及延伸分析的在固相中的靶核酸序列检测
WO2009133473A2 (en) Isothermal detection methods and uses thereof
JP5378724B2 (ja) 発現ｍＲＮＡ識別方法