JP2016195603A - Po切断及びハイブリダイゼーションによるターゲット核酸配列の検出 - Google Patents
Po切断及びハイブリダイゼーションによるターゲット核酸配列の検出 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】ターゲット核酸配列にハイブリダイズされるPOが切断され、POの切断はキャプチャリングオリゴヌクレオチド(CO)とのハイブリダイゼーションによって検出されるものを用いてターゲット核酸配列を検出する。非切断POは、固相基質上に固定化されたCOにハイブリダイズされる。PO及びCOのデザインが便利であり、反応条件の最適化が通常容易である。POs切断の反復と共に固相基質上のシグナルの検出を連続して実施する場合、切断されたPOsの数は切断反応の反復数によって増加し、シグナルは切断されたPOsの数によって変化される。したがって、ターゲット核酸配列はリアルタイム方式で検出されうる。一方、ターゲット核酸配列がない場合シグナルの変化は観察されない。
【選択図】なし
Description
(a)本発明は、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたPOが切断され、COとのハイブリダイゼーションによってPOの切断が検出されるものを利用することによって、ターゲット核酸配列を検出する。本発明で、非切断されたプローブは、固相基質上に固定化されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。
ターゲットプローブ及び固定化されたキャプチャリングプローブを使う従来技術によれば、従来技術は、(i)ヘアピン構造を有するようにターゲットプローブをデザインし、ターゲット配列とのハイブリダイゼーション条件及び固定化されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション条件のいずれをも調節するか、または(ii)固定化されたオリゴヌクレオチドの固定方向、及び固相基質の表面からの距離を考慮して、固定化されたオリゴヌクレオチドをデザインして、非切断されたターゲットプローブが固定化されたオリゴヌクレオチドとハイブリダイズされることを防止することが必要である。したがって、従来の方法は、ターゲットプローブ及び固定化されるオリゴヌクレオチドのデザイン及び反応条件の設定側面で非常に不便である。
一方、本発明は、このような不便と制約とから自在である。PO及びCOのデザインが便利であり、反応条件の最適化が容易である。
(b)本発明で、POs切断の反復と共に固相基質上のシグナルの検出を連続して実施する場合、切断されたPOsの数は、切断反応の反復数によって増加し、シグナルは、切断されたPOsの数によって変化される。したがって、ターゲット核酸配列は、リアルタイム方式で検出されうる。
(c)本発明は、一種の標識を利用するとしても、多数のターゲット核酸配列を同時的に検出することができる。POの切断は、固相基質上に固定化されたCOとのハイブリダイゼーションによって検出されるために、各ターゲット核酸配列に対するPOは、多数のターゲット核酸配列の検出時に異なる標識を有するように要求されない。
(d)一般的に、ターゲット核酸配列と固相基質上に固定化されたプローブとの間の直接的なハイブリダイゼーションを利用するターゲット検出方法は、固相反応であるという制限された反応環境のために、効果的かつ正確なハイブリダイゼーション結果が得られないということは、当業者に知られている。これとは違って、本発明は、固相でターゲット核酸配列の関与なしにPOとCOとの間のハイブリダイゼーションを用いて、典型的な固相反応環境及び条件でより効果的かつ正確な結果を提供する。
(e)本発明が、タギングPO及びPOのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を有するCOを利用する場合、ターゲット核酸配列を考慮することもなく、POのタギング部位の配列及びCOの配列を選択することができる。これは、本発明で有用な配列のプール(pool)の事前デザイン(pre−design)を可能にする。特に、COは、ターゲット核酸配列に対する考慮または情報なしに既存の方式(ready−madefashion)で製作することができる。このような特徴は、固相基質上に固定化されたCOを利用するマイクロアレイ上で顕著な利点を提供する。
I.単一標識を利用するPOCHによるターゲット検出過程
本発明の一様態によれば、本発明は、次の段階を含み、固相基質上におけるPOCH(PO切断及びハイブリダイゼーション)アッセイによってDNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する:
(a)前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びPOとハイブリダイズさせる段階であって、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記POは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、前記POは、単一標識を有し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記POのアップストリームに位置し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記POの切断を誘導し、
(b)前記POの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって、前記POが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記POは、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて単一標識含有断片が生成され、
(c)前記固相基質上に固定化されたCOに前記段階(b)の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記COは、前記POにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記単一標識含有断片は、前記COにハイブリダイズされず、非切断POは、前記COにハイブリダイズされて非切断PO/CO二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、そして、
(d)前記固相基質上の前記単一標識からのシグナルを測定して、前記POの切断の発生(occurrence)を検出する段階であって、前記POの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明によれば、まず、ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びPOとハイブリダイズさせる。
引き続き、POの切断のための条件下で段階(a)の結果物を、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させる。
固相基質上に固定化されたCOに前記段階(b)の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する。
ハイブリダイゼーション反応に引き続き、POの切断の発生は、固相基質上の単一標識からのシグナルを測定して検出され、これにより、POの切断の発生は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明は、ターゲット核酸配列の検出において、相互作用的二重標識を用いて卓越した性能を示す。
(a)前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びPOとハイブリダイズさせる段階であって、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記POは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、前記POは、供与体分子及び受容体分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記POのアップストリームに位置し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記POの切断を誘導し、
(b)前記POの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって、前記POが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記POは、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて、前記相互作用的二重標識が離隔し、これにより、供与体含有断片及び受容体含有断片が生成され、
(c)前記固相基質上に固定化されたCOに前記段階(b)の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記COは、前記POにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも1つは、前記COにハイブリダイズされず、非切断POは、前記COにハイブリダイズされて、非切断PO/CO二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、前記非切断PO/CO二量体からのシグナルは、前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも1つが、前記COにハイブリダイズされない場合に提供されるシグナルと区別され、そして、
(d)前記固相基質上の前記相互作用的二重標識からのシグナルを測定して、前記POの切断の発生を検出する段階であって、前記POの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明の二番目の具現例の段階(a)は、最初の具現例の段階(a)についての説明を参照して説明される。
本発明の二番目の具現例の段階(b)は、最初の具現例の段階(b)についての説明を参照して説明される。
固相基質上に固定化されたCOに段階(b)の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する。
ハイブリダイゼーション反応に引き続き、POの切断の発生は、固相基質上の相互作用的二重標識からのシグナルを測定して検出され、これにより、POの切断の発生は、ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明は、またターゲット核酸配列の検出において、インターカレーティング剤を用いて卓越した性能を示す。
(a)前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びPOとハイブリダイズさせる段階であって、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記POは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記POのアップストリームに位置し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記POの切断を誘導し、
(b)前記POの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって、前記POが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記POは、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて切断断片が生成され、
(c)インターカレーティング剤(intercalating agent)の存在下で、前記固相基質上に固定化されたCOに前記段階(b)の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記COは、前記POにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記切断断片は、前記COにハイブリダイズされず、非切断POは、前記COにハイブリダイズされて、非切断PO/CO二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、そして、
(d)前記固相基質上の前記インターカレーティング剤からのシグナルを測定して、前記POの切断の発生を検出する段階であって、前記POの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
マッチ鋳型にハイブリダイズされたPOの切断によって形成された単一標識含有断片は、COにハイブリダイズされないが、ミスマッチ鋳型にハイブリダイズされたPOの切断によって形成された単一標識含有断片は、COにハイブリダイズされる。ミスマッチ鋳型にハイブリダイズされたPOの切断によって形成された単一標識含有断片とCOとの間のハイブリダイゼーションは、非切断POとCOとの間のハイブリダイゼーションによって提供されるような同一のシグナルを提供し、これにより、ヌクレオチド変異を検出する。
本発明の望ましい一具現例で、本発明は、次の段階を含み、固相基質上におけるPOCH(PO切断及びハイブリダイゼーション)アッセイによってDNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する:
(a)前記ターゲット核酸配列をアップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーを含む一対のプライマー及びPOとハイブリダイズさせる段階であって、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーのそれぞれは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記POは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、前記POは、単一標識を有し、前記POは、その3’−末端がブロッキングされて延長が防止され、前記POの前記ターゲッティング部位は、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーの間に位置し、前記アップストリームプライマーの延長鎖は、5’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素による前記POの切断を誘導し、
(b)前記プライマーの延長及び前記POの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって、前記POが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記POは、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記鋳型−依存的核酸重合酵素によって切断されて単一標識含有断片が生成され、
(c)前記固相基質上に固定化されたCOに前記段階(b)の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記COは、前記POにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記単一標識含有断片は、前記COにハイブリダイズされず、非切断POは、前記COにハイブリダイズされて非切断PO/CO二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、
(d)前記段階(c)の結果物を変性させる段階;
(e)前記段階(a)−(d)を少なくとも2回繰り返す段階;及び
(f)前記固相基質上の前記単一標識からのシグナルを測定して、前記POの切断の発生を検出する段階であって、前記POの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
(a)前記ターゲット核酸配列をアップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーを含む一対のプライマー及びPOとハイブリダイズさせる段階であって、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーのそれぞれは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記POは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、前記POは、供与体分子及び受容体分子を含む相互作用的二重標識を有し、前記POは、その3’−末端がブロッキングされて延長が防止され、前記POの前記ターゲッティング部位は、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーの間に位置し、前記アップストリームプライマーの延長鎖は、5’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素による前記POの切断を誘導し、
(b)前記プライマーの延長及び前記POの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって、前記POが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記POは、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて、前記相互作用的二重標識が分離され、これにより、供与体含有断片及び受容体含有断片が生成され、
(c)前記固相基質上に固定化されたCOに前記段階(b)の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも1つは、前記COにハイブリダイズされず、非切断POは、前記COにハイブリダイズされて非切断PO/CO二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、前記非切断PO/CO二量体からのシグナルは、前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも1つが、前記COにハイブリダイズされない場合に提供されるシグナルと区別され、
(d)前記段階(c)の結果物を変性させる段階;
(e)前記段階(a)−(d)を少なくとも2回繰り返す段階;
(f)前記固相基質上の前記相互作用的二重標識からのシグナルを測定して、前記POの切断の発生を検出する段階であって、前記POの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
(a)前記ターゲット核酸配列をアップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーを含む一対のプライマー及びPOとハイブリダイズさせる段階であって、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーのそれぞれは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記POは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、前記POは、その3’−末端がブロッキングされて延長が防止され、前記POの前記ターゲッティング部位は、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーの間に位置し、前記アップストリームプライマーの延長鎖は、5’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素による前記POの切断を誘導し、
(b)前記プライマーの延長及び前記POの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって、前記POが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記POは、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記鋳型−依存的核酸重合酵素によって切断されて単一標識含有断片が生成され、
(c)インターカレーティング剤の存在下で、前記固相基質上に固定化されたCOに前記段階(b)の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記COは、前記POにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記単一標識含有断片が、前記COにハイブリダイズされず、非切断POは、前記COにハイブリダイズされて非切断PO/CO二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、
(d)前記段階(c)の結果物を変性させる段階;
(e)前記段階(a)−(d)を少なくとも2回繰り返す段階;
(f)前記固相基質上の前記インターカレーティング剤からのシグナルを測定して、前記POの切断の発生を検出する段階であって、前記POの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、次の段階を含み、固相基質上におけるPOCH(PO切断及びハイブリダイゼーション)アッセイによってDNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する:
(a)前記ターゲット核酸配列をPOとハイブリダイズさせる段階であって、前記POは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、前記POは、単一標識を有し、
(b)前記POの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって、前記POが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記POは、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて単一標識含有断片が生成され、
(c)前記固相基質上に固定化されたCOに前記段階(b)の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記COは、前記POにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記単一標識含有断片は、前記COにハイブリダイズされず、非切断POは、前記COにハイブリダイズされて非切断PO/CO二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、そして、
(d)前記固相基質上の前記単一標識からのシグナルを測定して、前記POの切断の発生を検出する段階であって、前記POの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
(a)前記ターゲット核酸配列をPOとハイブリダイズさせる段階であって、前記POは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、前記POは、供与体分子及び受容体分子を含む相互作用的二重標識を有し、
(b)前記POの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって、前記POが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記POは、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて、前記相互作用的二重標識が分離され、これにより、供与体含有断片及び受容体含有断片が生成され、
(c)前記固相基質上に固定化されたCOに前記段階(b)の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記COは、前記POにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも1つは、前記COにハイブリダイズされず、非切断POは、前記COにハイブリダイズされて非切断PO/CO二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、前記非切断PO/CO二量体からのシグナルは、前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも1つが、前記COにハイブリダイズされない場合に提供されるシグナルと区別され、そして、
(d)前記固相基質上の前記相互作用的二重標識からのシグナルを測定して、前記POの切断の発生を検出する段階であって、前記POの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
(a)前記ターゲット核酸配列をPOとハイブリダイズさせる段階であって、前記POは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、
(b)前記POの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって、前記POが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記POは、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて切断断片が生成され、
(c)インターカレーティング剤の存在下で、前記固相基質上に固定化されたCOに前記段階(b)の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、前記COは、前記POにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記切断断片は、前記COにハイブリダイズされず、非切断POは、前記COにハイブリダイズされて非切断PO/CO二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、そして、
(d)前記固相基質上の前記インターカレーティング剤からのシグナルを測定して、前記POの切断の発生を検出する段階であって、前記POの切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
本発明のさらに他の様態によれば、本発明は、次を含み、固相基質上におけるPOCH(PO切断及びハイブリダイゼーション)アッセイによってDNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供する:
(a)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含むPO;
(b)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアップストリームオリゴヌクレオチド;前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記POのアップストリームに位置し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記POの切断を誘導し、及び、
(c)前記固相基質上に固定化されたCO;前記COは、前記POにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、これにより、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって非切断されたPOは、前記COにハイブリダイズされて、非切断PO/CO二量体が形成される。
(a)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含むPO;及び、
(b)前記固相基質上に固定化されたCO;前記COは、前記POにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、これにより、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって非切断されたPOは、前記COにハイブリダイズされて、非切断PO/CO二量体が形成される。
新規なアッセイであるPOCHアッセイが、単一標識非タギングPOを用いてターゲット核酸配列を検出できるか否かについて評価した(図2参照)。PO切断は、チューブで実施し、キャプチャリングオリゴヌクレオチド(Capturing Oligonucleotide、CO)が固定化されたマイクロアレイで前記結果物の一部を移した。
NG−T 5’−AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA−3’(SEQ ID NO:1)
NG−R 5’−CAATGGATCGGTATCACTCGC−3’(SEQ ID NO:2)
NG−PO−1 5’−[Quasar570]TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]−3’(SEQ ID NO:3)
NG−CO−1 5’−[AminoC6]TTTTTTTTTTCGAAACACGCCAATGAGGGGCA[C3 spacer]−3’(SEQ ID NO:4)
Marker 5’−[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]−3’(SEQ ID NO:5)
本発明者らは、POCHアッセイが単一標識3’−タギングPOを用いてターゲット核酸配列を検出できるか否かについてさらに評価した(図4参照)。PO切断は、チューブで実施し、COが、固定化されたマイクロアレイで前記結果物の一部を移した。
NG−T 5’−AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA−3’(SEQ ID NO:1)
NG−R 5’−CAATGGATCGGTATCACTCGC−3’(SEQ ID NO:2)
NG−PO−2 5’−[Quasar570]TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCGGACGACGGCTTGGCTTTACGA[C3 spacer]−3’(SEQ ID NO:6)
NG−CO−2 5’−[AminoC6]TTTTTTCGTAAAGCCAAGCCGTCGTC[C3 spacer]−3’(SEQ ID NO:7)
Marker 5’−[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]−3’(SEQ ID NO:5)
(下線を引いた文字は、POの3’−タギング部位を示す)
本発明者らは、単一標識5’−タギングPOを利用したPOCHアッセイに対してさらに評価した(図5参照)。PO切断は、チューブで実施し、COが、固定化されたマイクロアレイで前記結果物の一部を移した。
NG−T 5’−AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA−3’(SEQ ID NO:1)
NG−R 5’−CAATGGATCGGTATCACTCGC−3’(SEQ ID NO:2)
NG−PO−3 5’−ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[Quasar570]−3’(SEQ ID NO:8)
NG−CO−3 5’−GCCAAGCCGTCGTTTTTTTTTTT[AminoC7]−3’(SEQ ID NO:9)
Marker 5’−[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]−3’(SEQ ID NO:5)
(下線を引いた文字は、POの5’−タギング部位を示す)
本発明者らは、POCHアッセイが二重標識3’−タギングPOを用いてターゲット核酸配列を検出できるか否かについてさらに評価した(図11参照)。PO切断は、チューブで実施し、COが、固定化されたマイクロアレイで前記結果物の一部を移した。
NG−T 5’−AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA−3’(SEQ ID NO:1)
NG−R 5’−CAATGGATCGGTATCACTCGC−3’(SEQ ID NO:2)
NG−PO−4 5’−[BHQ−2]TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[T(Quasar570)]GACGACGGCTTGGCTTTACGA[C3 spacer]−3’(SEQ ID NO:10)
NG−CO−2 5’−[AminoC6]TTTTTTCGTAAAGCCAAGCCGTCGTC[C3 spacer]−3’(SEQ ID NO:7)
Marker 5’−[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]−3’(SEQ ID NO:5)
(下線を引いた文字は、POの3’−タギング部位を示す)
本発明者らは、ターゲット配列の増幅を伴うターゲット核酸配列の検出にPOCHアッセイを応用した。本応用を実験するために、単一標識非タギングPO及び単一標識3’−タギングPOのそれぞれを利用した。PCR過程によるターゲット増幅の間のPO切断は、チューブで実施し、COが、固定化されたマイクロアレイで前記結果物の一部を移した。
本実施例で利用されたアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、PO、CO、及びマーカーの配列は、次の通りである:
NG−F 5’−TACGCCTGCTACTTTCACGCT−3’(SEQ ID NO:11)
NG−R 5’−CAATGGATCGGTATCACTCGC−3’(SEQ ID NO:2)
NG−PO−1 5’−[Quasar570]TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]−3’(SEQ ID NO:3)
NG−CO−1 5’−[AminoC6]TTTTTTTTTTCGAAACACGCCAATGAGGGGCA[C3 spacer]−3’(SEQ ID NO:4)
Marker 5’−[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]−3’(SEQ ID NO:5)
本実施例で利用されたアップストリームプライマー、ダウンストリームプライマー、3’−タギングPO、CO、及びマーカーの配列は、次の通りである:
NG−F 5’−TACGCCTGCTACTTTCACGCT−3’(SEQ ID NO:11)
NG−R 5’−CAATGGATCGGTATCACTCGC−3’(SEQ ID NO:2)
NG−PO−2 5’−[Quasar570]TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCGGACGACGGCTTGGCTTTACGA[C3 spacer]−3’(SEQ ID NO:6)
NG−CO−2 5’−[AminoC6]TTTTTTCGTAAAGCCAAGCCGTCGTC[C3 spacer]−3’(SEQ ID NO:7)
Marker 5’−[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]−3’(SEQ ID NO:5)
(下線を引いた文字は、POの3’−タギング部位を示す)
本発明者らは、ターゲット核酸配列のリアルタイム検出にPOCHアッセイを応用した。本応用を実験するために、3’−タギングPOを利用した。COが、固定化されたマイクロアレイ上でPCR過程によるターゲット増幅と共にPOの切断及びPOのハイブリダイゼーションを実施した。サイクル数による蛍光シグナルの変化を測定した。Neisseria gonorrhoeae(NG)のゲノムDNAをターゲット鋳型として利用した。
本発明者らは、追加的にアップストリームオリゴヌクレオチドなしに、ターゲット核酸配列の検出でのPOCHアッセイを評価した。アップストリームオリゴヌクレオチドなしに、POのアップストリームオリゴヌクレオチド−独立的切断をチューブで実施し、COが、固定化されたマイクロアレイで前記結果物の一部を移した。
NG−T 5’−AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATACCGATCCATTGAAAAA−3’(SEQ ID NO:1)
NG−PO−5 5’−[FAM]TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer]−3’(SEQ ID NO:12)
NG−CO−1 5’−[AminoC6]TTTTTTTTTTCGAAACACGCCAATGAGGGGCA[C3 spacer]−3’(SEQ ID NO:4)
Marker 5’−[Quasar570]ATATATATAT[AminoC7]−3’(SEQ ID NO:5)
Claims (36)
- 次の段階を含み、固相基質上におけるPOCH(PO切断及びハイブリダイゼーション)アッセイによってDNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法:
(a)前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びプロービングオリゴヌクレオチド(PO)とハイブリダイズさせる段階であって、
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、
前記POは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、
前記POは、単一標識を有し、
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記POのアップストリームに位置し、
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記POの切断を誘導し、
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは延長せず、
(b)前記POの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって、
前記POが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記POは、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて単一標識含有断片が生成され、
(c)前記固相基質上に固定化されたキャプチャリングオリゴヌクレオチド(CO)に前記段階(b)の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、
前記COは、前記POにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、
前記単一標識含有断片は、前記COにハイブリダイズされず、非切断POは、前記COにハイブリダイズされて非切断PO/CO二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、そして、
(d)前記固相基質上の前記単一標識からのシグナルを測定して、前記非切断PO/CO二量体の形成の有無を確認する段階であって、
前記非切断PO/CO二量体の形成が確認された場合、前記ターゲット核酸配列は存在せず、前記非切断PO/CO二量体の形成が確認されなかった場合、前記ターゲット核酸配列が存在する。 - 前記COでの前記POにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記POのターゲッティング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記POは、その3’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む3’−タギングPOであるか、またはその5’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む5’−タギングPOであり、前記COでの前記POにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記POのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記単一標識は、POの切断によって放出されるタギング部位含有断片上に残留されない位置に位置することを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 前記POは、その3’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む3’−タギングPOであるか、またはその5’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む5’−タギングPOであり、前記COでの前記POにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記POのタギング部位の一部、及び前記POのターゲッティング部位の一部にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記PO及び/またはCOは、その3’−末端がブロッキングされて延長が防止されたことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記POのターゲッティング部位と部分的に重なる配列を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、5’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性DNA重合酵素またはFENヌクレアーゼであることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、反復サイクルの間に変性過程を含み、前記段階(a)−(b)、(a)−(c)、または(a)−(d)を繰り返す段階をさらに含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記段階(a)−(d)は、1つの反応容器または個別反応容器で実施することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲット核酸配列は、少なくとも2種のターゲット核酸配列を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異(nucleotide variation)を含むことを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施することを特徴とする請求項1ないし請求項12のうち何れか一項に記載の方法。
- 次の段階を含み、固相基質上におけるPOCH(PO切断及びハイブリダイゼーション)アッセイによってDNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法:
(a)前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びプロービングオリゴヌクレオチド(PO)とハイブリダイズさせる段階であって、
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、
前記POは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、
前記POは、供与体分子及び受容体分子を含む相互作用的二重標識を有し、
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記POのアップストリームに位置し、
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記POの切断を誘導し、
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは延長せず、
(b)前記POの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって、
前記POが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記POは、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて、前記相互作用的二重標識が分離され、これにより、供与体含有断片及び受容体含有断片が生成され、
(c)前記固相基質上に固定化されたキャプチャリングオリゴヌクレオチド(CO)に前記段階(b)の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、
前記COは、前記POにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、
前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも1つは、前記COにハイブリダイズされず、非切断POは、前記COにハイブリダイズされて非切断PO/CO二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、
前記非切断PO/CO二量体からのシグナルは、前記供与体含有断片及び前記受容体含有断片のうち少なくとも1つが、前記COにハイブリダイズされない場合に提供されるシグナルと区別され、そして、
(d)前記固相基質上の前記相互作用的二重標識からのシグナルを測定して、前記非切断PO/CO二量体の形成の有無を確認する段階であって、
前記非切断PO/CO二量体の形成が確認された場合、前記ターゲット核酸配列は存在せず、前記非切断PO/CO二量体の形成が確認されなかった場合、前記ターゲット核酸配列が存在する。 - 前記COでの前記POにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記POのターゲッティング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記相互作用的二重標識は、前記非切断PO/CO二量体が形成される場合に、前記供与体分子からのシグナルが、前記受容体分子によってクエンチングされる位置に位置し、前記受容体分子からのシグナルを検出して、前記段階(d)を実施することを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記POは、その3’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む3’−タギングPOであるか、またはその5’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む5’−タギングPOであり、前記COでの前記POにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記POのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記相互作用的二重標識は、前記非切断PO/CO二量体が形成される場合に、前記供与体分子からのシグナルが、前記受容体分子によってクエンチングされる位置に位置し、前記受容体分子からのシグナルを検出して、前記段階(d)を実施することを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記COでの前記POにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記POのターゲッティング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記供与体含有断片が、前記COにハイブリダイズされない条件下で、前記段階(c)の前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、前記相互作用的二重標識は、前記非切断PO/CO二量体が形成される場合に、前記供与体分子からのシグナルが、前記受容体分子によってクエンチングされない位置に位置し、前記供与体分子からのシグナルを検出して、前記段階(d)を実施することを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記POは、その3’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む3’−タギングPOであるか、またはその5’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む5’−タギングPOであり、前記COでの前記POにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記POのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、前記供与体含有断片が、前記COにハイブリダイズ可能な前記タギング部位を含み、前記段階(c)の前記ハイブリダイゼーション反応で前記供与体含有断片が、前記COにハイブリダイズされ、前記相互作用的二重標識は、前記非切断PO/CO二量体が形成される場合に、前記供与体分子からのシグナルが、前記受容体分子によってクエンチングされる位置に位置し、前記供与体分子からのシグナルを検出して、前記段階(d)を実施することを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記POは、その3’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む3’−タギングPOであるか、またはその5’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む5’−タギングPOであり、前記COでの前記POにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記POのタギング部位の一部、及び前記POのターゲッティング部位の一部にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記方法は、反復サイクルの間に変性過程を含み、前記段階(a)−(b)、(a)−(c)、または(a)−(d)を繰り返す段階をさらに含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記段階(a)−(d)は、1つの反応容器または個別反応容器で実施することを特徴とする請求項14に記載の方法。
- 前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施することを特徴とする請求項14ないし請求項21のうち何れか一項に記載の方法。
- 次の段階を含み、固相基質上におけるPOCH(PO切断及びハイブリダイゼーション)アッセイによってDNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法:
(a)前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びプロービングオリゴヌクレオチド(PO)とハイブリダイズさせる段階であって、
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、
前記POは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含み、
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記POのアップストリームに位置し、
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記POの切断を誘導し、
前記アップストリームオリゴヌクレオチドは延長せず、
(b)前記POの切断のための条件下で、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素に前記段階(a)の結果物を接触させる段階であって、
前記POが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記POは、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって切断されて切断断片が生成され、
(c)インターカレーティング剤の存在下で、前記固相基質上に固定化されたキャプチャリングオリゴヌクレオチド(CO)に前記段階(b)の結果物を接触させてハイブリダイゼーション反応を実施する段階であって、
前記COは、前記POにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、
前記切断断片は、前記COにハイブリダイズされず、非切断POは、前記COにハイブリダイズされて非切断PO/CO二量体が形成される条件下で、前記ハイブリダイゼーション反応を実施し、そして、
(d)前記固相基質上の前記インターカレーティング剤からのシグナルを測定して、前記非切断PO/CO二量体の形成の有無を確認する段階であって、
前記非切断PO/CO二量体の形成が確認された場合、前記ターゲット核酸配列は存在せず、前記非切断PO/CO二量体の形成が確認されなかった場合、前記ターゲット核酸配列が存在する。 - 前記COでの前記POにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記POのターゲッティング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 前記方法は、反復サイクルの間に変性過程を含み、前記段階(a)−(b)、(a)−(c)、または(a)−(d)を繰り返す段階をさらに含むことを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 前記段階(a)−(d)は、1つの反応容器または個別反応容器で実施することを特徴とする請求項23に記載の方法。
- 前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施することを特徴とする請求項23ないし請求項26のうち何れか一項に記載の方法。
- 請求項1、14、及び23のいずれかに記載の方法の実施における使用のためのキットであって、
次を含み、固相基質上におけるPOCH(PO切断及びハイブリダイゼーション)アッセイによってDNAまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキット:
(a)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むターゲッティング部位を含むプロービングオリゴヌクレオチド(PO);
(b)前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアップストリームオリゴヌクレオチド;前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記POのアップストリームに位置し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記POの切断を誘導し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは延長せず、及び、
(c)前記固相基質上に固定化されたキャプチャリングオリゴヌクレオチド(CO);
前記COは、前記POにハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含み、これにより、5’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって非切断されたPOは、前記COにハイブリダイズされて、非切断PO/CO二量体が形成される。 - 前記POは、単一標識または相互作用的二重標識を有することを特徴とする請求項28に記載のキット。
- 前記POは、その3’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む3’−タギングPOであるか、またはその5’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む5’−タギングPOであり、前記COでの前記POにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記POのタギング部位にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項28に記載のキット。
- 前記POは、その3’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む3’−タギングPOであるか、またはその5’−部位に前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有するタギング部位をさらに含む5’−タギングPOであり、前記COでの前記POにハイブリダイズ可能な前記ヌクレオチド配列は、前記POのタギング部位の一部、及び前記POのターゲッティング部位の一部にハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項28に記載のキット。
- 前記キットは、5’ヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含むことを特徴とする請求項28に記載のキット。
- 前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記POのターゲッティング部位と部分的に重なる配列を有することを特徴とする請求項28に記載のキット。
- 前記キットは、インターカレーティング剤をさらに含むことを特徴とする請求項28に記載のキット。
- 前記キットは、少なくとも2種のターゲット核酸配列の検出に利用され、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、少なくとも2種のアップストリームオリゴヌクレオチドを含み、前記POは、少なくとも2種のPOを含み、前記COは、少なくとも2種のCOを含むことを特徴とする請求項28に記載のキット。
- 前記キットは、ダウンストリームプライマーをさらに含むことを特徴とする請求項28に記載のキット。
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