RU2015130335A - Детекция нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения зондирующего и метящего олигонуклеотида (рто) - Google Patents

Детекция нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения зондирующего и метящего олигонуклеотида (рто) Download PDF

Info

Publication number
RU2015130335A
RU2015130335A RU2015130335A RU2015130335A RU2015130335A RU 2015130335 A RU2015130335 A RU 2015130335A RU 2015130335 A RU2015130335 A RU 2015130335A RU 2015130335 A RU2015130335 A RU 2015130335A RU 2015130335 A RU2015130335 A RU 2015130335A
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
nucleic acid
pto
acid sequence
target nucleic
region
Prior art date
Application number
RU2015130335A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2620958C2 (ru
Inventor
Джон Йоон ЧУН
Янг Джо ЛИ
Original Assignee
Сиджен, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сиджен, Инк. filed Critical Сиджен, Инк.
Publication of RU2015130335A publication Critical patent/RU2015130335A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2620958C2 publication Critical patent/RU2620958C2/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Claims (69)

1. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), включающий:
(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;
(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;
(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется;
(e) проведение анализа плавления или анализа гибридизации для продукта со стадии (d) в диапазоне температур с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала; при этом сигнал обеспечивается посредством (1) метки, соединенной с НО, (2) метки, соединенной с СТО, (3) метки, соединенной с НО, и метки, соединенной с СТО, или (4) интеркалирующей метки; и
(f) детекцию сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
2. Способ по п. 1, где стадию (d) проводят в присутствии НО; при этом (1) фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется до гибридизации НО, и/или (2) если НО гибридизуется с СТО до удлинения данного фрагмента, то удлинение фрагмента приводит к расщеплению или вытеснению НО из комплекса с СТО, тем самым образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида между СТО и НО на стадии (е) ввиду ингибирования гибридизации НО с СТО и/или расходования НО в результате расщепления.
3. Способ по п. 1, где НО или СТО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае образования гибрида между СТО и НО отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, если гибрид между СТО и НО не образуется.
4. Способ по п. 1, где НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а СТО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае образования гибрида между СТО и НО отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, если гибрид между СТО и НО не образуется.
5. Способ по п. 1, который осуществляют, используя один дополнительный НО, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, и два НО гибридизуются с СТО в непосредственной близости друг к другу; при этом один из двух НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а другой из этих двух НО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае образования гибрида между СТО и двумя НО отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, если гибрид между СТО и этими двумя НО не образуется.
6. Способ по п. 1, где НО или СТО содержит одиночную метку; при этом одиночная метка располагается в таком месте, что сигнал от одиночной метки в случае образования гибрида между СТО и НО отличается от сигнала, поступающего от одиночной метки в случае, если гибрид между СТО и НО не образуется.
7. Способ по п. 1, где один из СТО и НО иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f), и детекцию сигнала осуществляют на твердой подложке.
8. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты на твердой фазе в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;
(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;
(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется;
(e) гибридизацию продукта со стадии (d) с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, в условиях, подходящих для гибридизации СТО с НО; при этом один из СТО и НО помечен одиночной меткой, а другой, немеченый, иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f); при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке; и
(f) детекцию сигнала на твердой подложке с целью обнаружения гибрида между СТО и НО на твердой подложке; при этом присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
9. Способ по п. 8, где стадию (d) проводят в присутствии НО; при этом (1) фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется до гибридизации НО, и/или (2) если НО гибридизуется с СТО до удлинения данного фрагмента, то удлинение фрагмента приводит к расщеплению или вытеснению НО из комплекса с СТО, тем самым образование удлиненного дуплекса препятствует образованию гибрида между СТО и НО на стадии (е) ввиду ингибирования гибридизации НО с СТО и/или расходования НО в результате расщепления.
10. Способ по п. 8, где (1) СТО содержит одиночную метку, а НО иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f), или (2) НО содержит одиночную метку, а СТО иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f).
11. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с располагающимся "вверх по течению" олигонуклеотидом и зондирующим и метящим олигонуклеотидом (РТО); при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид содержит гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;
(c) гибридизацию фрагмента, высвободившегося из РТО, с захватывающим и матричным олигонуклеотидом (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО;
(d) осуществление реакции удлинения с использованием продукта со стадии (с) и матричной полимеразы нуклеиновых кислот; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется;
(e) гибридизацию продукта со стадии (d) с гибридизующимся олигонуклеотидом (НО), содержащим гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, в условиях, подходящих для гибридизации СТО с НО; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение первого сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс ингибирует гибридизацию НО с СТО, обеспечивая тем самым получение второго сигнала, указывающего на присутствие НО, не гибридизованного с СТО; при этом сигналы обеспечиваются посредством (1) метки, соединенной с НО, (2) метки, соединенной с СТО, (3) метки, соединенной с НО, и метки, соединенной с СТО, или (4) интеркалирующей метки; и
(f) детекцию первого сигнала или второго сигнала при предварительно заданной температуре, при которой гибрид между СТО и НО сохраняет свою двухцепочечную форму; при этом присутствие гибрида между СТО и НО указывает на отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом отсутствие гибрида между СТО и НО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом разница в первом сигнале и втором сигнале позволяет определить присутствие или отсутствие гибрида между СТО и НО, что указывает на присутствие или отсутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты.
12. Способ по п. 11, где стадию (d) осуществляют в присутствии НО; при этом (1) фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется до гибридизации НО, и/или (2) если НО гибридизуется с СТО до удлинения фрагмента, то удлинение фрагмента приводит к расщеплению или вытеснению НО из комплекса с СТО.
13. Способ по п. 11, где НО или СТО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и НО диссоциированы друг от друга.
14. Способ по п. 11, где НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а СТО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и НО диссоциированы друг от друга.
15. Способ по п. 11, который осуществляют, используя один дополнительный НО, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО, и два НО гибридизуются с СТО в непосредственной близости друг к другу; при этом один из двух НО имеет одну метку из системы двух взаимодействующих меток, содержащей репортерную молекулу и молекулу-гаситель, а другой из этих двух НО имеет другую метку из системы двух взаимодействующих меток; при этом система двух взаимодействующих меток располагается в таком месте, что сигнал от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и эти два НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего от системы двух взаимодействующих меток в случае, когда СТО и эти два НО диссоциированы друг от друга.
16. Способ по п. 11, где НО или СТО содержит одиночную метку; при этом одиночная метка располагается в таком месте, что сигнал от одиночной метки в случае, когда СТО и НО ассоциированы с образованием гибрида, отличается от сигнала, поступающего от одиночной метки в случае, когда СТО и НО диссоциированы друг от друга.
17. Способ по п. 11, где один из СТО и НО иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала на стадии (f), и детекцию сигнала осуществляют на твердой подложке.
18. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где НО содержит нуклеотидную последовательность, конкурирующую с фрагментом в плане гибридизации с СТО.
19. Способ по п. 18, где НО не расщепляется при участии фрагмента или продукта его удлинения.
20. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где стадии (a)-(f) осуществляют в одном реакционном сосуде или в отдельных реакционных сосудах.
21. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где РТО, СТО и/или НО блокированы по своему 3'-концу, чтобы препятствовать его удлинению.
22. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер или располагающийся "вверх по течению" зонд.
23. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован достаточно близко к РТО, чтобы индуцировать расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью.
24. Способ по п. 23, где располагающийся "вверх по течению" праймер индуцирует посредством своей удлиненной цепи расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью.
25. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где захватывающий участок СТО содержит в своей 5'-концевой части нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевой части 3'-концевого узнающего мишень участка РТО.
26. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, который осуществляют с использованием контрольной группы, не имеющей никакой нуклеиновокислотной последовательности-мишени или имеющей предварительно заданное количество нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
27. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, дополнительно включающий повторение всех или некоторых из стадий (a)-(f) с денатурацией между повторяющимися циклами.
28. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, который осуществляют для детекции по меньшей мере двух типов нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид включает по меньшей мере два типа олигонуклеотидов, РТО включает по меньшей мере два типа РТО, СТО включает по меньшей мере два типа СТО, и НО включает по меньшей мере два типа НО.
29. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид представляет собой располагающийся "вверх по течению" праймер, и фермент на стадии (b), обладающий 5'-нуклеазной активностью, представляет собой матричную полимеразу нуклеиновых кислот для удлинения располагающегося "вверх по течению" праймера.
30. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где фермент, обладающий 5'-нуклеазной активностью, представляет собой полимеразу, обладающую 5'-нуклеазной активностью, или нуклеазу FEN (флэп-эндонуклеазу).
31. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, где нуклеиновокислотная последовательность-мишень содержит нуклеотидную вариацию.
32. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, который осуществляют в присутствии располагающегося "вниз по течению" праймера.
33. Способ по любому из пп. 1, 8 и 11, который осуществляют без применения располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида, и расщепление РТО на стадии (b) происходит без какого-либо участия располагающегося "вверх по течению" олигонуклеотида или его удлиненной цепи.
34. Набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), содержащий:
(a) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;
(b) зондирующий и метящий олигонуклеотид (РТО); при этом РТО содержит (1) З'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом З'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;
(c) захватывающий и матричный олигонуклеотид (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется; и
(d) гибридизующийся олигонуклеотид (НО), содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО;
при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала; при этом набор дополнительно содержит (1) метку, соединенную с НО, (2) метку, соединенную с СТО, (3) метку, соединенную с НО, и метку, соединенную с СТО, или (4) интеркалирующую метку.
35. Набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты на твердой фазе в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), содержащий:
(a) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;
(b) зондирующий и метящий олигонуклеотид (РТО); при этом РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;
(c) захватывающий и матричный олигонуклеотид (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется; и
(d) гибридизующийся олигонуклеотид (НО), содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО;
при этом один из СТО и НО помечен одиночной меткой, а другой, немеченый, иммобилизован на твердой подложке или будет иммобилизован на твердой подложке перед детекцией сигнала от одиночной метки; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то образуется удлиненный дуплекс, препятствующий образованию гибрида между СТО и НО, не обеспечивая тем самым получение сигнала от одиночной метки на твердой подложке.
36. Набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени в образце нуклеиновой кислоты в анализе с PCE-NH (отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения РТО), содержащий:
(a) располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;
(b) зондирующий и метящий олигонуклеотид (РТО); при этом РТО содержит (1) 3'-концевой узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) 5'-концевой тегирующий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; при этом 3'-концевой узнающий мишень участок гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, а 5'-концевой тегирующий участок не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью; располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид локализован "вверх по течению" относительно РТО; при этом располагающийся "вверх по течению" олигонуклеотид или его удлиненная цепь индуцирует расщепление РТО ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, так что в результате расщепления высвобождается фрагмент, содержащий 5'-концевой тегирующий участок или часть 5'-концевого тегирующего участка РТО;
(c) захватывающий и матричный олигонуклеотид (СТО); при этом СТО содержит в направлении 3'→5' (1) захватывающий участок, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную 5'-концевому тегирующему участку или части 5'-концевого тегирующего участка РТО, и (2) матричный участок, содержащий нуклеотидную последовательность, не комплементарную 5'-концевому тегирующему участку и 3'-концевому узнающему мишень участку РТО; при этом фрагмент, высвободившийся из РТО, гибридизуется с захватывающим участком СТО; при этом фрагмент, гибридизованный с захватывающим участком СТО, удлиняется с образованием удлиненной цепи, комплементарной матричному участку СТО, и образуется удлиненный дуплекс; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется; и
(d) гибридизующийся олигонуклеотид (НО), содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную СТО;
при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень не присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс не образуется, и СТО и НО образуют гибрид, обеспечивая тем самым получение первого сигнала, указывающего на присутствие гибрида между СТО и НО; при этом, если нуклеиновокислотная последовательность-мишень присутствует в образце нуклеиновой кислоты, то удлиненный дуплекс ингибирует гибридизацию НО с СТО, обеспечивая тем самым получение второго сигнала, указывающего на присутствие НО, не гибридизованного с СТО; при этом набор дополнительно содержит (1) метку, соединенную с НО, (2) метку, соединенную с СТО, (3) метку, соединенную с НО, и метку, соединенную с СТО, или (4) интеркалирующую метку.
RU2015130335A 2012-12-27 2013-12-27 Детекция нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения зондирующего и метящего олигонуклеотида (рто) RU2620958C2 (ru)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2012-0154834 2012-12-27
KR20120154834 2012-12-27
KR20130008580 2013-01-25
KR10-2013-0008580 2013-01-25
KR20130034670 2013-03-29
KR10-2013-0034670 2013-03-29
PCT/KR2013/012312 WO2014104818A1 (en) 2012-12-27 2013-12-27 Detection of target nucleic acid sequence by pto cleavage and extension-dependent non-hybridization assay

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2015130335A true RU2015130335A (ru) 2017-01-30
RU2620958C2 RU2620958C2 (ru) 2017-05-30

Family

ID=51021756

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2015130335A RU2620958C2 (ru) 2012-12-27 2013-12-27 Детекция нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения зондирующего и метящего олигонуклеотида (рто)

Country Status (12)

Country Link
US (2) US9783845B2 (ru)
EP (1) EP2943586B1 (ru)
JP (1) JP6178430B2 (ru)
KR (1) KR101760267B1 (ru)
CN (1) CN104903465B (ru)
AU (1) AU2013371128B2 (ru)
BR (1) BR112015014152B1 (ru)
CA (1) CA2896213C (ru)
ES (1) ES2653642T3 (ru)
MX (1) MX361191B (ru)
RU (1) RU2620958C2 (ru)
WO (1) WO2014104818A1 (ru)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11066704B2 (en) 2016-06-10 2021-07-20 Seegene, Inc. Methods for preparing tagging oligonucleotides
KR102264865B1 (ko) 2016-06-30 2021-06-14 주식회사 씨젠 반응 분석용 형광 검출 장치
BR112019012925A2 (pt) * 2016-12-23 2019-12-10 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg sonda mediadora em duas partes
ES2972231T3 (es) 2016-12-29 2024-06-11 Seegene Inc Procedimiento para reducir la formación de dímeros de cebadores y aumentar la eficacia de la amplificación
CN108823287B (zh) 2017-04-28 2019-04-12 厦门大学 一种检测靶核酸序列的方法
CN107236815A (zh) * 2017-07-18 2017-10-10 江西贤聚景欣医药生物科技有限公司 用于靶核酸序列检测的多重淬灭荧光探针及方法
WO2019045532A2 (en) 2017-08-31 2019-03-07 Seegene, Inc. EVALUATION OF COMPONENT PERFORMANCE USING A PAIR OF DIMER FORMER PRIMERS
WO2019066461A2 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Seegene, Inc. DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES BY CLEAVAGE ANALYSIS AND EXTENSION OF PTO
EP3735476B1 (en) 2018-01-05 2023-08-23 Seegene, Inc. Method for determining the presence or absence of m. tuberculosis, m. bovis and m. bovis bcg in a sample
CN113195734A (zh) * 2018-12-20 2021-07-30 豪夫迈·罗氏有限公司 通过固相分子成像检测靶核酸
WO2023043280A1 (ko) 2021-09-17 2023-03-23 주식회사 씨젠 합성 비자연 염기를 포함하는 태그 올리고뉴클레오타이드를 이용한 타겟 핵산 서열의 검출
EP4265734A1 (de) * 2022-04-22 2023-10-25 Hahn-Schickard-Gesellschaft für angewandte Forschung e.V. Nukleinsäurenachweis in einer pcr mittels eines zielsequenz-unspezifischem modularer reporterkomplexes
WO2023203230A1 (de) * 2022-04-22 2023-10-26 Hahn-Schickard-Gesellschaft Für Angewandte Forschung E. V. Nukleinsäurenachweis in einer pcr mittels eines zielsequenz-unspezifischem modularer reporterkomplexes
EP4372100A1 (en) * 2022-11-15 2024-05-22 Stilla Technologies Data analysis method for multiplex digital pcr using color-combination

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5994069A (en) 1996-01-24 1999-11-30 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acids by multiple sequential invasive cleavages
US5541311A (en) 1992-12-07 1996-07-30 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid encoding synthesis-deficient thermostable DNA polymerase
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
US7381532B2 (en) 1999-10-29 2008-06-03 Stratagene California Compositions and methods for the detection of a nucleic acid using a cleavage reaction
US6893819B1 (en) 2000-11-21 2005-05-17 Stratagene California Methods for detection of a nucleic acid by sequential amplification
US7601497B2 (en) * 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US7309573B2 (en) 2000-11-21 2007-12-18 Stratagene California Methods for detection of a nucleic acid by sequential amplification
KR20020063359A (ko) 2001-01-27 2002-08-03 일렉트론 바이오 (주) 핵산 및 올리거뉴클레오티드의 상보적 이중결합의 특정서열에 특이적으로 반응하는 절단기법을 이용한 핵산 혼성분석 방법 및 장치
GB0205455D0 (en) * 2002-03-07 2002-04-24 Molecular Sensing Plc Nucleic acid probes, their synthesis and use
CN101076537B (zh) * 2003-11-19 2012-07-04 阿莱洛吉克生物科学公司 标记有多个荧光团的寡核苷酸
WO2008011004A2 (en) * 2006-07-17 2008-01-24 Brandeis University Specialized oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification and detection
US20090023151A1 (en) 2006-08-30 2009-01-22 Dawson Elliott P Method For The Labeling And Detection Of Small Polynucleotides
US20080241838A1 (en) 2006-12-29 2008-10-02 Applera Corporation, Applied Biosystems Group Methods and systems for detecting nucleic acids
WO2012096430A1 (en) * 2011-01-11 2012-07-19 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences by pto cleavage and extension assay
US11078525B2 (en) * 2011-03-29 2021-08-03 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence by PTO cleavage and extension-dependent cleavage
MX342067B (es) * 2011-05-04 2016-09-09 Seegene Inc Detección de secuencias de ácido nucleico objetivo por desdoblamiento e hibridización de oligonucleótido de sonda.

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013371128A1 (en) 2015-08-13
AU2013371128B2 (en) 2017-08-10
CN104903465B (zh) 2017-04-26
JP2016502861A (ja) 2016-02-01
WO2014104818A1 (en) 2014-07-03
MX361191B (es) 2018-11-29
JP6178430B2 (ja) 2017-08-09
BR112015014152A2 (ru) 2017-08-22
EP2943586B1 (en) 2017-09-20
MX2015008494A (es) 2015-09-10
US20160060690A1 (en) 2016-03-03
RU2620958C2 (ru) 2017-05-30
EP2943586A1 (en) 2015-11-18
ES2653642T3 (es) 2018-02-08
CN104903465A (zh) 2015-09-09
CA2896213A1 (en) 2014-07-03
CA2896213C (en) 2018-12-11
KR20150093766A (ko) 2015-08-18
KR101760267B1 (ko) 2017-07-24
US20180057869A1 (en) 2018-03-01
BR112015014152B1 (pt) 2023-01-24
US9783845B2 (en) 2017-10-10
EP2943586A4 (en) 2016-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2015130335A (ru) Детекция нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с отсутствием гибридизации, зависящим от расщепления и удлинения зондирующего и метящего олигонуклеотида (рто)
RU2012142160A (ru) Детекция нуклеиновокислотных последовательностей-мишеней в анализе с расщеплением и удлинением рто
US11802308B2 (en) Detection of nucleic acids
RU2014133695A (ru) Детекция нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с гибридизацией сигнального олигонуклеотида, зависящей от расщепления и удлинения зондирующего и метящего олигонуклеотида
CA2766351C (en) Chimeric primers with hairpin conformations and methods of using same
RU2012109893A (ru) Зонд td и его применения
JP2019528726A5 (ru)
JP2019532628A5 (ru)
US10011861B2 (en) Cleavable hairpin primers
RU2014138951A (ru) Детекция нуклеотидной вариации в нуклеиновокислотной последовательности-мишени в анализе с расщеплением и удлинением зондирующего и метящего олигонуклеотида (рто)
RU2016104218A (ru) Определение целевых нуклеиновокислотных последовательностей путем расщепления зондирующего олигонуклеотида и гибридизации
WO2012173274A1 (ja) 核酸測定用の核酸プローブ
JP2013540449A5 (ru)
ES2575538T3 (es) Ensayo para Trichomonas vaginalis mediante amplificación y detección del gen AP65-1 de Trichomonas vaginalis
US6403339B1 (en) Method for detecting a nucleotide sequence
CN102321765B (zh) 一种实时荧光pcr方法及用途
JP2018500918A5 (ru)
Yang et al. An amplification-free detection method of nucleic acids by a molecular beacon probe based on endonuclease activity
CN108642165A (zh) 一种用于实时荧光pcr的探针及其使用方法
WO2008119046A3 (en) Methods and compositions for multiplexing detection of nucleic acid sequences within an array element
EP3377652B1 (en) A method and a kit for nucleic acid detection
JP2007515967A (ja) 高感度核酸多重解析法
EP2453022A1 (en) Method for detection or analysis of target sequence in genomic dna
WO2015185902A1 (en) Nucleic acid amplification system
US20140256597A1 (en) Method of amplifying and labeling the mRNA sample for mRNA microarray