MX2013012901A - Deteccion de secuencias de acido nucleico objetivo por desdoblamiento e hibridizacion de oligonucleotido de sonda. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la detección de una secuencia de ácido nucleico objetivo por un ensayo de POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido. La presente invención detecta la secuencia de ácido nucleico objetivo por el uso en el cual el PO (Oiigonucleótido de Sonda) hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo es desdoblado y el desdoblamiento del PO se detecta por hibridización con el CO (Oligonucleótido de Captura). En la presente invención, un PO no desdoblado es hibridizado con el CO inmovilizado sobre el sustrato sólido. Los diseños del PO y el CO son convenientes y la optimización de las condiciones de reacción es rutinariamente fácil en la presente invención. Donde la detección de la señal en el sustrato sólido es continuamente realizada junto con la repetición de desdoblamiento de POs en la presente invención, el número de los POs desdoblados se incrementa con base en el número de repetición de la reacción de desdoblamiento y la señal es cambiada en paralelo con el número de los POs desdoblados. Entonces, la secuencia de ácido nucleico objetivo puede ser detectada en una manera en tiempo real. Por el contrario, el cambio de la señal no se observa en la ausencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Description

DETECCIÓN DE SECUENCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO OBJETIVO POR DESDOBLAMIENTO E HIBRIDIZACION DE OLIGONUCLEÓTIDO DE SONDA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la detección de una secuencia de ácido nucleico objetivo por un ensayo de POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las tecnologías a base de hibridización de ADH podrían ser una herramienta muy útil en la determinación específica de la secuencia de ácido nucleico y claramente ser valiosa en diagnósticos clínicos, investigación genética, y análisis de laboratorio forense. Además de los procesos de hibridización de sonda, varios procedimientos usando reacciones enzimáticas adicionales, por ejemplo, método de sonda TaqMan™, han sido sugeridos.

En el método de sonda TaqMan™, la sonda etiquetada hibridizada con secuencias de ácido nucleico objetivo es desdoblada por una actividad de nucleasa al 5' de una polimerasa de ADN dependiente del cebador corriente arriba y se libera un fragmento etiquetado (Patentes Estadounidenses Nos. 5,210,015, 5,538,848 y 6,326,145). La liberación del fragmento etiquetado indica desdoblamiento de la sonda, indicando finalmente la presencia de secuencias objetivo. La detección del fragmento etiquetado puede ser realizada por análisis de tamaño tal como electroforesis de gel, sedimentación en gradientes, cromatografía de exclusión en gel, y homocromatografía . El desdoblamiento de sondas se puede llevar a cabo en una manera en tiempo real por el uso de etiquetas duales interactivas.

El método de sonda TaqMan™ sugiere dos procedimientos para generación de señal: desdoblamiento dependiente de la polimerización y desdoblamiento independiente de la polimerización. En el desdoblamiento dependiente de la polimerización, la extensión del cebador corriente arriba debe ocurrir antes de que una polimerasa de ácido nucleico encuentre el extremo-5' de la sonda etiquetada. Como la reacción de extensión continua, la polimerasa progresivamente desdobla el extremo-5' de la sonda etiquetada. En el desdoblamiento independiente de la polimerización, el cebador corriente arriba y la sonda etiquetada son hibridizados con un ácido nucleico objetivo en proximidad cercana de manera que tal enlace de la polimerasa del ácido nucleico al extremo-3' del cebador corriente arriba se pone en contacto con el extremo-5' de la sonda etiquetada para liberar la etiqueta. Además, el método de sonda TaqMan™ describe que la sonda etiquetada en su extremo-5' que tiene una región de cola-5' no hibridizable con secuencias objetivo es también desdoblada para formar un fragmento que comprende la región de cola-5' .

Se han reportado algunos métodos en los cuales las sondas que tienen una región de cola-5' no complementaria a la secuencias objetivo son desdobladas por la nucleasa del 5' para liberar un fragmento que comprende la región de cola-5' y la detección objetivo se realiza usando el fragmento que comprende la región de cola-5' .

Por ejemplo, La Patente Estadounidense No. 5,691,142 describe una estructura de desdoblamiento para ser digerida por actividad de nucleasa al 5' de polimerasa de D . La estructura de desdoblamiento es ejemplificada en la cual un oligonucleótido que comprende una porción al 5' no complementaria, y una porción al 3' complementaria a una plantilla es hibridizada con la plantilla y un oligonucleótido corriente arriba es hibridizado con la plantilla en proximidad cercana. La estructura de desdoblamiento es desdoblada por polimerasa de ADN que tiene actividad de nucleasa al 5' o polimerasa de ADN modificada con actividad sintética reducida para liberar la porción al 5' no complementaria con la plantilla. La porción al 5' liberada es entonces hibridizada con un oligonucleótido que tiene una estructura de hairpina para formar una estructura de desdoblamiento, de este modo induciendo reacciones de desdoblamiento progresivo para detectar secuencias objetivo.

La Patente Estadounidense No. 7,381,532 describe un proceso en el cual la estructura de desdoblamiento que tiene el oligonucleótido corriente arriba con el extremo-3' bloqueado es desdoblada por polimerasa de ADN que tiene actividad de nucleasa al 5' o nucleasa FEN para liberar la región traslapada al 5' complementaria y la región traslapada al 5' liberada es detectada por análisis de tamaño o etiqueta dual interactiva.

La Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 2008-0241838 describe un método de detección de objetivo usando desdoblamiento de sondas de etiqueta única que tienen porción al 5' no complementaria al objetivo y sondas de captura inmovilizadas en sustratos sólidos. Una etiqueta única es posicionada en la porción al 5' no complementaria de la sonda etiquetada. Las sondas etiquetadas hibridizadas con objetivo son desdobladas para liberar fragmentos, después de lo cual los fragmentos son entonces hibridizados con las sondas de captura para detectar la presencia de la secuencia objetivo. En este método, es necesario que una sonda intacta/no desdoblada no se someta a hibridación con la sonda de captura. Para esta realización, el método previene a la sonda objetivo no desdoblada, de hibridizarse con la sonda de captura inmovilizada controlando la orientación de inmovilización del oligonucleótido inmovilizado y su distancia de la superficie de un sustrato sólido. Sin embargo, tal limitación resulta en eficiencia inferior de hibridización en un sustrato sólido y dificultades en la optimización de las condiciones de reacción .

La Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense 2008-0193940 también describe un método de detección de objetivo usando sondas que tienen secuencia no complementaria (secuencia traslapada o etiqueta) al objetivo asi como también sondas de captura inmovilizadas en sustratos sólidos. Una etiqueta es también posicionada en la región no complementaria de las sonadas. Sondas no digeridas forman estructura de hairpina y no son hibridizadas con sondas de captura. Por el contrario, donde las sondas son digeridas, los fragmentos que contienen etiqueta son entonces hibridizados con sondas de captura, de este modo detectando la presencia de secuencias de ácido nucleico objetivo. Sin embargo, tiene serios problemas en los cuales las condiciones de reacción tienen que ser elaboradamente controladas considerando el valor Tm de hibridización entre las secuencias objetivo y sondas, y también considerando el valor de Tm de la estructura hairpina de las sondas no digeridas asi como también el valor Tm de la hibridización entre los fragmentos digeridos y las sondas de captura.

Por lo tanto, permanece un largo sentir en la técnica para desarrollar nuevos procedimientos para detección de una secuencia objetivo en una fase sólida, particularmente estando libres de desventajas de tecnologías convencionales que usan sondas que llevan secuencias de etiqueta y sondas de captura inmovilizadas en sustratos sólidos.

A través de esta solicitud, varias patentes y publicaciones son referenciadas y se proporcionan citaciones en paréntesis. La descripción de estas patentes y publicaciones en sus totalidades está de este modo incorporada para referencias en esta solicitud con el fin de describir más completamente esta invención y el estado de la técnica a la cual pertenece esta invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han hecho búsquedas intensivas para desarrollar nuevos procedimientos para detectar secuencias objetivos con exactitud y conveniencia más mejorada, entre otros, en una manera múltiple. Como un resultado, se han establecido nuevos protocolos para detección de secuencias objetivo usando un oligonucleótido de sonda (PO) y un oligonucleótido de captura (CO) , en los cuales la detección objetivo es realizada por reacción de desdoblamiento de sonda e hibridización de sonda adicional (es decir, reacción nucleolítica al 5' de la reacción de hibridización y PO entre el PO y CO desdoblado/no desdoblado) . Los presentes protocolos con especificidad objetivo dramáticamente mejorada son bien adoptados para reacciones de fase sólida, y aseguran detección múltiple de secuencias objetivo con exactitud y conveniencia más mej orada .

Por lo tanto, es un objeto de esta invención proporcionar un método para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido.

Es otro objeto de esta invención proporcionar un kit para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo de POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido.

Otros objetivos y ventajas de la presente invención llegarán a ser aparentes a partir de la descripción detallada que sigue tomada en conjunto con las reivindicaciones , y dibujos adjuntos.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra las estructuras esquemáticas de PO (Oligonucleótido de Sonda) y CO (Oligonucleótido de Captura) usadas en un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) . El PO incluye un PO no objetivo y un PO objetivo que es entonces clasificado en un PO de extremo-3' y un PO de extremo-5' . Preferiblemente, el extremo-3' del PO es bloqueado para prohibir su extensión (Fig. 1A) . El CO comprende una secuencia de nucleotido hibridizable con el PO. El CO es inmovilizado en el sustrato sólido vía su extermo-3' o extremo-5' . Preferiblemente, el extremo-3' del CO inmovilizado vía el extremo-5' es bloqueado para prohibir su extensión (Fig. IB).

La Figura 2 representa esquemáticamente el ensayo POCH usando un PO no objetivo que tiene una etiqueta fluorescente única en el extremo-5' de su porción objetivo.

La Figura 3 representa esquemáticamente el ensayo POCH usando un PO no objetivo que tiene una etiqueta fluorescente única en el extremo-3' de su porción objetivo.

La Figura 4 representa esquemáticamente el ensayo POCH usando un PO etiquetado al 3' que tiene una etiqueta fluorescente única en el extremo-5' de su porción objetivo.

La Figura 5 representa esquemáticamente el ensayo POCH usando un PO etiquetado al 5' que tiene una etiqueta fluorescente única en el extremo-3' de su porción objetivo.

La Figura 6 representa esquemáticamente el ensayo POCH usando un PO etiquetado al 5' que tiene una etiqueta fluorescente única en el extremo-3' de su porción objetivo y un CO que comprende además una porción de plantilla que sirve como una plantilla para extensión de la porción etiquetante hidribrizada con el CO.

La Figura 7 representa esquemáticamente el ensayo POCH usando un PO no objetivo que tiene una molécula donadora y una molécula aceptora de una etiqueta dual interactiva para medir la señal de la molécula aceptora. La molécula donadora y la molécula aceptora están localizadas en la medida en que una señal de la molécula donadora es apagada por la molécula aceptora cuando se forma el duplo PO/CO no desdoblado.

La Figura 8 representa esquemáticamente el ensayo POCH usando un PO etiquetado al 3' que tiene una molécula donadora y una molécula aceptora de una etiqueta dual interactiva para medir la señal de la molécula aceptora. La molécula donadora y la molécula aceptora están localizadas en la medida en que una señal de la molécula donadora es apagada por la molécula aceptora cuando se forma el duplo PO/CO no desdoblado .

La Figura 9 representa esquemáticamente el ensayo POCH usando un PO etiquetado al 5' que tiene una molécula donadora y una molécula aceptora de una etiqueta dual interactiva para medir la señal de la molécula aceptora. La molécula donadora y la molécula aceptora están localizadas en la medida en que una señal de la molécula donadora es apagada por la molécula aceptora cuando se forma el duplo PO/CO no desdoblado .

La Figura 10 representa esquemáticamente el ensayo POCH usando un PO no objetivo que tiene una molécula donadora y una molécula aceptora de una etiqueta dual interactiva para medir la señal de la molécula donadora. La molécula donadora y la molécula aceptora están localizadas en la medida en que una señal de la molécula donadora es no apagada por la molécula aceptora cuando se forma el duplo PO/CO no desdoblado.

La Figura 11 representa esquemáticamente el ensayo POCH usando un PO etiquetado al 3' que tiene una molécula donadora y una molécula aceptora de una etiqueta dual interactiva para medir la señal de la molécula donadora. La molécula donadora y la molécula aceptora están localizadas en la medida en que una señal de la molécula donadora es apagada por la molécula aceptora cuando se forma el duplo PO/CO no desdoblado .

La Figura 12 representa esquemáticamente el ensayo POCH usando un PO etiquetado al 5' que tiene una molécula donadora y una molécula aceptora de una etiqueta dual interactiva para medir la señal de la molécula donadora. La molécula donadora y la molécula aceptora están localizadas en la medida en que una señal de la molécula donadora es apagada por la molécula aceptora cuando se forma el duplo PO/CO no desdoblado .

La Figura 13 representa esquemáticamente el ensayo POCH usando un agente intercalante.

La Figura 14 representa los resultados de la detección de objetivo por el ensayo POCH usando un PO no objetivo con una etiqueta única.

La Figura 15 representa los resultados de la detección de objetivo por el ensayo POCH usando un PO etiquetado al 3' con una etiqueta única.

La Figura 16 representa los resultados de la detección de objetivo por el ensayo POCH usando un PO etiquetado al 5' con una etiqueta única.

La Figura 17 representa los resultados de la detección de objetivo por el ensayo POCH usando un PO etiquetado al 3' con una etiqueta dual.

La Figura 18 representa los resultados de la detección de objetivo por el ensayo POCH con amplificación por PCR. El PO es un PO no objetivo con una etiqueta única.

La Figura 19 representa los resultados de la detección de objetivo por el ensayo POCH con amplificación por PCR. El PO es un PO etiquetado al 3' con una etiqueta única .

La Figura 20 representa los resultados de detección en tiempo real de secuencias · de ácido nucleico objetivo por el ensayo POCH usando un PO etiquetado al 3' con una etiqueta única. La Figura 20A muestra imágenes fluorescentes dependiendo del número de ciclos durante el ensayo POCH y la Figura 20B muestra el cambio de intensidad de fluorescencia dependiendo del número de ciclos durante el ensayo POCH.

La Figura 21 representa esquemáticamente el ensayo POCH usando un PO etiquetado al 5' para detectar una variación de nucleótido único.

La Figura 22 representa esquemáticamente el ensayo POCH- usando un PO etiquetado al 5' que tiene un nucleótido desapareado artificial como porción de apareamiento no base para detectar una variación de nucleótido único.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han hecho búsquedas intensivas para desarrollar nuevos procedimientos para detectar secuencias objetivos con exactitud y conveniencia más mejorada, entre otros, en una manera múltiple. Como un resultado, se han establecido nuevos protocolos para detección de secuencias objetivo usando un oligonucleótido de sonda (PO) y un oligonucleótido de captura (CO) , en los cuales la detección objetivo es realizada por reacción de desdoblamiento de sonda e hibridización de sonda adicional (es decir, reacción nucleolitica al 5' de la reacción de hibridización y PO entre el PO y CO desdoblado/no desdoblado) . Los presentes protocolos con especificidad objetivo dramáticamente mejorada son bien adoptados para reacciones de fase sólida, y aseguran detección múltiple de secuencias objetivo con exactitud y conveniencia más mej orada .

La presente invención es un nuevo protocolo para detectar secuencias objetivo en un sustrato sólido utilizando una combinación de PO y CO.

El principio fundamental de la presente invención es detectar la incidencia de desdoblamiento del PO usando el CO inmovilizado en un sustrato sólido. Además, es digno mencionar que donde una secuencia objetivo en una muestra está ausente, un PO no desdoblado es hibridizado con el CO inmovilizado en un sustrato sólido. De conformidad con la presente invención, una señal final a ser medida es diferente dependiendo de su un duplo PO/CO no desdoblado se forma o no, el cual es capaz de indicar la presencia o ausencia de la secuencia objetivo.

La presente invención detecta una secuencia objetivo de conformidad con el principio de realización descrito anteriormente, y es clasificada en tres modalidades dependiendo de los sistemas de etiqueta adoptados.

La presente invención será descrita en la presente abajo en más detalle: I. Proceso de Detección de Objetivo por POCH usando Etiqueta Única En un aspecto de la presente invención, se proporciona un método para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridizacion de PO) en un sustrato sólido, que comprende: (a) hibridizar la secuencia de ácido nucleico objetivo con un oligonucleótido corriente arriba y un oligonucleótido de sonda (PO) ; en donde el oligonucleótido corriente arriba comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO tiene una etiqueta única; el oligonucleótido corriente arriba está localizado corriente arriba del PO; el oligonucleótido corriente arriba o su hebra extendida induce desdoblamiento del PO por una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' ; (b) poner en contacto el resultado de la etapa (a) con la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para desdoblamiento del PO; en donde cuando el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo, el PO es desdoblado por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' para producir un fragmento que contiene etiqueta única; (c) realizar una reacción de hibridación poniendo en contacto el resultado de la etapa (b) con un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO; en donde la reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que el fragmento que contiene etiqueta única no es hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado; y (d) detectar la incidencia del desdoblamiento del PO midiendo una señal de la etiqueta única en el sustrato sólido; de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Se ha sugerido que la presencia de una secuencia objetivo se determina por hibridización del fragmento desdoblado de una sonda objetivo con un oligonucleótido inmovilizado en un sustrato sólido (véase Publicaciones de Solicitudes de Patente Estadounidenses Nos. 2008-0241838 y 2008-0193940) . El método convencional determina la presencia o ausencia de una secuencia objetivo hibridizando solamente la sonda desdoblada con el oligonucleótido inmovilizado en un sustrato sólido. La sonda no desdoblada no está involucrada en la hibridización con el oligonucleótido inmovilizado. Para esta realización, el método convencional es requerido para prevenir a la sonda objetivo no desdoblada de hibridizar con el oligonucleótido inmovilizado diseñando la sonda objetivo con una porción etiquetante para tener una estructura de hairpina o controlando la orientación de inmovilización del oligonucleótido inmovilizado y su distancia a partir de la superficie de un sustrato sólido.

El método convencional que demanda la sonda objetivo que tiene una estructura de hairpina tiene serias desventajas en las cuales el diseño de la sonda objetivo y condiciones de reacción tienen que ser determinadas considerando ambas condiciones para hibridización entre la sonda objetivo que tiene una estructura de hairpina y la secuencia objetivo y condiciones para no hibridización entre la sonda objetivo y el oligonucleótido inmovilizado. Por lo tanto, los métodos convencionales son muy inconvenientes y no prácticos en términos de diseñar una sonda objetivo y un oligonucleótido inmovilizado y la determinación de las condiciones de reacción.

Contrario a los métodos convencionales, la presente invención emplea hibridización entre PO no desdoblado y CO inmovilizado, estando libres de desventajas asociadas con los métodos convencionales.

De conformidad con la presente invención, una señal final a ser medida indicativa de la presencia o ausencia de una secuencia objetivo es diferente dependiendo de si el fragmento desdoblado de PO es hibridizado con CO inmovilizado en un sustrato sólido o el PO no desdoblado es hibridizado con CO inmovilizado.

Por lo tanto, la presente invención es nombrada "Análisis de Desdoblamiento e Hibridización de PO (POCH)".

La presente invención será descrita en más detalle como sigue: Etapa (a) : Hibridización de un oligonucleótido corriente arriba y un PO con una secuencia de ácido nucleico objetivo .

De conformidad con la presente invención, una secuencia de ácido nucleico objetivo es primero hibridizada con un oligonucleótido corriente arriba y un PO (Oligonucleótido de Sonda) .

El término usado en la presente "ácido nucleico objetivo", "secuencia de ácido nucleico objetivo" o "secuencia objetivo" se refiere a una secuencia de ácido nucleico de interés para detección, la cual es templada a o hibridizada con una sonda o cebador bajo condiciones de hibridización, templado o amplificación.

De conformidad con una modalidad preferida, el oligonucleótido corriente arriba es un cebador corriente arriba o una sonda corriente arriba.

El PO usado en la presente invención es preferiblemente una sonda.

El término usado en la presente "sonda" se refiere a una molécula de ácido nucleico de hebra única que comprende una porción o porciones que son sustancialmente complementarias a una secuencia de ácido nucleico objetivo.

El término "cebador" como se usa en la presente se refiere a un oligonucleótido, el cual es capaz de actuar como un punto de inicio de síntesis cuando se coloca bajo condiciones en las cuales la síntesis del producto de extensión del cebador la cual es complementaria a una hebra de ácido nucleico (plantilla) se induce, es decir, en la presencia de nucleotidos y un agente para polimerización, tal como polimerasa de ADN, y a una temperatura y pH adecuado. Preferiblemente, el cebador es moléculas de desoxirribonucleótido de hebra única.

Las sondas o cebadores usados en esta invención pueden estar comprendidos de dNMP que se originan naturalmente (es decir, dAMP, dGM, dCMP y dTMP) , nucleótido modificado, o nucleótido no natural. Las sondas o cebadores también pueden incluir ribonucleótidos .

El cebador puede ser suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en la presencia del agente para polimerización. La longitud exacta de los cebadores dependerá de muchos factores, que incluyen temperatura, aplicación, y fuente de cebador. El término "templado" o "cebación" como se usa en la presente se refiere a la aposición de un oligodesoxinucleótido o ácido nucleico a un ácido nucleico de plantilla, de este modo la aposición permite a la polimerasa polimerizar nucleotidos en una molécula de ácido nucleico la cual es complementaria al ácido nucleico de plantilla o una porción del mismo.

El término "hibridizante" usado en la presente se refiere a la formación de un ácido nucleico de doble hebra de ácidos nucleicos de hebra única complementaria. La hibridización puede ocurrir entre dos hebras de ácido nucleico perfectamente apareadas o sustancialmente apareadas con algunos desapareamientos. La complementariedad para hibridización puede depender de las condiciones de hibridización, particularmente temperatura.

La hibridización de secuencias de ácido nucleico objetivo con el oligonucleótido corriente arriba y el PO se puede llevar a cabo bajo condiciones de hibridización adecuadas rutinariamente determinadas por procedimientos de optimización. Condiciones tales como temperatura, concentración de componentes, hibridización y tiempos de lavado, componentes amortiguadores, y su pH e intensidad iónica pueden ser variados dependiendo de varios factores, que incluyen la longitud y contenido GC de oligonucleótido (oligonucleótido corriente arriba y PO) y secuencias de nucleótido objetivo. Por ejemplo, cuando un oligonucleótido relativamente corto se usa, es preferible que se adopten condiciones de baja rigurosidad. Las condiciones detalladas para hibridización se pueden encontrar en Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); y M.L. . Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N. Y. (1999).

No existe distinción propuesta entre los términos "templado" e "hibridizante" , y estos términos serán usados intercambiablemente .

El oligonucleótido corriente arriba y PO tienen secuencias de nucleótido hibridizantes complementarias con la secuencia de ácido nucleico objetivo. El término "complementaria" se usa en la presente para significar que cebadores o sondas son suficientemente complementarios para hibridizar selectivamente a una secuencia de ácido nucleico objetivo bajo las condiciones de templado o condiciones rigurosas designadas, abarcando los términos "sustancialmente complementario" y "perfectamente complementario", preferiblemente perfectamente complementario.

El oligonucleótido de sonda (PO) usado en la presente significa un oligonucleótido que comprende una porción de objetivo que sirve como una sonda.

De conformidad con una modalidad preferida, el PO incluye un PO no objetivo sin una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo y un PO etiquetado con una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo (Figura 1A) .

De conformidad con una modalidad preferida, el PO es un PO etiquetado al 3' que comprende además en su porción-3' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo o un PO etiquetado al 5' que comprende además en su porción-5' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo (Figura 1A) .

La porción etiquetante del PO preferiblemente tiene una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo. El término "no complementario" se usa en la presente para significar que cebadores o sondas son suficientemente no complementarios para no hibridizar selectivamente a una secuencia de ácido nucleico objetivo bajo las condiciones de templado o condiciones rigurosas designadas, abarcando los términos "sustancialmente no complementario" y "perfectamente no complementario", preferiblemente perfectamente no complementario.

Preferiblemente, el PO etiquetado se utiliza para hibridizar selectivamente con el CO a través de la porción etiquetante .

El PO no requiere cualquier longitud especifica. El PO no etiquetado puede tener cualesquiera longitudes en la medida en que es específicamente hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo, por ejemplo, su longitud puede ser 10-60 nucleótidos, 10-50 nucleótidos, 10-40 nucleótidos, 10-30 nucleótidos, 15-60 nucleótidos, 15-50 nucleótidos, 15-40 nucleótidos, 15-30 nucleótidos, 20-60 nucleótidos, 20-50 nucleótidos, 20-40 nucleótidos o 20-30 nucleótidos. El PO etiquetado puede ser 15-80 nucleótidos, 15-60 nucleótidos, 15-40 nucleótidos, 20-80 nucleótidos, 20-60 nucleótidos, 20-40 nucleótidos, 30-80 nucleótidos, 30-60 nucleótidos, o 30-40 nucleótidos en longitud. La porción de objetivo del PO puede estar en cualesquiera longitudes en la medida en que es específicamente hibridizada con las secuencias de ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, la porción de objetivo del PO puede ser 10-50 nucleótidos, 10-40 nucleótidos, 10-30 nucleótidos, 15-50 nucleótidos, 15-40 nucleótidos, 15-30 nucleótidos, 20-50 nucleótidos, 20-40 nucleótidos o 20-30 nucleótidos en longitud. La porción etiquetante del PO etiquetado puede estar en cualesquiera longitudes en la medida en que es específicamente hidribrizada con el CO. Por ejemplo, la porción etiquetante del PO puede ser 5-50 nucleótidos, 5-40 nucleótidos, 5-30 nucleótidos, 5-20 nucleótidos, 10-50 nucleótidos, 10-40 nucleótidos, 10-30 nucleótidos, 10-20 nucleótidos, 15-50 nucleótidos, 15-40 nucleótidos, 15-30 nucleótidos o 15-20 nucleótidos en longitud.

El extremo-3' del PO puede tener un 3' -OH terminal. Preferiblemente, el extremo-3' del PO es "bloqueado" para prohibir su extensión.

El bloqueo se puede lograr de conformidad con métodos convencionales. Por ejemplo, el bloqueo puede ser realizado agregando al grupo 3' -hidroxilo del último nucleótido una porción química tal como biotina, etiquetas, un grupo fosfato, grupo alquilo, enlazador no nucleótido, fosforotioato, o alcan-diol. Alternativamente, el bloqueo se puede llevar a cabo removiendo el grupo 3' -hidroxilo del último nucleótido o- usando un nucleótido sin grupo 3'-hidroxilo tal como didesoxinucleótido .

Alternativamente, el PO puede ser · diseñado para tener una estructura secundaria tal como una estructura de hairpina. Puesto que un PO no desdoblado es hibridizado con oligonucleótidos inmovilizado en un sustrato sólido en la presente invención, la estructura de hairpina tiene que ser diseñada no para prevenir el PO no desdoblado de la hibridización con CO inmovilizado. Preferiblemente, la estructura de hairpina del PO tiene un valor Tm inferior que aquel del duplo entre el PO no desdoblado y CO inmovilizado.

Entre tanto, de conformidad con el método convencional para detectar una secuencia objetivo por el uso de la reacción de desdoblamiento de una sonda objetivo que tiene una porción etiquetante e hibridización con un oligonucleótido inmovilizado en un sustrato sólido, se requiere que la sonda objetivo tenga una estructura de hairpina para prevenir a una sonda objetivo no desdoblada de hibridizarse con el oligonucleótido inmovilizado.

Donde el PO etiquetado se usa, la hibridización con la secuencia de ácido nucleico objetivo se realiza bajo condiciones rigurosas que su porción de objetivo es hibridizada con la secuencia de ácido nucleico objetivo y su porción etiquetante no es hibridizada con la secuencia de ácido nucleico objetivo. La frase, "la porción etiquetante del PO no es hibridizada con la secuencia de ácido nucleico objetivo" significa que no forma un duplo estable con la secuencia de ácido nucleico objetivo bajo ciertas condiciones rigurosas. Preferiblemente, la porción etiquetante del PO etiquetado no es hibridizada con la secuencia de ácido nucleico objetivo, formando una hebra única.

El oligonucleótido corriente arriba está localizado corriente arriba del PO cuando se hibridiza con el ácido nucleico objetivo. El oligonucleótido corriente arriba o su hebra extendida hibridizada con la secuencia de ácido nucleico objetivo induce desdoblamiento del PO hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo por una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' .

La inducción del PO desdoblamiento por el oligonucleótido corriente arriba puede ser realizada por dos formas: (i) extensión de oligonucleotido corriente arriba (es decir, inducción de desdoblamiento independiente de la polimerización; y (ii) inducción de desdoblamiento dependiente de la extensión de oligonucleotido corriente arriba.

Donde el oligonucleotido corriente arriba se posiciona adyacentemente al PO suficiente para inducir el desdoblamiento de PO por una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5', la enzima unida al oligonucleotido corriente arriba digiere el PO sin reacción de extensión. Por el contrario, donde el oligonucleotido corriente arriba se posiciona distantemente al PO, una enzima que tiene actividad de polimerasa (por ejemplo, polimerasa dependiente de la plantilla) cataliza la extensión del oligonucleotido corriente arriba (por ejemplo, cebador corriente arriba) y una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' unida al producto extendido digiere el PO.

Por lo tanto, el oligonucleotido corriente arriba puede ser localizado con relación al PO en dos formas. El oligonucleotido corriente arriba puede ser localizado adyacentemente al PO suficiente para inducir el desdoblamiento de PO en una manera independiente de la extensión (es decir, polimerización) . Alternativamente, el oligonucleotido corriente arriba puede ser localizado distantemente al PO suficiente para inducir el desdoblamiento de PO en una manera dependiente de la extensión.

El término usado en la presente "adyacente" con referencia a posiciones o ubicaciones significa que el oligonucleótido corriente arriba se localiza adyacentemente a la porción de objetivo del PO para formar una muesca. También, el término significa que el oligonucleótido corriente arriba se localiza 1-30 nucleótidos, 1-20 nucleótidos o 1-15 nucleótidos aparte de la porción de objetivo del PO.

De conformidad con una modalidad preferida, el oligonucleótido corriente arriba se localiza distantemente al PO suficiente para inducir el desdoblamiento de PO en una manera dependiente de la extensión.

El término usado en la presente "distante" con referencia a posiciones o ubicaciones no tiene limitaciones como el término "adyacente", que incluye cualesquiera posiciones o ubicaciones suficientes para asegurar reacciones de extensión. Por ejemplo, el término "distante" puede incluir ubicación para formar una muesca.

De conformidad con una modalidad preferida, el oligonucleótido corriente arriba es un cebador corriente arriba o una sonda corriente arriba. El cebador corriente arriba es adecuado en una inducción de desdoblamiento independiente de la extensión o un desdoblamiento dependiente de la extensión, y la sonda corriente arriba es adecuada en una inducción de desdoblamiento independiente de la extensión .

Alternativamente, el oligonucleótido corriente arriba tiene una secuencia traslapada parcial con la porción de objetivo del PO. Preferiblemente, la secuencia traslapada es 1-10 nucleótidos, más preferiblemente 1-5 nucleótidos, todavía más preferiblemente 1-3 nucleótidos en longitud. Donde el PO etiquetado al 5' que tiene la secuencia traslapada parcial se usa, la porción de objetivo al 3' puede ser parcialmente digerida junto con digestión de la porción etiquetante en la reacción de desdoblamiento de la etapa (b) . Además, la secuencia traslapada permite desdoblar un sitio deseado de la porción de objetivo.

De conformidad con una modalidad preferida, el cebador corriente arriba induce a través de su hebra extendida el desdoblamiento del PO por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' .

Las tecnologías convencionales para reacciones de desdoblamiento por oligonucleótidos corriente arriba pueden ser aplicadas a la presente invención, en la medida que el oligonucleótido corriente arriba induce desdoblamiento del PO hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, métodos descritos en las Patentes Estadounidenses Nos. 5,210,015, 5,487,972, 5,691,142, 5,994,069 y 7,381,532 y Publicación de Solicitud Estadounidense No. 2008-0241838 pueden ser aplicados a la presente invención.

De conformidad con una modalidad preferida, el presente método se realiza en la presencia de un cebador corriente abajo. El cebador corriente abajo genera adicionalmente la secuencia de ácido nucleico objetivo para ser hibridizada con el PO, mejorando la sensibilidad en la detección del objetivo.

Donde el cebador corriente abajo es adicionalmente usado, un PO secundario localizado corriente abajo del cebador corriente abajo es adicionalmente usado.

De conformidad con una modalidad preferida, cuando el cebador corriente arriba y el cebador corriente abajo se usan, se emplea una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla para extensión de los cebadores. La polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla puede servir como una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' para desdoblamiento del PO.

De conformidad con una modalidad preferida, el oligonucleótido corriente arriba (cebador corriente arriba o sonda corriente arriba) y/o el cebador corriente abajo tienen una estructura de oligonucleótido de cebación dual (DPO) desarrollada por el presente inventor. Los oligonucleótidos que tienen la estructura DPO muestran especificidad objetivo significantemente mejorada comparada con cebadores y sondas convencionales (véase documento O 2006/095981; Chun et al., Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6e40( 2007)).

De conformidad con una modalidad preferida, la porción de objetivo del PO tiene una estructura de oligonucleótido de especificidad dual modificada (mDSO) desarrollada por el presente inventor. La estructura de oligonucleótido de especificidad dual modificada (mDSO) muestra especificidad objetivo significantemente mejorada comparada con sondas convencionales (véase documento WO 2011/028041) .

El término "oligonucleótido convencional" se refiere a oligonucleótidos (cebador o sonda) que no tienen estructura DSO o mDSO.

El PO usado en esta invención tiene una etiqueta única. La etiqueta única proporciona señal indicativa de la presencia o ausencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo. La etiqueta será descrita en más detalle en la etapa (d) .

Etapa (b) : Desdoblamiento del PO Posteriormente, el resultado de la etapa (a) es puesto en contacto con una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para desdoblamiento del PO.

El PO hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo es digerido por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' para liberar un fragmento que contiene etiqueta única (véase Figuras 2-6) . Donde la secuencia de ácido nucleico objetivo esté ausente, el PO no es digerido por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' .

El término usado en la presente "condiciones para desdoblamiento del PO" significa condiciones suficientes para digerir el PO hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' , tal como temperatura, pH, intensidad iónica, amortiguador, longitud y secuencia de oligonucleótidos, y enzimas. Por ejemplo, cuando la polimerasa de ADN Taq se usa como la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' , las condiciones para desdoblamiento del PO incluyen amortiguador Tris-HCl, KC1, MgCl2 y temperatura.

Una multitud de tecnologías convencionales puede ser empleada para la reacción de desdoblamiento del PO. Los sitios de desdoblamiento del PO son variados dependiendo del tipo de oligonucleótidos corriente arriba (sonda corriente arriba o cebador corriente arriba) , sitios de hibridización de oligonucleótidos corriente arriba y desdoblamiento condiciones (véase Patentes Estadounidenses Nos. 5,210,015, 5,487,972, 5,691,142, 5,994,069 y 7,381,532 y Publicación de Solicitud Estadounidense No. 2008-0241838) .

La longitud y secuencia del fragmento que contiene etiqueta única puede ser variado dependiendo de la tecnología de desdoblamiento adoptada. En particular, donde el PO etiquetado se usa, su fragmento que comprende una secuencia parcial o total de la porción etiquetante puede ser producido. Con el ajuste de la ubicación de la etiqueta única en el PO etiquetado, la etiqueta única puede no existir en el fragmento que comprende una secuencia parcial o total de la porción etiquetante.

En general, el sitio inicial para el desdoblamiento del PO por extensión del cebador corriente arriba es un punto de inicio de la hebra doble entre el PO y la secuencia de ácido nucleico objetivo o un sitio de 1-3 nucleótidos aparte del punto de partida. El PO desdoblado llega a ser más corto en longitud de manera que es disociado de la secuencia de ácido nucleico objetivo. Donde el PO etiquetado al 3' o el PO etiquetado al 5' se usa, un fragmento que comprende la porción etiquetante y una parte de la porción de objetivo puede ser producida. Cuando una reacción de desdoblamiento independiente de la extensión de oligonucleótidos corriente arriba se emplea, el sitio de desdoblamiento del PO se determina dependiendo de la ubicación de oligonucleótidos corriente arriba. Donde el PO etiquetado al 3' o el PO etiquetado al 5' se usa, un fragmento del PO producido puede comprender (i) a parte de la porción etiquetante, (ii) la porción etiquetante o (iii) la porción etiquetante y una parte de la porción de objetivo.

El término usado en la presente "un fragmento que comprende la porción etiquetante o una parte de la porción etiquetante" en conjunto con el desdoblamiento del PO etiquetado por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' se usa para abarcar (i) la porción etiquetante, (ii) la porción etiquetante y una secuencia parcial adyacente de la porción de objetivo y (iii) una parte de la porción etiquetante .

El término "parte" usado en conjunto con el PO tal como la parte de la porción etiquetante al 5' del PO y la parte del extremo 5' de la porción de objetivo al 3' del PO se refiere a una secuencia de nucleótido compuesta de 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 1-10 o 1-5 nucleótidos, preferiblemente 1, 2, 3 o 4 nucleótidos.

De conformidad con una modalidad preferida, la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' es polimerasa de ADN que tiene una actividad de nucleasa al 5' o nucleasa de FEN, más preferiblemente una polimerasa de ADN termoestable que tiene una actividad de nucleasa al 5' o nucleasa de FEN.

Una polimerasa de ADN adecuada que tiene una actividad de nucleasa al 5' en esta invención es una polimerasa de ADN termoestable obtenida de una variedad de especies bacterianas, que incluyen Thermus aquaticus (Taq) , Thermus thermophilus (Tth) , Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii, Thermus caldophilus, Thermus chliarophilus, Thermus flavus, Thermus igniterrae, Thermus lacteus, Thermus oshimai, Thermus ruber, Thermus rubens, Thermus scotoductus, Thermus sílvanus, Thermus species Z05, Thermus species sps 17, Thermus thermophilus, Thermotoga marítima, Thermotoga neapolitana, Thermosipho africanus, Thermococcus litoralis, Thermococcus barossi, Thermococcus gorgonarius, Thermotoga marítima, Thermotoga neapolitana , Thermosiphoafricanus, Pyrococcus woesei, Pyrococcus horikoshii , Pyrococcus abyssi, Pyrodictium occultum, Aquifex pyrophilus y Aquifex aeolieus . Muy preferiblemente, la polimerasa de ADN termoestable es polimerasa Taq.

Alternativamente, la presente invención puede emplear polimerasas de ADN que tienen una actividad de nucleasa al 5' modificada para tener menos actividades de polimerasa .

La nucleasa FEN (endonucleasa traslapante) usada es una nucleasa especifica del 5' traslapante.

La nucleasa de FEN adecuada en la presente invención comprende nucleasas de FENs obtenidas de una variedad de especies bacterianas, que incluyen Sulfolobus solfataricus, Pyrobaculum aerophilum, Thermococcus litoralis, Archaeaglobus veneficus, Archaeaglobus profundus, Acidianus brierlyi , Acidianus ambivalens, Desulfurococcus amylolyticus, Desulfurococcus mobilis, Pyrodictium brockii, Thermococcus gorgonaríus, Thermococcus zilligii, Methanopyrus kandleri, Methanococcus igneus, Pyrococcus horikoshii , Aeropyrum pernix, y Archaeaglobus veneficus .

Donde el cebador corriente arriba es usado en la etapa (a) , es preferible que las condiciones para desdoblamiento del PO comprendan reacción de extensión del cebador corriente arriba.

De conformidad con una modalidad preferida, el cebador corriente' arriba es usado en la etapa (a), una polimerasa dependiente de la plantilla se usa para extensión del cebador corriente arriba y la polimerasa dependiente de la plantilla es idéntica con la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' .

Opcionalmente, el cebador corriente arriba es usado en la etapa (a) , una polimerasa dependiente de la plantilla se usa para extensión del cebador corriente arriba y la polimerasa dependiente de la plantilla es diferente de la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' .

Etapa (c) : Hibridización con CO en Fase Sólida El resultado de la etapa (b) es puesto en contacto con un CO (Oligonucleótido de Captura) inmovilizado en el sustrato sólido para reacción de hibridización .

En la presente invención, el desdoblamiento del PO se detecta por el uso del CO inmovilizado en el sustrato sólido. Donde el PO no es desdoblado en la etapa (b) , el PO que contiene etiqueta única no desdoblado es hibridizado con el CO inmovilizado en el sustrato sólido de manera que la señal en el sustrato sólido se proporciona por la etiqueta única. Donde el PO se desdobla en la etapa (b) , el fragmento desdoblado que contiene etiqueta única no es hibridizado con el CO de manera que la señal en el sustrato sólido no es proporcionada por la etiqueta única.

Puesto que la incidencia de desdoblamiento del PO es dependiente de la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo, la secuencia de ácido nucleico objetivo puede ser detectada midiendo la extensión o reducción de la señal de la etiqueta única en el sustrato sólido.

El CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO. El término usado en la presente o "secuencia hibridizable" en conjunto con el CO se refiere a una secuencia capaz de formar un duplo estable con el PO no desdoblado en la etapa (c) . Por ejemplo, una secuencia hibridizable del CO con el PO puede comprender una secuencia complementaria en toda o una parte de la porción de objetivo del PO; toda o una parte de la porción etiquetante del PO; toda la porción de objetivo y una parte de la porción etiquetante del PO; una parte de la porción de objetivo y toda la porción etiquetante del PO; o una parte de la porción de objetivo y una parte de la porción etiquetante del PO.

No existe distinción propuesta entre los términos "secuencia de nucleótido hibridizable" y "secuencia de nucleótido complementaria", y estos términos serán usados intercambiablemente .

La reacción de hibridización en la etapa (c) se realiza bajo condiciones de manera que el fragmento que contiene la etiqueta única no es hibridizado con el CO y el PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado.

En una modalidad de esta invención, el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción de objetivo del PO. La secuencia de nucleótido hibridizable con la porción de objetivo del PO comprende una secuencia complementaria en toda o una parte de la porción de objetivo del PO y tiene longitud y complementariedad suficiente para formar un duplo estable entre el PO no desdoblado y el CO en la reacción de hibridización de la etapa (c) .

Como se ilustra en las Figuras 2 y 3, el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción de objetivo del PO. Donde la secuencia de ácido nucleico objetivo está presente, el fragmento que contiene la etiqueta única generado por la reacción de desdoblamiento tiene longitud más corta que el PO no desdoblado y entonces no es capaz de hibridizarse con el CO bajo ciertas condiciones rigurosas (particularmente, temperatura) . Finalmente, la etiqueta única no existe en el sustrato sólido.

Alternativamente, el CO puede ser diseñado para no tener una secuencia hibridizable con el fragmento que contiene la etiqueta única para prevenir al fragmento que contiene la etiqueta única de hibridizacion con el CO.

Por lo tanto, cuando la secuencia de ácido nucleico objetivo está presente, el duplo entre el PO no desdoblado y el CO no se general y no se proporciona señal a partir de la etiqueta única.

Donde la secuencia de ácido nucleico objetivo está ausente, el PO no desdoblado forma un duplo con el CO y la etiqueta única existe en el sustrato sólido.

Si los procesos ilustrados en Figuras 2 y 3 se realizan usando una polimerasa que no tiene actividad de nucleasa al 5' , el PO no etiquetado hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo no es desdoblado. Puesto que el PO no etiquetado es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo, su hibridizacion con el CO puede ser prevenida bajo una condición delicadamente controlada, no proporcionando señal a partir de la etiqueta única. Sin embargo, en el caso de usar enzimas que tienen una actividad de nucleasa al 5' como la presente invención, el PO hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo se desdobla y la incidencia del desdoblamiento se mide bajo una condición convenientemente establecida para detectar exactamente la presencia de la secuencia de ácido nucleico obj etivo .

Como se ilustra en las Figuras 4 y 5, el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante del PO. La etiqueta única en el PO etiquetado se posiciona de manera que la etiqueta única no está permaneciendo en el fragmento que contiene la porción etiquetante liberada por el desdoblamiento del PO etiquetado e hidribrizada con el CO. Aún cuando el fragmento que contiene la porción etiquetante es hibridizado con el CO, la etiqueta única no proporciona señal debido a que el fragmento que contiene la porción etiquetante no porta la etiqueta única. Se proporciona la señal después de la ibridización del PO etiquetado no desdoblado con el CO.

Donde la secuencia de ácido nucleico objetivo está presente, el duplo entre el PO no desdoblado y el CO no se forma debido al desdoblamiento del PO, resultando en extinción (o reducción) de la señal de la etiqueta única en el sustrato sólido que es indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

De conformidad con una modalidad preferida usando el PO etiquetado, la secuencia de nucleótido del CO hibridizable con la porción etiquetante del PO comprende una secuencia complementaria en toda o una parte de la porción etiquetante del PO y tiene longitud y complementariedad suficiente para formar un duplo estable entre el PO etiquetado no desdoblado y el CO en la reacción de hibridización de la etapa (c) .

Alternativamente, donde el PO etiquetado se usa, el CO puede comprender una secuencia de nucleótido hibridizable con una parte (o toda) la porción etiquetante y una parte (o toda) la porción de objetivo del PO etiquetado. La posición de la etiqueta única en el PO etiquetado se determina con consideración del método de desdoblamiento, sitio de desdoblamiento y la secuencia del CO, y el desdoblamiento del PO etiquetado se lleva a cabo bajo condiciones que el fragmento que contiene la etiqueta única no es hibridizado con el CO. Preferiblemente, la etiqueta única se posiciona de manera que está permaneciendo en un fragmento liberado por el desdoblamiento del PO etiquetado y no hibridizado con el CO.

De conformidad con una modalidad preferida usando el PO etiquetado al 5' , el CO puede comprender además una porción de plantilla que sirve como una plantilla para extensión de la porción etiquetante hidribrizada con el CO (véase Figura 6) . El producto de extensión permite a la hibridización con el CO ser más estable. Para la extensión, puede ser necesaria polimerasa de ADN adicional.

El CO es inmovilizado en el sustrato sólido a través de su extremo-5' o extremo-3' . De conformidad con una modalidad preferida, el PO es el PO etiquetado al 3' y el CO es inmovilizado en el sustrato sólido a través de su extremo-5' (Figura 4) . Preferiblemente, el PO es el PO etiquetado al 5' y el CO es inmovilizado en el sustrato sólido a través de su extremo-3' (Figura 5).

De conformidad con una modalidad preferida, el sustrato sólido en el cual el CO es inmovilizado es un microarreglo . El CO es inmovilizado directamente o indirectamente (preferiblemente indirectamente) a través de su extremo-5' o extremo-3' sobre la superficie del sustrato sólido. Además, el CO puede ser inmovilizado en la superficie del sustrato sólido en una manera covalente o no covalente. Donde los CO inmovilizados son inmovilizados indirectamente sobre la superficie del sustrato sólido, se usan enlazadores adecuados. Los enlazadores útiles en esta invención pueden incluir cualquiera de los enlazadores utilizados para inmovilización de sonda en la superficie del sustrato sólido. Por ejemplo, compuestos alquilo o arilo con funcionalidad amina, o compuestos alquilo o arilo con funcionalidad tiol, sirven como enlazadores para inmovilización de CO. Además, cola poli (T) o cola poli (A) pueden ser usados como enlazadores. La cola poli (T) o cola poli (A) es ventajosa en el sentido que es capaz de reducir el obstáculo de espacio en la acción de la enzima (por ejemplo, reacción de desdoblamiento enzimático) e incrementar la eficiencia de hibridización . La cola poli (T) o cola poli (A) no es considerada como secuencia de sondas.

El microarreglo para proporcionar un ambiente de reacción en esta invención puede incluir cualquiera de aquellos conocidos por uno de habilidad en la técnica. Todos los procesos de la presente invención, es decir, hibridización a secuencias de ácido nucleico objetivo, desdoblamiento y detección se llevan a cabo en el microarreglo. Los CO inmovilizados en el microarreglo sirven como elementos de arreglo hibridizable . El sustrato sólido para fabricar microarreglo incluye, pero no se limita a, metales (por ejemplo, oro, aleación de oro y cobre, aluminio), óxido de metal, vidrio, cerámica, cuarzo, silicio, semiconductores, oblea de Si/Si02, germanio, asernuro de galio, carbono, nanotubos de carbono, polímeros (por ejemplo, poliestireno, polietileno, polipropileno y poliacrilamida ) , sefarosa, agarosa y coloides. Una pluralidad de CO inmovilizados en esta invención puede ser inmovilizada en una región direccionable o dos o más regiones direccionables en un sustrato sólido que puede comprender 2-1,000,000 regiones direccionables. Los CO inmovilizados pueden ser fabricados para producir arreglo o arreglos para una aplicación dada por tecnologías de fabricación convencionales tales como fotolitografía, inyección de tinta, micromanchado mecánico, y derivados de los mismos.

La presente invención realizada en la fase sólida puede detectar simultáneamente una pluralidad de secuencias de ácido nucleico objetivo aún usando un tipo único de una etiqueta debido a que las etiquetas en los COs inmovilizados son físicamente separadas. En este sentido, el número de secuencias de ácido nucleico objetivo para ser detectadas por la presente invención en la fase sólida no está limitado.

Usando dispositivos de detección confocal en una fase sólida, la señal existente solamente en el sustrato sólido puede ser detectada sin influencia de la señal de etiquetas presentes en una solución de reacción.

La longitud del CO puede ser ampliamente variada.

El CO puede tener cualquier longitud en la medida que es capaz de formar un duplo con el PO no desdoblado. Por ejemplo, el CO es 5-80 nucleótidos, 5-60 nucleótidos, 5-40 nucleótidos, 5-30 nucleótidos, 10-80 nucleótidos, 10-60 nucleótidos, 10-40 nucleótidos, 10-30 nucleótidos, 10-20 nucleótidos, 15-80 nucleótidos, 15-60 nucleótidos, 15-40 nucleótidos, 15-30 nucleótidos o 15-20 nucleótidos en longitud.

De conformidad con una modalidad preferida usando el PO etiquetado al 5' , donde el CO comprende además la porción de plantilla para extensión de la porción etiquetante hidribrizada con el CO, el CO puede comprender además una longitud adicional de 5-100 nucleótidos en la porción de plantilla .

De conformidad con una modalidad preferida, el extremo-3' del CO es bloqueado para prohibir su extensión. El bloqueo no extendióle del CO se puede lograr de conformidad con métodos convencionales. Por ejemplo, el bloqueo puede ser realizado agregando al grupo hidroxilo-3' del último nucleótido del CO una porción química tal como biotina, etiquetas, un grupo fosfato, grupo alquilo, enlazador no nucleótido, fosforotioato o alcan-diol. Alternativamente, el bloqueo se puede llevar a cabo removiendo el grupo hidroxilo-3' del último nucleótido o usando un nucleótido sin grupo hidroxilo-3' tal como didesoxinucleótido.

La hibridización en la etapa (c) puede ser descrita en detalle con referencia a descripciones en la etapa (a) .

La hibridización en la etapa (c) se realiza bajo condiciones de manera que el fragmento que contiene la etiqueta única no es hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado. Las condiciones de hibridización pueden ser determinadas rutinariamente por métodos convencionales conocidos por uno de habilidad en la técnica. Por ejemplo, las condiciones de hibridización pueden ser ajustadas por temperatura, concentración de componentes, tiempos de hibridización, componentes amortiguadores, y su pH e intensidad iónica.

De conformidad con una modalidad preferida, las condiciones de hibridización en la etapa (c) se ajustan por temperatura para hibridización. Alternativamente, las condiciones de hibridización en la etapa (c) , en particular las condiciones que permiten al fragmento que contiene la etiqueta única no hibridizarse con el CO, pueden ser proporcionadas excluyendo en el CO una secuencia que es capaz de hibridizar establemente con el fragmento que contiene la etiqueta única.

El PO y CO pueden estar comprendidos de dNMPs que se originan naturalmente. Alternativamente, el PO y CO pueden estar comprendidos de nucleótido no natural o nucleótido modificado tal como PNA (ácido nucleico peptidico, véase Publicación de PCT No. WO 92/20702) y LNA (ácido nucleico cerrado, véase Publicaciones de PCT Nos. WO 98/22489, WO 98/39352 y WO 99/14226) . El PO y CO pueden comprender bases universales tales como desoxiinosina, inosina, 1- (2 ' -desoxi-beta-D-ribofuranosil) -3-nitropirrol y 5-nitroindol . El término "base universal" se refiere a una capaz de formar pares base con cada una de las bases de ADN/ARN natural con poca discriminación entre ellas.

Etapa (d) : Detección de Desdoblamiento de PO Indicando la Presencia de Secuencia Objetivo Después de la reacción de hibridización, la incidencia del desdoblamiento del PO es detectada midiendo una señal de la etiqueta única en el sustrato sólido, de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Como se discute anteriormente, el patrón de hibridización del PO con el CO es distintamente diferente dependiendo del desdoblamiento del PO. Tal diferencia en el patrón de hibridización es responsable de la diferencia en señal en el sustrato sólido. Por lo tanto, la presencia o ausencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo puede ser determinada detectando la señal de la etiqueta única en el sustrato sólido.

La etapa (d) se lleva a cabo midiendo la señal a partir de la etiqueta única unida al PO en el sustrato sólido .

La etiqueta única en el PO puede ser descrita como una molécula reportera.

La etiqueta única usada incluye, pero no se limita a, etiquetas únicas (por ejemplo, biotina) , etiquetas enzimáticas (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa, ß-galactosidasa y ß-glucosidasa ) , etiquetas fluorescentes, etiquetas luminiscentes, etiquetas quimioluminiscentes , electroetiquetas, etiquetas únicas y de metal. Preferiblemente, la etiqueta única incluye etiquetas fluorescentes .

La etiqueta única se posiciona de manera que la etiqueta única no está permaneciendo en un fragmento el cual es liberado por el desdoblamiento de PO e hibridizado con el CO.

Donde el PO no etiquetado se usa, la etiqueta única puede ser ligada en cualquier sitio. Preferiblemente, la etiqueta única está ligada a una porción de extremo-5' o una porción de extremo-3' del PO no etiquetado. Más preferiblemente, se localiza en el extremo-5' o extremo-3' o en 1-20 nucleótidos (todavía más preferiblemente 1-10 nucleótidos) aparte del extremo-5' o extremo-3' del PO no etiquetado, todavía más preferiblemente, en el extremo-5' o extremo-3' .

De conformidad con una modalidad preferida usando el PO etiquetado, la etiqueta única se posiciona de manera que la etiqueta única no está permaneciendo en un fragmento que contiene porción etiquetante liberada por el desdoblamiento del PO etiquetado. Más preferiblemente, la etiqueta única se posiciona de manera que la etiqueta única no está permaneciendo en un fragmento que contiene porción etiquetante la cual es liberada por el desdoblamiento del PO etiquetado e hidribrizada con el CO.

La ubicación de la etiqueta única puede ser determinada con consideración de los métodos de desdoblamiento, sitios de desdoblamiento, y liberación del PO desdoblado de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Más preferiblemente, la etiqueta única se localiza en una porción del extremo-5' o en 1-20 nucleótidos (todavía más preferiblemente 1-10 nucleótidos) aparte del extremo-5' del PO etiquetado al 3', y se localiza en una porción del extremo-3' o en 1-20 nucleótidos (todavía más preferiblemente 1-10 nucleótidos) aparte del extremo-3' del PO etiquetado al 5' . Todavía más preferiblemente, la etiqueta única se localiza en el extremo-5' del PO etiquetado al 3' , y localizado en el extremo-3' del PO etiquetado al 5' .

De conformidad con una modalidad preferida, el PO etiquetado tiene la etiqueta única; la etiqueta única se posiciona en la porción de objetivo del PO etiquetado; la etiqueta única se posiciona de manera que la etiqueta única no está permaneciendo en el fragmento que contiene la porción etiquetante generada por el desdoblamiento del PO en la etapa (b) ; y el duplo entre el fragmento que contiene la porción etiquetante y el CO no tiene la etiqueta única y el duplo CO/PO no desdoblado tiene la etiqueta única (véase Figuras 4 y 5) . El fragmento que contiene el duplo CO/porción etiquetante inmovilizado en el sustrato sólido falla para proporcionar la señal debido a la ausencia de la etiqueta única; sin embargo el duplo CO/PO no desdoblado proporciona la señal debido a la presencia de la etiqueta única en el PO no desdoblado.

Como se describe anteriormente, la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo es detectada midiendo la señal de la etiqueta única en el sustrato sólido.

De conformidad con una modalidad preferida usando el PO con la etiqueta única, la señal finalmente medida es comparada con la señal de un control negativo que no tiene secuencia de ácido nucleico objetivo. La extinción (o reducción) de la señal es entonces determinada para detectar la secuencia de ácido nucleico objetivo.

De, conformidad con una modalidad preferida usando el PO con la etiqueta única, donde la detección en el sustrato sólido es continuamente realizada junto con repetición de desdoblamiento de los POs, el número de POs desdoblados se incrementa después del número de repeticiones de la reacción de desdoblamiento y la señal se disminuye en paralelo con el número de POs desdoblados. Entonces, la secuencia de ácido nucleico objetivo puede ser detectada en una manera en tiempo real. Por el contrario, el cambio de la señal no se observa en la ausencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Las etiquetas fluorescentes únicas útiles en la presente invención pueden incluir cualquiera de las moléculas conocidas en la técnica. Ejemplos de estas son: Cy2™ (506), Y0-PR0™-1 (509), Y0Y0™-1 (509), Calceina (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rodamina 110 (520), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rodamina 123 (529), Magnesium Green™(531), Calcium Green™ (533), T0-PR0™-1 (533), TOTOl (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY T R (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Ficoeritrina R&B (575), Rodamina Faloidina (575), Calcium Orange™(576) , Pironina Y (580), Rodamina B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red (615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-ficocianina (642), C-Ficocianina (648), TO-PRO™-3 (660), TOT03 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Tiadicarbocianina (671), Cy5.5 (694), HEX (556), TET (536), Biosearch Blue (447), CAL Fluor Gold 540 (544), CAL Fluor Orange 560 (559), CAL Fluor Red 590 (591), CAL Fluor Red 610 (610), CAL Fluor Red 635 (637), FAM (520), Fluoresceina (520), Fluoresceina (520), Pulsar 650 (566), Quasar 570 (667), Quasar 670 (705) y Quasar 705 (610). El número en paréntesis es una longitud de onda de emisión máxima en nanómetros. Preferiblemente, las etiquetas fluorescentes únicas incluyen JOE, FAM, TAMRA, ROX y etiqueta a base de fluoresceina.

La etiqueta única puede ser ligada al PO por una variedad de- métodos conocidos por uno de habilidad en la técnica. Preferiblemente, la etiqueta única puede ser ligada al PO vía un espaciador que contiene al menos tres átomos de carbono (por ejemplo, espaciador de 3 carbonos, espaciador de 6 carbonos y espaciador de 12 carbonos) .

II. Proceso de Detección de Objetivo por POCH Usando Etiqueta Dual La presente invención exhibe excelente desempeño usando una etiqueta dual interactiva en la detección de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

En otro aspecto de esta invención, se proporciona un método para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, que comprende: (a) hibridizar la secuencia de ácido nucleico objetivo con un oligonucleótido corriente arriba y un oligonucleótido de sonda (PO) ; en donde el oligonucleótido corriente arriba comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO tiene una etiqueta dual interactiva que comprende una molécula donadora y una molécula aceptora; el oligonucleótido corriente arriba está localizado corriente arriba del PO; el oligonucleótido corriente arriba o su hebra extendida induce desdoblamiento del PO por una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' ; (b) poner en contactó el resultado de la etapa (a) con la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para desdoblamiento del PO; en donde cuando el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo, el PO es desdoblado por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' para separar la etiqueta dual interactiva, de este modo se producen un fragmento que contiene donador y un fragmento que contiene aceptor; (c) realizar una reacción de hibridación poniendo en contacto el resultado de la etapa (b) con un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO; en donde la reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que al menos uno del fragmento que contiene donador y el fragmento que contiene aceptor es no hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado; en donde una señal del duplo CO/PO no desdoblado es diferenciada de una señal proporcionada en el tiempo que al menos uno del fragmento que contiene donador y el fragmento que contiene aceptor es no hibridizado con el CO; y (d) detectar la incidencia del desdoblamiento del PO midiendo una señal de la etiqueta dual interactiva en el sustrato sólido; de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico obj etivo .

Puesto que la segunda modalidad de esta invención es la misma como la primera modalidad usando la etiqueta única excepto para un sistema de etiqueta, las descripciones comunes entre estas son omitidas con el fin de evitar redundancia indebida con respecto a la complejidad de esta especificación .

La etiqueta dual interactiva de donador/aceptor está ligada al PO.

La etiqueta dual interactiva es un sistema que genera señal en el cual la energía es pasada no radioactivamente entre una molécula donadora y una molécula aceptora. Como un representativo del sistema de etiqueta interactiva, el sistema de etiqueta FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) incluye una molécula reportera fluorescente (molécula donadora) y una molécula apagadora (molécula aceptora) . En FRET, el donador de energía es fluorescente, pero el aceptor de energía puede ser fluorescente o no fluorescente. En otra forma de sistemas de etiqueta interactivos, · el .donador de energía es no fluorescente, por ejemplo, un cromóforo, y el aceptor de energía es fluorescente. En aún otra forma de sistemas de etiqueta interactiva, el donador de energía es luminiscente, por ejemplo, bioluminiscente, quimioluminiscente, electroquimioluminiscente, y el aceptor es fluorescente.

De conformidad con una modalidad preferida, el PO tiene una etiqueta dual interactiva, más preferiblemente una etiqueta FRET, todavía más preferiblemente una etiqueta dual que comprende una molécula donadora y una molécula aceptora (véase Figuras 7-13) .

La molécula donadora y la molécula aceptora útiles en esta invención incluyen cualquiera de las moléculas conocidas por un experto en la técnica y sus ejemplos pueden ser descritos con referencia a etiquetas fluorescentes descritas anteriormente.

Pares adecuados de donador-aceptor se describen en una variedad de publicaciones como sigue: Pesce et al., editors, Fluorescence Spectroscopy (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., Fluorescence Analysis: A Practical Approach (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (Academic Press, New York, 1971) ; Griffiths, Color and Constitution of Organic Molecules (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, Indicators (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (Molecular Sondas, Eugene, 1992); Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence ( Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th Edition (Molecular Probes, Eugene, Oreg. , 1996) Patentes Estadounidenses Nos. 3,996,345 y 4,351,760.

En el sistema de señalización que comprende un reportero y un apagador adoptado por el PO, el reportero abarca un donador de FRET y el apagador abarca el otro asociado (aceptor) del FRET. Por ejemplo, un tinte de fluoresceína se usa como el reportero y un tinte de rodamina como el apagador.

La molécula donadora (reportera) y la molécula aceptora (apagadora) ligadas al PO pueden ser fluorescentes o no fluorescentes. Por ejemplo, un apagador oscuro no fluorescente capaz de apagar la fluorescencia con intervalo de longitud de onda' más amplio o una longitud de onda especifica puede ser usado en esta invención. Donde la molécula aceptora (apagadora) es fluorescente, la señal de la molécula aceptora fluorescente (apagador) puede ser empleada para detectar la secuencia de ácido nucleico objetivo.

La presente invención será descrita en más detalle como sigue: Etapa (a) : Hibridización de un oligonucleótido corriente arriba y un PO con una secuencia de ácido nucleico objetivo La etapa (a) de la segunda modalidad de esta invención puede ser entendida con referencia a las descripciones para la etapa (a) de la primera modalidad.

El PO tiene una etiqueta dual interactiva que comprende una molécula donadora y una molécula aceptora que proporciona señal indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Etapa (b) : Desdoblamiento del PO La etapa (b) de la segunda modalidad de esta invención puede ser entendida con referencia a las descripciones para la etapa (b) de la primera modalidad.

El resultado de la etapa (a) es puesto en contacto con una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para desdoblamiento del PO.

El PO hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo es digerido por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' para separar la etiqueta dual interactiva, de este modo se producen un fragmento que contiene donador y un fragmento que contiene aceptor (véase Figuras 7-13 ) .

De conformidad con una modalidad preferida, la molécula donadora y la molécula aceptora en el PO son separadas por un sitio de desdoblamiento por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' .

En la ausencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo, el PO no es digerido por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' y la etiqueta dual interactiva es por lo tanto no separada.

Etapa (c) : Hibridización con CO en Fase Sólida El resultado de la etapa (b) es puesto en contacto con un CO (Oligonucleótido de Captura) inmovilizado en el sustrato sólido para reacción de hibridización.

La etapa (c) de la segunda modalidad de esta invención puede ser entendida con referencia a las descripciones para la etapa (c) de la primera modalidad. La reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que al menos uno del fragmento que contiene donador y el fragmento que contiene aceptor es no hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado. Las condiciones de hibridización pueden ser determinadas rutinariamente por métodos convencionales conocidos por uno de habilidad en la técnica. Por ejemplo, las condiciones de hibridización pueden ser ajustadas por temperatura, concentración de componentes, tiempos de hibridización, componentes amortiguadores, y su pH e intensidad iónica.

De conformidad con una modalidad preferida, las condiciones de hibridización de manera que al menos uno del fragmento que contiene donador y el fragmento que contiene aceptor es no hibridizado con el CO se ajustan por temperatura para hibridización. Alternativamente, las condiciones de hibridización en la etapa (c) pueden ser proporcionadas excluyendo en el CO una secuencia que es capaz de hibridizar establemente con el fragmento que contiene etiqueta .

Donde la secuencia de ácido nucleico objetivo está presente, al menos uno del fragmento que contiene donador y el fragmento que contiene aceptor no es hibridizado con el CO. En el caso de la ausencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo, el PO no desdoblado que tiene la etiqueta dual interactiva es hibridizado con el CO.

La señal proporcionada del duplo CO/PO no desdoblado (es decir, en la ausencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo) es distintamente diferenciada de una señal proporcionada en el tiempo que al menos uno del fragmento que contiene donador y el fragmento que contiene aceptor es no hibridizado con el CO (es decir, en la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo). Por lo tanto, la señal de la etiqueta dual interactiva se genera de manera diferente dependiendo del la presencia o ausencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Etapa (d) : Detección de Desdoblamiento de PO Indicando la Presencia de la Secuencia objetivo Después de la reacción de hibridización, la incidencia del desdoblamiento del PO es detectada midiendo una señal de la etiqueta dual interactiva en el sustrato sólido, de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Como se discute anteriormente, el patrón de hibridización del PO con el CO es distintamente diferente dependiendo del desdoblamiento del PO. Tal diferencia en el patrón de hibridización es responsable de la diferencia en señal en el sustrato sólido. Por lo tanto, la presencia o ausencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo puede ser determinada detectando la señal de la etiqueta dual interactiva en el sustrato sólido.

En el caso de usar la etiqueta dual interactiva, la señal se mide en dos formas. La primera forma es medir la señal generada de la molécula aceptora y la segunda forma es medir la señal generada de la molécula donadora.

La primera forma de medición se ilustra en las Figuras 7-9.

La Figura 7 usando el PO no etiquetado representa una modalidad para medir la señal de la molécula aceptora. De conformidad con una modalidad preferida, la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción de objetivo del PO. En este caso, la etiqueta dual interactiva es preferiblemente localizada en la medida que la señal a partir de la molécula donadora es apagada por la molécula aceptora cuando se forma el duplo PO/CO no desdoblado, en donde la etapa (d) se realiza detectando la señal de la molécula aceptora.

Como se ejemplifica en la Figura 7, donde la molécula donadora y la molécula aceptora son adyacentes entre si en el PO no etiquetado en la medida que la energía se pasa entre la molécula donadora y la molécula aceptora (por ejemplo, adyacente para permitir un fenómeno FRET) , el PO no etiquetado hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo se desdobla para formar un fragmento que contiene molécula donadora y un fragmento que contiene molécula aceptora. De este modo, la interacción entre la molécula donadora y la molécula aceptora no ocurre a menos que tanto el fragmento que contiene molécula donadora como el fragmento que contiene molécula aceptora son hibridizados con el CO en la etapa (c) , finalmente no proporcionando señal en el sustrato sólido.

La expresión usada en la presente "la molécula donadora y la molécula aceptora son adyacentes" significa que la molécula donadora y la molécula aceptora son separados por un número de nucleótidos en la sonda en la medida que la energía se pasa entre la molécula donadora y la molécula aceptora. Preferiblemente, la molécula donadora y la molécula aceptora son separadas por 1-20, 1-15 y 1-10 nucleótidos.

En el caso de que la secuencia de ácido nucleico objetivo esté ausente, el PO no etiquetado no desdoblado es hibridizado con el CO y la interacción entre la molécula donadora y la molécula aceptora ocurre, de este modo proporcionando la señal de la molécula aceptora. La iluminación de luz con longitud de onda de excitación para la molécula donadora genera fluorescencia a partir de la molécula donadora que es entonces apagada por la molécula aceptora, finalmente proporcionando una señal fluorescente a partir del aceptor.

En la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo, el duplo CO/PO no desdoblado no se forma debido al desdoblamiento del PO y de este modo falla para proporcionar la señal del aceptor. La medición de extinción (o reducción) del único de la molécula aceptora en el sustrato sólido permite determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Las Figuras 8 y 9 usando el PO etiquetado representan modalidades para medir la señal de la molécula aceptora. De conformidad con una modalidad preferida, el PO es un PO etiquetado al 3' que comprende además en su porción-3' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo o un PO etiquetado al 5' que comprende además en su porción-5' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo, y la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante del PO. La etiqueta dual interactiva es preferiblemente localizada en la medida que una señal de la molécula donadora es apagada por la molécula aceptora cuando se forma el duplo PO/CO no desdoblado, en donde la etapa (d) se realiza detectando una señal de la molécula aceptora.

Como se ilustra en la Figura 8 usando el PO etiquetado al 3', donde la molécula donadora y la molécula aceptora son conformacionalmente adyacentes entre si en la medida que la energía se pasa entre la molécula donadora y la molécula aceptora, el PO etiquetado al 3' hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo se desdobla para formar un fragmento que contiene molécula donadora y un fragmento que contiene molécula aceptora. El fragmento que contiene molécula aceptora que comprende la porción etiquetante es hibridizado con el CO que comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante del PO etiquetado al 3' pero el fragmento que contiene molécula donadora no se involucra en la hibridización con el CO, de este modo fallando para proporcionar la señal del aceptor.

La expresión usada en la presente "la molécula donadora y la molécula aceptora son conformacionalmente adyacentes" significa que la molécula donadora y la molécula aceptora son tri-dimensionalmente adyacentes entre si por una estructura conformacional de una parte de PO o PO tal como estructura de hairpina y espiral aleatoria.

En el caso de que la secuencia de ácido nucleico objetivo esté ausente, el PO etiquetado-3' no desdoblado es hibridizado con el CO y la interacción entre la molécula donadora y la molécula aceptora ocurre, de este modo proporcionando la señal de la molécula aceptora.

En la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo, el duplo CO/PO no desdoblado no se forma debido al desdoblamiento del PO etiquetado al 3' y de este modo falla para proporcionar la señal del aceptor. La medición de extinción (o reducción) del único de la molécula aceptora en el sustrato sólido permite determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

De conformidad con una modalidad preferida, la molécula donadora y la molécula aceptora en el PO etiquetado al 3' son adyacentes entre si en la medida que la energía se pasa entre ellos. La molécula donadora y la molécula aceptora se localizan en el PO etiquetado al 3' en una dirección de 5' a 3' o dirección 3' a 5' .

De conformidad con una modalidad preferida, tanto la molécula donadora como la molécula aceptora están localizadas en la porción objetivo del PO etiquetado al 3' o uno de ellas se localiza en la porción de objetivo y la otra se localiza en la porción etiquetante del PO etiquetado al 3' .

Como se ilustra en la Figura 9 usando el PO etiquetado al 5' , donde la molécula donadora y la molécula aceptora son conformacionalmente adyacentes entre si en la medida que la energía se pasa entre la molécula donadora y la molécula aceptora, el PO etiquetado al 5' hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo se desdobla para formar un fragmento que contiene molécula donadora y un fragmento que contiene molécula aceptora. El fragmento que contiene molécula donadora que comprende la porción etiquetante es hibridizado con el CO que comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante del PO etiquetado al 5' pero el fragmento que contiene molécula aceptora no se involucra en la hibridización con el CO, de este modo fallando para proporcionar la señal del aceptor.

En el caso de que la secuencia de ácido nucleico objetivo esté ausente, el PO etiquetado al 5' no desdoblado es hibridizado con el CO y la interacción entre la molécula donadora y la molécula aceptora ocurre, de este modo proporcionando la señal de la molécula aceptora.

En la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo, el duplo CO/PO no desdoblado no se forma debido al desdoblamiento del PO etiquetado al 5' y de este modo falla para proporcionar la señal del aceptor. La medición de extinción (o reducción) del único de la molécula aceptora en el sustrato sólido permite determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

De conformidad con una modalidad preferida, la molécula donadora y la molécula aceptora en el PO etiquetado al 5' son adyacentes entre si en la medida que la energía se pasa entre ellos. La molécula donadora y la molécula aceptora se localizan en el PO etiquetado al 5' en una dirección de 5' a 3' o dirección 3' a 5' .

De conformidad con una modalidad preferida, tanto la molécula donadora como la molécula aceptora están localizadas en la porción objetivo del PO etiquetado al 5' o una de ellas se localiza en la porción de objetivo y la otra se localiza en la porción etiquetante del PO etiquetado al 5' .

La segunda forma de medición se ilustra en las Figuras 10-12.

La Figura 10 usando el PO no etiquetado representa una modalidad para medir la señal de la molécula donadora. De conformidad con una modalidad preferida, la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción de objetivo del PO. La reacción de hibridización en la etapa (c) se realiza bajo condiciones de manera que el fragmento que contiene donador no es hibridizado con el CO; en donde la etiqueta dual interactiva se localiza en la medida que una señal de la molécula donadora es no apagada por la molécula aceptora cuando se forma el duplo PO/CO no desdoblado y la etapa (d) se realiza detectando una señal de la molécula donadora .

Como se ejemplifica en la Figura 10, donde la molécula donadora y la molécula aceptora son conformacionalmente adyacentes entre si en el PO no etiquetado en la medida que la energía se pasa entre la molécula donadora y la molécula aceptora, el PO no etiquetado hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo se desdobla para formar un fragmento que contiene molécula donadora y un fragmento que contiene molécula aceptora. La hibridización se lleva a cabo en la etapa (c) bajo condiciones que el fragmento que contiene molécula donadora no es hibridizado con el CO. Por lo tanto, la señal de la molécula donadora no se proporciona en el sustrato sólido.

En el caso de que la secuencia de ácido nucleico objetivo esté ausente, el PO no etiquetado no desdoblado es hibridizado con el CO para separar la molécula donadora y la molécula aceptora, resultando en prevención de interacción entre la molécula donadora y la molécula aceptora. La iluminación de luz con longitud de onda de excitación para la molécula donadora por ejemplo, una molécula reportera) genera fluorescencia a partir de la molécula donadora que no es apagada por la molécula aceptora, finalmente proporcionando una señal fluorescente a partir del donador.

En la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo, el duplo CO/PO no desdoblado no se forma debido al desdoblamiento del PO y el fragmento que contiene donador no es hibridizado con el CO, de este modo fallando para proporcionar la señal del donador. La medición de extinción (o reducción) del único a partir de la molécula donadora en el sustrato sólido permite determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

De conformidad con una modalidad preferida, la molécula donadora y la molécula aceptora se localizan en el PO no etiquetado en una dirección de 5' a 3' o dirección 3' a 5' , más preferiblemente en una dirección de 5' a 3' .

Las Figuras 11 y 12 usando el PO etiquetado representan modalidades para medir la señal de la molécula donadora. De conformidad con una modalidad preferida, el PO es un PO etiquetado al 3' que comprende además en su porción-3' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo o un PO etiquetado al 5' que comprende además en su porción-5' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo y la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante del PO. El fragmento que contiene donador comprende la porción etiquetante hibridizable con el CO y en la reacción de hibridización en la etapa (c) , el fragmento que contiene donador es hibridizado con el CO. La etiqueta dual interactiva es preferiblemente localizado en la medida que una señal de la molécula donadora es apagada por la molécula aceptora cuando se forma el duplo PO/CO no desdoblado, en donde la etapa (d) se realiza detectando una señal de la molécula donadora.

Como se ilustra en la Figura 11 usando el PO etiquetado al 3' , donde la molécula donadora y la molécula aceptora son conformacionalmente adyacentes entre si en la medida que la energía se pasa entre la molécula donadora y la molécula aceptora, el PO etiquetado al 3' hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo se desdobla para formar un fragmento que contiene molécula donadora y un fragmento que contiene molécula aceptora. El fragmento que contiene molécula donadora que comprende la porción etiquetante es hibridizado con el CO que comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante del PO etiquetado al 3' pero el fragmento que contiene molécula aceptora no se involucra en la hibridización con el CO, de este modo proporcionando la señal a partir del donador.

En el caso de que la secuencia de ácido nucleico objetivo esté ausente, el PO etiquetado al 3' no desdoblado es hibridizado con el CO y la interacción entre la molécula donadora y la molécula aceptora ocurre para provocar el pasaje de la energía de la molécula donadora a la molécula aceptora, de este modo no generando fluorescencia de la molécula donadora.

En la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo, el PO etiquetado al 3' se desdobla y el fragmento que contiene molécula donadora que comprende la porción etiquetante es hibridizado con el CO, proporcionando la señal de la molécula donadora. La medición de la generación (o incremento) del único a partir de la molécula donadora en el sustrato sólido permite determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

De conformidad con una modalidad preferida, la molécula donadora y la molécula aceptora en el PO etiquetado al 3' son adyacentes entre sí en la medida que la energía se pasa entre ellos. La molécula aceptora y la molécula donadora se localizan en el PO etiquetado al 3' en una dirección de 5' De conformidad con una modalidad preferida, tanto la molécula aceptora como la molécula donadora están localizadas en la porción objetivo del PO etiquetado al 3', o la molécula aceptora se localiza en la porción de objetivo y la molécula donadora se localiza en la porción etiquetante del PO etiquetado al 3' .

Como se ilustra en la Figura 12 usando el PO etiquetado al 5' , donde la molécula donadora y la molécula aceptora son conformacionalmente adyacentes entre si en la medida que la energía se pasa entre la molécula donadora y la molécula aceptora, el PO etiquetado al 5' hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo se desdobla para formar un fragmento que contiene molécula aceptora y un fragmento que contiene molécula donadora que comprende la porción etiquetante. El fragmento que contiene molécula donadora que comprende la porción etiquetante es hibridizado con el CO que comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante del PO etiquetado al 5' pero el fragmento que contiene molécula aceptora no se involucra en la hibridización con el CO, de este modo proporcionando la señal a partir del donador indicativa de la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo. En el caso de que la secuencia de ácido nucleico objetivo esté ausente, el PO etiquetado al 5' no desdoblado es hibridizado con el CO y la interacción entre la molécula donadora y la molécula aceptora ocurre para provocar el pasaje de la energía de la molécula donadora a la molécula aceptora, de este modo no generando fluorescencia de la molécula donadora.

En la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo, el PO etiquetado al 5' se desdobla y el fragmento que contiene molécula donadora que comprende la porción etiquetante es hibridizado con el CO, proporcionando la señal de la molécula donadora. La medición de la generación (o incremento) del único a partir de la molécula donadora en el sustrato sólido permite determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

De conformidad con una modalidad preferida, la molécula donadora y la molécula aceptora en el PO etiquetado al 5' son adyacentes entre sí en la medida que la energía se pasa entre ellos. La molécula donadora y la molécula aceptora se localizan en el PO etiquetado al 5' en una dirección de 5' a 3' .

De conformidad con una modalidad preferida, tanto la molécula donadora como la molécula aceptora están localizadas en la porción objetivo del PO etiquetado al 5' , o la molécula aceptora se localiza en la porción de objetivo y la molécula donadora se localiza en la porción etiquetante del PO etiquetado al 5' .

En la alternativa usando el PO etiquetado, el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con una parte (o toda) la porción etiquetante y una parte (o toda) la porción de objetivo del PO etiquetado. La posición de la etiqueta dual interactiva en el PO se determina en consideración del método de desdoblamiento y sitio de desdoblamiento asi como también la secuencia del CO.

III. Proceso de Detección de Objetivo por POCH Usando Agente Intercalante La presente invención también exhibe excelente desempeño usando un agente intercalante en la detección de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

En otro aspecto de esta invención, se proporciona un método para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, que comprende: (a) hibridizar la secuencia de ácido nucleico objetivo con un oligonucleótido corriente arriba y un oligonucleótido de sonda (PO) ; en donde el oligonucleótido corriente arriba comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el oligonucleótido corriente arriba está localizado corriente arriba del PO; el oligonucleótido corriente arriba o su hebra extendida induce desdoblamiento del PO por una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' ; (b) poner en contacto el resultado de la etapa (a) con la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para desdoblamiento del PO; en donde cuando el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo, el PO es desdoblado por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' para producir un fragmento desdoblado; (c) realizar una reacción de hibridación en la presencia de un agente intercalante poniendo en contacto el resultado de la etapa (b) con un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO; en donde la reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que el fragmento desdoblado no es hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado; y (d) detectar la incidencia del desdoblamiento del PO midiendo una señal del agente intercalante en el sustrato sólido; de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Puesto que la tercera modalidad de esta invención es la misma como la primera modalidad usando la etiqueta única excepto para un sistema de etiqueta, las descripciones comunes entre ellas son omitidas con el fin de evitar la redundancia indebida que conduce a la complejidad de esta especificación .

De conformidad con una modalidad preferida, la reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que el fragmento desdoblado producido por el desdoblamiento del PO no es hibridizado con el CO.

Tintes intercalantes ejemplificados útiles en esta invención incluyen SYBR™ Green I, P0-PR0™-1, B0-PR0™-1, SYTO™43, SYTO™44, SYTO™45, SYTOX™Blue, P0P0™-1, P0P0™-3, BOBO™-1 , BOBO™-3, LO-PRO™-1, JO-PRO™-1, Y0-PR0™1, T0-PR0™1, SYT0™11, SYT0™13, SYT0™15, SYT0™16, SYTO™20, SYT0™23, TOTO™-3, YOYO™3, GelStar™ y tiazol anaranjado. Los tintes intercalantes se intercalan específicamente en las moléculas de doble hebra de ácidos nucleicos para generar señales.

Donde la secuencia de ácido nucleico objetivo está presente, el duplo CO/PO no desdoblado no se forma debido al desdoblamiento del PO y por lo tanto la señal del agente intercalante no se proporciona. La medición de extinción (o reducción) del único a partir del agente intercalante en el sustrato sólido permite determinar la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo (véase Figura 13) .

De conformidad con una modalidad preferida, el método comprende además repetir las etapas (a) -(b), (a) -(c) o (a) -(d) con desnaturalización entre ciclos de repetición. Esta repetición permite amplificar la secuencia de ácido nucleico objetivo y/o la señal objetivo.

De conformidad con una modalidad preferida, las etapas (a) -(d) se realizan en un recipiente de reacción o en recipientes de reacción separados. Más preferiblemente, las etapas (a) -(b) y etapas (c)-(d) se realizan en un recipiente de reacción o en recipientes de reacción separados.

Preferiblemente, las etapas (a) -(b) y etapas (c)-(d) pueden ser realizadas de manera separada aún en un recipiente de reacción. Por ejemplo, donde la hibridi zación entre la porción de objetivo del PO y la secuencia de ácido nucleico objetivo ocurre bajo condiciones rigurosas superiores que aquellas para hibridización entre el fragmento del PO y el CO, la repetición de las etapas (a) -(b) se puede llevar a cabo sin proceder con las etapas (c)-(d). Después de la terminación de la repetición de las etapas (a) -(b), las etapas (c)-(d) pueden llevarse a cabo sucesivamente.

Donde las etapas (a) -(b) y etapas (c)-(d) pueden ser realizadas de manera separada, las etapas (a) -(b) se llevan a cabo repetidamente con desnaturalización entre ciclos de repetición.

Donde la presente invención usando un cebador corriente arriba se lleva a cabo repitiendo etapas con desnaturalización entre ciclos de repetición, es preferible realizar el método en la presencia de un cebador corriente abajo. Muy preferiblemente, el presente método se lleva a cabo de conformidad con PCR (reacción en cadena de la polimerasa) .

Donde la presente invención usando una sonda corriente arriba se lleva a cabo repitiendo etapas con desnaturalización entre ciclos de repetición, es preferible realizar el método en la presencia de un cebador corriente abaj o .

La presente invención no requiere que las secuencias de ácido nucleico objetivo a ser detectadas y/o amplificadas tengan cualquier secuencia o longitud particular, que incluye cualquiera de las moléculas de ADN (ADNg y ADNc) y ARN .

Donde un ARNm se emplea como material de partida, una etapa de transcripción inversa es necesaria previo a realizar la etapa de templado, detalles de la cual se encuentran en Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001); y Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988). Para transcripción inversa, un hexámero aleatorio o un cebador dT de oligonucleótido hibridizable al ARNm puede ser usado.

Las secuencias de ácido nucleico objetivo las cuales pueden ser detectadas y/o amplificadas incluyen cualquiera de procarióticos, eucarióticos (por ejemplo, protozoarios y parásitos, hongo, levadura, plantas superiores, animales superiores e inferiores, que incluyen mamíferos y humanos) o virales (por ejemplo, virus del Herpes, VIH, virus de la influenza, virus Epstein-Barr, virus de la hepatitis, virus de la polio, etc.) que se originan naturalmente o ácido nucleico viroide.

La secuencia de ácido nucleico objetivo a ser detectada por la presente invención incluye una amplia variedad de secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, secuencias en un genoma, artificialmente aisladas o secuencias fragmentadas y secuencias sintetizadas (por ejemplo, secuencias de ADNc y secuencias de código de barras). Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico objetivo incluye secuencias marcadoras de ácido nucleico para Inmuno-PCR (IPCR). El IPCR emplea conjugados entre secuencias marcadoras de ácido nucleico y anticuerpos junto con PCR, lo cual es ampliamente aplicado para detectar varios tipos de objetivo que incluyen proteínas (véase Sano et al., Science 258 pp: 120-122(1992), La Patente Estadounidense No. 5,665,539, Niemeyer et al., Trends en Biotechnology 23 pp: 208-216 (2005) , Publicación de Patente Estadounidense No. 2005/0239108 y Ye et al., Journal of Environmental Science 22 pp: 796-300 (2010) ) .

El término "variación de nucleótido" usado en la presente se refiere a cualquiera de las sustituciones, supresiones o inserciones de nucleótido únicas o múltiples, en una secuencia de ADN en una ubicación particular entre segmentos de ADN contiguos que son de otro modo similares en secuencia .

Tales segmentos de ADN contiguos incluyen un gene o cualquier otra porción de un cromosoma. Estas variaciones de nucleótidos pueden ser variaciones de alelos mutantes o polimórficos . Por ejemplo, la variación de nucleótido detectada en la presente invención incluye SNP (polimorfismo de nucleótido único) , mutación, supresión, inserción, sustitución y transubicación. Variación de nucleótido ejemplificada incluye numerosas variaciones en un genoma humano (por ejemplo, variaciones en el MTHFR (gen (metilentetrahidrofolato reductasa) , variaciones involucradas en la resistencia al fármaco de patógenos y tumorigénesis causando variaciones. El término variación de nucleótido usado en la presente incluye cualquier variación en una ubicación particular en una molécula de ADN. En otras palabras, el término variación de nucleótido incluye un tipo nativo y su cualquier tipo mutante en una ubicación particular en una molécula de ADN.

En la presente invención para detección de una variación de nucleótido en una secuencia de ácido nucleico objetivo, donde cebadores o sondas usados tienen una secuencia complementaria a la variación de nucleótido en la secuencia de ácido nucleico objetivo, la secuencia de ácido nucleico objetivo que contiene la variación de nucleótido es descrita en la presente como una plantilla de apareamiento. Donde cebadores o sondas usados tienen una secuencia no complementaria a la variación de nucleótido en la secuencia de ácido nucleico objetivo, la secuencia de ácido nucleico objetivo que contiene la variación de nucleótido es descrita en la presente como una plantilla de desapareamiento.

Para detección de variación de nucleótidos, el extremo-3' del cebador corriente arriba puede ser diseñado para estar opuesto a un sitio de una variación de nucleótido en una secuencia de ácido nucleico objetivo. De conformidad con una modalidad preferida, el extremo-3' del cebador corriente arriba tiene una secuencia complementaria a la variación de nucleótido en una secuencia de ácido nucleico objetivo. El extremo-3' del cebador corriente arriba que tiene una secuencia complementaria a la variación de nucleótido en la secuencia de ácido nucleico objetivo es templado en la plantilla de apareamiento y extendido para inducir desdoblamiento del PTO. Por el contrario, donde el extremo-3' del cebador corriente arriba es desapareado en una variación de nucleótido en una plantilla de desapareamiento, no se extiende bajo condiciones que el templado del extremo-3' de los cebadores es esencial para la extensión aún cuando el cebador corriente arriba es hibridizado con la plantilla de apareamiento, de este modo resultando en ningún desdoblamiento del PTO.

Alternativamente, es posible usar desdoblamiento de PO dependiendo del la hibridización de PO que tiene una secuencia complementaria en una variación de nucleótido en una secuencia de ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, bajo condiciones controladas, un PO que tiene una secuencia complementaria a la variación de nucleótido en la secuencia de ácido nucleico objetivo es hibridizado con la plantilla de apareamiento y después desdoblado. Entre tanto, bajo las condiciones controladas, el PO no es hibridizado con una plantilla de desapareamiento que no tiene secuencia complementaria en la posición de variación de nucleótido y no es desdoblada. Preferiblemente, en este caso, la secuencia complementaria a la variación de nucleótido en el PO se posiciona en su mitad de la porción de objetivo al 3' del PO.

Alternativamente, la presente invención usa el PO que tiene el sitio de discriminación de variación de nucleótido posicionado en la parte del extremo 5' de la porción de objetivo al 3' para selectividad del PO a una variación de nucleótido especifico. La parte del extremo 5' de la porción de objetivo al 3' del PO se posiciona en una variación de nucleótido en una secuencia de ácido nucleico objetivo para la detección de la variación de nucleótido y la parte del extremo 5' de la porción de objetivo al 3' del PO tiene una secuencia complementaria a la variación de nucleótido en una secuencia de ácido nucleico objetivo.

El término usado en la presente "sitio de discriminación de variación de nucleótido" con referencia al PO significa un sitio (i) que comprende una secuencia complementaria a la variación de nucleótido en el ácido nucleico objetivo y (ii) posicionado en una parte del extremo-5' de la porción de objetivo al 3' .

Donde el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo (es decir, plantilla apareada) que tiene la variación de nucleótido complementario con el sitio de discriminación de variación de nucleótido, la parte del extremo 5' de la porción de objetivo al 3' forma una hebra doble con la plantilla apareada; sin embargo, donde el PO es hibridizado con una secuencia de ácido nucleico objetivo (es decir, plantilla desapareada) que tiene una variación de nucleótido no complementario con el sitio de discriminación de variación de nucleótido, la parte del extremo 5' de la porción de objetivo al 3' no forma una hebra doble con la plantilla desapareada.

Es de notarse que tales patrones de hibridización distintas en la variación de nucleótido de interés son responsables de diferencias en los sitios iniciales de desdoblamiento del PO.

La nucleasa al 5' usada en la presente invención es una enzima capaz de digerir una hebra de una molécula de ácido nucleico de doble hebra en una dirección de 5' a 3' exonucleoliticamente o endonucleoliticamente . En general, el sitio de desdoblamiento en el PO por la nucleasa al 5' puede ser variado dependiendo del hibridización de la porción del extremo-5' del PO.

Donde el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo (es decir, plantilla apareada) que tiene la variación de nucleótido complementario al sitio de discriminación de variación, la parte del extremo 5' de la porción de objetivo al 3' forma una hebra doble con la secuencia de ácido nucleico objetivo para inducir desdoblamiento a partir de un primer sitio inicial de desdoblamiento .

Donde el PO es hibridizado con una secuencia de ácido nucleico objetivo (es decir, plantilla desapareada) que tiene una variación de nucleótido no complementaria al sitio de discriminación de variación, la parte del extremo 5' de la porción de objetivo al 3' no forma una hebra doble con la secuencia de ácido nucleico objetivo para inducir desdoblamiento a partir de un segundo sitio inicial de desdoblamiento localizado corriente abajo del primer sitio inicial de desdoblamiento.

Es de notar que el segundo sitio inicial de desdoblamiento se localiza corriente abajo del primer sitio inicial de desdoblamiento.

El término usado en la presente "un primer sitio inicial de desdoblamiento" en conjunto con el PO significa en un sitio de desdoblamiento del PO siendo primeramente desdoblado cuando el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo que tiene la variación de nucleótido complementario al sitio de discriminación de variación. El término usado en la presente "un segundo sitio inicial de desdoblamiento" en conjunto con el PO significa en un sitio de desdoblamiento del PO siendo primeramente desdoblado cuando el PO es hibridizado con una secuencia de ácido nucleico objetivo que tiene una variación de nucleótido no complementaria al sitio de discriminación de variación.

De conformidad con una modalidad preferida, el sitio de discriminación de variación de nucleótido se localiza dentro de 10 nucleótidos, más preferiblemente 8 nucleótidos, todavía más preferiblemente 6 nucleótidos, todavía mucho más preferiblemente 4 nucleótidos, 3 nucleótidos, ,2 nucleótidos o 1 nucleótido aparte del extremo-5' de la porción de objetivo al 3' del PO. Preferiblemente, el sitio de discriminación de variación de nucleótido se localiza en el extremo-5' de la porción de objetivo al 3' del PO.

El término "sitio" con referencia a cualquier sitio de discriminación de variación de nucleótido de sondas o sitio de variación de nucleótido en secuencias objetivo es usado en la presente para abarcar no solamente un nucleótido único sino también una pluralidad de nucleótidos.

El PO que tiene el sitio de discriminación de variación de nucleótido posicionado en la parte del extremo 5' de la porción de objetivo al 3' puede ser empleado para detectar una variación de nucleótido junto con un bloqueador resistente al desdoblamiento por la enzima que tiene actividad de nucleasa al 5' .

Por ejemplo, el PO tiene una porción bloqueadora que contiene, como un bloqueador, al menos un nucleótido resistente al desdoblamiento por la enzima que tiene actividad de nucleasa al 5' y la porción bloqueadora se posiciona en un sitio para ser inicialmente desdoblada después de la hibridización del PO con la plantilla desapareada. Donde el PO que tiene la porción bloqueadora es hibridizado con una plantilla apareada, el desdoblamiento a partir de un primer sitio inicial de desdoblamiento no es afectado. Sin embargo, donde el PO que tiene la porción bloqueadora es hibridizado con una plantilla desapareada, la porción bloqueadora previene el desdoblamiento a partir de un segundo sitio inicial de desdoblamiento.

El número de bloqueadores contenidos en la porción bloqueadora puede ser no limitado, preferiblemente, 1-10, más preferiblemente 2-10, todavía más preferiblemente 3-8, muy preferiblemente 3-6 bloqueadores. Los bloqueadores presentes en las sondas pueden estar en una manera continua o intermitente, preferiblemente una manera continua. Los nucleótidos como bloqueadores con un esqueleto resistente a la actividad de exonucleasa al 5' a 3' incluyen cualquiera de los conocidos por uno de habilidad en la técnica. Por ejemplo, incluyen varios enlaces fosforotioato, enlaces de fosfonato, enlaces de fosforoamidato y modificaciones de 2'-carbohidratos. De conformidad con una modalidad más preferida, nucleótidos que tienen un armazón resistente a la exonucleasa 5' a 3' incluyen enlace de fosforotioato, enlaces de alquil fosfotriéster, enlaces de -aril fosfotriéster , enlace de alquil fosfonato, enlace de aril fosfonato, enlace de fosfato de hidrógeno, enlace de alquil fosforoamidato, enlace de aril fosforoamidato, enlace de fosforoselenato, modificación de 2 ' -O-aminopropilo, modificación de 2'-0-alquilo, modificación de 2'-0-alilo, modificación de 2'-0-butilo, oligodesoxinucleótido a-anomérico y modificación 1- (4' -tio- -D-ribofuranosilo) .

Opcionalmente , la detección de variación de nucleótidos puede ser realizada por una selección apropiada de ubicación de etiqueta considerando las ubicaciones del primer sitio inicial de desdoblamiento y el segundo sitio inicial de desdoblamiento sin el uso de bloqueadores.

Donde una etiqueta única se usa, las ubicaciones adecuadas de la etiqueta única permiten los siguientes: un fragmento que contiene etiqueta única formado por desdoblamiento del PO hibridizado con la plantilla apareada no es hibridizado con el CO pero un fragmento que contiene etiqueta única formado por desdoblamiento del PO hibridizado con la plantilla desapareada es hibridizado con el CO. La hibridización entre el CO y el fragmento que contiene la etiqueta única formado por desdoblamiento del PO hibridizado con la plantilla desapareada proporciona señal idéntica a aquella proporcionada por hibridización entre el PO no desdoblado y el CO, de este modo permitiendo detectar variación de nucleótidos.

De conformidad con una modalidad más preferida, una etiqueta única ligada al PO se localiza en un nucleótido entre el primer sitio inicial de desdoblamiento y el segundo sitio inicial de desdoblamiento.

En caso que una etiqueta dual interactiva se use, las ubicaciones adecuadas de la etiqueta dual permiten los siguientes: (i) después del desdoblamiento del PO hibridizado con la plantilla apareada, la etiqueta dual se separa de cada una de las otras y al menos uno de un fragmento que contiene donador y un fragmento que contiene aceptor no es hibridizado con el CO. (ii) después del desdoblamiento del PO hibridizado con la plantilla desapareada, la etiqueta dual no es separada de cada una de las otras y un fragmento que contiene etiqueta dual es hibridizado con el CO. La hibridización entre el CO y el fragmento que contiene etiqueta dual formado por desdoblamiento del PO hibridizado con la plantilla desapareada proporciona señal idéntica con aquella proporcionada por hibridización entre el PO no desdoblado y el CO, de este modo permitiendo detectar variación de nucleótidos .

De conformidad con una modalidad más preferida, donde el PO con una etiqueta dual se usa, una de la etiqueta dual está ligada a un nucleótido presente corriente arriba del primer sitio inicial de desdoblamiento y la otra en un nucleótido presente entre el primer sitio inicial de desdoblamiento y el segundo sitio inicial de desdoblamiento.' Por ejemplo, donde el PO etiquetado al 5' que tiene el sitio de discriminación de variación de nucleótido posicionado en la parte del extremo 5' de la porción de objetivo al 3' junto con el CO para ser hibridizado con la porción etiquetante al 5' se emplean, una ubicación adecuada de etiquetar permite la variación de nucleótidos sin el uso de bloqueadores .

Donde el PO etiquetado al 5' con una etiqueta única se usa, la etiqueta única ligada al PO etiquetado al 5' es preferiblemente localizado en un nucleótido entre el primer sitio inicial de desdoblamiento y el segundo sitio inicial de desdoblamiento .

La Figura 21 representa modalidades para detectar variación de nucleotido usando PO etiquetado al 5' con una etiqueta única. El sitio de discriminación de variación de nucleotido se posiciona en 1 nucleotido aparte del extremo-5' de la parte del extremo 5' de la porción de objetivo al 3' . La etiqueta única está ligada al nucleotido posicionado entre el primer sitio inicial de desdoblamiento y el segundo sitio inicial de desdoblamiento.

Cuando el PO etiquetado al 5' que contiene la etiqueta única es hibridizado con la plantilla apareada, se desdobla en el primer sitio inicial de desdoblamiento y un fragmento que contiene la porción etiquetante al 5' sin la etiqueta única es generado. Como el CO comprende una secuencia de nucleotido hibridizable con la porción etiquetante del PO, el fragmento que contiene la etiqueta única formado por desdoblamiento del PO hibridizado con la plantilla apareada no es hibridizado con el CO. Cuando el PO etiquetado al 5' que contiene la etiqueta única es hibridizado con la plantilla desapareada, se desdobla en el segundo sitio inicial de desdoblamiento y un fragmento que contiene la porción etiquetante al 5' con la etiqueta única es generado. Como el CO comprende una secuencia de nucleotido hibridizable con la porción etiquetante del PO, el fragmento que contiene la etiqueta única formado por desdoblamiento del PO hibridizado con la plantilla desapareada es hibridizado con el CO. La hibridización entre el CO y el fragmento que contiene la etiqueta única formado por desdoblamiento del PO hibridizado con la plantilla desapareada proporciona señal idéntica con aquella proporcionada por hibridización entre el PO no desdoblado y el CO.

Consecuentemente, diferentes señales pueden ser proporcionadas dependiendo de la presencia de variaciones de nucleótidos .

Donde el PO etiquetado al 5' con una etiqueta dual se usa, se prefiere que una de la etiqueta dual está ligada a un nucleótido presente corriente arriba del primer sitio inicial de desdoblamiento (por ejemplo, extremo-5' de la porción etiquetante al 5' de PO) y la otra a un nucleótido presente entre el primer sitio inicial de desdoblamiento y el segundo sitio inicial de desdoblamiento.

Cuando el PO etiquetado al 5' que contiene la etiqueta dual es hibridizado con la plantilla apareada, se desdobla en el primer sitio inicial de desdoblamiento y la etiqueta dual se separa para formar un fragmento que contiene molécula donadora y un fragmento que contiene molécula aceptora. Uno de los fragmentos comprende la porción etiquetante al 5' y es hibridizado con el CO que comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante del PO etiquetado al 5' . Cuando el PO etiquetado al 5' que contiene la etiqueta dual es 'hibridizado con la plantilla desapareada, se desdobla en el segundo sitio inicial de ¦ desdoblamiento, generando un fragmento que contiene la porción etiquetante al 5' con la etiqueta dual. El fragmento que contiene la porción etiquetante al 5' con la etiqueta dual es hibridizado con el CO y el producto de hibridización proporciona la señal idéntica a aquella de la hibridización entre el PO etiquetado al 5' no desdoblado y el CO.

Consecuentemente, diferentes señales pueden ser proporcionadas dependiendo de la presencia de variaciones de nucleótidos .

De conformidad con una modalidad preferida, es preferible entonces que parte del extremo-5' de la porción de objetivo al 3' del PO comprenda una porción de apareamiento sin base localizada dentro de 1-10 nucleótidos (más preferiblemente 1-5 nucleótidos) aparte del sitio de discriminación de variación de nucleótido La Figura 22 representa modalidades para detectar variación de nucleótido usando la porción de apareamiento sin base .

La porción de apareamiento sin base previene a la parte del extremo 5' de la porción de objetivo al 3' de formación de una hebra doble con la secuencia de nucleótido objetivo cuando el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo que tiene la variación de nucleótido no complementaria al sitio de discriminación de variación.

El uso de la porción de apareamiento sin base (por ejemplo, nucleótido desapareado) mejora la discriminación potencial del PO a variaciones de nucleótidos.

De conformidad con una modalidad preferida, la porción de apareamiento sin base no inhibe la formación de una hebra doble entre la parte del extremo-5' y la secuencia de ácido nucleico objetivo cuando el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo que tiene la variación de nucleótido complementario con el sitio de discriminación de variación de nucleótido.

De conformidad con una modalidad preferida, la porción de apareamiento sin base amplia la distancia entre el primer sitio inicial de desdoblamiento en el híbrido del PO y la plantilla de apareamiento y el segundo sitio inicial de desdoblamiento en el híbrido del PO y la plantilla de apareamiento .

La porción de apareamiento sin base incluye cualquiera de las porciones que no forman un par base entre secuencias de ácidos nucleicos objetivos. Preferiblemente, la porción de apareamiento sin base es (i) un nucleótido que comprende una base de desapareamiento artificial, una base de apareamiento sin base modificada para ser incapaz de apareamiento de base o una base universal, (ii) un nucleótido de apareamiento sin base modificada para ser incapaz del apareamiento de base, o (iii) un compuesto químico de apareamiento sin base.

Por ejemplo, la porción de apareamiento sin base incluye grupo alquileno, ribofuranosil naftaleno, desoxi ribofuranosil naftaleno, metafosfato, enlace fosforotioato, enlace alquil fosfotriéster , enlace aril fosfotriéster, enlace alquil fosfonato, enlace aril fosfonato, enlace fosfonato de hidrógeno, enlace alquil fosforoamidato y enlace aril fosforoamidato . Los espaciadores de carbono convencionales son también usados como porciones de apareamiento sin base. Bases universales como porciones de apareamiento sin base son útiles para ajustar los sitios de desdoblamiento del PO.

La porción de apareamiento sin base introducida en la parte del extremo-5' tiene preferiblemente 1-10, más preferiblemente 1-5, todavía más preferiblemente 1-2 porciones. Una pluralidad de porciones de apareamiento sin base en la parte del extremo-5' puede estar presente en una manera consecutiva o intermitente. Preferiblemente, la porción de apareamiento sin base tiene 2-5 porciones consecutivas .

Preferiblemente, la porción de apareamiento sin base es un compuesto químico de apareamiento sin base.

De conformidad con una modalidad preferida, el sitio de discriminación de variación de nucleótido y la porción de apareamiento sin base del PO se localizan dentro de 10 nucleótidos (más preferiblemente 8 nucleótidos, 7 nucleótidos, 6 nucleótidos, 5 nucleótidos, 4 nucleótidos, 3 nucleótidos, 2 nucleótidos o 1 nucleótido, todavía más preferiblemente 1 nucleótido) aparte del extremo-5' de la porción de objetivo al 3'.

De conformidad con una modalidad preferida, la porción de apareamiento sin base se localiza corriente abajo del primer sitio inicial de desdoblamiento.

De conformidad con una modalidad preferida, la secuencia de ácido nucleico objetivo usada en la presente invención es una secuencia de ácido nucleico pre-amplificada por un cebador de amplificación.

Las ventajas de la presente invención pueden ser resaltadas en la detección simultánea (múltiple) de al menos dos secuencias de ácidos nucleicos objetivos. De conformidad con una modalidad preferida, el método se realiza para detectar al menos dos tipos (más preferiblemente, al menos tres tipos, todavía más preferiblemente al menos cinco tipos) de secuencias de ácido nucleico objetivo. El oligonucleótido corriente arriba comprende al menos dos tipos (más preferiblemente, al menos tres tipos, todavía más preferiblemente al menos cinco tipos) de oligonucleótidos , el PO comprende al menos dos tipos (más preferiblemente, al menos tres tipos, todavía más preferiblemente al menos cinco tipos) del POs y el CO comprende al menos dos tipos (más preferiblemente, al menos tres tipos, todavía más preferiblemente al menos cinco tipos) del CO.

En la modalidad usando el PO etiquetado, las porciones etiquetantes de al menos dos POs pueden tener la secuencia idéntica a o secuencia diferente de entre sí. Por ejemplo, donde la presente invención se lleva a cabo seleccionando secuencias de ácidos nucleicos objetivos (por ejemplo, detección de una secuencia de ácido nucleico entre una pluralidad de secuencias de ácido nucleico objetivo) , los POs que tienen las porciones etiquetantes con la secuencia idéntica pueden ser usados.

Además, un tipo único del CO puede ser usado para detección de una pluralidad de secuencias de ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, donde los POs que tienen una secuencia idéntica en sus porciones etiquetantes se emplean para seleccionar secuencias de ácidos nucleicos objetivos, un tipo único del CO puede ser usado.

De conformidad con una modalidad preferida, el presente método puede ser realizado usando al menos dos corriente abajo cebadores.

Modalidades Preferibles de la Invención En una modalidad preferible de esta invención, se proporciona un método para detectar secuencias de ácidos nucleicos objetivos a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, que comprende: (a) hibridizar las secuencias de ácido nucleico objetivo con un par cebador que comprende un cebador corriente arriba y un cebador corriente abajo y un PO (Oligonucleótido de Sonda) ; en donde cada uno del cebador corriente arriba y el cebador corriente abajo comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO tiene una etiqueta única; el PO es bloqueado en su extremo 3' para prohibir su extensión; la porción de objetivo del PO se localiza entre el cebador corriente arriba y el cebador corriente abajo; una hebra extendida del cebador corriente arriba induce desdoblamiento del PO por una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla que tiene una actividad de nucleasa al 5' ; (b) poner en contacto el resultado de la etapa (a) con una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla que tiene una actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para la extensión de los cebadores y para desdoblamiento del PO; en donde cuando el PO es hibridizado con las secuencias de ácido nucleico objetivo, el PO se • desdobla por la polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla que tiene la actividad de nucleasa al 5' para producir un fragmento que contiene etiqueta única; (c) realizar una reacción de hibridación poniendo en contacto el resultado de la etapa (b) con un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO; en donde la reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que el fragmento que contiene la etiqueta única no es hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado; (d) desnaturalizar el resultado de la etapa (c) ; (e) repetir las etapas (a) -(d) al menos dos veces; y (f) detectar la incidencia del desdoblamiento del PO midiendo una señal de la etiqueta única en el sustrato sólido; de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Alternativamente, la etapa (b) es seguida por (b-1) desnaturalizar el resultado de la etapa (b) y (b-2) repetir las etapas (a) -(b-1) al menos dos veces. En este caso, las etapas (d) y (e) son opcionales.

La medición de la señal a partir de la etiqueta única puede ser realizada para cada ciclo de la repetición, después de la repetición de etapa (d) o a intervalos de tiempo predeterminados durante la repetición de la etapa (d) .

En otra modalidad preferible de esta invención, se proporciona un método para detectar secuencias de ácidos nucleicos objetivos a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, que comprende: (a) hibridizar las secuencias de ácido nucleico objetivo con un par cebador que comprende un cebador corriente arriba y un cebador corriente abajo y . un PO (Oligonucleótido de Sonda) ; en donde cada uno del cebador corriente arriba y el cebador corriente abajo comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO tiene una etiqueta dual interactiva que comprende una molécula donadora y una molécula aceptora; el PO es bloqueado en su extremo 3' para prohibir su extensión; la porción de objetivo del PO se localiza entre el cebador corriente arriba y el cebador corriente abajo; una hebra extendida del cebador corriente arriba induce desdoblamiento del PO por una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla que tiene una actividad de nucleasa al 5' ; (b) poner en contacto el resultado de la etapa (a) con una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla que tiene una actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para la extensión de los cebadores y para desdoblamiento del PO; en donde cuando el PO es hibridizado con las secuencias de ácido nucleico objetivo, el PO es desdoblado por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' para separar la etiqueta dual interactiva, de este modo se producen un fragmento que contiene donador y un fragmento que contiene aceptor; (c) realizar una reacción de hibridación poniendo en contacto el resultado de la etapa (b) con un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde la reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que al menos uno del fragmento que contiene donador y el fragmento que contiene aceptor es no hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado; en donde una señal del duplo CO/PO no desdoblado es diferenciada de una señal proporcionada en el tiempo que al menos uno del fragmento que contiene donador y el fragmento que contiene aceptor es no hibridizado con el CO; (d) desnaturalizar el resultado de la etapa (c) ; (e) repetir las etapas (a) -(d) al menos dos veces; y (f) detectar la incidencia del desdoblamiento del PO midiendo una señal de la etiqueta dual interactiva en el sustrato sólido; de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico obj etivo .

Alternativamente, la etapa (b) es seguida por (b-1) desnaturalizar el resultado de la etapa (b) y (b-2) repetir las etapas (a) -(b-1) al menos dos veces. En este caso, las etapas (d) y (e) son opcionales.

En todavía otra modalidad preferible de esta invención, se proporciona un método para detectar secuencias de ácidos nucleicos objetivos a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, que comprende: (a) hibridizar las secuencias de ácido nucleico objetivo con un par cebador que comprende un cebador corriente arriba y un cebador corriente abajo y un PO (Oligonucleótido de Sonda) ; en donde cada uno del cebador corriente arriba y el cebador corriente abajo comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO es bloqueado en su extremo 3' para prohibir su extensión; la porción de objetivo del PO se localiza entre el cebador corriente arriba y el cebador corriente abajo; una hebra extendida del cebador corriente arriba induce desdoblamiento del PO por una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla que tiene una actividad de nucleasa al 5' ; (b) poner en contacto el resultado de la etapa (a) con una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla que tiene una actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para la extensión de los cebadores y para desdoblamiento del PO; en donde cuando el PO es hibridizado con las secuencias de ácido nucleico objetivo, el PO se desdobla por la polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla que tiene la actividad de nucleasa al 5' para producir un fragmento que contiene etiqueta única; (c) realizar una reacción de hibridación en la presencia de un agente intercalante poniendo en contacto el resultado de la etapa (b) con un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO; en donde la reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que el fragmento que contiene la etiqueta única no es hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado; (d) desnaturalizar el resultado de la etapa (c) ; (e) repetir las etapas (a) -(d) al menos dos veces; y (f) detectar la incidencia del desdoblamiento del PO midiendo una señal del agente intercalante en el sustrato sólido; de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Alternativamente, la etapa (b) es seguida por (b-1) desnaturalizar el resultado de la etapa (b) y (b-2) repetir las etapas (a) -(b-1) al menos dos veces. En este caso, las etapas (d) y (e) son opcionales.

IV. Proceso de Detección de Objetivo por Ensayo POCH con base en la Actividad de Nucleasa al 5' Independiente del Oligonucleótido Corriente Arriba.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos ' por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, que comprende: (a) hibridizar la secuencia de ácido nucleico objetivo con un oligonucleótido de sonda (PO); en donde el PO comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO tiene una etiqueta única; (b) poner en contacto el resultado de la etapa (a) con una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para desdoblamiento del PO; en donde cuando el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo, el PO es desdoblado por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' para producir un fragmento que contiene etiqueta única; (c) realizar una reacción de hibridación poniendo en contacto el resultado de la etapa (b) con un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO; en donde la reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que el fragmento que contiene etiqueta única no es hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado; y (d) detectar la incidencia del desdoblamiento del PO midiendo una señal de la etiqueta única en el sustrato sólido; de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

En un aspecto todavía adicional de esta invención, se proporciona un método para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, que comprende: (a) hibridizar la secuencia de ácido nucleico objetivo con un oligonucleótido de sonda (PO); en donde el PO comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO tiene una etiqueta dual interactiva que comprende una molécula donadora y una molécula aceptora; (b) poner en contacto el resultado de la etapa (a) con una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para desdoblamiento del PO; en donde cuando el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo, el PO es desdoblado por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' para separar la etiqueta dual interactiva, de este modo se producen un fragmento que contiene donador y un fragmento que contiene aceptor; (c) realizar una reacción de hibridación poniendo en contacto el resultado de la etapa (b) con un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO; en donde la reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que al menos uno del fragmento que contiene donador y el fragmento que contiene aceptor es no hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado; en donde una señal del duplo CO/PO no desdoblado es diferenciada de una señal proporcionada en el tiempo que al menos uno del fragmento que contiene donador y el fragmento que contiene aceptor es no hibridizado con el CO; y (d) detectar la incidencia del desdoblamiento del PO midiendo una señal de la etiqueta dual interactiva en el sustrato sólido; de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

En un aspecto todavía adicional de esta invención, se proporciona un método para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, que comprende: (a) hibridizar la secuencia de ácido nucleico objetivo con un oligonucleótido de sonda (PO); en donde el PO comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido ibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; (b) poner en contacto el resultado de la etapa (a) con una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para desdoblamiento del PO; en donde cuando el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo, el PO es desdoblado por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' para producir un fragmento desdoblado; (c) realizar una reacción de hibridación en la presencia de un agente intercalante poniendo en contacto el resultado de la etapa (b) con un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO; en donde la reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que el fragmento desdoblado no es hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado; y (d) detectar la incidencia del desdoblamiento del PO midiendo una señal del agente intercalante en el sustrato sólido; de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

La presente invención se puede llevar a cabo sin el uso del oligonucleótido corriente arriba. El PO puede ser desdoblado por actividad de nucleasa al 5' independiente del oligonucleótido corriente arriba. En tal caso, enzimas convencionales que tienen actividad de nucleasa al 5' independiente del oligonucleótido corriente arriba pueden ser usadas .

Por ejemplo, nucleasa FEN al 5' que tiene actividad de exonucleasa al 5' independiente del oligonucleótido corriente arriba y/o actividad de nucleasa al extremo-5' puede ser usada.

Entre las polimerasas dependiente de la plantilla, existen varias enzimas que tienen actividad de nucleasa al 5' independiente del oligonucleótido corriente arriba (actividad de exonucleasa al 5' y/o actividad de endonucleasa al 5' ) , por ejemplo, polimerasa de ADN Taq (véase, lawyer et al, Genome Res. 2 pp: 275-287(1993), O 2008/011004 y Lyamichev et. al., Science 260 pp : 778-783 ( 1993 )) .

De conformidad con una modalidad preferida, el desdoblamiento del PO por la polimerasa dependiente de la plantilla que tiene actividad de nucleasa al 5' independiente del oligonucleótido corriente arriba es afectada por la posición de etiquetas o tipo de etiquetas enlazantes presentes en el PO. Preferiblemente, donde una etiqueta está ligada al extremo-5' del PO no etiquetado, el desdoblamiento del PO no etiquetado por la polimerasa dependiente de la plantilla que tiene una actividad de nucleasa al 5' puede ser más eficiente si la etiqueta está ligada a un grupo fosfato del extremo-5' del PO no etiquetado, particularmente a través de un espaciador de carbono. Donde la etiqueta está ligada a una base del extremo-5' del PO no etiquetado o el espaciador de carbono no se usa, el desdoblamiento del PO no etiquetado es improbable que ocurra.

La eficiencia de desdoblamiento para la actividad de nucleasa al 5' dependiente del oligonucleótido corriente arriba puede ser superior que para la actividad de nucleasa al 5' independiente del oligonucleótido corriente arriba.

La actividad de nucleasa al 5' independiente del oligonucleótido corriente arriba es más susceptible a condiciones de reacción (por ejemplo, tipos de enzimas, composiciones amortiguadoras y secuencias del PO) .

Considerando la amplificación de secuencias de ácido nucleico objetivo y eficiencia de desdoblamiento del PO, el ensayo POCH de la presente invención es preferiblemente realizado usando oligonucleótidos corriente arriba .

Kits para Detección de Objetivo En un aspecto adicional de esta invención, se proporciona un kit para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridi zación de PO) en un sustrato sólido, que comprende: (a) un oligonucleótido de sonda (PO) que comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; (b) un oligonucleótido corriente arriba que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; en donde el oligonucleótido corriente arriba está localizado corriente arriba del PO; el oligonucleótido corriente arriba o su hebra extendida induce desdoblamiento del PO por una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' ; y (c) un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibrid'izable con el PO, de este modo un PO no desdoblado por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado .

Puesto que el kit de esta invención es construido para realizar el método de detección de la presente invención descrito anteriormente, las descripciones comunes entre ellas son omitidas con el fin de evitar redundancia indebida que conduce a la complejidad de esta especificación.

De conformidad con una modalidad preferida, el PO tiene una etiqueta única o una etiqueta dual interactiva.

De conformidad con una modalidad preferida, el PO es un PO etiquetado al 3' que comprende además en su porción-3' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo o un PO etiquetado al 5' que comprende además en su porción-5' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo, y la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante del PO.

De conformidad con una modalidad preferida, el PO es un PO etiquetado al 3' que comprende además en su porción-3' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo o un PO etiquetado al 5' que comprende además en su porción-5' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo, y la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con una parte de la porción etiquetante y una parte de la porción de objetivo del PO.

De conformidad con una modalidad preferida, el PO es un PO etiquetado al 3' que comprende además en su porción-3' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo y el CO es inmovilizado en el sustrato a través de su extremo-5' .

De conformidad con una modalidad preferida, el PO es un PO etiquetado al 5' que comprende además en su porción-5' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo y el CO es inmovilizado en el sustrato a través de su extremo-3' .

De conformidad con una modalidad preferida, el oligonucleótido corriente arriba es un cebador corriente arriba o una sonda corriente arriba.

De conformidad con una modalidad preferida, el kit comprende además una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' , más preferiblemente una polimerasa de ADN termoestable que tiene una actividad de nucleasa al 5' o nucleasa de FEN.

De conformidad con una modalidad preferida, el oligonucleótido corriente arriba se localiza adyacentemente al PO en la medida que el oligonucleótido corriente arriba induce desdoblamiento del PO por una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' .

De conformidad con una modalidad preferida, el oligonucleótido corriente arriba tiene una secuencia traslapada parcial con la porción de objetivo del PO.

De conformidad con una modalidad preferida, el cebador corriente arriba induce a través de su hebra extendida el desdoblamiento del PO por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' .

De conformidad con una modalidad preferida, el oligonucleótido corriente arriba es un cebador corriente arriba y la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' es una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla que tiene una actividad de nucleasa al 5' .

De conformidad con una modalidad preferida, el kit comprende además un agente intercalante.

De conformidad con una modalidad preferida, el kit se usa para detección de al menos dos tipos de secuencias de ácido nucleico objetivo. El oligonucleótido corriente arriba comprende al menos dos tipos de oligonucleótidos corriente arriba, el PO comprende al menos dos tipos de POs y el CO comprende al menos dos tipos de CO.

De conformidad con una modalidad preferida, el kit comprende además un cebador corriente abajo.

En todavía un aspecto adicional de esta invención, se proporciona un kit para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, que comprende: (a) un oligonucleótido de sonda (PO) que comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; y (b) un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO, de este modo un PO no desdoblado por una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado .

Las características y ventajas de esta invención serán resumidas como sigue: (a) La presente invención detecta una secuencia de ácido nucleico objetivo mediante el uso de la cual el PO (Oligonucleótido de Sonda) hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo se desdobla y el desdoblamiento del PO es detectado por hibridización con el CO (Oligonucleótido de Captura) . En la presente invención, una sonda no desdoblada es hibridizada con un oligonucleótido inmovilizado en un sustrato sólido.

De conformidad con tecnologías convencionales que emplean sonda objetivo y sonda de captura inmovilizada, se requiere prevenir las sondas objetivo no desdobladas de hibridizar con oligonucleótidos inmovilizados mediante (i) diseñar la sonda objetivo para tener una estructura de hairpina y controlar tanto condiciones para hibridización con secuencia objetivos como condiciones para hibridización con inmovilizado oligonucleótidos; o (ü) diseñar oligonucleótidos inmovilizados considerando la orientación de inmovilización de oligonucleótidos inmovilizados y su distancia de la superficie de un sustrato sólido. Por lo tanto, los métodos convencionales son muy convenientes en términos de diseño de sondas objetivo y oligonucleótidos inmovilizados y establecimiento de condiciones de reacción.

Por el contrarío, la presente invención está libre de tales inconveniencias y limitaciones. El diseño del PO y el CO es conveniente y la optimización de condiciones de reacción es rutinariamente fácil en la presente invención. (b) Donde la detección de señal en el sustrato sólido .es continuamente realizada junto con repetición de desdoblamiento de los POs en la presente invención, el número del POs desdoblado se incrementa después del número de repeticiones de la reacción de desdoblamiento y la señal se cambia en paralelo con el número del POs desdoblados. Entonces, la secuencia de ácido nucleico objetivo puede ser detectada en una manera en tiempo real. (c) La presente invención puede detectar simultáneamente una pluralidad de secuencias de ácido nucleico objetivo aún usando solamente un tipo de etiqueta. Puesto que el desdoblamiento del PO es detectado por hibridización con el CO inmovilizado en el sustrato sólido, el PO para cada ácido nucleico objetivo no se requiere para tener diferentes etiquetas para detección de una pluralidad de secuencias de ácido nucleico objetivo. (d) En general, podría ser entendido por uno de habilidad en la técnica que los métodos de detección usando hibridización directa entre secuencias de ácidos nucleicos objetivos y sondas inmovilizadas en sustratos sólidos pueden obtener resultados de hibridización exactos y efectivos debido a que los ambientes de reacción restringidos que son inherentes a una reacción de fase sólida. De manera indistinta, la presente invención emplea hibridización entre el PO y el CO sin involucrar secuencias de ácidos nucleicos objetivos en una fase sólida, proporcionando resultados más efectivos y exactos en ambientes y condiciones de reacción de fase sólida típicos. (e) Donde la presente invención usa el PO etiquetado y el CO que tiene una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante del PO, la secuencia de la porción etiquetante del PO y la secuencia del CO puede ser seleccionada sin consideración de una secuencia de ácido nucleico objetivo. Esto hace posible pre-diseñar una combinación de secuencias útiles en la presente invención. En particular, el CO puede ser preparado en una forma lista para usar sin consideración o conocimiento de secuencias de ácido nucleico objetivo. Tales características proporcionan ventajas prominentes en un arreglo de microensayo usando COs inmovilizados en un sustrato sólido.

La presente invención será ahora descrita en detalle adicional por los ejemplos. Podría ser obvio para aquellos expertos en la técnica que estos ejemplos están propuestos para ser más concretamente ilustrativos y el campo de la presente invención como se expone en las reivindicaciones adjuntas no está limitado a, o por los ej emplos .

EJEMPLOS EJEMPLO 1 : Evaluación de Ensayo de Desdoblamiento de Oligonucleotido de Sonda e Hibridización (POCH) usando un Oligonucleotido de Sonda (PO) no etiquetado de etiqueta única Un nuevo ensayo, Ensayo de Desdoblamiento e Hibridización de Olionucleótido de Sonda (POCH), se evaluó para la detección de una secuencia de ácido nucleico objetivo usando un PO no etiquetado de etiqueta única (véase Figura 2) . El desdoblamiento de PO se condujo en un tubo y una alícuota del resultante se tomó en un microarreglo donde el Oligonucleotido de Captura (CO) fue inmovilizado.

La polimerasa de ADN Taq que tiene actividad de nucleasa al 5' se usó para la extensión de cebador corriente arriba y el desdoblamiento de PO. El PO no etiquetado comprende una porción de objetivo complemento a la secuencia de ácido nucleico objetivo y tiene Quasar570 como una molécula reportera fluorescente en su extremo-5' . El CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción de objetivo del PO. El PO y CO son bloqueados con un espaciador de carbono en sus extremos-3' . El CO tiene poli (T) io como un brazo enlazador y fue inmovilizado en la superficie de una laminilla de vidrio usando un grupo amino (AminoC6) en su extremo-5' . Una sonda marcadora que tiene una molécula reportera fluorescente (Quasar570) en su extremo-5' fue inmovilizada en la superficie de la laminilla de vidrio usando un grupo araino en su extremo-3' . Oligonucleótido sintético para Neisseria gonorrhoeae (NG) se usó como una plantilla .

Las secuencias de plantillas sintéticas, cebador corriente arriba, PO, CO y marcador usados en este Ejemplo son : NG-T 5'- AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTT GTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3 ' (SEC ID NO: 1) NG-R 5 ' -CAATGGATCGGTATCACTCGC-3 ' (SEC ID NO: 2) NG-PO-1 5'-[Quasar570] TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG [espaciador C3]-3' (SEC ID NO: 3) NG-CO-1 5'-[AminoC6] TTTTTTTTTTCGAAACACGCCAATGAGGGGCA [espaciador C3]-3' (SEC ID NO : ) Marcador 5 ' - [Quasar570 ] ATATATATAT [AminoC7 ] -3 ' (SEC ID NO: 5) Laminillas NSB9 NHS (NSBPOSTECH, Corea) se usaron para fabricación del CO y marcador (SEC ID NOs : 4 y 5) . El CO y marcador disueltos en amortiguador de manchado NSB a la concentración final de 50 µ? se imprimieron en las laminillas de NSB9 NHS con Moteador de Microarreglo PersonalArrayer™! 6 (CapitalBio, China) . El CO y marcador se mancharon lado por lado en un formato 2x1 (manchas duplicadas) , y el microarreglo resultante se incubó en una cámara mantenida a ~85% de humedad durante la noche. Las laminillas entonces se lavaron en una solución amortiguadora que contiene 2x SSPE (0.3 M de cloruro de sodio, 0.02 M de fosfato hidrógeno de sodio y 2.0 mM de EDTA), pH 7.4 y 7.0 mM de SDS a 37 °C por 30 min para remover el CO unido no específicamente y marcador, y enjuagaron con agua destilada. Entonces, las laminillas funcionalizadas con ADN se secaron usando una centrífuga de laminilla y se almacenaron en la oscuridad a 4°C hasta el uso.

La reacción de desdoblamiento se condujo en el volumen final de 50 µ? que contiene 2 pmole de plantilla sintética (SEC ID NO: 1) por gen NG, 10 pmole de cebador corriente arriba (SEC ID NO: 2), 1 pmole de PO (SEC ID NO: 3), y 25 µ? de Mezcla Principal 2X que contiene 2.5 mM de MgCl2, 200 µ? de dNTPs, y 4 unidades de polimerasa de ADN Taq-H (Solgent, Corea) ; el tubo que contiene la mezcla de reacción se colocó en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) ; la mezcla de reacción se desnaturalizó por 15 min a 95°C y se sometió a 30 ciclos de 30 seg a 95°C y 60 seg a 60°C.

Los 30 µ? de la mezcla resultante se aplicaron a una cámara ensamblada en la superficie de la laminilla de vidrio NSB en la cual el CO (SEC ID NO: 4) fue reticulado. La laminilla se colocó en un bloque in situ en un termociclador (GenePro B4I, China) . La reacción de hibridización se dejó por 30 min a 55°C. La adquisición de imagen se llevó a cabo por el uso de Barrido Láser Confocal, Axon GenePix4300A (Molecular Device, US) con barrido a resolución de 5 pm de pixeles. La intensidad de fluorescencia se analizó por el uso de software de análisis de microarreglo cuantitativo, software GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). La intensidad de fluorescencia se expresó como manchas medianas después de sustracciones de antecedente local. Cada mancha se duplicó por la prueba de reproductibilidad . La intensidad de fluorescencia indica el valor promedio de las manchas duplicadas .

Como se muestra en la Figura 14, una señal fluorescente disminuida (RFU: 9,006+20.5) fue detectada en la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo en comparación con la señal fluorescente (RFU: 65,484+0.7) en la ausencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Estos resultados indican que el ensayo POCH es aplicable para la detección de una secuencia de ácido nucleico objetivo.

EJEMPLO 2 : Evaluación del ensayo POCH usando un PO etiquetado al 3' de hebra única Se evaluó además el ensayo POCH para la detección de una secuencia de ácido nucleico objetivo usando un PO etiquetado al 3' de etiqueta única (véase Figura 4). El desdoblamiento de PO se condujo en un tubo y una alícuota del resultante se tomó en un microarreglo donde el CO fue inmovilizado .

La polimerasa de ADN Taq que tiene actividad de nucleasa al 5' se usó para la extensión de cebador corriente arriba y el desdoblamiento de PO. El PO etiquetado al 3' comprende una porción de objetivo . complemento a la secuencia de ácido ' nucleico objetivo y una porción etiquetante al 3' no complemento a la secuencia de ácido nucleico objetivo. El PO etiquetado al 3' tiene Quasar570 como una molécula reportera fluorescente en su extremo-5' . El CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante al 3' del PO. El PO etiquetado al 3' y CO son bloqueados con un espaciador de carbono en sus extremos-3' . El CO tiene poli (T) 5 como un brazo enlazador y fue inmovilizado en la superficie de una laminilla de vidrio usando un grupo amino (AminoC6) en su extremo-5' . Una sonda marcadora que tiene una molécula reportera fluorescente (Q_uasar570) en su extremo-5' fue inmovilizada en la superficie de la laminilla de vidrio usando un grupo amino en su extremo-3' . El oligonucleótido sintético para Neisseria gonorrhoeae (NG) se usó como una plantilla .

Las secuencias de plantillas sintéticas, cebador corriente arriba, PO etiquetado al 3' , CO y marcador usados en este Ejemplo son: NG-T 5'-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTT GTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3 ' (SEC ID NO: 1) NG-R 5 ' -CAATGGATCGGTATCACTCGC-3 ' (SEC ID NO: 2) NG-PO-2 5'-[Quasar570] TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCGGACGACGGCTTGGCTTTACGA [espaci ador C3]-3' (SEC ID NO: 6) NG-CO-2 5'-[AminoC6] TTTTTTCGTAAAGCCAAGCCGTCGTC [espaciador C3]-3' (SEC ID NO: 7 ) Marcador 5 ' - [Quasar570] TATATATAT [AminoC7 ] -3 ' (SEC ID NO: 5) (Las letras subrayadas indican la porción etiquetante al 3' de PO) La preparación de laminilla se condujo como el mismo protocolo usado en el Ejemplo 1 excepto que el CO de la seg ID NO: 7 es usado en lugar de aquel de la seg ID NO: 4.

La reacción de desdoblamiento se condujo en el volumen final de 50 µ? que contiene 2 pmole de plantilla sintética (SEC ID NO: 1) por gen NG, 10 pmole de cebador corriente arriba (SEC ID NO: 2), 1 pmole de PO (SEC ID NO: 6), y 25 µ? de Mezcla Principal 2X que contiene 2.5 mM de MgCl2, 200 µ? de dNTPs, y 4 unidades de polimerasa de ADN Taq-W (Solgent, Corea) ; el tubo que contiene la mezcla de reacción se colocó en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) ; la mezcla de reacción se desnaturalizó por 15 min a 95°C y se sometió a 30 ciclos de 30 seg a 95°C y 60 seg a 60°C.

Los 30 µ? de la mezcla resultante se aplicaron a una cámara ensamblada en la superficie de la laminilla de vidrio NSB en la cual el CO (SEC ID NO: 7) fue reticulado. La laminilla se colocó en un bloque in situ en un termociclador (GenePro B4I, China) . La reacción de hibridización se dejó por 30 min a 55°C. La adquisición de imagen se llevó a cabo por el uso de Barrido Láser Confocal, Axon GenePix4300A (Molecular Device, US) con barrido a resolución de 5 pm de pixeles. La intensidad de fluorescencia se analizó por el uso de software de análisis de microarreglo cuantitativo, software GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). La intensidad de fluorescencia se expresó como manchas medianas después de sustracciones de antecedente local. Cada mancha se duplicó por la prueba de reproductibilidad . La intensidad de fluorescencia indica el valor promedio de las manchas duplicadas.

Como se muestra en la Figura 15, una señal fluorescente disminuida (RFU: 10,217±73.5) fue detectada en la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo en comparación con la señal fluorescente (RFU: 65,464±6.4) en la ausencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Estos resultados indican que el ensayo POCH usando un PO etiquetado al 3' de etiqueta única es aplicable para la detección de una secuencia de ácido nucleico objetivo.

EJEMPLO 3 : Evaluación del ensayo POCH usando un PO etiquetado al 5' de etiqueta única Se evaluó además el ensayo POCH usando un PO etiquetado al 5' de etiqueta única (véase Figura 5) . Desdoblamiento de PO se condujo en un tubo y una alícuota del resultante se tomó en un microarreglo donde el CO fue inmóvili zado .

La polimerasa de ADN Taq que tiene actividad de nucleasa al 5' se usó para la extensión de cebador corriente arriba y el desdoblamiento de PO. El PO etiquetado al 5' comprende una porción de objetivo complemento a la secuencia de ácido nucleico objetivo y una porción etiquetante al 5' no complemento a la secuencia de ácido nucleico objetivo. El PO etiquetado al 5' tiene a Quasar570 como una molécula reportera fluorescente en su extremo-3' . El CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante al 5' del PO. El CO tiene poli(T)io como un brazo enlazador y fue inmovilizado en la superficie de una laminilla de vidrio usando un grupo amino (AminoC7) en su extremo-3' . Una sonda marcadora que tiene una molécula reportera fluorescente (Quasar570) en su extremo-5' fue inmovilizada en la superficie de la laminilla de vidrio usando un grupo amino en su extremo-3' . El oligonucleótido sintético para Neisseria gonorrhoeae (NG) se usó como una plantilla .

Las secuencias de plantillas sintéticas, cebador corriente arriba, PO etiquetado al 5' , CO y marcador usados en este Ejemplo son: NG-T 5'- AAATATGCGAMCACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGC GAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3 ' (SEC ID NO: 1) NG-R 5 ' -CAATGGATCGGTATCACTCGC-31 (SEC ID NO: 2) NG-PO-3 5'- ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG [Quasar570] -3' (SEC ID NO: 8) NG-CO-3 5'- GCCAAGCCGTCGTTTTTTTTTTT [AminoC7]-3' (SEC ID NO: 9) Marcador 5 ' - [Quasar570] ATATATATAT [AminoC7 ] -31 (SEC ID NO: 5) (Las letras subrayadas indican la porción etiquetante al 5' de PO) .

La preparación de laminilla se condujo como el mismo protocolo usado en Ejemplo 1, excepto que el CO de la seg ID NO: 9 es usado en lugar de aquel de la seg ID NO: 4.

La reacción de desdoblamiento se condujo en el volumen final de 50 µ? que contiene 2 pmole de plantilla sintética (SEC ID NO: 1) por gen NG, 10 pmole de cebador corriente arriba (SEC ID NO: 2), 1 pmole de PO (SEC ID NO: 8), y 25 µ? de Mezcla Principal 2X que contiene 2.5 mM de MgCl2, 200 µ? de dNTPs, y 4 unidades de polimerasa de ADN Tag-W (Solgent, Corea) ; el tubo que contiene la mezcla de reacción se colocó en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) ; la mezcla de reacción se desnaturalizó por 15 min a 95°C y se sometió a 30 ciclos de 30 seg a 95°C y 60 seg a 60°C.

Los 30 µ? de la mezcla resultante se aplicaron a una cámara ensamblada en la superficie de la laminilla de vidrio NSB en la cual el CO (SEC ID NO: 9) fue reticulado. La laminilla se colocó en un bloque in situ en un termociclador (GenePro B4I, China) . La reacción de hibridización se dejó por 30 min a 55°C. La adquisición de imagen se llevó a cabo por el uso de Barrido Láser Confocal, Axon GenePix4300A (Molecular Device, US) con barrido a resolución de 5 pm de pixeles. La intensidad de fluorescencia se analizó por el uso de software de análisis de microarreglo cuantitativo, software GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). La intensidad de fluorescencia se expresó como manchas medianas después de sustracciones de antecedente local. Cada mancha se duplicó por la prueba de reproductibilidad. La intensidad de fluorescencia indica el valor promedio de las manchas duplicadas.

Como se muestra en la Figura 16, una señal fluorescente disminuida (RFU: 17,586+ 152.0) fue detectada en la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo en comparación con la señal fluorescente (RFU: 65,455+0.7) en la ausencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Estos resultados indican que el ensayo POCH usando un PO etiquetado al 5' de etiqueta única es aplicable para la detección de una secuencia de ácido nucleico objetivo.

EJEMPLO 4 : Evaluación del ensayo POCH usando un PO etiquetado al 3' de etiqueta dual Se evaluó además el ensayo POCH para la detección de una secuencia de ácido nucleico objetivo usando un PO etiquetado al 3' de etiqueta dual (véase Figura 11). Desdoblamiento de PO se condujo en un tubo y una alícuota del resultante se tomó en un microarreglo donde el CO fue inmovilizado .

La polimerasa de ADN Taq que tiene actividad de nucleasa al 5' se usó para la extensión de cebador corriente arriba y el desdoblamiento de PO. El PO etiquetado al 3' comprende una porción de objetivo complemento a la secuencia de ácido nucleico objetivo y una porción etiquetante al 3' no complemento a la secuencia de ácido nucleico objetivo. Él PO etiquetado al 3' tiene una BHQ-2 como una molécula aceptora en su extremo-5' y una Quasar570 como una molécula donadora en su extremo-3' de la porción de objetivo. El CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante al 3' del PO. Una señal de la molécula donadora se midió para la detección de la secuencia de ácido nucleico objetivo. El PO etiquetado al 3' y CO son bloqueados con un espaciador de carbono en sus extremos-3' . El CO tiene poli (T) 5 como un brazo enlazador y fue inmovilizado en la superficie de una laminilla de vidrio usando un grupo amino (AminoC6) en su extremo-5' . Una sonda marcadora que tiene una molécula reportera fluorescente (Quasar570) en su extremo-5' fue inmovilizada en la superficie de la laminilla de vidrio usando un grupo amino en su extremo-3' . El oligonucleótido sintético para Neisseria qonorrhoeae (NG) se usó como una plantilla .

Las secuencias de plantillas sintéticas, cebador corriente arriba, PO etiquetado al 3' , CO y marcador usados en este Ejemplo son: NG-T 5'- AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAG CGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA-3 ' (SEC ID NO: 1) NG- 5 ' -CAATGGATCGGTATCACTCGC-3 ' (SEC ID NO: 2) NG-PO-4 5 ' - [BHQ- 2] TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG [Quasar570] GACGACGGCTTGGCTTTACGA [espaciador C3]-3' (SEC ID NO: 10) NG-CO-2 5'- [AminoC6]TTTTTT CGTAAAGCCAAGCCGTCGTC [espaciador C3]-3' (SEC ID NO: 7) Marcador 5 ' - [Quasar570] ATATATATA [AminoC7 ] -3 ' (SEC ID NO: 5) (Las letras subrayadas indican la porción etiquetante al 3' de PO) La preparación de laminilla se condujo como el mismo protocolo usado en Ejemplo 1, excepto que el CO de la seg ID NO: 7 es usado en lugar de aquel de la seg ID NO: 4.

La reacción de desdoblamiento se condujo en el volumen final de 50 µ? que contiene 2 pmole de plantilla sintética (SEC ID NO: 1) por gen NG, 10 pmole de cebador corriente arriba (SEC ID NO: 2), 1 pmole de PO (SEC ID NO: 10), y 25 µ? de Mezcla Principal 2X que contiene 2.5 mM de MgCl2, 200 µ? de dNTPs , y 4 unidades de polimerasa de ADN Taq-H (Solgent, Corea) ; el tubo que contiene la mezcla de reacción se colocó en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) ; la mezcla de reacción se desnaturalizó por 15 min a 95°C y se sometió a 30 ciclos de 30 seg a 95°C y 60 seg a 60°C.

Los 30 µ? de la mezcla resultante se aplicaron a una cámara ensamblada en la superficie de la laminilla de vidrio NSB en la cual el CO (SEC ID NO: 7) fue reticulado. La laminilla se colocó en un bloque in situ en un termociclador (GenePro B4I, China). La reacción de hibridización se dejó por 30 min a 55 °C. La adquisición de imagen se llevó a cabo por el uso de Barrido Láser Confocal, Axon GenePix4300A (Molecular Device, US) con barrido a resolución de 5 µp\ de pixel. La intensidad de fluorescencia se analizó por el uso de software de análisis de microarreglo cuantitativo, software GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). La intensidad de fluorescencia se expresó como manchas medianas después de sustracciones de antecedente local. Cada mancha se duplicó por la prueba de reproductibilidad. La intensidad de fluorescencia indica el valor promedio de las manchas duplicadas.

Puesto que el aceptor apaga la señal fluorescente a partir del donador, no existe señal a partir del donador en el duplo CO/PO etiquetado al 3' no desdoblado. Mientras el fragmento que contiene donador de PO etiquetado al 3' desdoblado hibridizado con el CO es capaz de proporcionar una señal fluorescente.

Como se muestra en la Figura 17, una señal fluorescente incrementada (RFU: 65,469+0.7) se observó en la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo en comparación con la señal fluorescente (RFU: 13 , 349±441.2 ) en la ausencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Estos resultados indican que el ensayo POCH usando un PO etiquetado al 3' de etiqueta dual es aplicable para la detección de una secuencia de ácido nucleico objetivo.

EJEMPLO 5 : Detección de una secuencia de ácido nucleico objetivo por ensayo POCH Se aplicó el ensayo POCH para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo acompañada con la amplificación de secuencia objetivo. Un PO no etiquetado de etiqueta única y un PO etiquetado al 3' de etiqueta única se usaron respectivamente para examinar esta aplicación. El desdoblamiento de PO durante la amplificación objetivo por el proceso de PCR se condujo en un tubo y una alícuota del resultante se tomó en un microarreglo donde el CO fue inmovilizado.

El cebador corriente arriba está involucrado en el desdoblamiento de PO por una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' y también involucrado en la amplificación de la secuencia de ácido objetivo con corriente abajo cebador por el proceso de PCR. La polimerasa de ADN Tag que tiene una actividad de nucleasa al 5' se usó para la extensión de cebador corriente arriba y corriente abajo cebador, y el desdoblamiento de PO.

El PO no etiquetado comprende una porción de objetivo complemento a la secuencia de ácido nucleico objetivo. El CO por el PO no etiquetado comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción de objetivo del PO. El PO etiquetado al 3' comprende una porción de objetivo complemento a la secuencia de ácido nucleico objetivo y una porción etiquetante al 3' no complemento a la secuencia de ácido nucleico objetivo. El CO por el PO etiquetado al 3' comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante al 3' del PO.

El PO no etiquetado y PO etiquetado al 3' tienen Quasar570 como una molécula reportera fluorescente en sus extremos al 5' . El POs y COs son bloqueados con un espaciador de carbono en sus extremos-3' . El CO por el PO no etiquetado tiene poli(T)io como un brazo enlazador y fue inmovilizado en la superficie de una laminilla de vidrio usando un grupo amino (AminoC6) en su extremo-5' . El CO por el PO etiquetado al 3' tiene poli (T) 5 como un brazo enlazador y fue inmovilizado en la superficie de una laminilla de vidrio usando un grupo amino (AminoC6) en su extremo-5' . Una sonda marcadora que tiene una molécula reportera fluorescente (Quasar570) en su extremo-5' fue inmovilizada en la superficie de la laminilla de vidrio usando un grupo amino en su extremo-3' . El ADN genómico de Neisseria gonorrhoeae (NG) se usó como una plantilla objetivo. 5-1. Ensayo POCH usando PO no etiquetado de etiqueta única Las secuencias de cebador corriente arriba, corriente abajo cebador, PO, CO y marcador usados en este Ejemplo son: NG-F 5 -TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3 ' (SEC ID NO: 11) NG-R 5 ' -CAATGGATCGGTATCACTCGC-3 ' (SEC ID NO: 2) NG-PO-1 5'-[Quasar570] TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG [espaciador C3]-3' (SEC ID NO: 3) NG-CO-1 5'-[AminoC6]TTTTTTTTTT CGAAACACGCCAATGAGGGGCA [ espaciador C3]-3' (SEC ID NO: 4) Marcador 51 - [Quasar570] ATATATATAT [AminoC7 ] -3 ' (SEC ID NO: 5) La preparación de laminilla se condujo como el mismo protocolo usado en Ejemplo 1.

La reacción de desdoblamiento se condujo en el volumen final de 50 µ? que contiene cada uno 100 pg del ADN genómico de NG, 10 pmole de cebador corriente abajo (SEC ID NO: 11), 10 pmole de cebador corriente arriba (SEC ID NO: 2), 1 pmole de PO (SEC ID NO: 3), y 25 µ? de Mezcla Principal 2X que contiene 2.5 mM de MgCl2, 200 µ? de dNTPs, y 4 unidades de polimerasa de ADN Taq-h (Solgent, Corea) ; el tubo que contiene la mezcla de reacción se colocó en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) ; la . mezcla de reacción se desnaturalizó por 15 min a 95°C y se sometió a 60 ciclos de 30 seg a 95°C y 60 seg a 60°C. Los 30 µ? de la mezcla resultante se aplicaron a una cámara ensamblada en la superficie de la laminilla de vidrio NSB en la cual el CO (SEC ID NO: 4) fue reticulado. La laminilla se colocó en un bloque m situ en un termociclador (GenePro B4I, China) . La reacción de hibridización se dejó por 30 min a 55°C. La adquisición de imagen se llevó a cabo después de cada lavado por el uso de Barrido Láser Confocal, Axon GenePix4300A (Molecular Device, US) con barrido a resolución de 5 pm de pixeles. La intensidad de fluorescencia se analizó por el uso de software de análisis de microarreglo cuantitativo, software GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). La intensidad de fluorescencia se expresó como manchas medianas después de sustracciones de antecedente local. Cada mancha se duplicó por la prueba de reproductibilidad. La intensidad de fluorescencia indica el valor promedio de las manchas duplicadas .

Como se muestra en la Figura 18, una señal fluorescente disminuida (RFU: 1,650+97.6) se observó en la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo en comparación con la señal fluorescente (RFU: 64,474+0.0) en la ausencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo. 5-2. Ensayo POCH usando PO etiquetado al 3' de etiqueta única Las secuencias de cebador corriente arriba, cebador corriente abajo, PO etiquetado al 3', CO y marcador usados en este Ejemplo son: NG-F 5 ' -TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3 ' (SEC ID NO: 11) NG-R 5 ' -CAATGGATCGGTATCACTCGC-3 ' (SEC ID NO: 2) NG-P0-2 5'-[Quasar570] TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCGGACGACGGCTTGGCTTTACGA [espaciador C3]-3' (SEC ID NO: 6) NG-CO-2 5 ' - [Ami'noC6] TTTTTTCGTAAAGCCAAGCCGTCGTC [espaciador C3] -3 ' (SEC ID NO: 7) Marcador 5 '- [Quasar570 ] ATATATATA [AminoC7 ] -3 ' (SEC ID NO: 5) (Las letras subrayadas indican la porción etiquetante al 3' de PO) La preparación de laminilla se condujo como el mismo protocolo usado en Ejemplo 2. La reacción de desdoblamiento se condujo en el volumen final de 50 µ? que contiene cada uno 100 pg de ADN genómico de NG, 10 pmole de cebador corriente abajo (SEC ID NO: 11), 10 pmole de cebador corriente arriba (SEC ID NO: 2), 1 pmole de PO (SEC ID NO: 6), y 25 µ? de Mezcla Principal 2X que contiene 2.5 mM de MgCl2, 200 µ? de dNTPs, y 4 unidades de' polimerasa de ADN Taq-V¡ (Solgent, Corea) ; el tubo que contiene la mezcla de reacción se colocó en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) ; la mezcla de reacción se desnaturalizó por 15 min a 95°C y se sometió a 60 ciclos de 30 seg a 95°C y 60 seg a 60°C. Los 30 µ? de la mezcla resultante se aplicaron a una cámara ensamblada en la superficie de la laminilla de vidrio NSB en la cual el CO (SEC ID NO: 7) fue reticulado. La laminilla se colocó en un bloque in situ en un termociclador (GenePro B4I, China) . La reacción de hibridización se dejó por 30 min a 55°C. La adquisición de imagen se llevó a cabo después de cada lavado por el uso de Barrido Láser Confocal, Axon GenePix4300A (Molecular Device, US) con barrido a resolución de 5 pm de pixeles. La intensidad de fluorescencia se analizó por el uso de software de análisis de microarreglo cuantitativo, software GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). La intensidad de fluorescencia se expresó como manchas medianas después de sustracciones de antecedente local. Cada mancha se duplicó por la prueba de reproductibilidad. La intensidad de fluorescencia indica el valor promedio de las manchas duplicadas.

Como se muestra en la Figura 19, una señal fluorescente disminuida (RFU: 9,969±217.1) se observó en la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo en comparación con la señal fluorescente (RFU: 65,470±1.4) en la ausencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Estos resultados indican que una secuencia de ácido nucleico objetivo puede ser detectada por ensayo POCH acompañada con amplificación objetivo por el proceso de PCR.

EJEMPLO 6 : Detección en tiempo real de una secuencia de ácido nucleico objetivo por ensayo POCH Se aplicó el ensayo POCH por detección en tiempo real de una secuencia de ácido nucleico objetivo. Un PO etiquetado al 3' se usó para examinar esta aplicación. El desdoblamiento de PO e hibridización de PO con CO se condujo con amplificación objetivo por el proceso de PCR en un microarreglo donde el CO fue inmovilizado. El cambio de una señal fluorescente dependiendo de los números de ciclos se midió. El ADN genómico de Neisseria gonorrhoeae (NG) se usó como una plantilla objetivo.

Los mismos oligonucleótidos (cebador corriente arriba, cebador corriente abajo, PO etiquetado al 3' , CO y marcador) usados en el Ejemplo 5-2 se usaron en este Ejemplo. La preparación de laminilla se condujo como el mismo protocolo usado en Ejemplo 2.

Una mezcla para el ensayo POCH se preparó en el volumen final de 30 µ? que contiene 100 pg de ADN genómico de NG, 10 pmole de cebador corriente abajo (SEC ID NO: 11) , 10 pmole de cebador corriente arriba (SEC ID NO: 2) , 1 pmole de PO (SEC ID NO: 6), y 25 µ? de Mezcla Principal 2X que contiene 2.5 mM de MgCl2, 200 µ? de dNTPs, y 4 unidades de polimerasa de ADN Taq-R (Solgent, Corea) ; la mezcla completa se aplicó a una cámara ensamblada en la superficie de la laminilla de vidrio NSB en la cual el CO fue reticulado (SEC ID NO: 7) . La laminilla se colocó en un bloque in situ en un termociclador (GenePro B4I, China). Cinco de las mismas laminillas se prepararon por análisis de ciclos. La reacción de POCH se llevó a cabo como sigue: 15 min desnaturalización a 95°C y O, 20, 30, 40 o 60 ciclos de 30 seg a 95°C, 60 seg a 60°C y 30 min a 55°C. Después del número de ciclo correspondiente, la adquisición de imagen se llevó a cabo por el uso de Barrido Láser Confocal, Axon GenePix4300A (Molecular Device, US) con barrido a resolución de 5 pm de pixeles. La intensidad de fluorescencia se analizó por el uso de software de análisis de microarreglo cuantitativo, software GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). La intensidad de fluorescencia se expresó como manchas medianas después de sustracciones de antecedente local. Cada mancha se duplicó por la prueba de reproductibilidad . La intensidad de fluorescencia indica el valor promedio de las manchas duplicadas .

Como se muestra en la Figura 20A y 20B, la señal fluorescente se disminuyó después de 30 ciclos (0 ciclos_RFU: 65,438±0.0; 20 ciclos_RFU: 65,445±2.1; 30 ciclos_RFU: 65,480±0.0; 40 ciclos_RFU: 8,844+ 1,485.6; y 60 ciclos_RFU: 4,878± 169.7) en la presencia de la plantilla. No hubo cambio de la señal fluorescente dependiendo de los números de ciclos en la ausencia de la plantilla.

Estos resultados indican que una secuencia de ácido nucleico objetivo puede ser detectada en una manera en tiempo real por ensayo POCH.

EJEMPLO 7 : Evaluación del ensayo POCH usando desdoblamiento de PO independien-be del oligonucleótido corriente arriba Se evaluó además el ensayo POCH para la detección de una secuencia de ácido nucleico objetivo sin oligonucleótido corriente arriba. El desdoblamiento de PO independiente del oligonucleótido corriente arriba se condujo sin un oligonucleótido corriente arriba en un tubo y una alícuota del resultante se tomó en un microarreglo donde el CO fue inmovilizado.

La polimerasa de ADN Taq que tiene actividad de nucleasa al 5' se usó para el desdoblamiento de PO independiente del oligonucleótido corriente arriba. El PO no etiquetado comprende una porción de objetivo complemento a la secuencia de ácido nucleico objetivo y tiene FAM como una molécula reportera fluorescente en su extremo-5' . El CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción de objetivo del PO. El PO y CO son bloqueados con un espaciador de carbono en sus extremos-3' . El CO tiene poli (T) io como un brazo enlazador y fue inmovilizado en la superficie de una laminilla de vidrio usando un grupo amino (Amino C6) en su extremo-5' . Una sonda marcadora que tiene una molécula reportera fluorescente (Quasar570) en su extremo-5' fue inmovilizada en la superficie de la laminilla de vidrio usando un grupo amino en su extremo-3' . El oligonucleótido sintético para Neisseria gonorrhoeae (NG) se usó como una plantilla.

Las secuencias de plantillas sintéticas, PO, CO y marcador usados en este Ejemplo son: NG-T 5'- AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAG CGAGTGAT ACCGATCCATTGAAAAA-3 ' (SEC ID NO: 1) NG-PO-5 5 ' - [FAM] GCCCCTCATTGGCGTGTTTCG [espaciador C3]-3' (SEC ID NO: 12) NG-CO-1 51 - [AminoC6] TTTTTTTTTT CGAAACACGCCAATGAGGGGCA [espaciador C3]-3' (SEC ID NO: 4) Marcador 5 ' - [Quasar570] ATATATATAT [AminoC7 ] -3 ' (SEC ID NO: 5) Las laminillas NSB9 NHS (NSBPOSTECH, Corea) se usaron para fabricación del CO y marcador (SEC ID NOs: 4 y 5) . El CO y marcador disueltos en amortiguador de manchado NSB a la concentración final de 50 µ? se imprimieron en las laminillas de NSB9 NHS con Marcador de Microarreglo PersonalArrayer™16 (CapitalBio, China) . El CO y marcador se mancharon lado por lado en un formato 2x1 (manchas duplicadas) , y el microarreglo resultante se incubó en una cámara mantenida a ~85% de humedad durante la noche. Las laminillas entonces se lavaron en una solución amortiguadora que contiene 2x SSPE (0.3 M de cloruro de sodio, 0.02 M de fosfato hidrógeno de sodio y 2.0 mM de DE EDTA), pH 7.4 y 7.0 mM de de SDS a 37 °C por 30 min para remover el CO unido no específicamente y marcador, y enjuagaron con agua destilada. Entonces, las laminillas funcionalizadas con ADN se secaron usando una centrifuga de laminilla y se almacenaron en la oscuridad a 4°C hasta el uso.

La reacción de desdoblamiento se condujo en el volumen final de 50 µ? que contiene 2 pmole de plantilla sintética (SEC ID NO: 1) por gen NG, 1 pmole de PO (SEC ID NO: 12), y 25 µ? de Mezcla Principal 2X que contiene 2.5 mM de MgCl2, 200 µ? de dNTPs, y 4 unidades de polimerasa de ADN Taq-ti (Solgent, Corea); el tubo que contiene la mezcla de reacción se colocó en el termociclador en tiempo real (CFX96, Bio-Rad) ; la mezcla de reacción se desnaturalizó por 15 min a 95°C y se sometió a 30 ciclos de 30 seg a 95°C y 60 seg a 60°C.

Los 30 µ? de la mezcla resultante se aplicaron a una cámara ensamblada en la superficie de la laminilla de vidrio NSB en la cual el CO (SEC ID NO: 4) fue reticulado. La laminilla se colocó en un bloque in situ en un termociclador (GenePro B4I, China) . La reacción de hibridización se dejó por 30 min a 55°C. La adquisición de imagen se llevó a cabo por el uso de Barrido Láser Confocal, Axon GenePix4300A (Molecular Device, US) con barrido a resolución de 5 pm de píxeles. La intensidad de fluorescencia se analizó por el uso de software de análisis de microarreglo cuantitativo, software GenePix pro7.0 (Molecular Device, US). La intensidad de fluorescencia se expresó como manchas medianas después de sustracciones de antecedente local. Cada mancha se duplicó por la prueba de reproductibilidad. La intensidad de fluorescencia indica el valor promedio de las manchas duplicadas .

Una señal fluorescente disminuida fue detectada en la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo en comparación con la señal fluorescente en la ausencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

Estos resultados indican que el ensayo POCH usando desdoblamiento de PO independiente del oligonucleótido corriente arriba es aplicable para la detección de una secuencia de ácido nucleico objetivo.

Habiendo descrito una modalidad preferida de la presente invención, se entiende que variantes y modificaciones de la misma que caen dentro del espíritu de la invención pueden llegar a ser aparentes para aquellos expertos en esta técnica, y el alcance de esta invención está siendo determinado por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes .

Claims (59)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

1. Un método para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, caracterizado porque comprende: (a) hibridizar la secuencia de ácido nucleico objetivo con un oligonucleótido corriente arriba y un oligonucleótido de sonda (PO) ; en donde el oligonucleótido corriente arriba comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO tiene una etiqueta única; el oligonucleótido corriente arriba está localizado corriente arriba del PO; el oligonucleótido corriente arriba o su hebra extendida induce desdoblamiento del PO por una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' ; (b) poner en contacto el resultado de la etapa (a) con la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para desdoblamiento del PO; en donde cuando el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo, el PO es desdoblado por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' para producir un fragmento que contiene etiqueta única; (c) realizar una reacción de hibridación poniendo en contacto el resultado de la etapa (b) con un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO; en donde la reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que el fragmento que contiene etiqueta única no es hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado; y (d) detectar la incidencia del desdoblamiento del PO midiendo una señal de la etiqueta única en el sustrato sólido; de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción de objetivo del PO.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el PO es un PO etiquetado al 3' que comprende además en su porción-3' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo o un PO etiquetado al 5' que comprende además en su porción-5' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo, y la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante del PO.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la etiqueta única se posiciona de manera que la etiqueta única no está permaneciendo en un fragmento que contiene porción etiquetante liberada por el desdoblamiento del PO.

5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la etiqueta única se localiza en el extremo-5' o 1-10 nucleotidos aparte del extremo-5' del PO etiquetado al 3' o localizado en el extremo-3' o 1-10 nucleotidos aparte del extremo-3' del PO etiquetado al 5' .

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el PO es un PO etiquetado al 3' que comprende además en su porción-3' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo o un PO etiquetado al 5' que comprende además en su porción-5' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo, y la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con una parte de la porción etiquetante y una parte de la porción de objetivo del PO.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el CO es inmovilizado en el sustrato sólido a través de su extremo-5' o extremo-3' .

8. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el PO es el PO etiquetado al 3' y el CO es inmovilizado en el sustrato sólido a través de su extremo-5' .

9. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el PO es el PO etiquetado al 5' y el CO es inmovilizado en el sustrato sólido a través de su extremo-3' .

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la etiqueta única es una etiquéta única fluorescente.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el PO y/o CO es bloqueado en su extremo 3' para prohibir su extensión.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótido corriente arriba es un cebador corriente arriba o una sonda corriente arriba.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótido corriente arriba se localiza adyacentemente al PO en la medida que el oligonucleótido corriente arriba induce desdoblamiento del PO por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' .

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótido corriente arriba tiene una secuencia traslapada parcial con la porción de objetivo del PO.

15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el cebador corriente arriba induce a través de su hebra extendida el desdoblamiento del PO por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' .

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la etapa (b) usa una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla para la extensión del cebador corriente arriba.

17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' es una polimerasa de ADN termoestable que tiene una actividad de nucleasa al 5' o nucleasa de FEN.

18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el oligonucleótido corriente arriba es un cebador corriente arriba y la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' es una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla que tiene una actividad de nucleasa al 5' .

19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el método comprende además repetir las etapas (a) -(b), (a) -(c) o (a) -(d) con desnaturalización entre ciclos de repetición.

20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las etapas (a) -(d) se realizan en un recipiente de reacción o en recipientes de reacción separados .

21. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico objetivo comprende al menos dos tipos de secuencias de ácido nucleico objetivo.

22. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico objetivo comprende una variación de nucleótido.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-22, caracterizado porque el método se realiza en la presencia de un cebador corriente abajo.

24. Un método para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, caracterizado porque comprende: (a) hibridizar la secuencia de ácido nucleico objetivo con un oligonucleótido corriente arriba y un oligonucleótido de sonda (PO) ; en donde el oligonucleótido corriente arriba comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO tiene una etiqueta dual interactiva que comprende una molécula donadora y una molécula aceptora; el oligonucleotido corriente arriba está localizado corriente arriba del PO; el oligonucleotido corriente arriba o su hebra extendida induce desdoblamiento del PO por una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' ; (b) poner en contacto el resultado de la etapa (a) con la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para desdoblamiento del PO; en donde cuando el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo, el PO es desdoblado por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' para separar la etiqueta dual interactiva, de este modo se producen un fragmento que contiene donador y un fragmento que contiene aceptor; (c) realizar una reacción de hibridación poniendo en contacto el resultado de la etapa (b) con un oligonucleotido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO; en donde la reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que al menos uno del fragmento que contiene donador y el fragmento que contiene aceptor es no hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado; en donde una señal del duplo CO/PO no desdoblado es diferenciada de una señal proporcionada en el tiempo que al menos uno del fragmento que contiene donador y el fragmento que contiene aceptor es no hibridizado con el CO; y (d) detectar la incidencia del desdoblamiento del PO midiendo una señal de la etiqueta dual interactiva en el sustrato sólido; de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico obj etivo .

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción de objetivo del PO, y la etiqueta dual interactiva se localiza en la medida que una señal de la molécula donadora es apagada por la molécula aceptora cuando se forma el duplo PO/CO no desdoblado, distinguido porque la etapa (d) se realiza detectando una señal de la molécula aceptora.

26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el PO es un PO etiquetado al 3' que comprende además en su porción-3' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo o un PO etiquetado al 5' que comprende además en su porción-5' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo, y la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende ' una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante del PO, y la etiqueta dual interactiva se localiza en la medida que una señal de la molécula donadora es apagada por la molécula aceptora cuando se forma el duplo PO/CO no desdoblado, distinguido porque la etapa (d) se realiza detectando una señal de la molécula aceptora.

27. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción de objetivo del PO, y la reacción de hibridización en la etapa (c) se realiza bajo condiciones de manera que el fragmento que contiene donador no es hibridizado con el CO; en donde la etiqueta dual interactiva se localiza en la medida que una señal de la molécula donadora es no apagada por la molécula aceptora cuando se forma el duplo PO/CO no desdoblado y la etapa (d) se realiza detectando una señal de la molécula donadora.

28. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el PO es un PO etiquetado al 3' que comprende además en su porción-3' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo o un PO etiquetado al 5' que comprende además en su porción-5' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante del PO; el fragmento que contiene donador comprende la porción etiquetante hibridizable con el CO y en la reacción de hibridización en la etapa (c) , el fragmento que contiene donador es hibridizado con el CO; en donde la etiqueta dual interactiva se localiza en la medida que una señal de la molécula donadora es apagada por la molécula aceptora cuando se forma el duplo PO/CO no desdoblado y la etapa (d) se realiza detectando una señal de la molécula donadora .

29. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el PO es un PO. etiquetado al 3' que comprende además en su porción-3' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo o un PO etiquetado al 5' que comprende además en su porción-5' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo, y la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con una parte de la porción etiquetante y una parte de la porción de objetivo del PO.

30. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el oligonucleótido corriente arriba es un cebador corriente arriba y la etapa (b) usa una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla para la extensión del cebador corriente arriba.

31. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el método comprende además repetir las etapas (a) -(b), (a) -(c) o (a) -(d) con desnaturalización entre ciclos de repetición.

32. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque las etapas (a) -(d) se realizan en un recipiente de reacción o en recipientes de reacción separados .

33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 24-32, caracterizado porque el método se realiza en la presencia de un cebador corriente abajo.

34. Un método para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, caracterizado porque comprende: (a) hibridizar la secuencia de ácido nucleico objetivo con un oligonucleótido corriente arriba y un oligonucleotido de sonda (PO); en donde el oligonucleotido corriente arriba comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el oligonucleotido corriente arriba está localizado corriente arriba del PO; el oligonucleotido .corriente arriba o su hebra extendida induce desdoblamiento del PO por una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' ; (b) poner en contacto el resultado de la etapa (a) con la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para desdoblamiento del PO; en donde cuando el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo, el PO es desdoblado por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' para producir un fragmento desdoblado; (c) realizar una reacción de hibridación en la presencia de un agente intercalante poniendo en contacto el resultado de la etapa (b) con un · oligonucleotido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO; en donde la reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que el fragmento desdoblado no es hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado; y (d) detectar la incidencia del desdoblamiento del PO midiendo una señal del agente intercalante en el sustrato sólido; de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción de objetivo del PO.

36. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el oligonucleótido corriente arriba es un cebador corriente arriba y la etapa (b) usa una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla para la extensión del cebador corriente arriba.

37. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el método comprende además repetir las etapas (a) -(b), (a) -(c) o (a) -(d) con desnaturalización entre ciclos de repetición.

38. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque las etapas (a) -(d) se realizan en un recipiente de reacción o en recipientes de reacción separados .

39. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-38, caracterizado porque el método se realiza en la presencia de un cebador corriente abajo.

40. Un método para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, caracterizado porque comprende: (a) hibridizar la secuencia de ácido nucleico objetivo con un oligonucleótido de sonda (PO); en donde el PO comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO tiene una etiqueta única; (b) poner en contacto el resultado de la etapa (a) con una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para desdoblamiento del PO; en donde cuando el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo, el PO es desdoblado por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' para producir un fragmento que contiene etiqueta única; (c) realizar una reacción de hibridación poniendo en contacto el resultado de la etapa (b) con un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO; en donde la reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que el fragmento que contiene etiqueta única no es hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado; y (d) detectar la incidencia del desdoblamiento del PO midiendo una señal de la etiqueta única en el sustrato sólido; de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

41. Un método para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, caracterizado porque comprende: (a) hibridizar la secuencia de ácido nucleico objetivo con un oligonucleótido de sonda (PO); en donde el PO comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; el PO tiene una etiqueta dual interactiva que comprende una molécula donadora y una molécula aceptora; (b) poner en contacto el resultado de la etapa (a) con una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para desdoblamiento del PO; en donde cuando el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo, el PO es desdoblado por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' para separar la etiqueta dual interactiva, de este modo se producen un fragmento que contiene donador y un fragmento que contiene aceptor; (c) realizar una reacción de hibridación poniendo en contacto el resultado de la etapa (b) con un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO; en donde la reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que al menos uno del fragmento que contiene donador y el fragmento que contiene aceptor es no hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado; en donde una señal del duplo CO/PO no desdoblado es diferenciada de una señal proporcionada en el tiempo que al menos uno del fragmento que contiene donador y el fragmento que contiene aceptor es no hibridizado con el CO; y (d) detectar la incidencia del desdoblamiento del PO midiendo una señal de la etiqueta dual interactiva en el sustrato sólido; de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo .

42. Un método para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, caracterizado porque comprende: (a) hibridizar la secuencia de ácido nucleico objetivo con un oligonucleótido de sonda (PO); en donde el PO comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; (b) poner en contacto el resultado de la etapa (a) con una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' bajo condiciones para desdoblamiento del PO; en donde cuando el PO es hibridizado con la secuencia de ácido nucleico objetivo, el PO es desdoblado por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' para producir un fragmento desdoblado; (c) realizar una reacción de hibridación en la presencia de un agente intercalante poniendo en contacto el resultado de la etapa (b) con un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO; en donde la reacción de hibridización se realiza bajo condiciones de manera que el fragmento desdoblado no es hibridizado con el CO y un PO no desdoblado es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado; y (d) detectar la incidencia del desdoblamiento del PO midiendo una señal del agente intercalante en el sustrato sólido; de este modo la incidencia del PO desdoblado indica la presencia de la secuencia de ácido nucleico objetivo.

43. Un kit para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, caracterizado porque comprende: (a) un oligonucleótido de sonda (PO) que comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; (b) un oligonucleótido corriente arriba que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; en donde el oligonucleótido corriente arriba está localizado corriente arriba del PO; el oligonucleótido corriente ' arriba o su hebra extendida induce desdoblamiento del PO por una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' ; y (c) un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO, de este modo un PO no desdoblado por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado .

44. El kit de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el PO tiene una etiqueta única o una etiqueta dual interactiva.

45. El kit de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el PO es un PO etiquetado al 3' que comprende además en su porción-3' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo o un PO etiquetado al 5' que comprende además en su porción-5' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo, y la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con la porción etiquetante del PO.

46. El kit de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el PO es un PO etiquetado al 3' que comprende además en su porción-3' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo o un PO etiquetado al 5' que comprende además en su porción-5' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo, y la secuencia de nucleótido hibridizable con el PO en el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con una parte de la porción etiquetante y una parte de la porción de objetivo del PO.

47. El kit de conformidad con, la reivindicación 43, caracterizado porque el PO es un PO etiquetado al 3' que comprende además en su porción-3' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo y el CO es inmovilizado en el sustrato a través de su extremo-5' .

48. El kit de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el PO es un PO etiquetado al 5' que comprende además en su porción-5' una porción etiquetante que tiene una secuencia de nucleótido no complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo y el CO es inmovilizado en el sustrato a través de su extremo-3' .

49. El kit de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el oligonucleótido corriente arriba es un cebador corriente arriba o una sonda corriente arriba.

50. El kit de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el kit comprende además una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' .

51. El kit de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el oligonucleótido corriente arriba se localiza adyacentemente al PO en la medida que el oligonucleótido corriente arriba induce desdoblamiento del PO por una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' .

52. El kit de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el oligonucleótido corriente arriba tiene una secuencia traslapada parcial con la porción de objetivo del PO.

53. El kit de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el cebador corriente arriba induce a través de su hebra extendida el desdoblamiento del PO por la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' .

54. El kit de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' es una polimerasa de ADN termoestable que tiene una actividad de nucleasa al 5' o nucleasa de FEN.

55. El kit de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el oligonucleótido corriente arriba es un cebador corriente arriba y la enzima que tiene la actividad de nucleasa al 5' es una polimerasa de ácido nucleico dependiente de la plantilla que tiene una actividad de nucleasa al 5' .

56. El kit de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el kit comprende además un agente intercalante.

57. El kit de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el kit se usa para detección de al menos dos tipos de secuencias de ácido nucleico objetivo; en donde el oligonucleótido corriente arriba comprende al menos dos tipos de oligonucleótidos corriente arriba, el PO comprende al menos dos tipos de POs y el CO comprende al menos dos tipos de CO.

58. El kit de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el kit comprende además un cebador corriente abajo.

59. Un kit para detectar una secuencia de ácido nucleico objetivo a partir de un ADN o una mezcla de ácidos nucleicos por un ensayo POCH (Desdoblamiento e Hibridización de PO) en un sustrato sólido, caracterizado porque comprende: (a) un oligonucleótido de sonda (PO) que comprende una porción de objetivo que comprende una secuencia de nucleótido hibridizante complementaria con la secuencia de ácido nucleico objetivo; y (b) un oligonucleótido de captura (CO) inmovilizado en el sustrato sólido; en donde el CO comprende una secuencia de nucleótido hibridizable con el PO, de este modo un PO no desdoblado por una enzima que tiene una actividad de nucleasa al 5' es hibridizado con el CO para formar un duplo PO/CO no desdoblado .