CN104903465A - 基于寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交探测的靶核酸序列的检测 - Google Patents

基于寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交探测的靶核酸序列的检测 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的靶核酸序列的检测。本发明利用基于形成靶-依赖性延伸二聚物的捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交抑制的发生。因此，本发明在杂交寡核苷酸未被切割的情况下也可检测靶序列。相关地，可以容易地设计5’-标记部位、捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸序列，还可以容易地设定反应条件。并且，可在与捕捉和模板化寡核苷酸的延伸互不相同的容器中实施杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的检测。

Description

基于寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交探测的靶核酸序列的检测
【相关申请的交叉引用】
本专利申请对韩国特许厅于2012年12月27日提出的韩国特许申请第2012-0154834号、2013年1月25日提出的韩国特许申请第2013-0008580号及2013年3月29日提出的韩国特许申请第2013-0034670号主张优先权，上述专利申请的公开内容作为参照引用于本说明书中。
【技术领域】
本发明涉及基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的靶核酸序列的检测。
【背景技术】
DNA杂交是分子生物学的基本的过程，受离子强度、碱基结构、核酸片段的长度、错配(mismatching)程度以及变形剂的存在的影响。基于DNA杂交的技术将成为决定特定核酸序列的非常有用的用具，将会明确有助于临床诊断、基因研究及法医学上的实验分析。但是，在仅依赖杂交的现有的方法以及过程中，发生因探针和非-靶序列之间的非-特异性杂交引起的假阳性(false positive)结果的可能性高。因此，现有的方法以及过程存在改善可靠性的问题。
除探针杂交过程以外还提出了利用酶反应的几种接近法，例如，TaqManTM探针方法。
在TaqManTM探针方法中，与靶核酸序列杂交的标记(labeled)探针基于上游引物(upstream primer)-依赖性DNA聚合酶的5’核酸酶活性被切割，来产生表示靶序列存在的信号(美国专利第5210015号、第5538848号以及第6326145号)。TaqManTM探针方法提出用于信号产生的两个接近法：聚合(polymerization)-依赖性切割以及聚合-独立性切割。在聚合-依赖性切割中，上游引物的延伸必须在核酸聚合酶与标记探针的5’-末端接触之前发生。随着延伸反应的进行，聚合酶逐渐地切割标记探针的5’-末端。在聚合-独立切割中，上游引物以及标记探针非常邻近，由此与靶核酸序列进行杂交，上游引物的3’-末端和核酸聚合酶的结合使上述核酸聚合酶与标记探针的5’-末端接触来放出标记。并且，TaqManTM探针方法公开，通过在其5’-末端部位具有不与靶序列杂交的5’-尾巴区域的标记探针被切割来形成包含5’-尾巴区域的片段。
也有对具有对靶序列非-互补的5’-尾巴区域的探针被5’核酸酶切割，放出包含5’-尾巴区域的片段的几种方法的报告。
例如，美国专利第5691142号就公开了对基于DNA聚合酶的5’核酸酶活性来被切割的切割结构。公开中例示了有对包含对模板非-互补的5’部位以及对模板互补的3’部位的寡核苷酸与模板杂交，并且，上游寡核苷酸与模板非常邻近而由此与模板进行杂交的切割结构。切割结构通过被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或具有减少的合成活性的变异DNA聚合酶切割，来放出与模板非-互补的5’部位。之后，被放出的5’部位与具有发夹结构的寡核苷酸杂交，形成切割结构。由此，诱导渐进性的切割反应来检测靶序列。
美国专利第7381532号公开了具有3’-末端被阻断的上游寡核苷酸的切割结构通过被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或瓣状核酸内切酶切割，来放出非-互补的5’皮瓣(flap)部位，被放出的5’皮瓣部位基于大小分析或相互作用性双重标记来被检测的过程。美国专利第6893819号公开了可以检测的被放出的皮瓣基于核酸合成依赖性的、皮瓣-媒介连续性扩增方法而生成的内容。在此方法中，从第一个切割结构放出的皮瓣，以核酸合成依赖性方式切割第二个切割结构来从第二个切割结构放出皮瓣，并检测被放出的皮瓣。
美国专利第7309573号公开了包括基于核酸合成生成的被放出的皮瓣的生成、被放出的皮瓣的延伸、在皮瓣延伸期间的寡核苷酸的切割及切割寡核苷酸而生成的信号检测的方法。
借助液相中的荧光-标记探针的杂交，即使利用一种荧光标记，也可基于解链曲线分析来同时检测多个靶核酸序列。但是，在基于相互作用性-双重标记探针的5’核酸酶介导的切割来检测靶序列的现有技术中，在检测多重靶时，对互不相同的靶序列需要互不相同的种类的荧光标记，由于这种荧光标记的种类数量有限，因而检测出的靶序列的数量受限。
美国申请公开号第2008-0241838号中公开了利用在靶核酸序列具有非-互补的5’部位的探针的切割以及捕捉(capture)探针的杂交的靶检测方法。标记位于非-互补的5’部位。杂交于靶序列的标记探针被切割而放出片段，之后，片段与捕捉探针杂交而检测靶序列的存在。在此方法中，非切割/完好无损的(uncleaved/intact)探针需要与捕捉探针非杂交。为此，需要长度短的捕捉探针在固相底物实现固定化。但是，这种限制会降低固相底物上的杂交效率，并且使反应条件的最优化变得困难。
因此，作为更加便利，且具有可靠性及再现性的方式，急需开发既用于杂交，又基于5’核酸切割反应(5’nucleolytic reaction)等酶反应来在液相及固相中检测靶序列，更优选地，检测多个靶序列的新的接近法的要求正在抬头。并且，在本发明所属领域中正需要一种不受限于标记(尤其，荧光标记)种类的数量的新的靶检测方法。
本说明书全文中，参照了多个专利及文献，并用括号来表示了其引用。这种专利及文献的公开内容全部作为参照包括在本说明书中，从而更加明确地说明本发明所属技术领域的水平及本发明的内容。
【发明内容】
本发明人为了开发具有更为改善的准确性及便利性，尤其，在多种(multiplex)方式中检测靶序列的新的接近法而进行了努力研究。结果，本发明人定立了用于检测靶序列的新的方案，而这种靶的检测通过探针杂交、酶探针的切割、延伸及利用杂交寡核苷酸的延伸产物(extended product)的检测来实现。本发明的方案不仅优秀地适用于固相反应，而且也优秀地适用于液相反应，并且具有更为改善的准确性及便利性来检测多个靶序列。
因此，本发明的目的在于，提供用于通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验检测来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的方法。
本发明的另一目的在于，提供用于通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来从DNA或核酸混合物检测靶核酸序列的试剂盒。
与发明要求保护范围及附图一同参照以下的详细说明可使本发明的其他目的及优点更为明确。
【附图说明】
图1示出利用于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization:PCE-NH)试验的探测和标记寡核苷酸(PTO，Probing and TaggingOligonucleotide)、捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturing andTemplating Oligonucleotide)及杂交寡核苷酸(HO，HybridizingOligonucleotide)的图式结构。尤其，探测和标记寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸的3’-末端通过阻断来防止延伸。
图2以图式性的方式表示包括解链(melting)分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式。杂交寡核苷酸具有报道(repoter)分子及淬灭(quencher)分子。延伸二聚物(extended duplex)的形成通过抑制(inhibit)杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交来防止(prevent)捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的形成。
图3以图式性的方式表示包括解链分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式。杂交寡核苷酸具有报道分子及猝灭分子。延伸二聚物的形成不仅通过抑制捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交，而且通过切割杂交寡核苷酸来防止在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物。
图4以图式性的方式表示包括解链分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式。杂交寡核苷酸具有报道分子且捕捉和模板化寡核苷酸具有猝灭分子。
图5以图式性的方式表示包括解链分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式。杂交寡核苷酸具有单一荧光标记，上述单一荧光标记根据存在于单链或双链来呈现出不同的信号强度。
图6以图式性的方式表示包括解链分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式。杂交寡核苷酸具有报道分子和猝灭分子。在杂交寡核苷酸与捕捉和模板化寡核苷酸的杂交中，包含与探测和标记寡核苷酸片段竞争的核苷酸序列。
图7以图式性的方式表示包括解链分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式。杂交寡核苷酸具有报道分子，捕捉和模板化寡核苷酸具有猝灭分子。在杂交寡核苷酸与捕捉和模板化寡核苷酸的杂交中，包含与探测和标记寡核苷酸片段竞争的核苷酸序列。
图8以图式性的方式表示在固相中利用单一标记的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第二实施方式。捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记，杂交寡核苷酸固定于固相底物上。延伸二聚物的形成通过抑制杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交来防止在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物。
图9以图式性的方式表示在固相中利用单一标记的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第二实施方式。捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记，杂交寡核苷酸固定于固相底物上。延伸二聚物的形成不仅通过抑制杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交抑制来防止在捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸之间形成杂交物，而且通过杂交寡核苷酸的切割或分离(displacement)来防止在捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸之间形成杂交物。
图10以图式性的方式表示在固相中利用单一标记的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第二实施方式。捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记，杂交寡核苷酸固定于固相底物上。延伸二聚物的形成通过捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交来防止在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物。
图11以图式性的方式表示在固相中利用单一标记的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第二实施方式。捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记，杂交寡核苷酸固定于固相底物上。延伸二聚物的形成不仅通过抑制杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交抑制来防止在捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸之间形成杂交物，而且通过杂交寡核苷酸的切割或分离(displacement)来防止在捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸之间形成杂交物。
图12以图式性的方式表示在固相中利用单一标记的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第二实施方式。捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记，杂交寡核苷酸固定于固相底物上。杂交寡核苷酸在与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的过程中包含与探测和标记寡核苷酸片段竞争的核苷酸序列。
图13以图式性的方式表示在固相中利用单一标记的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第二实施方式。捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记，杂交寡核苷酸固定于固相底物上。杂交寡核苷酸在与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的过程中包含与探测和标记寡核苷酸片段竞争的核苷酸序列。
图14以图式性的方式表示延伸二聚物的形成基于抑制捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交的新反应的包括在指定(pre-determined)温度下的检测的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试样的第三实施方式。杂交寡核苷酸具有报道分子及猝灭分子。
图15以图式性的方式表示延伸二聚物的形成基于抑制捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交的新反应的包括在指定温度下的检测的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试样的第三实施方式。杂交寡核苷酸具有报道分子，捕捉和模板化寡核苷酸具有猝灭分子。
图16以图式性的方式表示延伸二聚物的形成基于抑制捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交的新反应的包括在指定温度下的检测的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试样的第三实施方式。杂交寡核苷酸具有单一荧光标记，上述单一荧光标记根据存在于单链或双链来呈现出不同的信号强度。
图17以图式性的方式表示延伸二聚物的形成基于抑制捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交的新反应的包括在指定温度下的检测的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试样的第三实施方式。杂交寡核苷酸具有报道分子及猝灭分子。杂交寡核苷酸在与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的过程中包含与探测和标记寡核苷酸片段竞争的核苷酸序列。
图18以图式性的方式表示延伸二聚物的形成基于抑制捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交的新反应的包括在指定温度下的检测的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试样的第三实施方式。杂交寡核苷酸具有报道分子，捕捉和模板化寡核苷酸具有猝灭分子。杂交寡核苷酸在与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的过程中包含与探测和标记寡核苷酸片段竞争的核苷酸序列。
图19A及图19B表示捕捉和模板化核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交是否被延伸二聚物抑制的评价结果。Syn-Es意味着合成延伸链。
图20A表示在指定温度(杂交温度，55℃)中实时基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的靶检测结果。这种结果表示利用被延伸二聚物抑制的信号的靶检测。
图20B表示在指定温度(变性温度，55℃)中基于实时的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的靶检测结果。这种结果示出几个杂交寡核苷酸可以在进行反应的期间被切割。
图20C表示解链分析方式中基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的靶检测结果。
图21A表示在指定温度(杂交温度，60℃)中基于实时的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的靶检测结果。杂交寡核苷酸在与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的过程中包含与探测和标记寡核苷酸片段竞争的核苷酸序列。从杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交抑制中提供所检测的信号。通过杂交寡核苷酸的切割来提供的信号被排除。
图21B表示在指定温度(变性温度，95℃)中基于实时的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的靶检测结果。杂交寡核苷酸在与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的过程中包含与探测和标记寡核苷酸片段竞争的核苷酸序列。这种结果示出杂交寡核苷酸在反应期间内未被切割。
图21C表示在解链分析方式中基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的靶检测结果。杂交寡核苷酸在与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的过程中包含与探测和标记寡核苷酸片段竞争的核苷酸序列。
图22表示利用单一标记的捕捉和模板化寡核苷酸及固定于固相的杂交寡核苷酸的基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的靶检测结果。
图23表示在单独的管中实施延伸步骤及杂交寡核苷酸杂交步骤，从而防止杂交寡核苷酸被切割，并利用单一标记的捕捉和模板化寡核苷酸及固定于固相的杂交寡核苷酸的基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的靶检测结果。
【具体实施方式】
本发明涉及用于检测基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的靶核酸序列的新方法及用于通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测靶核酸序列的试剂盒。本发明通过探针杂交、酶探针切割、延伸及利用杂交寡核苷酸的延伸产物的检测来实施。通过用于检测利用杂交寡核苷酸的延伸产物的方式，本发明可分为三种方式。
【I.基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的靶检测过程的第一实施方式】
根据本发明的第一实施方式，本发明提供通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游寡核苷酸(upstreamoligonucleotide)及探测和标记寡核苷酸进行杂交(hybridizing)，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交，上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游；
步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸的条件下，使上述步骤(a)的产物与具有5’核酸酶活性的酶相接触，上述上游寡核苷酸或其延伸链基于具有上述5’核酸酶活性的酶来诱导上述探测和标记寡核苷酸的切割，由此上述切割放出上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交，上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用上述步骤(c)的产物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段延伸并生成与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸链(extended strand)，并形成延伸二聚物(extended duplex)，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物；
步骤(e)，在存在包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸的情况下，在规定温度范围内，对上述步骤(d)的产物实施解链分析或杂交分析，上述靶核酸序列不存在于上述核酸试样内的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此提供表示上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在的信号，在上述靶核酸序列存在于上述核酸试样内的情况下，形成上述延伸二聚物来防止在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物，由此，不提供上述信号，上述信号通过(i)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记、(ii)与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记、(iii)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记及与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入标记来提供；以及
步骤(f)，检测信号，上述信号表示上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在表示上述靶核酸序列的不存在，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的不存在表示上述靶核酸序列的存在。
本发明人为了开发具有更为改善的准确性及便利性，尤其，在多种方式中检测靶序列的新的接近法而进行了努力研究。结果，本发明人定立了用于检测靶序列的新的方案，而这种靶的检测通过利用探针杂交、酶探针切割、延伸及利用杂交寡核苷酸的解链分析来实现。本发明的方案不仅优秀地适用于固相反应，而且也优秀地适用于液相反应，并且具有更为改善的准确性及便利性来检测多个靶序列。
本发明利用包括探针杂交的如下连续性的事件：探测和标记寡核苷酸的切割及延伸、延伸二聚物的形成及使用杂交寡核苷酸的杂交分析或解链分析。在解链分析或杂交分析中，不形成具有杂交寡核苷酸的杂交物表示靶核酸序列的存在。因此，本发明被命名为探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验。
在仅存在上述靶核酸的情况下，形成上述延伸二聚物来防止在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物，因此，表示捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在的信号的不存在表示靶核酸的存在。
与上述延伸二聚物相关的术语“防止在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物”意味着与基于延伸二聚物的上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间不形成杂交物相关的所有事件。例如，上述术语包括基于延伸二聚物的杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交抑制及消耗形成杂交物的杂交寡核苷酸的杂交寡核苷酸的切割(即，在探测和标记寡核苷酸片段延伸的期间内切割杂交寡核苷酸)。
本发明作为用于检测是否存在上述捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的辨别因素，具有使用捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的Tm值的特征。捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物根据捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸的序列和/或长度而具有可区别的Tm值。基于Tm值来决定是否存在基于解链分析或杂交分析的捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物。
尤其，本发明不仅可在上述杂交寡核苷酸被切割时，为了检测靶核酸序列而适用，而且在杂交寡核苷酸未被切割的情况下(即，杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交通过延伸二聚物的形成而被抑制)，也可以为了检测靶核酸序列而适用。
包括在与靶序列杂交后被切割的探针中发生信号的现有技术可以不提供解链曲线。与此不同，本发明使用具有与靶序列无关的序列的捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物所提供的解链信号的消灭(或减少)。因此，本发明可在杂交寡核苷酸依赖于靶序列的存在来被切割的情况下，也可以通过解链分析来检测靶序列。
对包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式进行更为详细的说明如下。
【步骤(a)：靶核酸序列和上游寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸的杂交】
根据本发明，首先，使靶核酸序列与上游寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸进行杂交。
在本说明书中所使用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶序列”意味着所要检测的核酸序列，且在杂交、退火或扩增条件下与探针或引物进行退火或杂交。
在本说明书中所使用的术语“探针(probe)”意味着与靶核酸序列实质上互补的部位或包含这些部位的单链核酸分子。
在本说明书中所使用的术语“引物”意味着寡核苷酸，在诱导与核酸链(模板)互补的引物延伸产物的合成的条件，即，如核苷酸和DNA聚合酶之类的聚合剂的存在以及适合的温度与pH的条件下，可起到合成的起始点的作用。
本发明的特定实例中，探针及引物为单链脱氧核糖核苷酸分子。在本发明中所利用的探针或引物可包含天然(naturally occurring)脱氧单磷酸核苷(dNMP)(即，脱氧腺苷酸(dAMP)、dGMP(脱氧鸟苷酸)、dCMP(脱氧胞苷酸)及dTMP(脱氧胸苷酸))、变异核苷酸或非-天然核苷酸。并且，探针或引物还可包含核糖核苷酸。
就引物而言，应充分长，以便可以在聚合剂的存在之下引发延伸产物的合成。引物的适合的长度取决于包括例如，温度、应用领域及引物的根源(source)的多个因素。在本说明书中使用的术语“退火”或“引发”意味着在模板核酸并置(apposition)寡脱氧核苷酸或核酸，就上述并置而言，通过聚合酶对核苷酸进行聚合而在模板核酸或其一部分形成互补的核酸分子。
在本说明书中使用的术语“杂交(hybridizing)”意味着互补的单链核酸形成双链核酸。在两个核酸链之间的互补性完全匹配(perfectmatch)时发生杂交，或即使存在一部分错配(mismatches)碱基也能发生杂交。杂交所需的互补性的程度可根据杂交条件而不同，尤其是可根据温度来进行调节。
上游寡核苷酸以及探测和标记寡核苷酸与靶核酸序列的杂交可在通常基于最佳化步骤而决定的合适的杂交条件下实施。温度、成分的浓度、杂交及清洗次数、缓冲液成分及它们的pH及离子强度之类的条件可根据包含寡核苷酸(上游寡核苷酸以及探测和标记寡核苷酸)的长度及糖皮质激素(GC)含量及靶核酸序列的各种因子而不同。例如，在利用相对短的寡核苷酸的情况下，优选地，选择低的严格条件(stringent condition)。用于杂交的详细条件可以在Joseph Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)；以及M.L.M.Anderson，Nucleic Acid Hybridization，Springer-Verlag NewYork Inc.N.Y.(1999)中确认。
术语“退火”和“杂交”没有区别，在本说明书中混用。
上游寡核苷酸以及探测和标记寡核苷酸具有与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列。在本说明书中使用的术语“互补的”意味着在预定的退火条件或严格条件下引物或探针以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分地互补，并全部包括“实质上互补的(substantiallycomplementary)”及“完全互补的(perfectly complementary)”，优选地，意味着完全互补的意思。
探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位具有与靶核酸序列非-互补的核苷酸序列。捕捉和模板化寡核苷酸(CTO，Capturing andTemplating Oligonucleotide)的模板化部位具有与探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列。在本说明书中使用的术语“非-互补的”意味着在预定的退火条件或严格条件下引物或探针不以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分地非-互补，并全部包括“实质上非互补的(substantially non-complementary)”及“完全非-互补的(perfectly non-complementary)”，优选地，意味着完全非-互补的意思。
例如，揭示探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位而所使用的术语“非-互补的”意味着在预定的退火条件或严格条件下，上述5’-标记部位不以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分地非-互补，并全部包括“实质上非互补的(substantially non-complementary)”及“完全非-互补的(perfectly non-complementary)”，优选地，意味着完全非-互补的意思。
在本说明书中使用的术语“探测和标记寡核苷酸(PTO，Probingand Tagging Oligonucleotide)”意味着寡核苷酸，上述寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，其起到探针的作用；以及(ii)5’-标记部位，其包含与靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，与靶核酸序列杂交后被切割，来从探测和标记寡核苷酸放出。探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位以及3’-靶向部位必须以5’→3’的顺序而置。在图1中以图式性方式示出了探测和标记寡核苷酸。
根据本发明的一实例，在3’-靶向部位与靶核酸序列杂交，且5’-标记部位不与靶核酸序列杂交的严格条件下实施步骤(a)的杂交。
探测和标记寡核苷酸不要求任何特定的长度。例如，探测和标记寡核苷酸可具有15-150核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸、20-150核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-60核苷酸、20-50核苷酸、30-150核苷酸、30-100核苷酸、30-80核苷酸、30-60核苷酸、30-50核苷酸、35-100核苷酸、35-80核苷酸、35-60核苷酸或35-50核苷酸的长度。只要探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位与靶核酸序列特异性地杂交，就可以具有任何长度。例如，探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位可具有10-100核苷酸、10-80核苷酸、10-50核苷酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-50核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-50核苷酸、20-40核苷酸或20-30核苷酸的长度。只要5’-标记部位与捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位特异性地杂交后被延伸，就可以具有任何长度。例如，探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位可具有5-50核苷酸、5-40核苷酸、5-30核苷酸、5-20核苷酸、10-50核苷酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、10-20核苷酸、15-50核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸或15-20核苷酸的长度。
探测和标记寡核苷酸的3’-末端还可具有3’-OH末端(terminal)。在某些实施例中，探测和标记寡核苷酸的3’-末端被“阻断”，由此防止其延伸。
阻断可通过现有方法来达成。例如，阻断可通过在最后核苷酸的3’-羟基上追加如生物素、标记、磷酸基、烷基、非-核苷酸连接肽、硫代磷酸酯或烷烃-二醇残基之类的化学组成部分(moiety)来实施。择一性地，阻断可通过去除最后核苷酸的3’-羟基或利用如双脱氧核苷酸之类的没有3’-羟基的核苷酸来实施。
择一性地，可设计成使探测和标记寡核苷酸具有发夹结构。
探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及靶核酸序列之间的非-杂交意味着在特定杂交条件下，它们之间不形成稳定的双链。根据本发明的实施例，不参与和靶核酸序列的杂交的探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位形成单链。
上游寡核苷酸位于探测和标记寡核苷酸的上游。
并且，与靶核酸序列杂交的上游寡核苷酸或其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的探测和标记寡核苷酸切割。
基于上游寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割的诱导可通过2种方式来达成。(i)诱导上游寡核苷酸延伸-独立性切割；以及(ii)诱导上游寡核苷酸延伸-依赖性切割。
在上游寡核苷酸与探测和标记寡核苷酸相邻近，进而可充分诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的上述探测和标记寡核苷酸的切割反应的情况下，与上游寡核苷酸结合的上述酶可以无需延伸反应而切割探测和标记寡核苷酸。相反，在上游寡核苷酸从探测和标记寡核苷酸隔开的情况下，具有聚合酶活性的酶(例如，模板-依赖性聚合酶)促进上游寡核苷酸(例如，上游引物)的延伸，且与延伸产物相结合的具有5’核酸酶活性的酶切割探测和标记寡核苷酸。
因此，上游寡核苷酸可以以2种方式位于与探测和标记寡核苷酸相对的位置。上游寡核苷酸可位于与探测和标记寡核苷酸邻近的位置，由此以延伸-独立性方式可以充分诱导探测和标记寡核苷酸切割。择一性地，上游寡核苷酸可位于充分可以以延伸-依赖性方式诱导探测和标记寡核苷酸切割的从探测和标记寡核苷酸隔开的位置。
在本说明书中揭示方位(positions)或位置(locations)而使用的术语“邻近的(adjacent)”意味着上游寡核苷酸紧位于与探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位相近的位置形成缺口(nick)。并且，上述术语意味着上游寡核苷酸位于从探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位隔开1-30核苷酸、1-20核苷酸或1-15核苷酸的位置。
在本说明书中揭示方位或位置而使用的术语“隔开(distant)”包括可以充分产生延伸反应的某种位置或位点。
根据本发明一实施例，上游寡核苷酸可位于从探测和标记寡核苷酸隔开的位置，由此以延伸-依赖性方式可以充分诱导探测和标记寡核苷酸切割。
根据本发明一实施例，上游寡核苷酸为上游引物或上游探针。上游引物适合诱导延伸-独立性切割或延伸-依赖性切割，上游探针适合诱导延伸-独立性切割。
择一性地，上述上游寡核苷酸可具有与探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-一部分部分重叠的序列(partial-overlapped sequence)。重叠的序列优选为1-10核苷酸长度、更优选为1-5核苷酸长度、尤其优选为1-3核苷酸长度。在上游寡核苷酸具有与探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-一部分部分重叠的序列(partial-overlappedsequence)的情况下，在步骤(b)的切割反应中，3’-靶向部位将与5’-标记部位一起被部分切割。并且，重叠的序列可以使3’-靶向部位中所需的特定部位被切割。
根据本发明的一实施例，上游引物通过其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的探测和标记寡核苷酸切割。
只要上游寡核苷酸可以诱导与靶核酸序列杂交的探测和标记寡核苷酸切割，使得包含探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的一部分的片段被放出，那么与基于上游寡核苷酸的切割反应相关的现有技术就可以适用于本发明。例如，美国专利第5210015号、第5487972号、第5691142号、第5994069号、第7381532号以及美国申请公开号第2008-0241838号就可以应用于本发明。
根据本发明的一实施例，上述方法在存在下游引物的情况下实施。下游引物可以使与探测和标记寡核苷酸杂交的靶核酸序列追加生成，并可以提高靶检测的灵敏度。
根据本发明的一实施例，在利用上游引物以及下游引物的情况下，为了引物的延伸可追加使用模板-依赖性核酸聚合酶。
根据本发明的一实施例，上游寡核苷酸(上游引物或上游探针)、下游引物和/或探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位具有由本发明人开发的双重引发寡核苷酸(DPO)结构。具有DPO结构的寡核苷酸与现有引物以及探针相比表现出相当得到改善的靶特异度(参照WO2006/095981；Chun等，Dual priming oligonucleotide system for themultiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping ofCYP2C19 gene，Nucleic Acid Research，35:6e40(2007))。
根据本发明一实施例，探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位具有由本发明人开发的变形双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构。变形双重特异性寡核苷酸(mDSO)结构与现有的探针相比表现出相当得到改善的靶特异性(参照WO 2011/028041)。
【步骤(b)：从探测和标记寡核苷酸放出片段】
接着，在用于探测和标记寡核苷酸切割的条件下，使步骤(a)的产物与具有5’核酸酶活性的酶相接触。与靶核酸序列杂交的探测和标记寡核苷酸被具有5’核酸酶活性的酶切割，因而放出包含探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段。
在本说明书中使用的术语“用于探测和标记寡核苷酸切割的条件”意味着对基于具有5’核酸酶活性的酶发生与靶核酸序列杂交的探测和标记寡核苷酸切割的充分的条件，例如，温度、pH、离子强度、缓冲液、寡核苷酸的长度及序列和酶。例如，在利用作为具有5’核酸酶活性的酶的Taq DNA聚合酶的情况下，用于探测和标记寡核苷酸切割的条件包含Tris-HCl缓冲液、KCl、MgCl2及温度。
在探测和标记寡核苷酸与靶核酸序列杂交的情况下，虽然探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位与靶核酸序列杂交，但是5’-标记部位就不与靶核酸序列杂交，而是形成单链(参照图2)。像这样，可基于在本发明所属领域中公知的各种技术，利用具有5’核酸酶活性的酶来切割均包含单链以及双链结构的寡核苷酸。
探测和标记寡核苷酸切割的位置根据上游寡核苷酸(上游探针或上游引物)的种类、上游寡核苷酸的杂交位置以及切割条件而多样(参照美国专利第5210015号、第5487972号、第5691142号、第5994069号以及第7381532号或美国申请公开号第2008-0241838号)。
为了探测和标记寡核苷酸的切割反应，可以利用多个以往技术，并放出包含5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段。
综上所述，在步骤(b)的切割反应中可有三种切割位置。第一切割位置为探测和标记寡核苷酸的杂交部位(3’-靶向部位)以及非-杂交部位(5’-标记部位)之间的连接位置(junction site)。第二切割位置为从探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的3’-末端沿着3’-方向隔开一部分核苷酸的位置。第二切割位置可位于探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端一部分。第三切割位置为从探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的3’-末端沿着5’-方向隔开一部分核苷酸的位置。
根据本发明一实施例，上游引物被延伸的同时基于具有5’核酸酶活性的模板-依赖性聚合酶而开始探测和标记寡核苷酸切割的位置是探测和标记寡核苷酸及靶核酸序列之间的双链开始的方位或从其开始方位隔开1-3核苷酸的位置。
因此，在本说明书中揭示基于具有5’核酸酶活性的酶的探测和标记寡核苷酸切割而使用的术语“包含探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段”意味着包含(i)5’-标记部位、(ii)5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端一部分及(iii)5’-标记部位的一部分。并且，在本说明书中，术语“包含探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段”表现为“探测和标记寡核苷酸片段”。
根据本发明一实施例，探测和标记寡核苷酸包括阻断剂部位，上述阻断剂(blocker)部位包括对具有5’核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的1个阻断剂，上述阻断剂部位用于调节切割位置和/或连续性切割。
根据本发明一实施例，探测和标记寡核苷酸具有阻断剂部位作为阻断剂(blocker)，上述阻断剂部位包括对具有5’核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的至少1个核苷酸。
例如，为了在探测和标记寡核苷酸的杂交部位(3’-靶向部位)以及非-杂交部位(5’-标记部位)之间的连接位置诱导切割，探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端一部分可以由阻断剂阻断。
阻断剂部位中所包括的阻断剂的数量不受限制，可包含1-10阻断剂、2-10阻断剂、3-8阻断剂或3-6阻断剂。存在于探针的阻断剂可以以连续或不连续的方式存在，优选为连续的方式。作为阻断剂的核苷酸，即包含对5’→3’外切核酸酶活性具有耐性的主链的核苷酸包含本领域中公知的任何核苷酸。例如，上述核苷酸包含各种硫代磷酸酯连接、膦酸酯连接、磷酰胺酯连接及2’-碳水化合物变形(modification)。根据本发明的一实施例，包含对5’→3’外切核酸酶具有耐性的主链的核苷酸包含硫代磷酸酯连接、烷基磷酸三酯连接、芳基磷酸三酯连接、膦酸烷基酯连接、膦酸芳基酯连接、氢膦酸酯连接、烷基磷酰胺酯连接、芳基磷酰胺酯连接、硒代磷酸酯连接、2’-O-氨基丙基变形、2’-O-烷基变形、2’-O-烯丙基变形、2’-O-丁基变形、α-异头寡脱氧核苷酸及1-(4’-硫代-β-D-呋喃核糖)变形。
根据本发明一实施例，核苷酸包含锁核酸(LNA，locked nulceicacid)作为阻断剂。
在本说明书中揭示如探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的一部分、探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端一部分以及捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位的5’-末端一部分的探测和标记寡核苷酸或捕捉和模板化寡核苷酸而使用的术语“一部分(part)”意味着由1-40、1-30、1-20、1-15、1-10或1-5核苷酸组成的核苷酸序列，优选为1核苷酸、2核苷酸、3核苷酸或4核苷酸。
根据本发明一实施例，根据优选一实例，具有5’核酸酶活性的酶为具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或瓣状核酸内切酶，更优选为具有5’核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶或瓣状核酸内切酶。
适合于本发明的具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶为从各种细菌种得到的热稳定性DNA聚合酶，其包含Thermus aquaticus(Taq)、Thermus thermophilus(Tth)、Thermus filiformis、Thermis flavus、Thermococcus literalis、Thermus antranikianii、Thermuscaldophilus、Thermus chliarophilus、Thermus flavus、Thermusigniterrae、Thermus lacteus、Thermus oshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermusspecies Z05、Thermus species sps 17、Thermus thermophilus、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana、Thermosiphoafricanus、Thermococcus litoralis、Thermococcus barossi、Thermococcus gorgonarius、Thermotoga maritima、Thermotoganeapolitana、Thermosiphoafricanus、Pyrococcus woesei、Pyrococcushorikoshii、Pyrococcus abyssi、Pyrodictium occultum、Aquifexpyrophilus以及Aquifex aeolieus。更为优选地，热稳定性DNA聚合酶为Taq聚合酶。
择一性地，本发明可使用变形为虽然具有5’核酸酶活性，但减少聚合酶活性的DNA聚合酶。
所使用的瓣状内切核酸酶(FEN，flap endonuclease)为5’皮瓣-特异性核酸酶(5’flap-specific nuclease)。
适合于本发明的瓣状核酸内切酶包含从各种细菌种得到的瓣状核酸内切酶，其包含Sulfolobus solfataricus、Pyrobaculum aerophilum、Thermococcus litoralis、Archaeaglobus veneficus、Archaeaglobusprofundus、Acidianus brierlyi、Acidianus ambivalens、Desulfurococcusamylolyticus、Desulfurococcus mobilis、Pyrodictium brockii、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus zilligii、Methanopyruskandleri、Methanococcus igneus、Pyrococcus horikoshii、Aeropyrumpernix以及Archaeaglobus veneficus。
在步骤(a)中利用上游引物的情况下，可包括用于探测和标记寡核苷酸切割的条件包含上游引物的延伸反应。
根据本发明一实施例，在步骤(a)中利用上游引物，为了使上述上游引物延伸，利用模板-依赖性聚合酶，上述模板-依赖性聚合酶为与具有5’核酸酶活性的酶相同的酶。
选择性地，在步骤(a)中利用上游引物，为了使上述上游引物延伸，利用模板-依赖性聚合酶，上述模板-依赖性聚合酶为与具有5’核酸酶活性的酶不相同的酶。
【步骤(c)：从探测和标记寡核苷酸放出的片段与捕捉和模板化寡核苷酸的杂交】
从探测和标记寡核苷酸放出的片段与捕捉和模板化寡核苷酸杂交。
捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含与探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，其包含与探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列。
捕捉和模板化寡核苷酸起到用于延伸从探测和标记寡核苷酸放出的片段的模板的作用。起到引物作用的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸杂交，并通过被延伸来形成二聚物。
只要模板化部位具有与探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的序列，那么就可以包含任何序列。并且，只要模板化部位可以起到用于延伸从探测和标记寡核苷酸放出的片段的模板的作用，那么就可以包含任何序列。
如上所述，优选地，在放出具有探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的片段的情况下，捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位应被设计成包含与5’-标记部位互补的核苷酸序列。优选地，在放出具有5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端一部分的片段的情况下，捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位应被设计成包含与5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端一部分互补的核苷酸序列。优选地，在放出具有探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的一部分的片段的情况下，捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位应可被设计成具有与5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列。
另一方面，可通过预想探测和标记寡核苷酸切割位置来设计捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位。例如，在捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位被设计成包含与5’-标记部位互补的核苷酸序列的情况下，具有5’-标记部位的一部分的片段或具有5’-标记部位的片段可与捕捉部位杂交，之后将被延伸。在放出包含5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端一部分的片段的情况下，上述片段可能与被设计成包含与5’-标记部位互补的核苷酸序列的捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，即使在上述片段的3’-末端部位存在错配核苷酸，也可以成功地被延伸。这是因为即使引物的3’-末端包含一部分错配核苷酸(例如，1～3错配核苷酸)，引物也可以根据反应条件而被延伸。
在放出包含5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端一部分的片段的情况下，可以通过将捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位的5’-末端一部分设计成具有与被切割的上述3’-靶向部位的5’-末端一部分互补的核苷酸序列，来解决与错配核苷酸相关的问题(参照图1)。
本发明一实施例中，就与被切割的3’-靶向部位的5’-末端一部分互补的捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位的5’-末端一部分的核苷酸序列而言，可根据探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位上的预想到的切割位置来选择。与被切割的3’-靶向部位的5’-末端一部分互补的捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位的5’-末端一部分的核苷酸序列可具有1-10核苷酸序列、1-5核苷酸序列或1-3核苷酸序列的长度。
捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端可包含不包含于与片段的杂交的追加的核苷酸。并且，只要捕捉和模板化寡核苷酸与上述片段稳定地杂交，那么捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位就可以包含仅与上述片段的一部分(例如，包含片段的3’-末端部位的片段的一部分)互补的核苷酸序列。
如上所述，在本说明书中使用的术语“包含与5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列的捕捉部位”将包括捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位的各种设计以及结构来进行说明。
捕捉和模板化寡核苷酸可被设计成具有发夹结构。
捕捉和模板化寡核苷酸的长度可以多样。例如，捕捉和模板化寡核苷酸具有7-1000核苷酸、7-500核苷酸、7-300核苷酸、7-100核苷酸、7-80核苷酸、7-60核苷酸、7-40核苷酸、15-1000核苷酸、15-500核苷酸、15-300核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸、20-1000核苷酸、20-500核苷酸、20-300核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-60核苷酸、20-40核苷酸、30-1000核苷酸、30-500核苷酸、30-300核苷酸、30-100核苷酸、30-80核苷酸、30-60核苷酸或30-40核苷酸的长度。只要与从探测和标记寡核苷酸放出的片段特异性地杂交，捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位就可以具有任何长度。例如，捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位可以具有5-100核苷酸、5-60核苷酸、5-40核苷酸、5-30核苷酸、5-20核苷酸、10-100核苷酸、10-60核苷酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、10-20核苷酸、15-100核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸或15-20核苷酸的长度。并且，只要捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位在从探测和标记寡核苷酸放出的片段的延伸反应中可起到模板的作用，捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位就可以具有任何长度。例如，捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位可以具有2-900核苷酸、2-400核苷酸、2-300核苷酸、2-100核苷酸、2-80核苷酸、2-60核苷酸、2-40核苷酸、2-20核苷酸、5-900核苷酸、5-400核苷酸、5-300核苷酸、5-100核苷酸、5-80核苷酸、5-60核苷酸、5-40核苷酸、5-30核苷酸、10-900核苷酸、10-400核苷酸、10-300核苷酸、15-900核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸或15-20核苷酸的长度。
捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端可以具有3’-OH末端。优选地，捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端被阻断，用于防止延伸。通过现有方法就可以实现阻断捕捉和模板化寡核苷酸的非-延伸。例如，可以通过在捕捉和模板化寡核苷酸的最后核苷酸的3’-羟基追加如生物素、标记、磷酸基、烷基、非-核苷酸连接肽、硫代磷酸酯或烷烃-二醇残基之类的化学组成部分(moiety)来实施阻断。择一性地，阻断可通过去除最后核苷酸的3’-羟基或利用如双脱氧核苷酸之类的没有3’-羟基的核苷酸来实施。
从探测和标记寡核苷酸放出的片段与捕捉和模板化寡核苷酸杂交，并提供适合于片段的延伸的形态。并且，即使非切割探测和标记寡核苷酸通过其5’-标记部位与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，由于探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位不与捕捉和模板化寡核苷酸杂交，因而防止延伸二聚物的形成。
参照对步骤(a)中的杂交的说明，就可以详细地说明步骤(c)中的杂交。
【步骤(d)：片段的延伸】
利用模板-依赖性核酸聚合酶及步骤(c)的产物来实施延伸反应。与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的片段被延伸，来形成延伸二聚物。相反，与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的非切割探测和标记寡核苷酸不被延伸，也不形成延伸二聚物。
在本说明书中与片段一同使用的术语“延伸链”意味着由片段及片段的延伸序列组成的序列。在本说明书中所使用的术语“延伸二聚物”意味着基于将模板-依赖性核酸聚合酶和捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位利用为模板使与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的片段被延伸的延伸反应而形成的二聚物。
在步骤(d)中使用的模板-依赖性核酸聚合酶包含任何核酸聚合酶，例如，E.coli DNA聚合酶I的“克列诺(Klenow)”片段、热稳定性DNA聚合酶以及噬菌体T7DNA聚合酶。优选地，聚合酶为可以从各种细菌种得到的热稳定性DNA聚合酶，其包含Thermusaquaticus(Taq)、Thermus thermophilus(Tth)、Thermus filiformis、Thermis flavus、Thermococcus literalis、Thermus antranikianii、Thermus caldophilus、Thermus chliarophilus、Thermus flavus、Thermus igniterrae、Thermus lacteus、Thermus oshimai、Thermusruber、Thermus rubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermus species Z05、Thermus species sps 17、Thermusthermophilus、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana、Thermosipho africanus、Thermococcus litoralis、Thermococcusbarossi、Thermococcus gorgonarius、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana、Thermosiphoafricanus、Pyrococcus furiosus(Pfu)、Pyrococcus woesei、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、Pyrodictium occultum、Aquifex pyrophilus以及Aquifex aeolieus。最优选地，模板-依赖性核酸聚合酶为Taq聚合酶。
根据本发明一实施例，在步骤(b)中利用的具有5’核酸酶活性的酶与在步骤(d)中利用的模板-依赖性核酸聚合酶相同。更优选地，在步骤(b)中利用的具有5’核酸酶活性的酶、为了使上游引物延伸而利用的模板-依赖性核酸聚合酶以及在步骤(d)中利用的模板-依赖性核酸聚合酶相同。
【步骤(e)：利用杂交寡核苷酸的解链或杂交分析】
紧接着延伸反应，在存在杂交寡核苷酸的情况下，在规定温度范围内对步骤(d)的产物实施连接分析或杂交分析，从而测定是否发生表示在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间存在杂交物的信号。
在上述靶核酸序列不存在于核酸试样内的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此提供表示在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间存在杂交物的信号。在上述靶核酸序列存在于核酸试样的情况下，形成上述延伸二聚物来防止在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物，由此，不提供信号。
步骤(e)使用上述杂交寡核苷酸来实施。
上述杂交寡核苷酸包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列。由于不形成上述延伸二聚物，在上述捕捉和模板化寡核苷酸为单链的情况下，上述杂交寡核苷酸与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交来形成杂交物。在进行解链分析或杂交分析的期间内，上述杂交物在规定温度范围内得到形成和/或解链，从而提供表示在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间存在杂交物的信号。在形成上述延伸二聚物，使上述捕捉和模板化寡核苷酸为双链的情况下，上述延伸二聚物防止在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交管核苷酸之间形成杂交物，由此，在进行解链或杂交分析的期间内，不提供表示在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间存在杂交物的信号。
上述杂交寡核苷酸的长度可以多样。例如，杂交核苷酸具有5-100核苷酸、5-80核苷酸、5-60核苷酸、5-40核苷酸、5-20核苷酸、5-10核苷酸、10-100核苷酸、10-80核苷酸、10-60核苷酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、10-20核苷酸、15-100核苷酸、5-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸、15-20核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-60核苷酸、20-40核苷酸或20-30核苷酸的长度。
在本发明中，上述捕捉的模板化寡核苷酸/延伸链的延伸二聚物可以为比上述捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸的杂交物更为稳定的二聚物。为此，上述杂交寡核苷酸的Tm值可低于捕捉和模板化寡核苷酸的Tm值。根据本发明的一实例，捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的Tm值比上述捕捉和模板化寡核苷酸/延伸链的延伸二聚物的Tm值至少低10℃、20℃、30℃或40℃。
在本发明的一实施例中，上述杂交寡核苷酸因杂交寡核苷酸的3’-末端被阻断而防止杂交寡核苷酸的延伸。
基于上述延伸二聚物的防止在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物可以在捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸之间根据接触机会(contact opportunity)的发生时点(occurrence timepoint)来以多种方式实现。
例如，在捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸在步骤(e)中第一次接触的情况下(假如，在单独的反应容器中实施步骤(a)～步骤(d)及步骤(e)～步骤(f))，可以以如图2所示的方式实施本发明。在上述探测和标记寡核苷酸片段延伸之前，上述杂交寡核苷酸不与上述捕捉和模板化寡核苷酸接触，但参加(involve)与延伸反应的产物的杂交。在解链分析步骤中，上述延伸二聚物的形成因抑制上述杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸的杂交而防止在上述捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸形成杂交物。
在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸在步骤(d)中相互接触的情况下(例如，在一个反应容器中实施步骤(a)～步骤(f))，可以以如图3所示的方式实施本发明。上述杂交寡核苷酸可在延伸之前与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交，并参与延伸反应。杂交寡核苷酸在片段延伸之前与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的情况下，片段的延伸使杂交寡核苷酸从捕捉和模板化寡核苷酸切割或分离。尤其，杂交寡核苷酸在进行延伸反应期间被切割的情况下，延伸二聚物的形成因基于切割的杂交寡核苷酸的消耗而在解链分析步骤中防止捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸的杂交物的形成。杂交寡核苷酸在步骤(d)中与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的情况下，延伸二聚物的形成可从捕捉和模板化寡核苷酸中放出(分离)杂交寡核苷酸(杂交寡核苷酸的链置换)。在这种情况下，所分离的杂交寡核苷酸可以因抑制捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交而在解链或杂交分析中不形成捕捉和模板化寡核苷酸嗯哼杂交物。
根据本发明的一实施例，基于探测和标记寡核苷酸片段的延伸的杂交寡核苷酸的切割和/或链置换(strand displacement)受模板-依赖性核酸聚合酶的种类或反应条件的影响。
上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸即使在步骤(d)中具有相互接触的机会，几个杂交寡核苷酸也可以在延伸之前不与上述捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交。在这种情况下，上述杂交寡核苷酸可以因抑制捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交而在步骤(e)中无法形成捕捉和模板化寡核苷酸和杂交物。
根据本发明的一实施例，在步骤(d)中调节反应条件(例如，反应温度及杂交寡核苷酸、探测和标记寡核苷酸片段的Tm值)，由此，杂交寡核苷酸在延伸之前不与捕捉和模板化寡核苷酸杂交，且不参与延伸反应。
上述杂交寡核苷酸与捕捉和模板化寡核苷酸第一次接触的步骤不相关，在存在靶核酸序列的情况下，形成延伸二聚物并通过(i)抑制杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸的杂交和/或(ii)基于切割的杂交寡核苷酸的消耗来防止在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物。
在上述靶核酸序列的不存在的情况下，不形成上述延伸二聚物，因此，形成上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物。
根据本发明的一实施例，在杂交寡核苷酸存在的情况下实施步骤(d)，杂交寡核苷酸与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交和/或不杂交。根据本发明的一实例，在存在杂交寡核苷酸的情况下实施上述步骤(d)，(i)与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段在上述杂交寡核苷酸进行杂交之前延伸和/或(ii)在上述片段延伸之前，从上述捕捉和模板化寡核苷酸切割或分离上述杂交寡核苷酸，以此，上述延伸二聚物的形成因基于上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交的抑制和/或基于切割的杂交寡核苷酸的消耗而在上述步骤(e)中防止在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物。
根据本发明的一实施例，可根据用于延伸与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的片段的条件，使上述杂交寡核苷酸与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的情况处于优势或使上述杂交寡核苷酸不与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的情况处于优势。
即使上述杂交寡核苷酸包含与捕捉和模板化寡核苷酸互补的序列，上述延伸二聚物的靶-依赖性形成也防止上述杂交寡核苷酸与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交。即使杂交寡核苷酸在形成延伸二聚物之前与捕捉和模板化寡核苷酸杂交时，杂交寡核苷酸也从上述捕捉和模板化寡核苷酸脱落、放出或去除(例如，通过杂交寡核苷酸的切割或分离)。
上述杂交寡核苷酸包含与捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列。上述杂交寡核苷酸的核苷酸序列可被设计成包含捕捉和模板化寡核苷酸的区域中的与除了探测和标记寡核苷酸片段进行杂交的区域之外的区域互补的序列。在这种情况下，杂交寡核苷酸在与捕捉和模板化寡核苷酸的结合中不与探测和标记寡核苷酸片段(或非切割探测和标记寡核苷酸)竞争。
根据本发明的一实施例，杂交寡核苷酸包含与捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的核苷酸序列。
在本发明的特定实例中，杂交寡核苷酸可被设计成在与捕捉和模板化寡核苷酸的杂交过程中包含与片段(或非切割探测和标记寡核苷酸)竞争的核苷酸序列(参照图6及图7)。在本发明的特定实例中，上述竞争性杂交寡核苷酸(competitive HO)不会被上述片段或其延伸产物切割或在进行延伸反应期间分离。例如，杂交寡核苷酸可被设计成包含可以与捕捉部位杂交的核苷酸序列。
在本说明书中，提及杂交寡核苷酸的序列时所使用的术语“可以与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的核苷酸序列”表示在杂交寡核苷酸与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交时，形成捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位和双链的杂交寡核苷酸的部位。可以与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位进行杂交的杂交寡核苷酸的核苷酸序列可以为杂交寡核苷酸的总序列或一部分序列。上述杂交寡核苷酸中可以与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的核苷酸序列与上述杂交寡核苷酸的总序列或一部分序列(例如，10％、30％、40％、50％、60％，、70％，、80％、90％或95％)相对应。
在杂交寡核苷酸包含可以与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的核苷酸序列的情况下，上述杂交寡核苷酸可具有与探测和标记寡核苷酸片段和/或非切割的探测和标记寡核苷酸的5’-标记的标记部位重叠(overlapping)的序列。在这种情况下，(i)杂交寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸片段，或(ii)杂交寡核苷酸及非切割探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位竞争与捕捉和模板化寡核苷酸的杂交。
在本说明书中所使用的术语“竞争性杂交寡核苷酸”表示在与捕捉和模板化寡核苷酸杂交方面与探测和标记寡核苷酸片段或与非切割的探测和标记寡核苷酸竞争的序列的杂交寡核苷酸。根据本发明的一实例，竞争性杂交寡核苷酸在与捕捉和模板化寡核苷酸杂交方面具有低于探测和标记寡核苷酸片段(具体地，探测和标记寡核苷酸片段的延伸链)的竞争力，且具有高于探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的竞争力。
存在靶核酸序列且竞争性杂交寡核苷酸存在于步骤(c)和/或步骤(d)的情况下，在与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的过程中，竞争性杂交寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸片段之间的竞争会成问题。在这种情况下，优选地，与竞争性杂交寡核苷酸相比，探测和标记寡核苷酸片段与捕捉和模板化寡核苷酸杂交并延伸，从而产生延伸链。由于与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的探测和标记寡核苷酸片段会延伸，因此，与竞争性杂交寡核苷酸相比，探测和标记寡核苷酸片段更有利于与捕捉和模板化寡核苷酸杂交。
在本发明的特定实例中，在探测和标记寡核苷酸片段和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交比上述杂交寡核苷酸捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交更为有利的条件下实施步骤(c)。这种有利的条件可通过多种方法来实现。例如，为了有利的条件，可阻断上述杂交寡核苷酸的3’-末端。具有被阻断的3’-末端的杂交寡核苷酸不会延伸，且增加由与上述探测和标记寡核苷酸片段的竞争引起的从捕捉和模板化寡核苷酸的分离概率。与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的探测和标记寡核苷酸片段可以通过延伸来形成延伸链，且可以更加稳定地得到维持。因此，经过上述步骤(c)及步骤(d)的反应产物与捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物相比，延伸二聚物更具有优势。总而言之，捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的数(或量)在存在存在靶核酸序列的情况下，因延伸二聚物而与不存在靶核酸序列的情况相比，会相对较少。
在不存在上述靶核酸序列的情况下，不会引起上述探测和标记寡核苷酸的切割，上述探测和标记寡核苷酸以非切割的探测和标记寡核苷酸状态残留。非切割的上述探测和标记寡核苷酸及竞争性杂交寡核苷酸均存在的情况下，非切割的探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位和竞争性杂交寡核苷酸具有相互重叠的序列，因此，竞争对捕捉和模板化寡核苷酸的杂交。在不存在上述靶核酸序列的情况下，本发明的原理需要捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交，因此，与非切割探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位相比，竞争性杂交寡核苷酸更有利于与捕捉和模板化寡核苷酸的杂交。
在上述探测和标记寡核苷酸片段的Tm值高于竞争性杂交寡核苷酸的Tm值的情况下，探测和标记寡核苷酸片段与竞争性杂交寡核苷酸相比，更有利于与捕捉和模板化寡核苷酸的杂交。考虑到上述非切割的探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位和竞争性杂交寡核苷酸之间的竞争，探测和标记寡核苷酸片段的高的Tm值并不始终优选。即使在探测和标记寡核苷酸片段的Tm值低于竞争性杂交寡核苷酸的Tm值时，也可因与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的探测和标记寡核苷酸片段的延伸而与竞争性杂交寡核苷酸相比，更有利于与捕捉和模板化寡核苷酸的杂交。在这种情况下，竞争性杂交寡核苷酸与非切割的探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位相比，可以更有利于与捕捉和模板化寡核苷酸的杂交。
考虑上述记载的诸多因素或问题，需要设计适当的竞争性杂交寡核苷酸。根据本发明的一实例，上述捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物及上述探测和标记寡核苷酸片段/捕捉和模板化寡核苷酸杂交物的Tm值之间的差异为±40℃、±30℃、±20℃、±15℃、±10℃、±5℃或±3℃以内。
根据本发明的一实施例，捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物及非切割的探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位/捕捉和模板化寡核苷酸杂交物的Tm值之间的差异为±40℃、±30℃、±20℃、±15℃、±10℃、±5℃或±3℃以内。
根据本发明的一实施例，在上述杂交寡核苷酸及非切割的上述探测和标记寡核苷酸与捕捉和模板化寡核苷酸竞争性杂交的情况下，上述捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸的Tm值可高于上述捕捉和模板化寡核苷酸/非切割的探测和标记寡核苷酸的Tm值(例如，至少2℃、4℃、6℃、8℃、10℃、15℃或20℃)。
由与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的探测和标记寡核苷酸序列的部位决定非切割的上述探测和标记寡核苷酸/捕捉和模板化寡核苷酸杂交物的Tm值。例如，在非切割的上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的情况下，5’-标记部位的Tm值为决定非切割的探测和标记寡核苷酸/捕捉和模板化寡核苷酸杂交物的Tm值的因素。
在本说明书中所使用的术语“非切割的探测和标记寡核苷酸的Tm值”只要不以其他形式表示，就意味着由与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的非切割的探测和标记寡核苷酸序列的部位决定的Tm值。
根据本发明的一实施例，片段的延伸链具有大于杂交寡核苷酸的Tm值，杂交寡核苷酸具有大于探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的Tm值。
根据本发明的一实施例，当考虑与捕捉和模板化寡核苷酸的杂交时，探测和标记寡核苷酸片段的延伸链的Tm值大于上述杂交寡核苷酸的Tm值，且杂交寡核苷酸的Tm值大于上述非切割的探测和标记寡核苷酸的Tm值。
根据本发明的一实施例，上述杂交寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸片段被设计成通过除重叠的部位之外的部位来不与捕捉和模板化寡核苷酸杂交。在这种情况下，可防止上述杂交寡核苷酸和探测和标记寡核苷酸片段一同与捕捉和模板化寡核苷酸杂交。
通过杂交的核苷酸序列的长度及G/C含量来决定Tm值。根据本发明的一实例，Tm值可通过Wallace rule(R.B.Wallace等，NucleicAcids Research，6：3543-3547(1979))及nearest-neighbor方法(SantaLucia J.Jr.等，Biochemistry，35：35553562(1996))；SugimotoN.等，Nucleic Acids Res.，24：4501-4505(1996))之类的现有方法计算。
根据本发明的一实施例，Tm值表示在实际使用的反应条件下的实际Tm值。
在包括解链分析或杂交的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交中，用于表示在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间存在杂交物的信号可通过以下多种标记系统来提供：(i)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记、(ii)与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记、(iii)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记及与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入标记。
根据本发明的一实施例，在本发明中，涉及上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的形成的信号在涉及上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的不形成的信号可以在不同的限度内使用多种标记及标记位置。原理上，本发明需要提供适合于解链或杂交分析的信号。与此相关地，上述表达包括如下含义：在本发明中，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸杂交来形成杂交物的情况下所提供的信号和在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸相互分离的情况下所提供的信号可以在不同的限度内使用多种种类的标记及标记位置。在本说明书中所使用的表达方式“形成捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的信号和不形成捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的信号不同。”包含如下含义：“上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸杂交来形成杂交物的情况下所提供的信号和上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸相互分离的情况下所提供的信号不同。”下述的用于信号的标记应具有如下特征：上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸杂交来形成杂交物的情况下所提供的信号和上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸相互分离的情况下所提供的信号不同。
根据本发明的一实施例，通过如信号的生成及信号的消灭等现象来提供上述信号的不同。
根据本发明的一实施例，通过如强度的变化(信号增加及信号减少)等来提供上述信号的不同。
例如，本发明的有用的标记包括单一标记、相互作用性双重标记及包括嵌入标记的本发明所属技术领域公知的多个标记。
本发明中的有用的标记包括相互作用性双重标记(参照图2～图4及图6～图7)。
作为上述相互作用性标记系统的代表性的例，荧光共振能量转移(FRET，fluorescence resonance energy transfer)标记系统包含荧光报道分子(供体分子)及猝灭分子(受体分子)。在荧光共振能量转移中，能量供体可为荧光性，能量受体可以为荧光性或非-荧光性。在相互作用性标记系统的再一形态中，能量供体为非-荧光性，例如，为发色团(chromophore)，能量受体可以为荧光性。相互作用性标记系统的另一形态中，能量受体为发光性(luminescent)，例如，生物发光性、化学发光性或电化学反光性，受体可以为荧光性。供体分子及受体分子可以在本发明中分别以报道分子及猝灭分子来进行说明。相互作用性双重标记包含提供可基于接触-介质猝灭(contact-mediated quenching)来检测信号的标记对(Salvatore et al.,Nucleic Acids Research,2002(30)no.21 e122and Johansson et al.,J.AM.CHEM.SOC 2002(124)pp 6950-6956)。在本发明中，相互作用性标记系统包含包括基于至少2个分子(例如，染料)之间的相互作用的信号变化的所有或某种案例。
根据本发明的一实施例，表示上述捕捉和模板化寡核苷酸-杂交寡核苷酸杂交物的存在或不存在的信号通过相互作用性标记系统，尤其，通过荧光共振能量转移标记系统(即，相互作用性双重系统)来生成。
根据本发明的一实施例，上述杂交寡核苷酸或上述捕捉和模板化寡核苷酸具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记，上述相互作用性双重标记位于在形成有上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号和在不形成上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号互不相同的位置。
根据本发明的一实施例，上述杂交寡核苷酸具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记。
上述杂交寡核苷酸为单链状态的情况下，杂交寡核苷酸上的报道分子及猝灭分子在结构上相互接近，使得猝灭分子猝灭报道分子的信号。在不存在靶核酸序列并形成有捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的情况下，杂交寡核苷酸上的报道分子及猝灭分子在结构上相互隔开，使得猝灭分子对报道分子的信号实施未淬灭，由此，在进行解链或杂交分析的期间内引起信号的变化，从而提供表示捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的存在的信号(参照图2及图3)。在存在靶核酸序列，且不形成捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的情况下，在进行解链或杂交分析期间内不发生信号变化，且不提供表示捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物存在的信号(参照图2及图3)。
在本说明书中所使用的表达方式“报道分子及猝灭分子在结构上接近”意味着报道分子及猝灭分子通过杂交寡核苷酸或捕捉和模板化寡核苷酸的形态结构，例如，无规线圈(coil)及发夹结构来以三维方式相邻。
在本说明书中所使用的表达方式“报道分子及猝灭分子在结构上隔开”意味着报道分子及猝灭分子通过基于形成双链的捕捉和模板化寡核苷酸或杂交寡核苷酸的形态结构的变化来以三维方式隔开。
根据本发明的一实施例，捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记，杂交寡核苷酸包含与捕捉和模板化寡核苷酸的标记-连接区域互补的序列。在捕捉和模板化寡核苷酸为单链形态的情况下，捕捉和模板化寡核苷酸上的报道分子及猝灭分子在结构上相互接近，使得猝灭分子猝灭报道分子的信号。在不存在靶核酸序列，且不形成捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的情况下，捕捉和模板化寡核苷酸上的报道分子及猝灭分子结构上相互相互隔开，使得猝灭分子对报道分子的信号实施未淬灭，由此，在进行解链或杂交分析的期间内引起信号的变化，从而提供表示捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的存在的信号。在存在靶核酸序列，且不形成捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的情况下，在进行解链或杂交分析期间内不发生信号变化，且不提供表示捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物存在的信号。
在本发明中使用具有相互作用性双重标记的捕捉和模板化寡核苷酸的情况下，捕捉和模板化寡核苷酸/延伸链的延伸二聚物可在解链分析中提供信号。由于上述延伸二聚物的Tm值与捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的Tm值不同，因此，捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的信号可以与延伸二聚物的信号以不同的方式检测。可知，利用捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的信号的本发明与利用延伸二聚物的信号的发明明确不同。
根据本发明的一实施例，依赖于捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的解链或捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交，在报道分子的信号得到猝灭或未猝灭的限度内，报道分子及猝灭分子的可位于杂交寡核苷酸或捕捉和模板化寡核苷酸的任何位置。
根据本发明的一实施例，上述杂交寡核苷酸的报道分子及猝灭分子中的一个位于其5’-末端或从其5’-末端隔开1-5核苷酸序列的位置，剩余一个根据杂交寡核苷酸的形态(conformation)来位于对报道分子信号进行猝灭或未猝灭的位置。根据本发明的一实施例，上述杂交寡核苷酸的报道分子及猝灭分子中的一个位于其3’-末端或从其3’-末端隔开1-5核苷酸序列的位置，剩余一个根据杂交寡核苷酸的形态来位于对报道分子的信号进行猝灭或未猝灭的位置。在本发明的特定实例中，报道分子及猝灭分子分别位于杂交寡核苷酸的两末端。
根据本发明的一实施例，上述捕捉和模板化寡核苷酸的薄的分子及猝灭分子中的一个位于其5’-末端或从5’-末端隔开1-核苷酸序列的位置，剩余一个根据捕捉和模板化寡核苷酸的形态来位于对报道分子的信号进行猝灭及未猝灭的位置。根据本发明的一实例，捕捉和模板化寡核苷酸的报道分子及猝灭分子中的一个位于其3’-末端或从其3’-末端1-5隔开核苷酸序列的位置，剩余一个根据捕捉和模板化寡核苷酸的形态来位于对报道分子的信号进行猝灭及未猝灭的位置。
对本发明有用的报道分子及猝灭分子可包含本说明书所述的上述荧光标记。
适合的一对报道分子-猝灭分子公开在许多文献中：Pesce等，editors，Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker，New York，1971)；White等，Fluorescence Analysis:A Practical Approach(Marcel Dekker，New York，1970)；Berlman，Handbook ofFluorescence Spectra ofAromatic Molecules，2nd Edition(AcademicPress，New York，1971)；Griffiths，Color AND Constitution ofOrganic Molecules(Academic Press，New York，1976)；Bishop，editor，Indicators(Pergamon Press，Oxford，1972)；Haugland，Handbookof Fluorescent Probes and Research Chemicals(Molecular Probes，Eugene，1992)；Pringsheim，Fluorescence and Phosphorescence(Interscience Publishers，New York，1949)；Haugland，R.P.，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，6th Edition(Molecular Probes，Eugene，Oreg.，1996)；美国专利第3996345号及第4351760号。
在本发明中，值得关注的是，可以利用可对广范围波长或特定波长的荧光进行猝灭的非-荧光黑猝灭分子(或黑猝灭分子)。作为非-荧光黑猝灭分子的例，有BHQ及DABCYL。在由报道及猝灭构成的信号系统中，报道分子包含荧光共振能量转移的供体，猝灭分子包含荧光共振能量转移的另一伙伴(受体)。例如，使用荧光素染料(fluorescein dye)作为报道分子，使用罗丹明染料(rhodamine dye)作为猝灭分子。
根据本发明的一实施例，在猝灭分子为荧光的情况下，信号检测通过对猝灭分子的信号变化或猝灭分子及报道分子两者的信号变化进行测定来实施。
本发明可使用链间-相互作用性双重标记系统(参照图4)。
根据本发明的一实例，上述杂交寡核苷酸具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记中的一个，上述捕捉和模板化寡核苷酸具有上述相互作用性双重标记中的剩余一个，上述相互作用性双重标记位于在形成有上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号和在不形成上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号互不相同的位置。
链间-相互作用性双重标记利用与捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记(例如，供体分子)及与杂交寡核苷酸相连接的标记(受体分子)之间的相互作用。
上述杂交寡核苷酸具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记中的一个，捕捉和模板化寡核苷酸具有上述相互作用性双重标记中的剩余一个。上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交改变链间-相互作用性双重标记的信号，从而提供表示捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的存在的信号(参照图4)。在本发明的特定实例中，标记与捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位相连接。
在本发明的特定实例中，报道分子及猝灭分子分别与杂交寡核苷酸的3’-末端及捕捉和模板化寡核苷酸的5’-末端相连接。
在本发明的特定实例中，本发明的方法还使用一个包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸来实施，上述两个杂交寡核苷酸与上述捕捉和模板化寡核苷酸相接近来进行杂交，上述两个杂交寡核苷酸中的一个具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记中的一个，两个杂交寡核苷酸中的剩余一个具有相互作用性双重标记中的剩余一个，上述相互作用性双重标记位于在形成有上述捕捉和模板化寡核苷酸和两个杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号和在不形成上述捕捉和模板化寡核苷酸和两个杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号互不相同的位置。
在上述两个杂交寡核苷酸不与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的情况下，上述两个杂交寡核苷酸相互分离而存在，且报道分子从猝灭分子分离，由此，不会猝灭报道分子的信号。在两个杂交寡核苷酸与捕捉和模板化寡核苷酸相互接近来杂交的情况下，杂交使得猝灭分子可以猝灭报道分子的信号，由此，在进行解链或杂交分析期间内，引起信号变化，从而提供用于表示捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的存在的信号。存在靶核酸序列且不形成捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的情况下，信号变化不会在解链或杂交分析期间内发生，且不会发生表示捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的存在的信号。
在使用单一标记的情况下，可以与上述杂交寡核苷酸或捕捉和模板化寡核苷酸两者中的一个相连接(参照图5)。
根据本发明的一实例，上述杂交寡核苷酸或上述捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记，上述单一标记位于在形成有上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述单一标记的信号和在不形成上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述单一标记的信号互不相同的位置。
上述单一标记可以根据是否存在于双链或单链上来提供不同的信号。单一标记包括荧光标记、发光标记、化学发光标记、电化学标记及金属标记。优选地，单一标记包括荧光标记。
在本发明的特定实例中，根据具有单一标记的核酸序列存在于单链还是双链，上述单一标记包括可生成强度不同的信号的荧光标记。
图5利用单一标记来说明本发明。在图5中，上述杂交寡核苷酸具有单一标记。杂交寡核苷酸在进行解链分析的期间内与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的情况下，杂交寡核苷酸中的单一标记的信号发生变化。对比性地，在杂交寡核苷酸不与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的情况下，杂交寡核苷酸中的单一标记的信号不会发生变化。
在本发明的一实施例中，在上述捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记的情况下，杂交寡核苷酸包含与捕捉和模板化寡核苷酸的标记-连接区域互补的序列。在上述杂交寡核苷酸进行解链分析的期间内与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的情况下，捕捉和模板化寡核苷酸的单一标记的信号发生变化。对比性地，在上述杂交寡核苷不与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的情况下，上述捕捉和模板化寡核苷酸的单一标记的信号不会发生变化。在这种情况下，上述捕捉和模板化寡核苷酸/延伸链的延伸二聚物可在解链分析中提供信号。由于上述延伸二聚物的Tm值与捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的Tm值不同，上述捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的信号与延伸二聚物的信号以区别的方式检测。可知，利用捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的信号的本发明与利用延伸二聚物的信号的发明明确不同。
在本发明的实例中，上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位具有单一标记，上述杂交寡核苷酸包含与捕捉和模板化寡核苷酸的标记-连接区域互补的序列。
荧光标记的种类及标记的位置公开于美国专利第7537886号及第7348141号中。
在本发明中有用的报道分子及猝灭分子可包含在本发明所属技术领域中公知的任何分子。具体例如下：Cy2TM(506)、YO-PROTM-1(509)、YOYOTM-1(509)、Calcein(517)、FITC(518)、FluorXTM(519)、AlexaTM(520)、Rhodamine 110(520)、Oregon GreenTM 500(522)、Oregon GreenTM 488(524)、RiboGreenTM(525)、RhodamineGreenTM(527)、Rhodamine 123(529)、Magnesium GreenTM(531)、Calcium GreenTM(533)、TO-PROTM-1(533)、TOTO1(533)、JOE(548)、BODIPY530/550(550)、Dil(565)、BODIPY TMR(568)、BODIPY558/568(568)、BODIPY564/570(570)、Cy3TM(570)、AlexaTM546(570)、TRITC(572)、Magnesium OrangeTM(575)、PhycoerythrinR&B(575)、Rhodamine Phalloidin(575)、Calcium OrangeTM(576)、Pyronin Y(580)、Rhodamine B(580)、TAMRA(582)、RhodamineRedTM(590)、Cy3.5TM(596)、ROX(608)、Calcium CrimsonTM(615)、AlexaTM 594(615)、Texas Red(615)、Nile Red(628)、YO-PROTM-3(631)、YOYOTM-3(631)、R-phycocyanin(642)、C-Phycocyanin(648)、TO-PROTM-3(660)、TOTO3(660)、DiD DilC(5)(665)、Cy5TM(670)、Thiadicarbocyanine(671)、Cy5.5(694)、HEX(556)、TET(536)、BiosearchBlue(447)、CAL Fluor Gold 540(544)、CAL Fluor Orange 560(559)、CAL Fluor Red 590(591)、CAL Fluor Red 610(610)、CAL Fluor Red635(637)、FAM(520)、Fluorescein(520)、Fluorescein-C3(520)、Pulsar650(566)、Quasar 570(667)、Quasar 670(705)及Quasar 705(610)。括号内的数字为以纳米为单位表示的最大的发光波长。
例如，上述荧光标记包括JOE、FAM、TAMRA、ROX及基于荧光素的标记。
标记可通过现有的方法来与杂交寡核苷酸或捕捉和模板化寡核苷酸两者中的一个相连接。例如，标记可通过包含碳元素的隔片(例如，3-碳隔片、6-碳隔片及12-碳隔片)来与杂交寡核苷酸或捕捉和模板化寡核苷酸相连接。
本发明可在提供表示上述杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的存在的信号中使用嵌入标记。在本发明中有用的嵌入标记的例包含SYBRTM Green I、PO-PROTM-1、BO-PROTM-1、SYTOTM43、SYTOTM44、SYTOTM45、SYTOXTMBlue、POPOTM-1、POPOTM-3、BOBOTM-1、BOBOTM-3、LO-PROTM-1、JO-PROTM-1、YO-PROTM1、TO-PROTM1、SYTOTM11、SYTOTM13、SYTOTM15、SYTOTM16、SYTOTM20、SYTOTM23、TOTOTM-3、YOYOTM3、GelStarTM及噻唑橙(thiazole orange)。嵌入染料以特异性的方式插入于双链核酸分子内来生成信号。
在本发明中使用上述嵌入染料颜料的情况下，上述捕捉和模板化寡核苷酸/延伸链的延伸二聚物可在解链或杂交分析中提供信号。由于上述延伸二聚物的Tm值与捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的Tm值不同，因此，上述捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的信号可以与延伸二聚物的信号以区别的方式检测。可知，利用捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的本发明与利用从延伸二聚物的信号的发明明确不同。
在本发明中所使用的杂交寡核苷酸只要在解链或杂交分析期间内通过杂交来产生信号的限度内，可包含任何探针，例如，包含MolecularbeaconTM(US 5,925,517)、HybeaconsTM(D.J.French,et al.,Molecular and Cellular Probes(2001)13,363–374and US 7,348,141),Dual-labeled,self-quenched probe(US 5,876,930),LUXTM(I.A.Nazarenko,et al.Nucleic Acids Res 2002,30:2089-2095.and US pat no.7,537,886,Hybridization probe(Bernard PS,et al.,Clin Chem 2000,46,147-148and Deepti Parashar et al.,Indian J Med Res 124,reviewarticle October 2006 385-398)。
可通过本发明所属技术领域公知的方法来执行步骤(e)中的解链或杂交分析。
在本说明书中所使用的术语“解链分析”意味着通过二聚物的解链来获得表示捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的存在的信号的方法，包括在两种不同温度下测定信号的方式、解链曲线分析、解链模式分析及解链峰分析。
在本说明书中所使用的术语“杂交分析”(或“退火分析”)意味着获得在形成二聚物的期间表示捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物存在的靶信号的方法，包括在两种不同温度下测定信号的方法、杂交曲线分析、杂交模式分析及杂交峰分析。
一般情况下，通过解链分析来生成靶信号的情况下，靶信号也可通过杂交分析来获得，在相反的情况下也相同。只要本说明书中未以其他方式提及，术语“解链分析”就意味着包括杂交分析的含义。
解链曲线或杂交曲线可如现有技术，例如，美国专利第6174670号及第5789167号、Drobyshev等、Gene 188:45(1997)；Kochinskyand Mirzabekov Human Mutation 19:343(2002)；Livehits等，J.Biomol.Structure Dynam.11:783(1994)；以及Howell等，NatureBiotechnology 17:87(1999)中说明的方法来得到。例如，解链曲线或杂交曲线可由对于杂交严格度(stringency)的参数的输出信号(output signal)变化的图表绘制(graphic plot)或显示(display)构成。输出信号可以直接对杂交参数进行绘图。典型地，例如，解链曲线或杂交曲线在Y-轴具有表示二聚物结构的程度(即，杂交程度)的荧光，在X-轴具有绘图(plotting)有杂交参数的输出信号。
【步骤(f)：检测用于表示在捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸存在杂交物的信号】
解链或杂交分析中，检测用于表示在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间存在杂交物的信号。捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在表示靶核酸序列的不存在，捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的的不存在表示靶核酸序列的存在。
本发明的特定实例中，上述解链分析为了定量分析而实施至少两次。在解链分析中获得的解链峰的面积或高度受捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的影响，并提供对靶核酸序列的初始量的信息。可测定达到预定阈值(threshold)以上的解链峰面积和/或高度的解链分析的循环数，由此决定靶核酸序列的量。
例如，本发明可通过以下步骤来执行：步骤(i)，反复循环之间反复实施包括变性过程的步骤(a)～步骤(d)；步骤(ii)，对捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物实施解链分析；以及步骤(iii)，反复至少两次步骤(i)及步骤(ii)。可从至少两点的指定反复间隔(predetermined repetition interval)中获得数据。接着，解链分析结果(例如，解链峰面积或高度)对解链分析的各循环数(或累计循环数)进行绘制并比较，由此，对靶核酸序列的量实施定量化。可以选择性地调节步骤(a)～步骤(d)的步骤的反复数。
择一性地，解链分析结果(例如，解链分析面积或高度)对解链分析的各循环数(或累计循环数)进行绘制并比较，由此，对靶核酸序列的量实施定量化。
根据本发明的一实施例，存在靶序列的情况下的信号与不存在靶序列的情况下的信号不同。在通过解链分析或杂交分析来检测靶序列的情况下，这种信号的不同包括解链峰的高度也不同。在本发明的一实例中，这种信号的不同为至少10％、至少30％、至少50％、至少70％或至少90％。
根据本发明的一实施例，上述方法使用没有靶核酸序列或包含指定含量(predetermined amount)的靶核酸序列的对照组来实施。本发明与对照组一同对关注的核酸试样实施，并通过比较结果，可以对核酸试样内的靶核酸序列的存在或量进行更加准确的检测。
可在液相或固相中的一个中实施本发明。
【固相中的靶检测】
根据本发明的一实施例，本发明在固相中实施，上述捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸中的一个固定于固相底物上或在上述步骤(f)中检测信号之前固定于固相底物上，从上述固相底物上检测上述信号。
上述捕捉和模板化寡核苷酸或杂交寡核苷酸的固定化可通过两种方式来实施。
第一种种方式，使上述捕捉和模板化寡核苷酸或杂交寡核苷酸中的一个预先固定于固相底物上来参与步骤(c)～步骤(f)。第二种方式，在将上述捕捉和模板化寡核苷酸或杂交寡核苷酸中的一个以非-固定的形态参与到步骤(c)、步骤(d)或步骤(e)之后，固定于固相底物上。
根据本发明的一实施例，在包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验中，上述捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸中的一个在步骤(d)及步骤(e)之间固定于固相底物上。
对于上述固相反应的标记系统可以与上述标记系统相同。并且，对于固相反应的单一标记以比上述更为多样的方式使用。在固相反应中，上述单一标记无需具有根据具有单一标记的核酸序列存在于单链还是双链，来生成强度不同的信号的能力。
单一标记包括化学标记(例如，生物素)、酶性标记(例如，碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶及β-葡萄糖苷酶)、放射性同位素标记(例如，I125及C14)、荧光标记、化学发光标记及金属标记(例如，金)，但并不局限于此。
为了实现固相反应，上述捕捉和模板化寡核苷酸或杂交寡核苷酸的固定化通过其5’-末端或3’-末端(尤其，3’-末端)来直接或间接(尤其，直接)固定于固相底物的表面。并且，捕捉和模板化寡核苷酸或杂交寡核苷酸可以以共价键或非共价键方式固定于固相底物的表面上。在实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸或杂交寡核苷酸间接固定于固相底物的表面的情况下，利用适当的连接肽。本发明中有用的连接肽可包含利用于固相底物的表面上的探针固定化的任何连接肽。例如，可使用具有胺基的烷基或芳基化合物或具有硫醇基的烷基或芳基化合物作为连接肽利用于捕捉和模板化寡核苷酸的固定化。并且，可使用聚胸腺嘧啶尾(poly T tail)或聚腺苷酸尾(poly A tail)为连接肽，来减少作为酶作用(例如，酶切割反应)的抑制因子的空间性妨碍(space hindrance)，从而增加杂交效率。作为连接肽，聚胸腺嘧啶尾或聚腺苷酸尾不被视为探针的序列。
根据本发明的一实例，上述捕捉和模板化寡核苷酸或杂交寡核苷酸可通过结合伙伴(例如，生物素/链霉亲和素)之间的相互作用来固定于固相底物上。例如，具有结合伙伴(生物素及链霉亲和素)中的一个的捕捉和模板化寡核苷酸或杂交寡核苷酸可以以剩余结合伙伴来固定于表面表型的固相底物上。
根据本发明的一实例，上述捕捉和模板化寡核苷酸或杂交寡核苷酸可通过用于实现固定化的核苷酸序列来固定于固相底物上。例如，利用用于实现固定化的核苷酸序列来使表面发生变形的固相底物可以用来固定杂交寡核苷酸，上述杂交寡核苷酸具有与用于捕捉和模板化寡核苷酸或固定化的核苷酸序列互补的追加序列。
根据本发明的一实例，在本发明中使用的固相底物为微阵列。在本发明中提供反应环境的微阵列可以使用本发明所属的技术领域中公知的任何微阵列。本发明的所有过程，即，与靶核酸序列的杂交、切割、延伸、解链以及荧光的检测在微阵列实施。在微阵列实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸或杂交寡核苷酸利用为杂交阵列因素(hybridizable array element)。用于制备微阵列的固相底物包含金属(例如，金、金与铜的合金、铝)、金属氧化物、玻璃、陶瓷、石英、硅、半导体、Si/SiO2晶圆、锗、砷化镓、碳、碳纳米管、聚合物(例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯以及聚丙烯酰胺)、琼脂糖凝胶、琼脂糖及胶体，但并不局限于此。固相底物可以为试纸(dipstick)、板、粒子(例如，珠子)、亲和柱及膜形态。本发明的多个实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸或杂交寡核苷酸可固定于固相底物的一个寻址(addressable)部位或多个寻址部位，固相底物可包括2～1000000个寻址部位。可借助如光刻法、喷墨打印法、机械点样法及与其类似的方法等现有的制备技术来构建(fabricate)为了生产阵列或用于特定应用的阵列而实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸或杂交寡核苷酸。
当在固相中实施本发明时，实现固定化的捕捉和模板化寡核苷酸的标记以物理方式相互隔开，因此即使利用一种标记也能够同时检测多个靶核酸序列。因此，在固相中，根据本发明能够检测的靶核酸序列的数量不受限制。
可使用共聚焦检测装置，以不受悬浮于液相内的标记的影响的方式仅检测出上述固相底物上的信号。
根据本发明的一实施例，上述方法在不使用上述上游寡核苷酸的情况下实施，在步骤(b)中的上述探测和标记寡核苷酸的切割是在没有上游寡核苷酸或其延伸链的帮助下发生的。以下，更为详细地说明使用上游寡核苷酸-独立性5’-核酸酶活性的实例。
【基于上游寡核苷酸-独立性5’-核酸酶活性的基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试样的靶检测】
根据本发明的另一实施方式，提供用于通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与与探测和标记寡核苷酸进行杂交，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；
步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸的条件下，使上述步骤(a)的产物与具有5’核酸酶活性的酶相接触，与上述靶核酸序列杂交的上述探测和标记寡核苷酸被具有5’核酸酶活性的酶切割，由此上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交，上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用上述步骤(c)的产物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段延伸并生成与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸链(extended strand)，并形成延伸二聚物(extended duplex)，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物；
步骤(e)，在存在包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸的情况下，在规定温度范围内，对上述步骤(d)的产物实施解链分析或杂交分析，上述靶核酸序列不存在于上述核酸试样内的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此提供表示上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在的信号，在上述靶核酸序列存在于上述核酸试样内的情况下，形成上述延伸二聚物来防止在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物，由此，不提供上述信号，上述信号通过(i)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记、(ii)与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记、(iii)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记及与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入标记来提供；以及
步骤(f)，检测用于表示在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间存在杂交物的信号，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在表示上述靶核酸序列的不存在，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的不存在表示上述靶核酸序列的存在。
基于上述上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶的本发明的方法除了未使用上游寡核苷酸之外，与使用上游寡核苷酸的上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式相同，因此，为了避免导致本说明书的复杂性的过多的反复，省略它们之间的的相同内容。
有趣的是，基于上述上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的本发明的方法也通过不使用寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来提供靶信号。
本发明的方法可使用具有上述上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的现有的酶。在具有5’核酸酶活性的模板-依赖性聚合酶中，存在具有上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的例如Taq DNA聚合酶等多种酶。
当考虑到上述靶核酸序列的扩增及探测和标记寡核苷酸的切割效率时，优选地，本发明的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验使用上游寡核苷酸来实施。
【用于检测靶的试剂盒】
根据本发明的另一实施方式，提供通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的试剂盒，包含：
(a)，上游寡核苷酸，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；
(b)，探测和标记寡核苷酸，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交，上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游，上述上游寡核苷酸或其延伸链通过具有上述5’核酸酶活性的酶来诱导上述探测和标记寡核苷酸的切割，这种上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
(c)，捕捉和模板化寡核苷酸，上述捕捉和模板化寡核苷酸向3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的片段通过延伸来生成与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸链，并形成延伸二聚物，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物；以及
(d)，包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸，
在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此提供表示上述杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的存在的信号，在上述核酸试样内存在上述靶核酸序列的情况下，形成上述延伸二聚物来防止在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物，由此，不提供信号，上述试剂盒还包含(i)与杂交寡核苷酸相连接的标记、(ii)与捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记、(iii)与杂交寡核苷酸相连接的标记及与捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入(intercalating)标记。
由于本发明的试剂盒以实施上述本发明的检测方法的方式构成，因此，为了避免导致本说明书的复杂性的过多的反复，省略它们之间的的相同内容。
在本发明的一实例中，试剂盒还包含具有5’核酸酶活性的酶。在本发明的一实例中，试剂盒还包含模板-依赖性核酸聚合酶。
本发明试剂盒的另一实例可参照上述本发明的方法来说明。
本说明书中上述本发明的所有试剂盒可选择性包含如缓冲液、DNA聚合酶辅因子及脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸之类的靶扩增聚合酶链式反应(PCR)(例如，聚合酶链式反应)所需要的试剂。选择性地，本发明的试剂盒还可包含多种多核苷酸分子、逆转录酶、多种缓冲液及试剂及用于抑制DNA聚合酶活性的抗体。并且，试剂盒可包含在实施阳性对照组及阴性对照组反应时所必的试剂。在特定反应中所使用的试剂的最佳量可由本发明所属技术领域的普通技术人员容易地决定。典型地，本发明的试剂盒制成包含上述结构成分的额外的包装或隔间(compartment)。
【II.基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的靶检测方法的第二实施方式】
根据本发明的另一实施方式，提供用于通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来在固相中检测核酸试样内的靶核酸序列的方法包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸进行杂交，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交，上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游；
步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸的条件下，使上述步骤(a)的产物与具有5’核酸酶活性的酶相接触，上述上游寡核苷酸或其延伸链基于具有上述5’核酸酶活性的酶来诱导上述探测和标记寡核苷酸的切割，由此，上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交，上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用上述步骤(c)的产物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段延伸并生成与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸链，并形成延伸二聚物，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物；
步骤(e)，在适合进行上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交的条件下，使包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸与上述步骤(d)的产物杂交，上述捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸中的一个被标记为单一标记，未被标记的剩余一个固定于固相底物上或在上述步骤(f)中检测信号之前固定于固相底物上，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此在固相底物上提供上述单一标记中的信号，在上述核酸试样内存在上述靶核酸序列的情况下，形成上述延伸二聚物来防止在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物，由此不在固相底物上提供上述单一标记的信号；以及
步骤(f)，检测上述固相底物上的上述信号，在上述固相底物上检测上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在表示上述靶核酸序列的不存在，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的不存在表示上述靶核酸序列的存在。
本发明的第二实施方式以本法发明的第一实施例方式的接近法探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交为基础。本发明的第二实施方式的特征在于，上述捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸中的一个标记为单一标记，未被标记的另一个固定于固相底物上或在步骤(f)中检测信号之前固定于固相底物上，并可在指定的(pre-determined)温度下检测信号。
本发明的第二实施方式可以被视为用于利用固相底物及单一标记来有效地实现靶检测的，探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交接近法的变形的形态，通过使用捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸两种寡核苷酸的组合，在靶核酸序列不存在的情况下，上述单一标记的信号生成于固相底物上，而在存在靶核酸序列的情况下，上述单一标记的信号在上述固相底物上消失或减少。捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸中的一个被标记为单一标记，未被标记的另一个可以固定于固定底物或在步骤(f)中检测信号之前固定于固相底物上，并可在用于捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸之间的杂交的适当温度下检测标记的信号。
如本发明的第一实施方式，本发明的第二实施方案也可在杂交寡核苷酸被切割时，适用于靶核酸序列的检测，而且，当杂交寡核苷酸未被切割时(即，杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交因延伸二聚物的形成而得到抑制)，也适用于靶核酸序列的检测。
以下，更为详细地说明固相中的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交的第二实施方式。
【步骤(a)：靶核酸序列、上游寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸的杂交】
可以参照包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式的步骤(a)的说明来对上述步骤(a)进行说明。
【步骤(b)：从探测和标记寡核苷酸切割中放出片段】
可以参照包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式的步骤(b)的说明来对上述步骤(b)进行说明。
【步骤(c)：从探测和标记寡核苷酸放出的片段和捕捉和模板化寡核苷酸的杂交】
可以参照包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式的步骤(c)的说明来对上述步骤(c)进行说明。
【步骤(d)：片段的延伸】
可以参照包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式的步骤(d)的说明来对上述步骤(d)进行说明。
【步骤(e)：延伸二聚物和杂交寡核苷酸的杂交】
紧接着延伸反应，适合上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交的条件下，上述步骤(d)的产物与杂交寡核苷酸杂交，上述杂交寡核苷酸包含与捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列。捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸中的一个被标记为单一标记，未被标记的另一个固定于固相底物或在步骤(f)中检测信号之前固定于固相底物上。
本发明的第二实施方的特征在于，单一标记寡核苷酸式并不固定于固相底物上，而是当与固定于固相底物上的寡核苷酸杂交时，在固相底物上提供信号。
在上述靶核酸序列不存在于核酸试样内的情况下，不形成上述延伸二聚物，捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此，在上述固相底物上提供单一标记的信号。靶核酸序列存在于核酸试样内的情况下，形成延伸二聚物来防止在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物，由此，在固相底物上不提供单一标记的信号。根据本发明的一实例，清洗步骤在用于使步骤(d)的产物和杂交寡核苷酸杂交的步骤(e)及用于检测信号的步骤(f)之间实施。根据本发明的一实例，在进行清洗之前，有必要将捕捉和模板化寡核苷酸或杂交寡核苷酸中的一个固定于底物上。
择一性地，不需要清洗步骤。可在固相中使用共聚焦检测装置来以不受存在于反应溶液中的信号影响的方式检测存在于固相底物上的信号。
上述杂交寡核苷酸的详细说明可参照对包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试样的第一实施方式中的杂交寡核苷酸的说明来进行说明。
根据本发明的一实例，上述捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记，上述杂交寡核苷酸固定于固相底物上或在步骤(f)中检测信号之前固定于固相底物上(例如，图8～图9及图12)。择一性地，杂交寡核苷酸具有单一标记，捕捉和模板化寡核苷酸固定于固相底物上或在步骤(f)中检测信号之前固定于固相底物上(例如，图10～图11及图13)。
根据本发明的一实例，单一标记可以是任何标记。
单一标记包括化学标记(例如，生物素)、酶性标记(例如，碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶及β-葡萄糖苷酶)、放射性同位素标记(例如，I125及C14)、荧光标记、发光标记、化学发光标记及金属标记(例如，金)，但并不局限于此。
本发明的方法中，上述杂交寡核苷酸或捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记，上述单一标记位于在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物的情况下的单一标记的信号和在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间不形成杂交物的情况下的单一标记的信号不同的位置。
图8以图式性的方式表示使用具有单一标记的捕捉和模板化寡核苷酸和固定化的杂交寡核苷酸的本发明的第二实施方式。在上述靶核酸序列存在于核酸试样内的情况下，形成上述延伸二聚物来防止在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物，由此，在固相底物上不提供捕捉和模板化寡核苷酸的单一标记的信号。在上述靶核酸序列不存在于核酸试样内的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此，在固相中提供捕捉和模板化寡核苷酸的单一标记的信号。
与基于延伸二聚物来防止在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物相关的详细说明也可以参照包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式中对防止形成杂交物的说明来进行说明。
例如，在上述捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸在上述步骤(e)中第一次相接触的情况下(例如，在单独的反应容器中实施步骤(a)～步骤(d)及步骤(e)～步骤(f))，可以以如图8及10所示的方式实施本发明。在上述探测和标记寡核苷酸片段延伸之前，上述杂交寡核苷酸不与上述捕捉和模板化寡核苷酸相接触，但参加与延伸反应的产物的杂交。在步骤(e)中，延伸二聚物的形成通过抑制杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸杂交来防止在捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸形成杂交物。
在上述捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸在上述步骤(d)中相互接触的情况下(例如，在一个反应容器中实施步骤(a)～步骤(f))，可以以如图9及11所示的方式实施本发明。上述杂交寡核苷酸可在延伸之前与捕捉和模板化寡核苷酸杂交，并参与延伸反应。若杂交寡核苷酸在片段延伸之前与捕捉和模板化寡核苷酸杂交，则片段的延伸使杂交寡核苷酸从捕捉和模板化寡核苷酸切割或分离。尤其，在延伸反应期间内切割杂交寡核苷酸的情况下，延伸二聚物的形成通过基于切割的杂交寡核苷酸的消耗来在步骤(e)中防止形成捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸的杂交物。
即使上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸在步骤(d)中间具有相互接触的机会，杂交寡核苷酸的一部分也可以在延伸之前不与捕捉和模板化寡核苷酸杂交。这种情况下，杂交寡核苷酸可通过抑制杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸的杂交来在步骤(e)中不形成捕捉和模板化寡核苷酸和杂交物。
与上述杂交寡核苷酸第一次与捕捉和模板化寡核苷酸接触的步骤无关，在存在靶核酸序列的情况下形成延伸二聚物，并通过如下方式来防止捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的形成：(i)抑制杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸的杂交和/或(ii)基于切割的杂交寡核苷酸的消耗。
在不存在靶核酸序列的情况下，不形成延伸二聚物，因此，形成捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物。
根据本发明的一实例，上述步骤(d)在杂交寡核苷酸的存在下实施，且上述杂交寡核苷酸与捕捉和模板化寡核苷酸杂交和/或不与捕捉和模板化寡核苷酸杂交。根据本发明的一实例，在杂交寡核苷酸存在的条件下实施上述步骤(d)，(i)与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段在与上述杂交寡核苷酸进行杂交之前延伸和/或(ii)在上述片段延伸之前，上述杂交寡核苷酸与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的情况下，上述片段的延伸使上述杂交寡核苷酸从上述捕捉和模板化寡核苷酸切割或分离(displace)，由此，延伸二聚物的形成通过基于捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交的抑制和/或基于切割的杂交寡核苷酸的消耗来防止在步骤(f)中形成捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物。
上述杂交寡核苷酸包含与捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列。上述杂交寡核苷酸的核苷酸序列可被设计成在捕捉和模板化寡核苷酸的区域中与除了探测和标记寡核苷酸片段进行杂交的区域之外的区域互补的序列。在本发明的特定实例中，上述杂交寡核苷酸可被设计成在与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的过程中包含与片段(或非切割的探测和标记寡核苷酸)竞争的核苷酸序列(参照图12及图13)。具体地，上述竞争性杂交寡核苷酸不会被上述片段或其延伸产物切割。
对上述竞争性杂交寡核苷酸的详细说明可参照对包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式的杂交寡核苷酸的说明来进行说明。
根据本发明的一实例，上述捕捉和模板化寡核苷酸及杂交管核苷酸中的一个在上述步骤(d)及步骤(e)之间或步骤(e)及步骤(f)之间的步骤中固定于固相底物上。
【步骤(f)：表示捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的存在的信号的检测】
最终，为了检测固相底物上的捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物，在固相底物上检测信号。捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在表示靶核酸序列的不存在，捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的不存在表示靶核酸序列的存在。
根据本发明的一实例，存在上述靶序列的情况下的信号与不存在靶序列的情况下的信号不同。在通过本发明的方法来检测上述靶序列的情况下，上述信号的不同包括信号强度的差异。根据本发明的一实例，上述信号差异为至少10％、至少30％、至少50％、至少70％或至少90％。
在本发明中，上述捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸中的一个被标记为单一标记，未被标记的另一个固定于固相底物上或在上述步骤(f)中检测信号之前固定于固相底物上。在不存在靶核酸序列的情况下，上述单一标记的信号生成于固相底物上，在靶核酸序列存在的情况下，上述单一标记的信号在固相底物上消失或减少，如上所述的本发明的接近法可通过这种两种寡核苷酸组合来实现。
根据本发明的一实例，在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物维持双链形态的指定温度下，在固相底物上检测信号来实施在上述固相底物上的信号检测。
上述步骤(f)的检测可以以实时方式、终点方式或指定时间间隔(predetermined time interval)方式实施。在本发明还包括通过在上述反复循环之间包括变性过程来反复实施步骤(a)～步骤(f)的全部或一部分的步骤的情况下，可以在指定温度下的上述反复的各循环中(即，实时方式)，在指定温度下的上述反复的结束时刻(即，终点方式)或在指定温度下的上述反复期间内，分别在各个指定时间间隔中检测信号。
根据本发明的一实例，在固相底物上的信号检测是在规定温度范围中通过解链或杂交分析来实施的。上述解链或杂交分析的详细说明可参照包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式加上对解链或杂交分析的说明来进行说明。
上述信号检测可根据如台式(benchtop)荧光计，荧光多孔板读数器，光纤荧光计，荧光显微镜及微芯片/与荧光检测相结合的微流体系统等现有的方法来实施。
根据本发明的一实例，上述方法不使用上述上游寡核苷酸来实施，而在上述步骤(b)中，探测和标记寡核苷酸的切割在没有上游寡核苷酸或其延伸链的帮助下发生。以下，更加详细地说明使用上游寡核苷酸-独立性5’-核酸酶活性的本发明的一实例。
【基于上游寡核苷酸-独立性5’-核酸酶活性的基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的靶检测】
在本发明的再一实施方式中，提供通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来在固相中检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与探测和标记寡核苷酸进行杂交，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；
步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸的条件下，使上述步骤(a)的产物与具有5’核酸酶活性的酶相接触，与上述靶核酸序列杂交的上述探测和标记寡核苷酸基于具有上述5’核酸酶活性的酶而被切割，由此上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交，上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用上述步骤(c)的产物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段延伸并生成与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸链，并形成延伸二聚物，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物；
步骤(e)，在适合进行上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交的条件下，使包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸与上述步骤(d)的产物杂交，上述捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸中的一个被标记为单一标记，未被标记的剩余一个固定于固相底物上或在上述步骤(f)中检测信号之前固定于固相底物上，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此在固相底物上提供上述单一标记中的信号，在上述核酸试样内存在上述靶核酸序列的情况下，形成上述延伸二聚物来防止在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物，由此不在固相底物上提供上述单一标记的信号；以及
步骤(f)，检测上述固相底物上的上述信号，来在上述固相底物上检测上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在表示上述靶核酸序列的不存在，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的不存在表示上述靶核酸序列的存在。
基于上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的本发明的方法除了未使用上游寡核苷酸之外，与使用上游寡核苷酸的上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第二实施方式相同，因此，为了避免导致本说明书的复杂性的过多的重复，省略它们之间的的相同内容。
为了本发明的方法，可使用具有上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的现有的酶。具有5’核酸酶活性的模板-依赖性聚合酶包含具有上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的如Taq DNA聚合酶之类的多种酶。
【用于靶检测的试剂盒】
本发明的再一实施方式中，提供通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来在固相中检测核酸试样内的靶核酸序列的试剂盒，包含：
(a)，上游寡核苷酸(upstream oligonucleotide)，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；
(b)，探测和标记寡核苷酸(Probing and TaggingOligonucleotide)，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交，上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游，上述上游寡核苷酸或其延伸链通过具有上述5’核酸酶活性的酶来诱导上述探测和标记寡核苷酸的切割，由此，上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
(c)，捕捉和模板化寡核苷酸(Capturing and TemplatingOligonucleotide)，上述捕捉和模板化寡核苷酸向3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的片段通过延伸来生成与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸链，并形成延伸二聚物，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物；以及
(d)，杂交寡核苷酸(Hybridizing Oligonucleotide)，包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列，
上述捕捉和模板化寡核苷酸及上述杂交寡核苷酸中的一个被标记为单一标记，未标记的剩余一个固定于上述固相底物上或从上述单一标记检测信号之前固定于固相底物，在上述核酸试样内存在上述靶核酸序列的情况下，形成上述延伸二聚物来防止在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物，由此，在上述固相底物上不提供上述单一标记的信号，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此在固相底物上提供上述单一标记的信号。
由于本发明的试剂盒以实施上述本发明的检测方法的方式构成，因此，为了避免导致本说明书的复杂性的过多的反复，省略它们之间的的相同内容。
【III.基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交(Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization，PCE-NH)试验的靶检测方法的第三实施方式】
本发明的另一实施方式中，提供通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来在固相中检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游寡核苷酸(upstreamoligonucleotide)及探测和标记寡核苷酸(Probing and TaggingOligonucleotide)进行杂交，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交，上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游；
步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸的条件下，使上述步骤(a)的产物与具有5’核酸酶活性的酶相接触，上述上游寡核苷酸或其延伸链基于具有上述5’核酸酶活性的酶来诱导上述探测和标记寡核苷酸的切割，由此上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸(Capturing and Templating Oligonucleotide)进行杂交，上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用上述步骤(c)的产物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段延伸并生成与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸链，并形成延伸二聚物，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物；
步骤(e)，在适合进行上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交的条件下，使包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸与上述步骤(d)的产物杂交，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此提供表示上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在的第一信号，在上述核酸试样内存在上述靶核酸序列的情况下，上述延伸二聚物抑制上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交，由此提供表示不与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的杂交寡核苷酸的存在的第二信号，上述信号通过(i)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记、(ii)与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记、(iii)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记及与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入标记来提供；以及
步骤(f)，在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物在维持双链形态的指定温度下检测上述第一信号或上述第二信号，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在表示上述靶核酸序列的不存在，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的不存在表示上述靶核酸序列的存在，上述第一信号和第二信号的差异能够决定上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在或不存在，从而表示上述核酸试样内的上述靶核酸序列的存在或不存在。
本发明的第三实施方式以本发明的第一实施方式的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交接近法为基础。然而，本发明的第三实施方式的特征在于，在靶核酸序列存在的情况下，延伸二聚物抑制捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交，并将重点放在信号在指定温度下检测到的现象。
本发明人确认了上述延伸二聚物的形成诱导对捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交的抑制，从而在上述杂交寡核苷酸未被切割的情况下，也不形成上述捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物，并可将其成功适用于靶核酸序列的检测。与上述原理一样，在本发明中，上述杂交寡核苷酸未被切割且以单链形态维持的情况下的信号和上述杂交寡核苷酸形成捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的情况下的信号需不相同。
由于本发明在上述探测和标记寡核苷酸片段的延伸中并不是必须需要上述杂交寡核苷酸的切割，因此，可单独实施探测和寡核苷酸的片段的延伸(即，步骤(a)～步骤(d))、杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交及检测(即，步骤(e)～步骤(f))。在使用具有相互作用性双重标记的杂交寡核苷酸且存在靶核酸序列的情况下，从杂交寡核苷酸的切割中产生的信号呈现出与从抑制捕捉和模板化寡核苷酸和完整的杂交寡核苷酸杂交中产生的信号相互区别的不同轮廓。
在本说明书中，提及延伸二聚物的过程中所使用的术语“抑制捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交”意味着在延伸二聚物内的延伸链抑制捕捉和模板化寡核苷酸与非切割的杂交寡核苷酸或完整的杂交寡核苷酸的相结合(或退火)。术语“抑制捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交”可被视为术语“防止在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物”的限制性的实例。
因此，本发明的第三实施方式需要抑制捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交。如下所述，上述条件不排除基于延伸链切割杂交寡核苷酸或基于分离防止在捕捉和防止模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物。
以下，更为详细地说明探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第三实施方式。
【步骤(a)：靶核酸序列、上游寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸的杂交】
可以参照包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式的步骤(a)的说明来对上述步骤(a)进行说明。
【步骤(b)：从探测和标记寡核苷酸切割中放出片段】
可以参照包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式的步骤(b)的说明来对上述步骤(b)进行说明。
【步骤(c)：从探测和标记寡核苷酸放出的片段和捕捉和模板化寡核苷酸的杂交】
可以参照包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式的步骤(c)的说明来对上述步骤(c)进行说明。
【步骤(d)：片段的延伸】
可以参照包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式的步骤(d)的说明来对上述步骤(d)进行说明。
【步骤(e)：延伸二聚物和杂交寡核苷酸的杂交】
紧接着延伸反应，在对捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交适合的条件下，上述步骤(d)的产物与杂交寡核苷酸杂交，上述杂交寡核苷酸包含与捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列。
在上述靶核酸序列不存在于核酸试样内的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成形成杂交物，由此提供表示捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在的第一信号。在上述靶核酸序列存在于核酸试样内的情况下，上述延伸二聚物抑制捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交，由此提供表示与捕捉和模板化寡核苷酸非杂交的杂交寡核苷酸的存在的第二信号。
上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交可在上述步骤(e)中第一次发生。择一性地，捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交可在步骤(d)中第一次发生。在本发明的特定实例中，在杂交寡核苷酸存在的条件下实施上述步骤(d)，(i)与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段在与上述杂交寡核苷酸进行杂交之前延伸和/或(ii)在上述片段延伸之前，上述杂交寡核苷酸与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的情况下，上述片段的延伸使上述杂交寡核苷酸从上述捕捉和模板化寡核苷酸切割或分离。
在靶核酸序列存在的情况下下形成延伸二聚物，并通过如下方式来防止捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的形成：(i)抑制捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交和/或(ii)基于切割的杂交寡核苷酸的消耗。
本发明的方法的特征在于，使用通过抑制上述捕捉和模板化寡核苷酸与非切割的或完整的杂交寡核苷酸的杂交来提供的信号变化。在本发明中，在适合捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交的指定温度下，在上述杂交寡核苷酸与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的情况下所提供的信号和捕捉和模板化寡核苷酸与非切割的或完整的杂交核苷酸之间的杂交被延伸二聚物抑制的情况下所提供的信号不同。
在杂交寡核苷酸的存在下实施上述步骤(d)的情况下，一部分杂交寡核苷酸可在探测和标记寡核苷酸片段延伸的期间内被切割，且从切割中提供的信号可以共存。
上述杂交寡核苷酸的详细说明可参照对包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试样的第一实施方式中的杂交寡核苷酸的说明来进行说明。
上述杂交寡核苷酸包含与捕捉和模板化寡核苷酸互补性的核苷酸序列。上述杂交寡核苷酸的核苷酸序列可被设计成包含捕捉和模板化寡核苷酸的区域中与除了探测和标记寡核苷酸片段进行杂交的区域之外的区域互补的序列。择一性地，上述杂交寡核苷酸与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的过程中包含与上述片段竞争的核苷酸序列(参照图17及图18)。具体地，这种竞争性杂交寡核苷酸不会被上述片段或其延伸产物切割。
第一信号及第二信号通过(i)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记、(ii)与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记、(iii)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记及与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入标记来提供。
根据本发明的实例，在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸杂交来形成杂交物的情况下所提供的信号和上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸相互分离的情况下所提供的信号不同的情况下，本发明可使用多种类型的标记及标记位置。
在表达方式“捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸相互分离的”中所使用的术语“杂交寡核苷酸”意味着非切割的或完整的杂交寡核苷酸。
根据本发明的一实例，上述杂交寡核苷酸或上述捕捉和模板化寡核苷酸具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记，上述相互作用性双重标记位于在形成有上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号和在不形成上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号互不相同的位置(参照图14及图17)。
在使用具有上述相互作用性双重标记的杂交寡核苷酸的情况下，从上述杂交寡核苷酸的切割过程中产生的信号呈现出与从抑制上述杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交中产生的信号相互区别的不同模式。
在上述杂交寡核苷酸为单链状态的情况下，杂交寡核苷酸上的报道分子及猝灭分子在结构上相互接近，使得猝灭分子猝灭报道分子的信号。在不存在靶核酸序列并形成有捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的情况下，杂交寡核苷酸上的报道分子及猝灭分子在结构上相互隔开，使得猝灭分子不猝灭报道分子的信号。
在上述靶核酸序列存在的情况下，上述延伸二聚物的模板-依赖性的形成用于抑制捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交，由此，杂交寡核苷酸能够以单链的状态存在并猝灭报道分子的信号。随着延伸二聚物的数量增加，单链的杂交寡核苷酸的数量也增加，结果最终呈现出所检测的信号强度减少的模式。
另一方面，在上述靶核酸序列存在的情况下，与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的杂交寡核苷酸在探测和标记寡核苷酸片段延伸的期间内被切割。上述切割生成永久隔开的报道分子及猝灭分子来对报道分子的信号完全实施未淬灭。基于杂交寡核苷酸的切割的未猝灭程度大于基于捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交的未猝灭程度。因此，在检测出通过杂交寡核苷酸的切割来提供的信号的情况下，信号强度呈现出随着切割的杂交寡核苷酸的数量而增加的模式。
在包括上述稳定的杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交的抑制及杂交寡核苷酸的切割的两种状况同时发生的期间内，提供符合更为优势状况的信号模式。
根据本发明的一实例，上述杂交寡核苷酸具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记中的一个，上述捕捉和模板化寡核苷酸具有上述相互作用性双重标记中的剩余一个，上述相互作用性双重标记位于在形成有上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号和在不形成上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号互不相同的位置(参照图15及图18)。
本发明的特定实例中，上述本发明还使用一个包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸来实施，上述两个杂交寡核苷酸与上述捕捉和模板化寡核苷酸相接近来进行杂交，上述两个杂交寡核苷酸中的一个具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记中的一个，两个杂交寡核苷酸中的剩余一个具有相互作用性双重标记中的剩余一个，上述相互作用性双重标记位于在形成有上述捕捉和模板化寡核苷酸和两个杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号和在不形成上述捕捉和模板化寡核苷酸和两个杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号互不相同的位置。
根据本发明的一实例，上述杂交寡核苷酸或上述捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记，上述单一标记位于在形成有上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述单一标记的信号和在不形成上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述单一标记的信号互不相同的位置(参照图16)。
标记系统的详细说明(包括发信号机制及标记位置等)可以参照对包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式中的标记系统的说明来进行说明。
【步骤(f)：在指定温度下检测第一信号或第二信号】
最终，在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物维持双链形态的指定温度下检测第一信号或第二信号。
捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在表示靶核酸序列的不存在，捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的不存在表示靶核酸序列的存在。根据第一信号及第二信号的不同可决定捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在或不存在，从而表示在核酸试样中的靶核酸序列的存在或不存在。
根据本发明的一实例，第一信号及第二信号通过如信号发生及信号消失等现象来区分。
根据本发明的实例，第一信号及第二信号通过如强度的变化(信号的增加及信号的减少)等现象来区分。
根据本发明的一实例，靶序列存在的情况下的信号和靶序列不存在的信号不同。在通过本发明的方法来检测靶序列的情况下，上述信号的不同包括信号强度的差异。本发明的一实例中，上述信号的差异为至少10％、至少30％、至少50％、至少70％或至少90％。
一般可考虑捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的Tm值来决定捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物维持双链形态的温度。
上述步骤(f)的检测可以以实时方式、终点方式或指定时间间隔方式实施。在本发明还包括通过在反复循环之间包括变性过程来反复实施步骤(a)～步骤(f)的全部或一部分的步骤的情况下，可以在指定温度下的上述反复的各循环中(即，实时方式)，在指定温度下的上述反复的结束时刻(即，终点方式)或在指定温度下的上述反复期间内，分别在各个指定时间间隔中实施检测信号。
根据本发明的一实例，上述方法使用没有靶核酸序列或包括指定含量的靶核酸序列的对照组来实施。
在固相或液相中均可以实施本发明。
【固相中的靶检测】
根据本发明的一实例，本发明在固相中实施，上述捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸中的一个固定于固相底物上或在上述步骤(f)中检测信号之前固定于固相底物上，在上述固相底物上检测上述信号。
根据本发明的一实例，捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸中的一个在步骤(d)和步骤(e)之间或步骤(e)和步骤(f)之间固定于固相底物上。
对于第三实施方式的在固相中检测靶的详细说明可以参照包括解链或杂交分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第一实施方式来进行说明。
根据本发明的一实例，本发明的方法不使用上述上游寡核苷酸来实施，而在上述步骤(b)中，上述探测和标记寡核苷酸的切割没有上述上游寡核苷酸或其延伸链的帮助下发生。以下，更加详细地说明使用上述上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的本发明的实例。
【基于以上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性为基础的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的靶检测】
根据本发明的另一实施方式，提供通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与探测和标记寡核苷酸(Probing andTagging Oligonucleotide)进行杂交，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；
步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸的条件下，使上述步骤(a)的产物与具有5’核酸酶活性的酶相接触，基于具有上述5’核酸酶活性的酶来切割与上述靶核酸序列杂交的上述探测和标记寡核苷酸，由此上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸(Capturing and Templating Oligonucleotide)进行杂交，上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用上述步骤(c)的产物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段延伸并生成与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸链，并形成延伸二聚物，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物；
步骤(e)，在适合进行上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交的条件下，使包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸与上述步骤(d)的产物杂交，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此提供表示上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在的第一信号，在上述核酸试样内存在上述靶核酸序列的情况下，上述延伸二聚物抑制上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交，由此提供表示不与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的杂交寡核苷酸的存在第二信号，上述信号通过(i)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记、(ii)与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记、(iii)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记及与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入标记来提供；以及
步骤(f)，在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物在维持双链形态的指定温度下检测上述第一信号或上述第二信号，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在表示上述靶核酸序列的不存在，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的不存在表示上述靶核酸序列的存在，上述第一信号和第二信号的差异能够决定上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在或不存在，从而表示上述核酸试样内的上述靶核酸序列的存在或不存在。
基于上述上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的本发明的方法除了不使用上游寡核苷酸之外，与使用上游寡核苷酸的上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的第三实施方式相同，因此，为了避免导致本说明书的复杂性的过多的反复，省略它们之间的的相同内容。
【用于靶检测的试剂盒】
根据本发明的又一实施方式，提供通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来在固相中检测核酸试样内的靶核酸序列的试剂盒，包含：
(a)，上游寡核苷酸(upstream oligonucleotide)，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；
(b)，探测和标记寡核苷酸(Probing and TaggingOligonucleotide)，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交，上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游，上述上游寡核苷酸或其延伸链通过具有上述5’核酸酶活性的酶来诱导上述探测和标记寡核苷酸的切割，由此上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
(c)，捕捉和模板化寡核苷酸(Capturing and TemplatingOligonucleotide)，上述捕捉和模板化寡核苷酸向3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的片段延伸并生成与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸链，并形成延伸二聚物，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物；以及
(d)，杂交寡核苷酸(Hybridizing Oligonucleotide)，包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列；
在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此提供表示上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在的第一信号，在上述核酸试样内存在上述靶核酸序列的情况下，上述延伸二聚物抑制上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交，由此提供表示不与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的杂交寡核苷酸的存在的第二信号，上述信号通过(i)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记、(ii)与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记、(iii)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记及与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入标记来提供。
【本发明的共同的内容】
本发明第一实施方式、第二实施方式及第三实施方式的共同的内容为如下。
引物、探测和标记寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸可由天然(naturally occurring)磷酸脱氧(dNMPs)和/或天然核底物蛋白(NMPs)组成。择一性地，引物、探测和标记寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸可包含变异核苷酸序列或非-天然核苷酸序列，例如肽核酸(PNA，Peptide Nucleic Acid，参照PCT第WO 92/20702号)及锁核酸(LNA，Locked Nucleic Acid，参照PCT第WO 98/22489号)。引物、探测和标记寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸可包含脱氧肌苷、肌苷、1-(2'-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-硝基吡咯和5-硝基吲哚等通用碱基。术语“通用碱基”意味着可分别对于天然DNA/RNA碱基几乎没有多大区别地形成碱基对。
如上所述，探测和标记寡核苷酸可在从探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的3’-末端向3’-方向隔开的一位置被切割。切割位置可位于探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端的一部分。在探测和标记寡核苷酸片段包含探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端一部分的情况下，与3’-靶向部位的5’-末端的一部分杂交的捕捉和模板化寡核苷酸的位置可包含通用碱基、简并序列(degenerate sequence)或它们的组合。例如，若探测和标记寡核苷酸在从探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的3’-末端向3’-方向隔开一个核苷酸序列程度的位置被切割，则为了与上述核苷酸序列的杂交，捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位的5’-末端的一部分优选包含通用碱基。若探测和标记寡核苷酸在从探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位的3’-末端向3’-方向隔开两个核苷酸序列的位置被切割，则捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位的5’-末端包含简并序列，与3’-方向相邻的其核苷酸序列包含通用碱基。像这样，在3’-靶向部位的5’-末端的一部分的多个位置中发生探测和标记寡核苷酸切割的情况下，最好是在捕捉和模板化寡核苷酸利用通用碱基及简并序列。并且，在上游引物延伸-依赖性切割诱导下，若在多个靶核酸序列筛选中利用具有相同5’-标记部位的探测和标记寡核苷酸，则3’-靶向部位的5’-末端的一部分生成互不相同的探测和标记寡核苷酸片段。在这种情况下，通用碱基及简并序列有效地使用于捕捉和模板化寡核苷酸中。在捕捉和模板化寡核苷酸利用通用碱基及简并序列的战略为了多个靶核酸序列的筛选而使用一类型的捕捉和模板化寡核苷酸或最少类型的捕捉和模板化寡核苷酸。
根据本发明的一实例，本发明的方法在上述反复循环之间包括变性过程来还包括反复执行上述步骤(a)～步骤(f)的全部或一部分的步骤。这种反复可扩增靶核酸序列和/或靶信号。根据本发明的一实例，步骤(a)～步骤(b)、(a)～步骤(d)或(e)～步骤(f)可包括变性过程来进行反复。在本发明的特定实例中，可选择性地调节反复的循环数。可通过现有技术来实施变性过程，例如，可通过包含热、碱、甲酰胺、尿素及乙二醛处理、酶方法(如解旋酶作用)及结合蛋白质的公知的技术实施变性，但并不局限于此。例如，解链可在80～105℃温度范围内进行热处理来实现。在Joseph Sambrook，等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2001)中提供用于实现这种处理的常规方法。
根据本发明的实例，上述步骤(a)～步骤(f)可在一个反应容器或单独的反应容器中实施。例如，上述步骤(a)～步骤(b)、(c)～步骤(d)及(e)～步骤(f)可在个别的反应容器或单独的反应容器中实施。例如，决定探测和标记寡核苷酸就捕捉和模板化寡核苷酸序列及反应条件，使得上述探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位和上述靶核酸序列之间的杂交在比上述探测和标记寡核苷酸片段和上述捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交更为严格的条件下实施的情况下，上述步骤(a)～步骤(b)可以不执行上述步骤(c)～步骤(f)来反复。可以紧接着步骤(a)～步骤(b)的反复来实施步骤(c)～步骤(f)。
在本发明的特定实例中，上述步骤(a)～步骤(d)及步骤(e)～步骤(f)可在单独的反应容器中实施。
在本发明的特定实例中，可包括上述变性过程来反复实施步骤(a)～步骤(d)。
本发明所属技术领域的普通技术人员可以明确特定步骤的反复、反复过程中的变形的介入(intervention)、特定步骤的分离实施及检测时点可以发生大幅度的变化。
根据本发明的一实例，上述反复使用上述探测和标记寡核苷酸的上游引物来与变性过程一同实施的情况下，上述反复在下游引物的存在下实施，尤其根据聚合酶链式反应来实施。对上述探测和标记寡核苷酸的上游引物及下游引物的使用可扩增靶核酸序列。
根据本发明的一实施例，上述反复使用上述探测和标记寡核苷酸的上游探针来与变性过程一同实施的情况下，在存在探测和标记寡核苷酸的下游引物的条件下实施上述反复。
在本说明书中所使用的术语“核酸试样”意味着包含非生物学试样(例如，食品、水、空气、土壤及废水)或核酸分子的生物学试样。生物学试样可来源于动物，植物，人，真菌，细菌及病毒。生物试样可以为细胞、组织或从生物学来源的流体、血液、血浆、血清、淋巴、奶、尿、粪便、眼流体、唾液、精液、脑提取物、脊髓液、阑尾、脾脏及扁桃组织的提取物。
本发明并不要求所要检测和/或扩增的靶核酸序列包含全部DNA(gDNA及cDNA)及RNA分子来具有某种特定序列或长度。靶核酸序列可以为单链或双链。
在使用mRNA为初始物质的情况下，在实施退火步骤之前，必需实施反转录步骤，在Joseph Sambrook等，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.(2001)；及Noonan，K.F.等，Nucleic AcidsRes.16：10366(1988)中公开了详细内容。为了实施逆转录反应，可利用与随机六聚体或mRNA杂交的寡核苷酸dT引物。
本发明中可检测和/或扩增的靶核酸序列还包含任何天然(naturally occurring)原核细胞核酸、真核细胞(例如，原生动物和寄生动物、菌类、酵母、高等植物、低等动物及包含哺乳动物和人类的高等动物)核酸、病毒(例如，疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、EB病毒、肝炎病毒以及脊髓灰质炎病毒等)核酸或类病毒核酸。
通过本发明来检测的靶核酸序列包含各种核酸序列，例如，基因组内序列、分离或片段化的序列及合成序列(例如，cDNA序列及条形码序列)。例如，靶核酸序列包含用于免疫PCR(IPCR)的核酸标记序列。反向聚合酶链式反应(IPCR)与聚合酶链式反应一同使用核酸标记序列及抗体间的接合体，这广泛适用于检测包含蛋白质的各种靶(see Sano et al，Science 258pp：120-122(1992)，U.S.Pat.No.5,665,539，Niemeyer et al，Trends in Biotechnology 23pp:208-216(2005)，U.S.Pat.Pub.No.2005/0239108and Ye et al，Journal ofEnvironmental Science 22pp：796-800(2010))。
本法发明的靶核酸分子可以作为在反向聚合酶链式反应(IPCR)方法中使用的核酸来包含，本发明可以为了通过反向聚合酶链式反应方法来检测核酸标记而使用。
并且，本发明对核苷酸变异的检测有用。优选地，靶核酸序列包含核苷酸变异。在本说明书中使用的术语“核苷酸变异”意味着在连续的DNA片段或序列类似的DNA片段中存在于特定位置的DNA序列中的所有单一或多个核苷酸置换、缺失或插入。这种连续的DNA片段包含一个基因或一个染色体的任意其他部位。这种核苷酸变异可以为突变(mutant)或多态性等位基因变异(polymorphic allelevariations)。例如，在本发明中检测的核苷酸变异包括：单核苷酸多态性(SNP，single nucleotide polymorphism)、突变(mutation)、缺失、插入、置换以及移位。核苷酸变异的例子包括：人类基因组的各种变异(例如，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR，methylenetetrahydrofolate reductase)基因的变异)、病原体的药物耐性相关的变异以及癌产生-相关的变异。所使用的上述术语“核苷酸变异”包含位于核酸序列的特定位置的任何变异。即，术语“核苷酸变异”包含野生型及位于核酸序列的特定位置的任何突变型。
在检测靶核酸序列的核苷酸变异的本发明中，所使用的引物或探针具有对靶核酸序列的上述核苷酸变异互补的序列的情况下，包含上述核苷酸变异的靶核酸序列在本说明书中被记载为匹配模板(matching template)。在所使用的引物或探针具有对靶核酸序列的核苷酸变异非-互补的序列的情况下，包含上述核苷酸变异的靶核酸序列在本说明书中被记载为错配模板(mismatching template)。
为了检测核苷酸变异，可将上游引物的3’-末端设计成位于靶核酸序列的核苷酸变异位置的对面。根据本发明的一实例，上游引物的3’-末端具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列。具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列的上游引物的3’-末端通过被匹配模板退火并被延伸来诱导探测和标记寡核苷酸切割。作为产物，探测和标记寡核苷酸片段通过与捕捉和模板化寡核苷酸杂交并延伸，从而生成提供靶信号的核酸分子。相反，上游引物的3’-末端在错配模板中与核苷酸变异错配的情况下，即使上游引物与错配模板杂交，为了实现延伸反应，在需要对引物的3’-末端进行退火的条件下也不会被延伸，由此不会产生靶信号。
择一性地，可利用对探测和标记寡核苷酸的杂交有着依赖性的探测和标记寡核苷酸切割，上述探测和标记寡核苷酸具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列。例如，在已调节的条件下，具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列的探测和标记寡核苷酸在与匹配模板杂交之后被切割。作为产物，探测和标记寡核苷酸片段通过与捕捉和模板化寡核苷酸杂交来延伸，并形成用于防止在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间进行杂交的延伸二聚物，由此，用于表示捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸的杂交物的存在的信号不会被提供。相反，在已调节的条件下，探测和标记寡核苷酸不会与具有对核苷酸变异位置非-互补的序列的错配模板杂交，也不会被切割。这种情况下，优选地，与探测和标记寡核苷酸的核苷酸变异互补的序列位于探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的中间。
根据一实例，使用人为错配核苷酸能够提高对核苷酸变异的探测和标记寡核苷酸的区别可能性。
择一性地，本发明为了对特定核苷酸变异的探测和标记寡核苷酸的选择性而使用位于3’-靶向部位的5’-末端的一部分的具有核苷酸变异区别位点(nucleotide variation discrimination site)的探测和标记寡核苷酸。为了检测核苷酸变异，探测和标记寡核苷酸的3’-末端部位的5’-末端的一部分在靶核酸序列中位于核苷酸变异中，而上述探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端的一部分在靶核酸序列中具有与核苷酸变异互补的序列。
探测和标记寡核苷酸与具有与核酸变异区别位点互补的核苷酸变异的靶核酸序列(即，匹配模板)杂交的情况下，3’-靶向部位的5’-末端的一部分与匹配模板形成双链，但在探测和标记寡核苷酸与在核苷酸变异区别位点具有非互补性的核苷酸变异的靶核酸序列(即，错配模板)杂交的情况下，3’-靶向部位的5’-末端的一部分不与错配模板形成双链。
在本说明书中，提及探测和标记寡核苷酸时所使用的术语“核苷酸变异区别位点”为与探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端的一部分的靶核酸序列中对核苷酸变异互补的序列。
根据本发明的优选一实例，上述核苷酸变异区别位点位于从探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端隔开10核苷酸，更优选为8核苷酸，尤其优选为6核苷酸，进而优选为4核苷酸、3核苷酸、2核苷酸或1核苷酸的位置以内。优选地，核苷酸变异区别位点位于探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端。
在本发明中，在探针的核苷酸变异区别位点或靶序列的核苷酸变异位点中所提及的术语“位点”不仅包含一个核苷酸，而且包含多个核苷酸。
可以关注的是，像这样，对于关注的核苷酸变异的区别化的杂交模式提供在探测和标记寡核苷酸的初始切割位置中的差异，由此生成两种探测和标记寡核苷酸片段，并根据是否存在关注的核苷酸变异来发生信号差异。
在存在所关注的上述核苷酸变异的情况下，第一片段通过探测和标记寡核苷酸和匹配模板之间的杂交物的切割来生成，在不存在关注的核苷酸序列变异的情况下，第二片段通过探测和标记寡核苷酸和错配模板之间的杂交物的切割来生成。上述第二片段包含追加性的3’-末端部位，上述追加性的3’-末端部位用于生成与第一次片段不同的第二次片段。
在本发明的用于检测单一核苷酸序列变异的一实例中，上述探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端在上述核酸序列中具有与单一核苷酸变异互补的序列。如上所示，与匹配模板杂交的探测和标记寡核苷酸的切割可在例如上游引物的延伸-依赖性切割的诱导下，向探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端方向在直接接近的一个位置中得到诱导。探测和标记寡核苷酸片段的3’-末端具有与单一核苷酸序列互补的核苷酸序列。探测和标记寡核苷酸片段与具有包含相当于核苷酸变异的序列的捕捉部位的捕捉和模板化寡核苷酸杂交之后延伸，从而形成防止在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物的延伸二聚物，由此，不提供用于表示捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物存在的信号。若相同的探测和标记寡核苷酸除单一核苷酸序列变异之外，与对匹配模板具有相同序列的错配模板杂交，则可以在从探测和标记寡核苷酸的3’-末端部位的5’-末端向3’-方向隔开2个核苷酸序列的位置中生成探测和标记寡核苷酸的切割。除了与核苷酸变异互补的核苷酸序列之外，探测和标记寡核苷酸片段的3’-末端具有追加切割的核苷酸序列。与追加切割的核苷酸序列杂交的捕捉和模板化寡核苷酸的位置被设计成对上述追加切割的核苷酸序列具有非互补的序列的情况下，探测和标记寡核苷酸片段的3’-末端不与捕捉和模板化寡核苷酸杂交，并且在被调节的条件下，探测和标记寡核苷酸片段不会延伸。
根据本发明一实例，对上述探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端一部分的核苷酸变异具有互补序列的探测和标记寡核苷酸的切割位置依赖于匹配模板或错配模板的杂交而不同，由此，从上述两个杂交事件所放出的探测和标记寡核苷酸片段具有不同的序列，优选地，在其3’-末端一部分，更优选地，在其3’-末端具有不同的序列。
根据本发明的一实例，可通过考虑上述探测和标记寡核苷酸片段的3’-末端的一部分不同的捕捉和模板化寡核苷酸的核苷酸序列的选择来匹配模板和错配模板。
根据本发明一实例，一个探测和标记寡核苷酸片段的生成可通过捕捉和模板化寡核苷酸上的延伸反应来明确地进行检测。
根据本发明一实例，在第二片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的情况下，具有选择捕捉和模板化寡核苷酸的序列，因此，捕捉和模板化寡核苷酸不与第二片段的追加性3’-末端部位杂交，且防止第二片段的延伸。
如上所述，第一片段的延伸因形成延伸二聚物而通过与杂交寡核苷酸的非-杂交来检测。
根据本发明的一实例，探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端的一部分从核苷酸变异区别位点隔开1～10核苷酸序列(更优选为1～5核苷酸序列)的位置中包含非-碱基配对部分(non-base pairingmoiety)。
探测和标记寡核苷酸与对变异区别位点具有非-杂交的核苷酸变异的靶核酸序列杂交的情况下，非-碱基配对部分防止3’-靶向部位的5’-末端的一部分与靶核酸序列形成双链。
非-碱基配对部分(例如，人为错配核苷酸序列)的使用提高对核苷酸序列变异的探测和标记寡核苷酸的区别能力。
根据本发明的一实例，在探测和标记寡核苷酸与核苷酸变异区别位点互补的核苷酸序列变异的靶核酸序列杂交的情况下，非-碱基配对部分与不会抑制在5’-末端一部分和靶核酸序列之间形成双链。
根据本发明的一实例，非-碱基配对部分扩大探测和标记寡核苷酸和匹配模板的杂交物上的初始切割位置和探测和标记寡核苷酸和错配模板的杂交物上的初始切割位置之间的距离。
根据本发明的一实例，非-碱基配对部分序列的导入可以调节初始切割位置，尤其可以调节探测和标记寡核苷酸与错配模板的杂交物上的初始切割位置。
根据本发明的一实例，非-碱基配对部分位于核苷酸变异区分位置的下游。
非-碱基配对部分包含靶核酸序列之间不形成碱基对的某些部分。优选地，非-碱基配对部分为(i)人为错配碱基、无法形成碱基-对的天然/非天然碱基、碱基对或无法形成通用碱基的变异碱基、(ii)以无法形成碱基对的方式发生变异的非-碱基对核苷酸序列或(iii)非-碱基对化学化合物。
例如，非-碱基配对部分包含碱性组(alkylene group)、呋喃核糖基萘(ribofuranosyl naphthalene)、脱氧呋喃核糖基萘(deoxyribofuranosyl naphthalene)、偏磷酸盐(metaphosphate)、硫代磷酸酯键(phosphorothioate linkage)、烷基磷酸三酯键(alkylphosphotriester linkage)、芳基磷酸三酯键(aryl phosphotriesterlinkage)、烷基膦酸酯键(alkyl phosphonate linkage)、芳基膦酸酯键(aryl phosphonate linkage)、氢膦酸酯键(hydrogen phosphonatelinkage)、烷基磷酸酯键(alkyl phosphoroamidate linkage)及芳基磷酸酯键(aryl phosphoroamidate linkage)。使用为现有的碳隔片或非-碱基配对部分。作为非-碱基配对部分，通用碱基有用于探测和标记寡核苷酸的接近的切割位置。
随着包含如脱氧肌苷(deoxyinosine)、肌苷(inosine)、1-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖)-3-硝基吡咯(1-(2’-deoxybeta-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrole)及5-硝基吲哚(5-nitroindole)之类的通用碱基的碱基在天然碱基之间具有更低的结合强度，碱基在特定杂交条件下可以用作非-碱基配对部分。
优选地，导入于5’-末端的一部分的非-碱基配对部分具有1-10部分，更优选地，具有1-5部分，进而优选地，具有1-2部分。多个非-碱基对部分可以在5’-末端一部分以连续或不连续的方式存在。优选地，非-碱基配对部分具有2-5个连续性的部分。
优选地，非-碱基配对部分为非-碱基对化学化合物。
根据本发明的一实例，探测和标记寡核苷酸的核苷酸变异区别位点及非-碱基对部分位于从3’-靶向部位的5’-末端隔开10核苷酸(更优选为8核苷酸、7核苷酸、6核苷酸、5核苷酸、4核苷酸、3核苷酸、2核苷酸及1核苷酸)的位置以内。
根据本发明的一实例，探测和标记寡核苷酸具有阻断剂部位，上述阻断剂部位包含对具有5’核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的至少1个核苷酸作为阻断剂(blocker)，上述阻断剂部位用于调节初期切割位置或在一个位置或多个位置防止切割。
为了改善核苷酸变异的检测效率，本发明可通过使用肽核酸的箝术来实施。在Henrik et al.,Nucleic Acid Research 21:5332-5336(1993)及Luo et al.,Nucleic Acid Research Vol.34,No 2 e12(2006)中公开了使用肽核酸的代表性的箝术。
例如，在使用肽核酸的聚合酶链式反应箝术中，不仅使具有野生型核苷酸序列变异的核苷酸序列扩增，而且使具有突变型核苷酸序列变异的核酸学扩增，接着通过本说明书所记述的方法，可以更为有效检测核苷酸序列变异。尤其，在聚合酶链式反应箝术中，只扩增具有特异型核苷酸变异的核酸序列，因此若将聚合酶链式反应箝术与本发明的方法相结合，则能够以更有效的方式检测少数-变异体(minority-variant)。
在本发明中，术语“扩增阻断剂”意味着为了箝术而使用的寡核苷酸。
一般情况下，用于箝术的扩增阻断剂被设计成不与具有单一错配的模板杂交，在相同条件下，仅与具有与扩增阻断剂完全互补的序列的模板杂交。与用于抑制引物退火或使链延伸(elongation)的扩增阻断剂杂交的模板不会扩增，只有与扩增阻断剂不杂交的模板扩增。肽核酸及锁核酸之类的核酸类似体在对单一碱基的差异也呈现出相当的Tm差异，在这一方面，作为扩增阻断剂很有用。
根据本发明的一实例，扩增阻断剂还用于在本发明中检测少数-变体。根据本发明的一实例，扩增阻断剂防止位于扩增阻断剂的上游的引物延伸。根据本发明的一实例，扩增阻断剂及探测和标记寡核苷酸可被设计成在双链或相互不同链中与相同链杂交。根据本发明的一实例，扩增阻断剂包含5’核酸酶活性加上主要耐性的核酸/核苷酸序列。根据本发明的一实例，扩增阻断剂包含肽核酸、锁核酸、吗啉(morpholino)、乙二醇核酸(GNA，glycol nucleic acid)、苏糖核酸(TNA，threose nucleic acid)、桥核酸(BNA)、N3'-P5'氨基磷酸酯(NP，N3'-P5'phosphoramidate)低聚物、小沟结合物联寡核苷酸(MGB-linked oligonucleotides)，硫代磷酸酯(PS，phosphorothioate)的低聚物、C1-C4烷基膦酸酯低聚物(C1-C4alkylphosphonate oligomers)、磷酰胺(phosphoramidates)、β-磷酸二酯寡核苷酸(B-phosphodiester oligonucleotides)、磷酸A-寡核苷酸(a-phosphodiester oligonucleotides)或它们的混合。
5’-末端部位可在具有一个核苷酸序列变异区别部位的探针与错配模板杂交的情况下，5’-末端部位在特定条件下形成单链。上述探针可以相当于探测和标记寡核苷酸。信号可通过本发明的探测和标记寡核苷酸试验生成。这种接近法可有用于具有与探针的核苷酸序列变异区别位点非-杂交的核苷酸序列变异的靶核酸序列的检测。
根据本发明的一实例，本发明中使用的靶核酸序列为预扩增(pre-amplified)的核酸序列。预扩增的核酸序列的利用可以有意增加本发明的靶检测的敏感度及特异性。
根据本发明的一实例，在探测和标记寡核苷酸中存在引物的条件下实施本发明的方法。
同时检测至少2种靶核酸序列(多重)，这使本发明的优点更加突出。
根据本发明的一实例，本发明的方法为了检测至少2种(更具体为至少3种，进而具体为至少5种)靶核酸序列而实施。
根据本发明的一实例，本发明的方法为了检测至少2种(更具体为至少3种，进而具体为至少5种)靶核酸序列而实施，上述上游寡核苷酸包含至少2种(更具体为至少3种，进而具体为至少5种)上游寡核苷酸，上述探测和标记寡核苷酸包含至少2种(更具体为至少3种，进而具体为至少5种)探测和标记寡核苷酸，上述捕捉和模板化寡核苷酸包含至少2种(更具体为至少3种，进而具体为至少5种)捕捉和模板化寡核苷酸，上述杂交寡核苷酸包含至少2种(更具体为至少3种，进而具体为至少5种)杂交寡核苷酸。
在本发明的特定实例中，在存在至少2种靶核酸序列的情况下，与其相对应的信号也提供至少2种。
根据本发明的一实例，本发明对上述探测和标记寡核苷酸使用至少2种下游引物来实施。
为了增加延伸链的数量，本发明可以利用追加的探测和标记寡核苷酸，并通过追加性的5’核酸酶切割反应来向捕捉和模板化寡核苷酸上提供可延伸的追加片段，上述追加的探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述延伸链互补的杂交核苷酸序列及(ii)5’-标记部位，包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉互补，但与延伸链非-互补的核苷酸序列。为了5’核酸酶的切割反应，可追加使用包含与延伸链互补的杂交核苷酸序列并位于追加性的探测和标记寡核苷酸的上游的上游寡核苷酸。根据本发明的一实例，杂交寡核苷酸可以用作追加性的探测和标记寡核苷酸。
上述优选实例具有上述追加片段的形成依赖于延伸链的形成的特征。
择一性地，上述追加片段可以通过使用追加性的探测和标记寡核苷酸来提供，上述追加性的探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述延伸链互补的杂交核苷酸序列及(ii)5’-标记部位，包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉互补，但与延伸链非-互补。
根据本发明的一实例，上述追加性的延伸二聚物通过延伸链的追加生成来形成，从而贡献于靶信号的扩增。
概括本发明的特征和优点如下：
(a)为了决定靶序列的存在，本发明利用(i)与上述把序列杂交的探测和标记寡核苷酸、(ii)可以通过靶-依赖性方法形成延伸二聚物的捕捉和模板化寡核苷酸及(iii)与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的杂交寡核苷酸，由此大幅度增加靶序列的特异性。并且，用于发生信号的条件可以与靶序列不相关地进行调节，因此可以容易地设定本发明的方法的反应条件。上述特征不仅可容易地决定用于发生信号的条件，而且当对试样，尤其，对临床试样进行多重靶检测时，可以防止发生假阳性信号。
(b)上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的的Tm值可通过序列和/或杂交寡核苷酸的长度来调节，因此，不可随意预先设定上述杂交物的Tm值。利用上述特征，可以容易地决定(i)捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的固有的Tm值可以作为捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的存在的区别因子来使用(例如，在解链分析中)；以及(ii)用于维持捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的检测温度及用于对至少两个靶序列进行多重检测的反应条件。
(c)本发明利用基于靶-依赖性延伸二聚物的形成的捕捉和模板化寡核苷酸和完整的杂交寡核苷酸之间的杂交抑制的发生。因此，本发明也可在杂交核苷酸未被切割的情况下检测靶序列。与此相关，捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的检测可以在不同于捕捉和模板化寡核苷酸延伸反应的容器中实施。
(d)本发明的第一实施方式及第三实施方式不仅利用杂交寡核苷酸的切割，而且利用捕捉和模板化寡核苷酸和完整的杂交寡核苷酸之间的杂交的抑制。因此，探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位，捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸序列的设计变得容器，且还可以容易地设定反应条件。
(e)本发明的第一实施方式及第三实施方式可利用用于检测靶序列的多种标记。
(f)用于检测至少两个靶序列的本发明的第一实施方式中，在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物具有互不相同的Tm值的情况下，上述至少两个靶核酸序列即使使用提供具有相同荧光特性的信号的标记系统，也通过解链曲线分析检测。上述优点可以克服多重实时检测中因检测的荧光标签数量的限制而导致的多重体现受限的问题。
(g)利用解链分析来分析探针和靶序列之间的杂交物或靶序列的聚合酶链式反应扩增产物的现有技术在如临床试样之类的核苷酸序列变异-敏感性试样(nucelotide variation-susceptible samples)的情况下，有可能出现分析偏差高的问题。然而，本发明的第一实施方式可使用与靶序列无关地进行设计的捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸，从而可以获得试样中无偏差的分析结果。
(h)通过固定于固相的寡核苷酸和靶核酸序列之间的直接性的杂交来检测靶核酸序列的现有固相反应因固相这一局限性的反应环境而有可能得不到有效的反应结果。相反，本发明可在固相中与靶核酸序列无关地利用与捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交反应，因此，即使在定型的反应条件中也可得到更为有效的结果。
(i)在本发明的固相反应中，即使至少两个靶序列使用单一标记，也可同时进行检测。
(j)在上述杂交寡核苷酸与上述捕捉和模板化寡核苷酸的杂交方面，在包含与上述片段竞争的核苷酸序列的情况下，可实质性地排除杂交寡核苷酸的切割。在这种情况下，靶序列的检测可不受杂交寡核苷酸切割的影响而实施。
(k)在上述杂交寡核苷酸与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交方面，在包含与上述片段竞争的核苷酸序列的情况下，杂交寡核苷酸在单一反应容器中抑制探测和标记寡核苷酸与捕捉和模板化寡核苷酸相结合，因此，与捕捉和模板化寡核苷酸相比，探测和标记寡核苷酸更有可能与靶序列杂交。
(i)在与上述捕捉和模板化寡核苷酸的杂交方面，使用包含与上述片段竞争的核苷酸序列的上述杂交寡核苷酸的本发明的一实例中，可使用比较短的捕捉和模板化寡核苷酸，其可改善捕捉和模板化寡核苷酸的合成效率及费用效率。
以下，通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅用于对本发明进行更具体的说明本，只要是本发明所属技术领域的普通技术人员，就能明确地了解根据本发明的要旨，本发明的范围并不局限于这些实施例。
【实施例】
【实施例1：对于捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交的延伸二聚物形成的影响评价】
本发明人对杂交寡核苷酸的捕捉和模板化寡核苷酸的杂交是否因延伸二聚物的数量增加而减少进行了试验，而这表示延伸二聚物的形成抑制杂交寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交。为了调节延伸二聚物的数量而准备了具有与捕捉和模板化寡核苷酸互补的核苷酸序列的合成延伸链(Syn-ES)，并在多种数量的Syn-ES中使用固定数量的捕捉和模板化寡核苷酸来形成延伸二聚物。
Syn-ES及捕捉和模板化寡核苷酸不具有标记。捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端被碳隔片阻断。杂交寡核苷酸的5’-末端具有荧光报道分子(Cal Fluor Red 610)，杂交寡核苷酸的3’-末端具有猝灭分子(BHQ-2)。
本实施例中，通过解链分析来检测捕捉和模板化寡核苷酸-杂交寡核苷酸杂交物的存在。
在本实施例中利用的Syn-ES、捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸的序列如下。
NG-Syn-ES
5’-ACGACGGCTTGGCTGAGCGCTGGATACCCTGGACGATATG-3’(SEQ ID NO:1)
NG-CTO-1
5’-CATATCGTCCAGGGTATCCAGCGCTCAGCCAAGCCGTCGT[Spacer C3]-3’(SEQ ID NO：2)
NG-HO-15’-[Cal Fluor Red610]GCGCTGGATACCCTG[BHQ-2]-3’(SEQ ID NO：3)
利用含有Syn-ES(SEQ ID NO:1)(3，2，1，0.5，0.1或0pmole)、捕捉和模板化寡核苷酸(SEQ ID NO:2)1pmole、杂交寡核苷酸(SEQID NO:3)1pmole及2X主混合液[包含2.5mM的MgCl2、200μm的dNTPs及1.6units的H-Taq DNA聚合酶(韩国索尔杰恩特公司(Solgent，Korea))]10μl量的20μl的最终体积来实施反应。使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，Bio-Rad)，使上述反应混合物在95℃温度中进行15分钟变性。在进行变性过程之后，使反应混合物冷却至40℃，并在40℃维持10分钟后，从40℃慢慢加热至85℃，从而得到解链曲线。在温度上升的过程中，连续测定荧光来监测捕捉和模板化寡核苷酸-杂交寡核苷酸杂交物的解离。解链峰来源于解链曲线数据。
如图19A至图19B所示，在0～0.5pmole的Syn-ES范围内，相当于捕捉和模板化寡核苷酸-杂交寡核苷酸杂交物的预计Tm值的57℃中检测出解链峰，该解链峰的高度以与Syn-ES的量成反比的方式减少。在使用1pmole以上的Syn-ES的情况下，未检测出解链峰。
这种结果表示捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交因延伸二聚物的形成而减少，且延伸二聚物的形成抑制捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交。
【实施例2：利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交实验的靶核酸序列的检测】
并且，本发明人对探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验(i)是否可以在指定温度下实时检测或(ii)是否可以通过解链分析来检测靶核酸序列进行了实验。
为了上游引物及下游引物的延伸、探测和标记寡核苷酸的切割及探测和标记寡核苷酸片段的延伸而使用具有5’核酸酶活性的TaqDNA聚合酶。
探测和标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸不具有标记。探测和标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端被碳隔片(carbonspacer)阻断。使用了淋病奈瑟菌(NG)基因的基因组DNA作为靶。杂交寡核苷酸的5’-末端荧光报道分子(Cal Fluor Red 610)，杂交寡核苷酸的3’-末端具有猝灭分子(BHQ-2)。
在本实施例中所使用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸的序列如下。
NG-F-1
5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’(SEQID NO:4)
NG-R-1
5’-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’(SEQID NO:5)
NG-PTO
5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[SpacerC3]-3’(SEQ ID NO:6)
NG-CTO-1
5’-CATATCGTCCAGGGTATCCAGCGCTCAGCCAAGCCGTCGT[Spacer C3]-3’(SEQ ID NO:2)
NG-HO-15’-[Cal Fluor Red610]GCGCTGGATACCCTG[BHQ-2]-3’(SEQ ID NO:3)
(下划线文字部分表示探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位)
【2-1.聚合酶链式反应期间，在指定温度下的实时检测】
利用含有淋病奈瑟菌的染色体组DNA100pg、上游引物(SEQ IDNO：4)10pmole、下游引物(SEQ ID NO:5)10pmole、探测和标记寡核苷酸(SEQ ID NO：6)5pmole、捕捉和模板化寡核苷酸(SEQID NO：2)0.5pmole、杂交寡核苷酸(SEQ ID NO：3)0.5pmole及2X主混合液[包含2.5mM的MgCl2、200μm的dNTPs及1.6units的H-Taq DNA聚合酶(韩国索尔杰恩特公司)]10μl量的20μl的最终体积来实施反应，使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，Bio-Rad)，使上述反应混合物在95℃温度中变性15分钟，并以在95℃温度中变性30秒钟、在55℃温度中变性60秒钟及在72℃温度中变性30秒钟的方式反复实施了50次。信号的检测是在捕捉和模板化寡核苷酸-杂交寡核苷酸杂交物预计维持双链形态的各循环的杂交步骤(55℃)中实施的。并且，在各循环的变性步骤(95℃)中测定了信号。
包括在指定温度下的实时检测的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验利用基于捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交来形成的双链的信号与基于捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交的抑制来存在的单链杂交寡核苷酸的信号不同的事实。
本实施例中，杂交寡核苷酸具有相互作用性双重标记。在杂交寡核苷酸为单链的状态下，杂交寡核苷酸的报道分子及猝灭分子在结构上相互接近，使得猝灭分子猝灭报道分子的信号。在不存在靶核酸序列且形成捕捉和模板化寡核苷酸/杂交寡核苷酸杂交物的情况下，杂交寡核苷酸上的报道分子及猝灭分子在结构上相互隔开，使得猝灭粉子对报道分子的信号实施未猝灭。
在存在靶核酸序列的情况下，延伸二聚物的靶-依赖性的形成会抑制捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交，由此可使杂交寡核苷酸变为单链状态，并猝灭报道分子的信号。因此，单链状态的杂交寡核苷酸的数量随着延伸二聚物的数量增加而增加，结果，最终检测的信号的强度表现出减少的模式。
另一方面，在存在靶核酸序列的情况下，与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的杂交寡核苷酸可在探测和标记寡核苷酸片段的延伸期间被切割。上述切割生成永久隔开的报道分子及猝灭分子来对报道分子的信号完全实施未淬灭。基于杂交寡核苷酸的切割的未猝灭程度大于基于捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交的未猝灭程度。因此，在检测出通过杂交寡核苷酸的切割来提供的信号的情况下，信号强度呈现出随着切割的杂交寡核苷酸的数量来增加的模式。可在多种温度下检测通过杂交寡核苷酸的切割来提供的信号。可去除在高温下检测的杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交所提供的信号。
本实施例中，在同时发生抑制杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交及杂交寡核苷酸的切割的期间内，可提供符合更为优势的状况的信号模式。
如图20A所示，在杂交步骤(55℃)中测定的荧光信号的强度呈现出在存在靶的情况下下减少的模式。当不存在靶时，未检测出信号。这种结果表示探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验可以通过实时检测方法来检测靶核酸序列，并且完整的杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸的杂交的抑制可通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测靶序列的存在。
并且，为了在反应期间内观察一部分杂交寡核苷酸的存在，在上述反应期间内的各循环的变性步骤(95℃)中实施信号的检测。如图20B所示，在存在靶的情况下，荧光信号的强度增加。在不存在靶的情况下，未检测出任何信号。这种结果可表示一部分杂交寡核苷酸可以在反应期间内被切割。
【2-2.解链分析】
在进行实施例2-1的反应之后，解链曲线使反应混合物冷却至40℃，并在40℃中维持10分钟之后，从40℃慢慢加热至85℃，从而获得解链曲线。在温度上升的期间内，通过连续测定荧光来监测捕捉和模板化寡核苷酸-杂交寡核苷酸杂交物的解离。解链峰来源于解链曲线数据。
如图20C所示，当不存在靶时，在与捕捉和模板化寡核苷酸-杂交寡核苷酸杂交物的Tm值相对应的59℃温度中检测解链峰。当存在靶时，未检测出任何信号。这种结果表示探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验可以通过解链分析方式来检测靶核酸序列。
【实施例3.为了靶核酸序列的检测而使用竞争性杂交寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的评价】
并且，本发明人对探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验(i)是否可以在指定温度下实时检测或(ii)是否可以通过解链分析方式来在没有杂交寡核苷酸的切割所提供的信号的情况下，从捕捉和模板化寡核苷酸和完整的杂交寡核苷酸的杂交抑制中提供的信号来检测靶核酸序列。为了探测和标记寡核苷酸片段延伸期间内排除杂交寡核苷酸的切割的效果，竞争性杂交寡核苷酸被设计成在与捕捉和模板化寡核苷酸的杂交方面，与探测和标记寡核苷酸片段竞争。在实施例中，竞争性杂交寡核苷酸包含探测和标记寡核苷酸片段序列及其3’-末端的一部分的与捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的追加序列。
为了上游引物及下游引物的延伸、探测和标记寡核苷酸的切割及探测和标记寡核苷酸片段的延伸而使用具有5’核酸酶活性的TaqDNA聚合酶。
探测和标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸不具有标记。探测和标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的3’-末端被碳隔片阻断。使用淋病奈瑟菌基因的基因组DNA作为靶。竞争性杂交寡核苷酸的5’-末端具有荧光报道分子(Cal Fluor Red 610)，竞争性杂交寡核苷酸的3’-末端具有猝灭分子(BHQ-2)。
在本实施例中所使用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸，捕捉和模板化寡核苷酸及稳定的杂交寡核苷酸的序列如下：
NG-F-25’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’(SEQ ID NO:7)
NG-R-25’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’(SEQ ID NO:8)
NG-PTO
5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[SpacerC3]-3’(SEQ ID NO:6)
NG-CTO-1
5’-CATATCGTCCAGGGTATCCAGCGCTCAGCCAAGCCGTCGT[Spacer C3]-3’(SEQ ID NO:2)
NG-HO-25’-[Cal Fluor Red610]ACGACGGCTTGGCTGAGCGC[BHQ-2]-3’(SEQ ID NO:9)
(下划线文字部分表示探测和标记寡核苷酸5’-标记的部位)
【3-1.指定温度下的实时检测】
利用含有淋病奈瑟菌的染色体组DNA100pg、上游引物(SEQ IDNO：7)10pmole、下游引物(SEQ ID NO：8)10pmole、探测和标记寡核苷酸(SEQ ID NO：6)5pmole、捕捉和模板化寡核苷酸(SEQID NO：2)0.5pmole、竞争性杂交寡核苷酸(SEQ ID NO：9)1pmole及2X主混合液[2.5mM的MgCl2、200μm的dNTPs及1.6units的H-Taq DNA聚合酶(韩国索尔杰恩特公司)]10μl量的20μl的最终体积来实施反应，使含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪，并使上述反应混合物在95℃温度中变性15分钟，并以在95℃温度中反应30秒钟、在60℃温度中变性60秒钟及在72℃温度中变性30秒钟的方式反复实施了50次。信号的检测是在捕捉和模板化寡核苷酸-杂交寡核苷酸杂交物预计维持双链形态的各循环的杂交步骤(60℃)中实施的。并且，在各循环的变性步骤(95℃)中测定了信号。
如图21A所示，获得了在存在靶时，在杂交步骤(60℃)中测定的荧光信号的强度减少的模式。当不存在靶时，未检测出信号。
这种结果表示探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验可在没有杂交寡核苷酸的切割的情况下，利用完整的杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸的杂交的抑制，由此可检测靶核酸序列。
并且，为了在反应期间内观察一部分杂交寡核苷酸的切割，在上述反应期间内的各循环的变性步骤(95℃)中实施信号的检测。如图21B所示，不仅是在不存在靶的情况下，而且在存在靶的情况下下，也未检测出任何信号。这种结果表示杂交寡核苷酸在反应期间内不会被切割。
【3-2.解链分析】
在进行实施例4-1的反应之后，解链曲线使反应混合物冷却至55℃，并在55℃中维持30分钟之后，从55℃慢慢加热至85℃，从而获得解链曲线。在温度上升的期间内，通过连续测定荧光来监测捕捉和模板化寡核苷酸-杂交寡核苷酸杂交物的解离。解链峰来源于解链曲线数据。
如图21C所示，在与捕捉和模板化寡核苷酸-杂交寡核苷酸杂交物的预计的Tm值相对应的70℃温度中，在不存在靶的情况下检测出解链峰。在存在靶的情况下，也未检测出任何信号。
这种结果表示包括解链分析的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交在没有杂交寡核苷酸切割的情况下，在捕捉和模板化寡核苷酸使用完整的杂交寡核苷酸的杂交的抑制来检测核酸序列。
【实施例4：使用固定于单一标记的捕捉和模板化寡核苷酸及微型陈列的杂交寡核苷酸序的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的评价】
并且，本发明人对使用固定于单一标记的捕捉和模板化寡核苷酸及微陈列的杂交寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验进行了实验。在微陈列中同时实施了探测和标记寡核苷酸的切割、探测和标记寡核苷酸片段的延伸及固定化的杂交寡核苷酸与捕捉和模板化寡核苷酸杂交。在进行反应之后，分析了捕捉和模板化寡核苷酸-杂交寡核苷酸二聚物的存在或不存在。在杂交寡核苷酸的存在下，若探测和标记寡核苷酸片段延伸，则可通过(i)杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交抑制和/或(ii)在探测和标记寡核苷酸片段延伸的期间内的杂交寡核苷酸的切割来防止在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物。
具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶用于上游引物及下游引物的延伸、探测和标记寡核苷酸片段的切割及延伸。探测和标记寡核苷酸的3’-末端被碳隔片阻断。捕捉和模板化寡核苷酸在3’-末端具有报道分子(Quasar670)。杂交寡核苷酸作为连接臂(linker arm)，具有poly(T)10，且利用其3’-末端的氨基组(AminnoC7)来固定于载玻片的表面。5’-末端具有荧光报道分子(Quasar670)的标记探针使用3’-末端的氨基组来固定于载玻片的表面。
在本实施例中所使用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸、杂交寡核苷酸及标记的序列如下：
NG-F-25’-TACGCCTGCTACTTTCACGCT-3’(SEQ ID NO:7)
NG-R-25’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’(SEQ ID NO:8)
NG-PTO
5’-ACGACGGCTTGGCTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’(SEQ ID NO:6)
NG-COT-2
5’-CATATCGTCCAGGGTATCCAGCGCTCAGCCAAGCCGTCGT[Quasar670]-3’(SEQ ID NO:10)
NG-HO-3
5’-GCGCTGGATACCCTGGACGATATGTTTTTTTTTT[AminoC7]-3’(SEQ ID NO:11)
Marker 5’-[Quasar670]ATATATATAT[AminoC7]-3’(SEQ IDNO:12)
(下划线文字部分表示探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位)
将NSB9NHS载玻片(韩国NSB浦项科技有限公司(NSBPOSTECH，Korea))利用于捕捉和模板化寡核苷酸及标记(SEQ ID NO：11及12)的制备。利用PersonalArrayerTM16微阵列测定点位器(Microarray Spotter，中国博奥生物(CapitalBio，China))来将用NSB测定点位缓冲液(NSB spotting buffer)来溶解成最终浓度为50μm的杂交寡核苷酸及标记印刷在NSB9NHS载玻片。使杂交寡核苷酸及标记以2×1格式(双重点(duplicate spots))并排测定点位(spotting)，并将由此制备的微阵列放在湿度约为85％的腔室培养了一宿。为了去除以非-特异性结合的捕捉和模板化寡核苷酸及标记，用含有2×SSPE(0.3M的氯化钠(sodium chloride)、0.02M的碳酸氢二钠(sodium hydrogen phosphate)及2.0mM的乙二胺四乙酸(EDTA，Ethylenediaminetetraacetic acid))、pH 7.4及7.0mM的十二烷基硫酸钠(SDS，Sodium dodecyl sulfate)的缓冲液溶液，在37℃清洗上述载玻片30分钟，并用蒸馏水进行清洗。之后，利用载玻片离心分离器来将上述DNA-功能化的(DNA-functionalized)载玻片进行干燥，并保管在4℃温度的暗室内以备后用。
利用含有淋病奈瑟菌基因的染色体组DNA100pg、上游引物(SEQID NO：7)10pmole、下游引物(SEQ ID NO：8)10pmole、探测和标记寡核苷酸(SEQ ID NO：6)5pmole、捕捉和模板化寡核苷酸(SEQID NO：2)0.5pmole及2X主混合液[2.5mM的MgCl2、200μm的dNTPs及1.6units的H-Taq DNA聚合酶(韩国索尔杰恩特公司)]15μl量的30μl的最终体积来实施探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交反应，将上述整个混合物适用于组装在交联(cross-linked)了杂交寡核苷酸(SEQ ID NO：11)的NSB载玻片的表面的腔室。使上述载玻片以原位(in situ)块方式位于热循环仪(中国基因宝(GeneproB4I，China))，并以如下方式实施了上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交反应，在95℃温度中变性15分钟，并以在95℃温度中变性30秒钟、在60℃温度中变性60秒钟及在72℃温度中变性30秒钟的方式反复实施40次，并在55℃中杂交5分钟。
在进行反应之后，利用共聚焦激光扫描仪Axon GenePix4100A(美国分子器件(molecular Device，US))，以5-μm像素分辨率的扫描来获得图像。利用定量的微阵列分析软件、GenePix pro7.0软件(美国分子器件(molecular Device，US))来分析了荧光强度。在去除周边本底后用点-中央值(spot-medians)来表示荧光强度。为了调查再现性，每按两个，对各点进行测定点位。用反复的点的平均值来表示了荧光强度。
如图22所示，与不存在靶的情况相比，在存在靶时，荧光强度明显减少。这种结果表示使用固定于单一标记的捕捉和模板化寡核苷酸及微型陈列的杂交寡核苷酸序的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验可以检测靶核酸序列。
【实施例5：以没有杂交寡核苷酸的切割的方式使用单一标记的捕捉和模板化寡核苷酸及固定于微型陈列的杂交寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验的评价】
并且，本发明人对使用单一标记的捕捉和模板化寡核苷酸及固定于微型陈列的杂交寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验进行了实验。在一个容器中实施探测和标记寡核苷酸的切割及探测和标记寡核苷酸片段的延伸，并使产物向固定有杂交寡核苷酸的微陈列移动。这可以排除交寡核苷酸在探测和标记寡核苷酸片段延伸的期间内被切割。在杂交反应之后，分析捕捉和模板化寡核苷酸-杂交寡核苷酸二聚物的存在或不存在。
使用与上述实施例4相同的Taq DNA聚合酶、探测和标记寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸、杂交寡核苷酸及标记。
以在实施例4中利用的方案相同的方案制备了载玻片。
利用含有淋病奈瑟菌的染色体组DNA100pg、上游引物(SEQ IDNO：7)10pmole、下游引物(SEQ ID NO：8)10pmole、探测和标记寡核苷酸(SEQ ID NO：6)5pmole、捕捉和模板化寡核苷酸(SEQID NO：2)0.5pmole及2X主混合液[2.5mM的MgCl2、200μm的dNTPs及1.6units的H-Taq DNA聚合酶(韩国索尔杰恩特公司)]15μl量的30μl的最终体积来实施探测和标记寡核苷酸的切割及探测和标记寡核苷酸片段的延伸，使含有实施反应混合物的管位于实时热循环仪(CFX96，Bio-Rad)，使上述反应混合物在95℃温度中变性15分钟，并以在95℃温度中变性30秒钟、在60℃温度中变性60秒钟及在72℃温度中变性30秒钟的方式反复实施了40次。
将作为上述产物的混合物适用于组装在交联了杂交寡核苷酸(SEQ ID NO：11)的NSB载玻片的表面的腔室。使上述载玻片以原位(in situ)块方式位于热循环仪(中国基因宝)。在55℃温度中实施30分钟的杂交反应。最终，用蒸馏水对载玻片实施1分钟的清洗。利用共聚焦激光扫描仪Axon GenePix4300A(美国分子器件)，以5-μm像素分辨率的扫描来获得图像。利用定量的微阵列分析软件、GenePixpro7.0软件(美国分子器件(molecular Device，US))来分析了荧光强度。在去除周边本底后用点-中央值(spot-medians)来表示荧光强度。为了调查再现性，每按两个，对各点进行测定点位。用反复的点的平均值来表示了荧光强度。
如图23所示，与不存在靶的情况相比，在存在靶时，荧光强度明显减少。这种结果表示使用单一标记的捕捉和模板化寡核苷酸及固定于微型陈列的杂交寡核苷酸的探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验可以在没有杂交寡核苷酸切割步骤的情况下检测靶核酸序列。
以上，详细记述了本发明的优选的实例，可以进行根据本发明的原理的变形及修改，且本发明的范围根据所附的发明要求保护范围及与其等同的技术方案来定义，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

Claims (36)

1.一种通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸进行杂交，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交，上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游；
步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸的条件下，使上述步骤(a)的产物与具有5’核酸酶活性的酶相接触，上述上游寡核苷酸或其延伸链基于具有上述5’核酸酶活性的酶来诱导上述探测和标记寡核苷酸的切割，由此上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交，上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用上述步骤(c)的产物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段延伸并生成与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸链，并形成延伸二聚物，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物；
步骤(e)，在存在包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸的情况下，在规定温度范围内，对上述步骤(d)的产物实施解链分析或杂交分析，上述靶核酸序列不存在于上述核酸试样内的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此提供表示上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在的信号，在上述靶核酸序列存在于上述核酸试样内的情况下，形成上述延伸二聚物来防止在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物，由此，不提供上述信号，上述信号通过(i)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记、(ii)与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记、(iii)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记及与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入标记来提供；以及
步骤(f)，检测用于表示在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间存在杂交物的信号，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在表示上述靶核酸序列的不存在，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的不存在表示上述靶核酸序列的存在。
2.根据权利要求1所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，在杂交寡核苷酸存在的条件下实施上述步骤(d)，(i)与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段在与上述杂交寡核苷酸进行杂交之前延伸和/或(ii)在上述片段延伸之前，上述杂交寡核苷酸与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的情况下，上述片段的延伸使上述杂交寡核苷酸从上述捕捉和模板化寡核苷酸切割或分离，对此，上述延伸二聚物的形成因基于上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交的抑制和/或基于切割的杂交寡核苷酸的消耗而防止在上述步骤(e)中形成上述杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物。
3.根据权利要求1所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述杂交寡核苷酸或上述捕捉和模板化寡核苷酸具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记，上述相互作用性双重标记位于在形成有上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号和在不形成上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号互不相同的位置。
4.根据权利要求1所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述杂交寡核苷酸具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记中的一个，上述捕捉和模板化寡核苷酸具有上述相互作用性双重标记中的剩余一个，上述相互作用性双重标记位于在形成有上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号和在不形成上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号互不相同的位置。
5.根据权利要求1所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法还使用一个包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸来实施，上述两个杂交寡核苷酸与上述捕捉和模板化寡核苷酸相接近来进行杂交，上述两个杂交寡核苷酸中的一个具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记中的一个，两个杂交寡核苷酸中的剩余一个具有相互作用性双重标记中的剩余一个，上述相互作用性双重标记位于在形成有上述捕捉和模板化寡核苷酸和两个杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号和在不形成上述捕捉和模板化寡核苷酸和两个杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号互不相同的位置。
6.根据权利要求1所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述杂交寡核苷酸或上述捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记，上述单一标记位于在形成有上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述单一标记的信号和在不形成上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述单一标记的信号互不相同的位置。
7.根据权利要求1所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸中的一个固定于固相底物上或在上述步骤(f)中检测信号之前固定于固相底物上，从上述固相底物上检测出上述信号。
8.一种通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来在固相中检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸进行杂交，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交，上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游；
步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸的条件下，使上述步骤(a)的产物与具有5’核酸酶活性的酶相接触，上述上游寡核苷酸或其延伸链基于具有上述5’核酸酶活性的酶来诱导上述探测和标记寡核苷酸的切割，由此上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交，上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用上述步骤(c)的产物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段延伸并生成与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸链，并形成延伸二聚物，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物；
步骤(e)，在适合进行上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交的条件下，使包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸与上述步骤(d)的产物杂交，上述捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸中的一个被标记为单一标记，未被标记的剩余一个固定于固相底物上或在上述步骤(f)中检测信号之前固定于固相底物上，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此在固相底物上提供上述单一标记中的信号，在上述核酸试样内存在上述靶核酸序列的情况下，形成上述延伸二聚物来防止在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物，由此不在固相底物上提供上述单一标记的信号；以及
步骤(f)，检测上述固相底物上的上述信号，在上述固相底物上检测上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在表示上述靶核酸序列的不存在，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的不存在表示上述靶核酸序列的存在。
9.根据权利要求8所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来在固相中检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，在杂交寡核苷酸的存在下实施上述步骤(d)，上述(i)与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段在与上述杂交寡核苷酸进行杂交之前延伸和/或(ii)在上述片段延伸之前，上述杂交寡核苷酸与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的情况下，上述片段的延伸使上述杂交寡核苷酸从上述捕捉和模板化寡核苷酸切割或分离，对此，上述延伸二聚物的形成因基于上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交的抑制和/或切割的杂交寡核苷酸的消耗而防止在上述步骤(e)中形成上述杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物。
10.根据权利要求8所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来在固相中检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，(i)上述捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记，且上述杂交寡核苷酸固定于上述固相底物上或在上述步骤(f)中检测信号之前固定于上述固相底物上，或者(ii)上述杂交寡核苷酸具有单一标记，且上述捕捉和模板化寡核苷酸固定于固相底物上或在上述步骤(f)中检测信号之前固定于固相底物上。
11.一种通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来在固相中检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游寡核苷酸及探测和标记寡核苷酸进行杂交，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交，上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游；
步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸的条件下，使上述步骤(a)的产物与具有5’核酸酶活性的酶相接触，上述上游寡核苷酸或其延伸链基于具有上述5’核酸酶活性的酶来诱导上述探测和标记寡核苷酸的切割，由此上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交，上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用上述步骤(c)的产物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段延伸并生成与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸链，并形成延伸二聚物，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物；
步骤(e)，在适合进行上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交的条件下，使包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸与上述步骤(d)的产物杂交，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此提供表示上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在的第一信号，在上述核酸试样内存在上述靶核酸序列的情况下，上述延伸二聚物抑制上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸的杂交，由此提供表示不与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的杂交寡核苷酸的存在的第二信号，上述信号通过(i)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记、(ii)与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记、(iii)与上述杂交寡核苷酸相连接的标记及与上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入标记来提供；以及
步骤(f)，在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物在维持双链形态的指定温度下检测上述第一信号或上述第二信号，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在表示上述靶核酸序列的不存在，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的不存在表示上述靶核酸序列的存在，上述第一信号和第二信号的差异能够决定上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的存在或不存在，从而表示上述核酸试样内的上述靶核酸序列的存在或不存在。
12.根据权利要求11所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来在固相中检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，在杂交寡核苷酸存在的条件下实施上述步骤(d)，(i)与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段在与上述杂交寡核苷酸进行杂交之前延伸和/或(ii)在上述片段延伸之前，上述杂交寡核苷酸与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的情况下，上述片段的延伸使上述杂交寡核苷酸从上述捕捉和模板化寡核苷酸切割或分离。
13.根据权利要求11所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来在固相中检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述杂交寡核苷酸或上述捕捉和模板化寡核苷酸具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记，上述相互作用性双重标记位于上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸通过杂交来形成杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号和上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸相互分离的情况下的上述相互作用性双重标记的信号互不相同的位置。
14.根据权利要求11所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来在固相中检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述杂交寡核苷酸具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记中的一个，捕捉和模板化寡核苷酸具有相互作用性双重标记中的剩余一个，上述相互作用性双重标记位于在形成有上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号和在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸相互分离的情况下的上述相互作用性双重标记的信号互不相同的位置。
15.根据权利要求11所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来在固相中检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法还使用一个包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸来实施，上述两个杂交寡核苷酸与上述捕捉和模板化寡核苷酸相接近来进行杂交，上述两个杂交寡核苷酸中的一个具有包含报道分子及猝灭分子的相互作用性双重标记中的一个，两个杂交寡核苷酸中的剩余一个具有相互作用性双重标记中的剩余一个，上述相互作用性双重标记位于在形成有上述捕捉和模板化寡核苷酸和两个杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号和在不形成上述捕捉和模板化寡核苷酸和两个杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述相互作用性双重标记的信号互不相同的位置。
16.根据权利要求11所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来在固相中检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述杂交寡核苷酸或上述捕捉和模板化寡核苷酸具有单一标记，上述单一标记位于在形成有上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间的杂交物的情况下的上述单一标记的信号和在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸相互分离的情况下的上述单一标记的信号互不相同的位置。
17.根据权利要求11所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来在固相中检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述捕捉和模板化寡核苷酸及杂交寡核苷酸中的一个固定于固相底物上或在上述步骤(f)中检测信号之前固定于固相底物上，从上述固相底物上检测出上述信号。
18.根据权利要求1、8及11中任一项所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述杂交寡核苷酸与上述捕捉和模板化寡核苷酸杂交的过程中包含与上述片段竞争的核苷酸序列。
19.根据权利要求18所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述杂交寡核苷酸不会被上述片段或其延伸产物切割。
20.根据权利要求1、8及11中任一项所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，在一个反应容器或额外的反应容器中实施上述步骤(a)～步骤(f)。
21.根据权利要求1、8及11中任一项所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述探测和标记寡核苷酸、上述捕捉和模板化寡核苷酸和/或上述杂交寡核苷酸以防止延伸的方式在其3’-末端被阻断。
22.根据权利要求1、8及11中任一项所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述上游寡核苷酸为上游引物或上游探针。
23.根据权利要求1、8及11中任一项所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述上游寡核苷酸以诱导基于具有上述5’核酸酶活性的酶的上述探测和标记寡核苷酸的切割的程度接近于上述探测和标记寡核苷酸的位置。
24.根据权利要求23所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述上游引物通过其延伸链来诱导基于具有上述5’核酸酶活性的酶的上述探测和标记寡核苷酸的切割。
25.根据权利要求1、8及11中任一项所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位的5’末端一部分互补且与上述探测和标记寡核苷酸的3’-靶向部位的5’-末端一部分互补的核苷酸序列。
26.根据权利要求1、8及11中任一项所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法使用没有靶核酸序列或包含指定含量的靶核酸序列的对照组。
27.根据权利要求1、8及11中任一项所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法以变性的方式包括上述步骤(a)～步骤(f)全部或一部分步骤并反复实施。
28.根据权利要求1、8及11中任一项所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法为用于检测至少2种靶核酸序列的方法，上述上游寡核苷酸包含至少2种上游寡核苷酸，上述探测和标记寡核苷酸包含至少2种探测和标记寡核苷酸，上述捕捉和模板化寡核苷酸包含至少2种捕捉和模板化寡核苷酸，上述杂交寡核苷酸包含至少2种杂交寡核苷酸。
29.根据权利要求1、8及11中任一项所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述上游寡核苷酸为上游引物，上述步骤(b)中具有5’核酸酶活性的酶为用于延伸上述上游引物的模板-依赖性核酸聚合酶。
30.根据权利要求1、8及11中任一项所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，具有上述5’核酸酶活性的酶为具有5’核酸酶活性的聚合酶或瓣状内切核酸酶。
31.根据权利要求1、8及11中任一项所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述靶核酸序列包含核苷酸变异。
32.根据权利要求1、8及11中任一项所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法在存在下游引物的情况下实施。
33.根据权利要求1、8及11中任一项所述的通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法，其特征在于，上述通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的方法不使用上述上游寡核苷酸来实施，在上述步骤(b)中，在没有上述上游寡核苷酸或其延伸链的帮助下发生上述探测和标记寡核苷酸的切割。
34.一种通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，包含：
(a)，上游寡核苷酸，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；
(b)，探测和标记寡核苷酸，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交，上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游，上述上游寡核苷酸或其延伸链通过具有上述5’核酸酶活性的酶来诱导上述探测和标记寡核苷酸的切割，这种上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
(c)，捕捉和模板化寡核苷酸，上述捕捉和模板化寡核苷酸向3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的片段通过延伸来生成与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸链，并形成延伸二聚物，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物；以及
(d)，包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此提供表示上述杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的存在的信号，在上述核酸试样内存在上述靶核酸序列的情况下，形成上述延伸二聚物来防止在捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物，由此，不提供信号，上述试剂盒还包含(i)与杂交寡核苷酸相连接的标记、(ii)与捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记、(iii)与杂交寡核苷酸相连接的标记及与捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入标记。
35.一种通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来在固相中检测核酸试样内的靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，包含：
(a)，上游寡核苷酸，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；
(b)，探测和标记寡核苷酸，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交，上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游，上述上游寡核苷酸或其延伸链通过具有上述5’核酸酶活性的酶来诱导上述探测和标记寡核苷酸的切割，这种上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
(c)，捕捉和模板化寡核苷酸，上述捕捉和模板化寡核苷酸向3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的片段通过延伸来生成与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸链，并形成延伸二聚物，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物；以及
(d)，包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸，上述捕捉和模板化寡核苷酸及上述杂交寡核苷酸中的一个被标记为单一标记，未标记的剩余一个固定于上述固相底物上或从上述单一标记检测信号之前固定于固相底物，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此在固相底物上提供上述单一标记的信号，在上述核酸试样内存在上述靶核酸序列的情况下，形成上述延伸二聚物来防止在上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸之间形成杂交物，由此，在上述固相底物上不提供上述单一标记的信号。
36.一种通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非-杂交试验来检测核酸试样内的靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，包含：
(a)，上游寡核苷酸，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；
(b)，探测和标记寡核苷酸，上述探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，以及(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交，上述上游寡核苷酸位于上述探测和标记寡核苷酸的上游，上述上游寡核苷酸或其延伸链通过具有上述5’核酸酶活性的酶来诱导上述探测和标记寡核苷酸的切割，这种上述切割放出包含上述探测和标记寡核苷酸5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；
(c)，捕捉和模板化寡核苷酸，上述捕捉和模板化寡核苷酸向3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列，从上述探测和标记寡核苷酸放出的上述片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的上述片段通过延伸来生成与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸链，并形成延伸二聚物，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物；以及
(d)，包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的杂交寡核苷酸，在上述核酸试样内不存在上述靶核酸序列的情况下，不形成上述延伸二聚物，上述捕捉和模板化寡核苷酸和杂交寡核苷酸形成杂交物，由此提供表示上述杂交寡核苷酸和捕捉和模板化寡核苷酸之间的杂交物的存在的第一信号，在上述核酸试样内存在上述靶核酸序列的情况下，上述延伸二聚物抑制上述捕捉和模板化寡核苷酸和上述杂交寡核苷酸的杂交，由此提供表示与上述步骤和模板化寡核苷酸非杂交的杂交寡核苷酸的存在的第二信号，上述试剂盒还包含(i)与杂交寡核苷酸相连接的标记、(ii)与捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记、(iii)与杂交寡核苷酸相连接的标记及与捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标记或(iv)嵌入标记。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108300772A (zh) * 2017-07-18 2018-07-20 江西贤聚景欣医药生物科技有限公司 用于靶核酸序列检测的多重淬灭荧光探针及方法

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102218776B1 (ko) 2016-06-10 2021-02-22 주식회사 씨젠 태깅 올리고뉴클레오타이드의 제공 방법
EP3479101B1 (en) 2016-06-30 2023-12-13 Seegene, Inc. Apparatus and method for amplificating nucleic acid
JP7299154B2 (ja) * 2016-12-23 2023-06-27 ハーン － シッカート － ゲゼルシャフト フュア アンゲバンテ フォルシュング エー．ファウ． ２パートメディエータプローブ
CN110168103B (zh) 2016-12-29 2023-09-08 Seegene株式会社 降低引物二聚体形成且提高扩增效率的方法
CN108823287B (zh) 2017-04-28 2019-04-12 厦门大学 一种检测靶核酸序列的方法
US11591645B2 (en) 2017-08-31 2023-02-28 Seegene, Inc. Evaluation of performance of components using a pair of dimer-forming primers
US11401546B2 (en) 2017-09-29 2022-08-02 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences by PTO cleavage and extension-dependent extension assay
WO2019135567A1 (en) 2018-01-05 2019-07-11 Seegene, Inc. . Method for determining the presence or absence of m. tuberculosis, m. bovis and m. bovis bcg in a sample
US20220298555A1 (en) * 2018-12-20 2022-09-22 Roche Molecular Systems, Inc. Detection of target nucleic acid by solid-phase molography
EP4403645A1 (en) 2021-09-17 2024-07-24 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence by using synthetic non-natural base-bearing tag oligonucleotide
EP4265734A1 (de) * 2022-04-22 2023-10-25 Hahn-Schickard-Gesellschaft für angewandte Forschung e.V. Nukleinsäurenachweis in einer pcr mittels eines zielsequenz-unspezifischem modularer reporterkomplexes
WO2023203230A1 (de) * 2022-04-22 2023-10-26 Hahn-Schickard-Gesellschaft Für Angewandte Forschung E. V. Nukleinsäurenachweis in einer pcr mittels eines zielsequenz-unspezifischem modularer reporterkomplexes
EP4372100A1 (en) * 2022-11-15 2024-05-22 Stilla Technologies Data analysis method for multiplex digital pcr using color-combination

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5994069A (en) 1996-01-24 1999-11-30 Third Wave Technologies, Inc. Detection of nucleic acids by multiple sequential invasive cleavages
US5541311A (en) 1992-12-07 1996-07-30 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid encoding synthesis-deficient thermostable DNA polymerase
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
US6893819B1 (en) 2000-11-21 2005-05-17 Stratagene California Methods for detection of a nucleic acid by sequential amplification
US7381532B2 (en) 1999-10-29 2008-06-03 Stratagene California Compositions and methods for the detection of a nucleic acid using a cleavage reaction
US7601497B2 (en) * 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
US7309573B2 (en) 2000-11-21 2007-12-18 Stratagene California Methods for detection of a nucleic acid by sequential amplification
KR20020063359A (ko) * 2001-01-27 2002-08-03 일렉트론 바이오 (주) 핵산 및 올리거뉴클레오티드의 상보적 이중결합의 특정서열에 특이적으로 반응하는 절단기법을 이용한 핵산 혼성분석 방법 및 장치
GB0205455D0 (en) * 2002-03-07 2002-04-24 Molecular Sensing Plc Nucleic acid probes, their synthesis and use
WO2005051967A2 (en) 2003-11-19 2005-06-09 Allelogic Biosciences Corp. Oligonucleotides labeled with a plurality of fluorophores
EP2046989B1 (en) * 2006-07-17 2013-03-20 Brandeis University Specialized oligonucleotides and their use in nucleic acid amplification and detection
US20090023151A1 (en) 2006-08-30 2009-01-22 Dawson Elliott P Method For The Labeling And Detection Of Small Polynucleotides
EP2118310B1 (en) 2006-12-29 2013-03-06 Applied Biosystems, LLC Systems and methods for detecting nucleic acids
MX340258B (es) 2011-01-11 2016-07-01 Seegene Inc Detección de secuencias de ácido nucleico objetivo mediante ensayo de escisión y extensión del pto.
KR101569479B1 (ko) * 2011-03-29 2015-11-16 주식회사 씨젠 Ｐｔｏ 절단 및 연장-의존적 절단에 의한 타겟 핵산서열의 검출
MX342067B (es) * 2011-05-04 2016-09-09 Seegene Inc Detección de secuencias de ácido nucleico objetivo por desdoblamiento e hibridización de oligonucleótido de sonda.

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108300772A (zh) * 2017-07-18 2018-07-20 江西贤聚景欣医药生物科技有限公司 用于靶核酸序列检测的多重淬灭荧光探针及方法

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