CN103534358B - 基于pto切割以及延伸-依赖性切割的靶核酸序列的检测 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于PTO切割以及延伸-依赖性切割（PTO？Cleavage？and？Extension-Dependent？Cleavage：PCEC）试验的靶核酸序列的检测。本发明的特征在于，在随着靶核酸序列的存在与否而形成的延伸二聚物上，生成被核酸切割酶切割的切割位点。本发明检测延伸二聚物是否发生切割，由此决定靶核酸序列存在与否。

Description

基于PTO切割以及延伸-依赖性切割的靶核酸序列的检测
技术领域
本发明涉及基于PTO切割及延伸-依赖性切割（PTO Cleavage andExtension-Dependent Cleavage：PCEC）试验的靶核酸序列的检测（Detection of Target Nucleic Acid Sequence by PTO Cleavage andExtension-Dependent Cleavage）。
背景技术
DNA杂交（hybridization）是分子生物学的基本的过程，受离子强度、碱基结构、核酸片段的长度、错配程度以及变性剂的存在的影响。基于DNA杂交的技术将成为决定特定核酸序列的非常有用的用具，将会明确有助于临床诊断、基因研究及法医学上的实验分析。
但是，在仅依赖杂交的以往的方法以及过程中，发生因探针和非-靶序列之间的非-特异性杂交引起的假阳性结果的可能性高。因此，以往的方法以及过程存在改善可靠度的问题。
除探针杂交过程以外还提出了利用酶反应的几种接近法，例如，TaqManTM探针方法。
在TaqManTM探针方法中，与靶核酸序列杂交的标记探针基于上游引物-依赖性DNA聚合酶的5’核酸酶活性被切割，来产生表示靶序列存在的信号（美国专利第5,210,015号、第5,538,848号以及第6,326,145号）。TaqManTM探针方法提出用于信号产生的两种接近法：聚合-依赖性切割（polymerization-dependent cleavage）以及聚合-独立性切割（poly merization-independent cleavage）。在聚合-依赖性切割中，上游引物的延伸必须在核酸聚合酶与标记探针的5’-末端接触之前发生。随着延伸反应的进行，聚合酶逐渐地切割标记探针的5’-末端。在聚合-独立切割中，上游引物以及标记探针非常邻近，由此与靶核酸序列进行杂交，上游引物的3’-末端和核酸聚合酶的结合使上述核酸聚合酶与标记探针的5’-末端接触来放出标记。并且，TaqManTM探针方法公开，通过在其5’-末端部位具有不与靶序列杂交的5’-尾巴区域的标记探针被切割来形成包含5’-尾巴区域的片段。
也有对具有对靶序列非-互补的5’-尾巴区域的探针被5’核酸酶切割，放出包含5’-尾巴区域的片段的几种方法的报告。
例如，美国专利第5,691,142号就公开了对基于DNA聚合酶的5’核酸酶活性来被切割的切割结构。公开中则例示有对包含对模板非-互补的5’部位以及对模板互补的3’部位的寡核苷酸与模板杂交，并且上游寡核苷酸与模板非常邻近而由此与模板进行杂交的切割结构。切割结构通过被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或者具有减少的合成活性的变形DNA聚合酶切割，来放出与模板非-互补的5’部位。之后，被放出的5’部位与具有发夹结构的寡核苷酸杂交，形成切割结构。由此，诱导渐进性的切割反应来检测靶序列。
美国专利第7,381,532号则公开了具有3’-末端被阻断的上游寡核苷酸的切割结构通过被具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或者FEN核酸酶切割，来放出非-互补的5’皮瓣（flap）部位，被放出的5’皮瓣部位基于大小分析或者相互作用性双重标记来被检测的过程。美国专利第6,893,819号则公开了能够检测的被放出的皮瓣基于核酸合成依赖性的、皮瓣-媒介连续性扩增方法而生成的内容。在此方法中，从第一个切割结构放出的皮瓣，以核酸合成依赖性方式切割第二个切割结构来放出皮瓣，并检测被放出的皮瓣。
美国申请公开号第2008-0241838号中公开了利用在靶核酸序列具有非-互补的5’部位的探针的切割以及捕捉（capture）探针的杂交的靶检测方法。标记位于非-互补的5’部位。杂交于靶序列的标记探针被切割而放出片段，之后，片段与捕捉探针杂交而检测靶序列的存在。在此方法中，未切割的/完好无损的（uncleaved/intact）探针不与捕捉探针杂交是必须的。为此，需要长度短的捕捉探针在固相基质上实现固定化。但是，这种限制会降低固相基质上的杂交效率，并且使反应条件的最优化变得困难。
因此，对开发以更加便利、具有可靠性以及再现性的方式，不仅基于杂交，还基于5’核酸切割反应（5’nucleolytic reaction）等的酶反应，在液相以及固相中检测靶序列，更为优选地检测多个靶序列的新颖的接近法的要求正在抬头。并且，在本行业正需求一种不受限于标记（尤其，荧光标记）种类的数量的新颖的靶检测方法。
在本说明书全文中参照多个专利及文献，其引用由括号来表示。这样的专利及文献的公开，作为参照全部包括在本说明书中，因此能够更加明确地说明本发明所属的技术领域的水准及本发明的内容。
发明内容
要解决的问题
本发明者为了开发具有更加得到改善的准确性以及方便性的，尤其以多重方式检测靶序列的新颖的接近法而锐意研究努力。其结果，本发明者定立了用于检测靶序列的新颖的方案，这种靶检测不仅通过探针杂交，还通过连续的切割反应，即PTO的5’核酸切割反应及延伸二聚物的核酸切割反应而达成）。本发明的方案不仅优秀地适用于固相反应，而且也能够优秀地适用于液相反应，具有更加得到改善的准确性以及方便性，能够检测多个靶序列。
因此，本发明的目的在于，提供利用PCEC（PTO Cleavage andExtension-Dependent Cleavage）试验，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法。
本发明的再一目的在于，提供用于利用PCEC（PTO Cleavage andExtension-Dependent Cleavage）试验，从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法的试剂盒。
本发明的另一目的及优点，通过所附的权利要求书及附图，以及下面的详细说明将变得更加明确。
附图说明
图1表示利用于PCEC（PTO Cleavage and Extension-DependentCleavage）试验的探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probing and TaggingOligonucleotide）以及捕捉和模板化寡核苷酸（CTO，Capturing andTemplating Oligonucleotide）的图示性结构。优选地，PTO以及CTO的3’-末端因被阻断，因而防止延伸。
图2表示利用被5’→3’外切核酸酶切割的切割位点的PCEC试验的实施例。CTO在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子。
图3表示利用被限制酶切割的切割位点的PCEC试验的实施例。CTO在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子。
图4表示利用被RNase H切割的切割位点的PCEC试验的实施例。CTO在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子。
图5表示利用被5’→3’外切核酸酶切割的切割位点的PCEC试验的实施例。CTO在其模板化部位具有荧光单一标记。CTO通过其3’-末端固定在固相基质上。
图6表示利用被限制酶切割的切割位点的PCEC试验的实施例。CTO在其捕捉部位具有荧光单一标记。CTO通过其5’-末端固定在固相基质上。
图7表示利用被RNase H切割的切割位点的PCEC试验的实施例。CTO在其捕捉部位具有荧光单一标记。CTO通过其5’-末端固定在固相基质上。
图8表示利用被限制酶切割的切割位点的PCEC试验的实施例。PTO在其标记部位具有荧光单一标记。CTO通过其5’-末端固定在固相基质上。
图9表示利用被RNase H切割的切割位点的PCEC试验的实施例。PTO在其标记部位具有荧光单一标记。CTO通过其5’-末端固定在固相基质上。
图10表示基于PCEC试验的淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）基因的实时检测结果。CTO在其模板化部位具有报道分子及猝灭分子。
具体实施方式
根据本发明的一实施方式，本发明提供一种基于PCEC（PTO切割及延伸-依赖性切割）试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：
步骤（a），将上述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及PTO进行杂交；上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述PTO包含：（i）3’-靶向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及（ii）5’-标记部位，其包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；上述上游寡核苷酸位于上述PTO的上游；
步骤（b），在用于切割上述PTO的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；上述上游寡核苷酸或者其延伸链诱导基于具有上述5’核酸酶活性的酶的上述PTO的切割，这种上述切割放出包含上述PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分的片段；
步骤（c），将从上述PTO放出的上述片段与CTO进行杂交；上述CTO沿着3’→5’方向包含：（i）捕捉部位，其包含与上述PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及（ii）模板化部位，其包含与上述PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述PTO放出的上述片段与上述CTO的捕捉部位杂交；
步骤（d），利用上述步骤（c）的结果物以及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应；杂交于上述CTO的捕捉部位的上述片段，通过被延伸来形成延伸二聚物，并生成被核酸切割酶切割的切割位点；
步骤（e），利用上述核酸切割酶来切割上述延伸二聚物，用于生成切割的片段；以及
步骤（f），检测上述延伸二聚物是否发生切割，上述延伸二聚物发生切割表示上述靶核酸序列存在。
本发明者为了开发具有更加得到改善的准确性以及方便性的，尤其以多重方式检测靶序列的新颖的接近法而锐意研究努力。其结果，本发明者定立了用于检测靶序列的新颖的方案，这种靶检测不仅通过探针杂交，还通过连续的切割反应，即PTO的5’核酸切割反应及延伸二聚物的核酸切割反应而达成）。本发明的方案不仅优秀地适用于固相反应，而且也能够优秀地适用于液相反应，具有更加得到改善的准确性以及方便性，能够检测多个靶序列。
本发明利用基于以下连续的核酸切割反应，即，基于5’核酸切割反应的探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probing and TaggingOligonucleotide）的第一次切割及基于核酸切割反应的延伸二聚物的第二次切割，生成靶信号。因此，本发明被命名为PCEC（PTO Cleavageand Extension-Dependent Cleavage）试验。
对本发明PCEC试验进行更详细的说明，如下。
步骤（a）：靶核酸序列和上游寡核苷酸及PTO的杂交
根据本发明，首先将靶核酸序列与上游寡核苷酸以及探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probing and Tagging Oligonucleotide）进行杂交。
在本说明书中使用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或者“靶序列”意味着所要检测的核酸序列，且，在杂交、退火或者扩增条件下与探针或者引物进行退火或者杂交。
在本说明书中使用的术语“探针（probe）”意味着与靶核酸序列实质上互补的部位或者包含这些部位的单-链核酸分子。
在本说明书中使用的术语“引物”意味着寡核苷酸，在诱导与核酸链（模板）互补的引物延伸产物的合成的条件，即，如核苷酸和DNA聚合酶等聚合剂的存在以及适合的温度与pH的条件下，可起到合成的起始点的作用。
优选地，探针以及引物为单-链脱氧核糖核苷酸分子。在本发明中利用的探针或者引物可包含天然（naturally occurring）脱氧单磷酸核苷（dNMP）（即，脱氧腺苷酸（dAMP）、dGMP（脱氧鸟苷酸）、dCMP（脱氧胞苷酸）及dTMP（脱氧胸苷酸））、变形的核苷酸或者非-天然核苷酸。并且，探针或者引物还可包含核糖核苷酸。
就引物而言，应充分长，以便能够在聚合剂的存在之下引发延伸产物的合成。引物的适合的长度取决于包括例如，温度、应用领域及引物的根源（source）的多个因素。在本说明书中使用的术语“退火”或“引发”意味着在模板核酸并置（apposition）寡脱氧核苷酸或者核酸，就上述并置而言，通过聚合酶对核苷酸进行聚合而在模板核酸或者其一部分形成互补的核酸分子。
在本说明书中使用的术语“杂交（hybridization）”意味着互补的单链核酸形成双链核酸。在两个核酸链之间的互补性完全匹配（perfectmatch）时发生杂交，或者即使存在一部分错配（mismatch）碱基也能发生杂交。杂交时所需的互补性的程度可随着杂交条件而不同，尤其是可通过温度来进行调节。
上游寡核苷酸以及PTO与靶核酸序列的杂交可在通常基于最佳化步骤而决定的合适的杂交条件下实施。温度、成分的浓度、杂交及清洗次数、缓冲液成分及它们的pH及离子强度等条件可根据包含寡核苷酸（上游寡核苷酸以及PTO）的长度及糖皮质激素（GC）含量以及靶核苷酸序列等的多种因子而变化。例如，在利用相对短的寡核苷酸的情况下，优选地，选择低的严格条件（stringent condition）。用于杂交的详细条件可以在Joseph Sambrook等，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor5，N.Y.（2001）；及M.L.M.Anderson，Nucleic Acid Hybridization，Springer-Verlag New York Inc.N.Y.（1999）确认。
术语“退火”和“杂交”没有区分，在本说明书中混用。
上游寡核苷酸以及PTO具有与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列。在本说明书中使用的术语“互补的”意味着在预定的退火条件或者严格条件下引物或者探针以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分地互补，并包括“实质上互补的（substantially complementary）”及“完全互补的（perfectly complementary）”，优选地意味着完全互补的意思。
PTO的5’-标记部位具有与靶核酸序列非-互补的核苷酸序列。捕捉和模板化寡核苷酸（CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide）的模板化部位具有与PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列。在本说明书中使用的术语“非-互补的”意味着在预定的退火条件或者严格条件下引物或者探针不以选择性地与靶核酸序列杂交的程度充分地非-互补，并包括“实质上非互补的（substantiallynon-complementary）”及“完全非-互补的（perfectlynon-complementary）”，优选地意味着完全非-互补的意思。
在本说明书中使用的术语“探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probingand Tagging Oligonucleotide）”意味着寡核苷酸，其包含：（i）3’-靶向部位，其起到探针的作用；以及（ii）5’-标记部位，其具有在与靶核酸序列杂交后被切割，进而从PTO放出，并与靶核酸序列非-互补的核苷酸序列。PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位必须以5’→3’顺序而置。在图1中图示PTO。
优选地，在3’-靶向部位与靶核酸序列杂交，5’-标记部位不与靶核酸序列杂交的严格条件下实施步骤（a）的杂交。
PTO不要求任何特定的长度。例如，PTO的长度可具有15-150核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸、20-150核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-60核苷酸、20-50核苷酸、30-150核苷酸、30-100核苷酸、30-80核苷酸、30-60核苷酸、30-50核苷酸、35-100核苷酸、35-80核苷酸、35-60核苷酸或者35-50核苷酸的长度。只要PTO的3’-靶向部位与靶核酸序列特异性地杂交，就可以具有任何长度。例如，PTO的3’-靶向部位可具有10-100核苷酸、10-80核苷酸、10-50核苷酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-50核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-50核苷酸、20-40核苷酸或者20-30核苷酸的长度。只要5’-标记部位与CTO的模板化部位特异性地杂交后被延伸，就可以具有任何长度。例如，PTO的5’-标记部位可具有5-50核苷酸、5-40核苷酸、5-30核苷酸、5-20核苷酸、10-50核苷酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、10-20核苷酸、15-50核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸或者15-20核苷酸的长度。
PTO的3’-末端还可具有3’-OH末端（terminal）。优选地，PTO的3’-末端被“阻断”，由此防止其延伸。
阻断可通过以往方法来达成。例如，阻断可通过在最后核苷酸的3’-羟基上追加如生物素、标记、磷酸盐基、烷基、非-核苷酸连接肽、硫代磷酸酯或者烷烃-二醇残基等的化学组成部分（moiety）来实施。择一性地，阻断可通过去除最后核苷酸的3’-羟基或者利用如双脱氧核苷酸这种没有3’-羟基的核苷酸来实施。
择一性地，可设计成使PTO具有发夹结构。
PTO的5’-标记部位以及靶核酸序列之间的非-杂交意味着在特定杂交条件下它们之间非-形成稳定的双-链。根据本发明的优选实施例，不参与与靶核酸序列的杂交的PTO的5’-标记部位形成单-链。
上游寡核苷酸位于PTO的上游。
并且，与靶核酸序列杂交的上游寡核苷酸或者其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的PTO的切割。
基于上游寡核苷酸的对PTO切割的诱导可通过两种方式来达成。（i）诱导上游寡核苷酸延伸-独立性切割；以及（ii）诱导上游寡核苷酸延伸-依赖性切割。
在上游寡核苷酸与PTO相邻近，进而能够充分诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的上述PTO的切割反应的情况下，与上游寡核苷酸结合的上述酶能够无需延伸反应而切割PTO。另一方面，在上游寡核苷酸与PTO隔开的情况下，具有聚合酶活性的酶（例如，模板-依赖性聚合酶）能够促进上游寡核苷酸（例如，上游引物）的延伸，与延伸产物结合的具有5’核酸酶活性的酶切割PTO。
因此，上游寡核苷酸能够以两种方式位于与PTO相对的位置。上游寡核苷酸可位于与PTO邻近的位置，由此以延伸-独立性方式能够充分诱导PTO的切割。择一性地，上游寡核苷酸可位于充分能够以延伸-依赖性方式诱导PTO切割的与PTO隔开的位置。
在本说明书中揭示方位（positions）或者位置（locations）而使用的术语“邻近的（adjacent）”意味着上游寡核苷酸紧位于与PTO的3’-靶向部位相近的位置形成缺口（nick）。并且，上述术语意味着上游寡核苷酸位于从PTO的3’-靶向部位隔开1-30核苷酸、1-20核苷酸或者1-15核苷酸的位置。
在本说明书中揭示方位或者位置而使用的术语“隔开（distant）”包含能够充分产生延伸反应的某种位置或者位点。
根据本发明的优选实施例，上游寡核苷酸可位于从PTO隔开的位置，由此以延伸-依赖性方式能够充分诱导PTO的切割。
根据本发明的优选实施例，上游寡核苷酸为上游引物或者上游探针。上游引物适合诱导延伸-独立性切割或者延伸-依赖性切割，上游探针适合诱导延伸-独立性切割。
选择性地，上游寡核苷酸可具有与PTO的3’-靶向部位的5’-一部分部分重叠的序列（partial-overlapped sequence）。优选地，重叠的序列为1-10核苷酸长度、更优选为1-5核苷酸长度、进而优选为1-3核苷酸长度。在上游寡核苷酸具有与PTO的3’-靶向部位的5’-一部分部分重叠的序列（partial-overlapped sequence）的情况下，在步骤（b）的切割反应中，3’-靶向部位将与5’-标记部位一起被部分切割。并且，重叠的序列能够使3’-靶向部位中所需的特定部位被切割。
根据本发明的优选实施例，上游引物通过其延伸链来诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的PTO的切割。
只要上游寡核苷酸能够诱导与靶核酸序列杂交的PTO的切割，使得包含PTO的5’-标记部位或者PTO的5’-标记部位的一部分的片段被放出，与基于上游寡核苷酸的切割反应相关的以往技术就能够适用于本发明。例如，美国专利第5,210,015号、第5,487,972号、第5,691,142号、第5,994,069号、第7,381,532号以及美国申请公开号第2008-0241838号就能够应用于本发明。
根据本发明的优选实施例，上述方法在存在下游引物的情况下实施。下游引物能够使与PTO杂交的靶核酸序列追加生成，并能够提高靶检测的灵敏度。
根据本发明的优选实施例，在利用上游引物以及下游引物的情况下，为了引物的延伸可追加使用模板-依赖性核酸聚合酶。
根据本发明的优选实施例，上游寡核苷酸（上游引物或者上游探针）、下游引物和/或PTO的5’-标记部位具有由本发明者开发的双重引发寡核苷酸（DPO）结构。具有DPO结构的寡核苷酸与以往引物以及探针相比表现出相当得到改善的靶特异度（参照WO2006/095981；Chun等，Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detectionof respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19gene，NucleicAcid Research，35:6e40（2007））。
根据本发明的优选实施例，PTO的3’-靶向部位具有由本发明者开发的变形双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构。变形双重特异性寡核苷酸（mDSO）结构与以往的探针相比表现出相当得到改善的靶特异性（参照WO2011/028041）。
步骤（b）：从PTO放出片段
接着，在用于切割PTO的条件下，将上述步骤（a）的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触。与靶核酸序列杂交的PTO被具有5’核酸酶活性的酶切割，因而放出包含PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分的片段。
在本说明书中使用的术语“用于切割PTO的条件”意味着基于具有5’核酸酶活性的酶产生对与靶核酸序列杂交的PTO的切割的充分的条件，例如，温度、pH、离子强度及缓冲液、寡核苷酸的长度及序列和酶。例如，在利用作为具有5’核酸酶活性的酶的Taq DNA聚合酶的情况下，用于切割PTO的条件包含Tris-HCl缓冲液、氯化钾（KCl）、氯化镁（MgCl2）以及温度。
在PTO与靶核酸序列杂交的情况下，虽然3’-靶向部位进行杂交，但是其5’-标记部位则不与靶核酸序列杂交而形成单-链（参照图2）。像这样，将单-链以及双-链结构都包含在内的寡核苷酸可基于在本领域被告知的多种技术，利用具有5’核酸酶活性的酶来切割。
PTO的切割位点根据上游寡核苷酸（上游探针或者上游引物）的种类、上游寡核苷酸的杂交位置以及切割条件会不同（美国专利第5,210,015号、第5,487,972号、第5,691,142号、第5,994,069号以及第7,381,532号或者美国申请公开号第2008-0241838号）。
为了PTO的切割反应可利用多个以往技术，会放出包含5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分的片段。
综合来看，在步骤（b）的切割反应中可有三种切割位点。第一切割位点为PTO的杂交部位（3’-靶向部位）以及非-杂交部位（5’-标记部位）之间的连接位置（junction site）。第二切割位点为从PTO的5’-标记部位的3’-末端沿着3’-方向隔开一部分核苷酸的位置。第三切割位点为从PTO的5’-标记部位的3’-末端沿着5’-方向隔开一部分核苷酸的位置。
根据本发明的优选实施例，上游引物被延伸的同时基于具有5’核酸酶活性的模板-依赖性聚合酶而开始切割PTO的位置是PTO及靶核酸序列之间的双链开始的地点或者从其开始的地点隔开1-3核苷酸的位置。
因此，在本说明书中揭示基于具有5’核酸酶活性的酶的对PTO的切割而使用的术语“包含PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分的片段”意味着包含（i）5’-标记部位、（ii）5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端的一部分、以及（iii）5’-标记部位的一部分。并且，在本发明中，术语“包含PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分的片段”表现为“PTO片段”。
在本说明书中揭示如同PTO的5’-标记部位的一部分、PTO的3’-靶向部位的5’-末端的一部分以及CTO的捕捉部位的5’-末端的一部分的PTO或者CTO而使用的术语“一部分（part）”意味着由1-40、1-30、1-20、1-15、1-10或者1-5核苷酸构成的核苷酸序列，优选为1核苷酸、2核苷酸、3核苷酸或者4核苷酸。
根据本说明书的优选实施例，具有5’核酸酶活性的酶为具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶或者FEN核酸酶，更优选为具有5’核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶或者FEN核酸酶。
适合于本发明的具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶为从多种细菌种得到的热稳定性DNA聚合酶，其包含Thermus aquaticus（Taq）、Thermus thermophilus（Tth）、Thermus filiformis、Thermis flavus、Thermococcus literalis、Thermus antranikianii、Thermus caldophilus、Thermus chliarophilus、Thermus flavus、Thermus igniterrae、Thermuslacteus、Thermus oshimai、Thermus ruber、Thermus rubens、Thermusscotoductus、Thermus silvanus、Thermus species Z05、Thermus species sps17、Thermus thermophilus、Thermotoga maritima、Thermotoganeapolitana、Thermosipho africanus、Thermococcus litoralis、Thermococcus barossi、Thermococcus gorgonarius、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana、Thermosiphoafricanus、Pyrococcus woesei、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、Pyrodictium occultum、Aquifexpyrophilus以及Aquifex aeolieus。最优选地，热稳定性DNA聚合酶为Taq聚合酶。
择一性地，本发明可使用变形为具有聚合酶活性的、具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶。
所使用的皮瓣内切核酸酶（FEN，flap endonuclease）为5’皮瓣-特异性核酸酶（5’flap-specific nuclease）。
适合于本发明的FEN核酸酶包含从多种细菌种得到的FEN核酸酶，其包含Sulfolobus solfataricus、Pyrobaculum aerophilum、Thermococcus litoralis、Archaeaglobus veneficus、Archaeaglobusprofundus、Acidianus brierlyi、Acidianus ambivalens、Desulfurococcusamylolyticus、Desulfurococcus mobilis、Pyrodictium brockii、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus zilligii、Methanopyruskandleri、Methanococcus igneus、Pyrococcus horikoshii、Aeropyrum pernix以及Archaeaglobus veneficus。
优选地，在步骤（a）中利用上游引物的情况下，用于切割PTO的条件包含上游引物的延伸反应。
根据本发明的优选实施例，在步骤（a）中利用上游引物，为了使上述上游引物延伸而利用模板-依赖性聚合酶，上述模板-依赖性聚合酶为与具有5’核酸酶活性的酶相同的酶。
选择性地，在步骤（a）中利用上游引物，为了使上述上游引物延伸而利用模板-依赖性聚合酶，上述模板-依赖性聚合酶为与具有5’核酸酶活性的酶不同的酶。
择一性地，本发明无需利用上游寡核苷酸。PTO可通过上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性切割。在这种情况下，可利用具有上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的以往酶。在具有5’核酸酶活性的模板-依赖性聚合酶中，存在具有上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的一些部分酶，例如，Taq DNA聚合酶。
鉴于靶核酸序列的扩增及PTO的切割效率，优选地，利用上游寡核苷酸来实施本发明的PCEC试验。
步骤（c）：从PTO放出的片段与CTO的杂交
从PTO放出的片段与CTO（Capturing and TemplatingOligonucleotide）杂交。
CTO沿着3’→5’方向包含（i）捕捉部位，其包含与上述PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及（ii）模板化部位，其包含与PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列。
CTO起到用于延伸从PTO放出的片段的模板的作用。起到引物作用的上述片段与CTO杂交，通过被延伸来形成延伸二聚物。
只要模板化部位具有与PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的序列，就可以包含任何序列。并且，只要模板化部位能够起到用于延伸从PTO放出的片段的模板的作用，就可以包含任何序列。
如上所述，优选地，在放出具有PTO的5’-标记部位的片段的情况下，CTO的捕捉部位应被设计成包含与5’-标记部位互补的核苷酸序列。优选地，在放出具有5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端的一部分的片段的情况下，CTO的捕捉部位应被设计成包含与5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端的一部分互补的核苷酸序列。优选地，在放出具有PTO的5’-标记部位的一部分的片段的情况下，CTO的捕捉部位应被设计成具有与5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列。
另一方面，可通过预想PTO的切割位点来设计CTO的捕捉部位。例如，在CTO的捕捉部位被设计成包含与5’-标记部位互补的核苷酸序列的情况下，具有5’-标记部位的一部分的片段或者具有5’-标记部位的片段可与捕捉部位杂交，之后将被延伸。在放出包含5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端一部分的片段的情况下，上述片段可能与被设计成包含与5’-标记部位互补的核苷酸序列的CTO的捕捉部位杂交，即使在上述片段的3’-末端部位存在错配核苷酸，也能够成功地被延长。这是由于即使引物的3’-末端包含一部分错配核苷酸（例如，1-3错配核苷酸），引物也能够根据反应条件而被延长。
在放出包含5’-标记部位以及3’-靶向部位的5’-末端的一部分的片段的情况下，通过将CTO的捕捉部位的5’-末端的一部分设计成具有与上述被切割的3’-靶向部位的5’-末端的一部分互补的核苷酸序列，就能够解决与错配核苷酸相关的问题（参照图1）。
优选地，对与被切割的3’-靶向部位的5’-末端的一部分互补的CTO的捕捉部位的5’-末端的一部分的核苷酸序列，可根据PTO的3’-靶向部位上的预想到的切割位点来选择。优选地，与被切割的3’-靶向部位的5’-末端的一部分互补的CTO的捕捉部位的5’-末端的一部分的核苷酸序列为1-10核苷酸，更优选为1-5核苷酸，进而优选为1-3核苷酸。
CTO的3’-末端可包含不包含于与片段的杂交的追加的核苷酸。并且，只要CTO与上述片段稳定地杂交，CTO的捕捉部位就能够包含仅仅与上述片段的一部分（例如，包含片段的3’-末端部位的片段的一部分）互补的核苷酸序列。
对在本说明书中使用的术语“包含与5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列的捕捉部位”，如同上述，将包含CTO的捕捉部位的多种设计以及结构来进行说明。
CTO可被设计成具有发夹结构。
CTO的长度可以是多种的。例如，CTO具有7-1000核苷酸、7-500核苷酸、7-300核苷酸、7-100核苷酸、7-80核苷酸、7-60核苷酸、7-40核苷酸、15-1000核苷酸、15-500核苷酸、15-300核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸、20-1000核苷酸、20-500核苷酸、20-300核苷酸、20-100核苷酸、20-80核苷酸、20-60核苷酸、20-40核苷酸、30-1000核苷酸、30-500核苷酸、30-300核苷酸、30-100核苷酸、30-80核苷酸、30-60核苷酸或者30-40核苷酸的长度。只要与从PTO放出的片段特异性地杂交，CTO的捕捉部位就可以具有任何长度。例如，CTO的捕捉部位可以具有5-100核苷酸、5-60核苷酸、5-40核苷酸、5-30核苷酸、5-20核苷酸、10-100核苷酸、10-60核苷酸、10-40核苷酸、10-30核苷酸、10-20核苷酸、15-100核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸、15-30核苷酸或者15-20核苷酸的长度。并且，只要CTO的模板化部位在从PTO放出的片段的延伸反应中起到模板作用，CTO的模板化部位就可以具有任何长度。例如，CTO的模板化部位可以具有1-900核苷酸、1-400核苷酸、1-300核苷酸、1-100核苷酸、1-80核苷酸、1-60核苷酸、1-40核苷酸、1-20核苷酸、2-900核苷酸、2-400核苷酸、2-300核苷酸、2-100核苷酸、2-80核苷酸、2-60核苷酸、2-40核苷酸、2-20核苷酸、5-900核苷酸、5-400核苷酸、5-300核苷酸、5-100核苷酸、5-80核苷酸、5-60核苷酸、5-40核苷酸、5-30核苷酸、10-900核苷酸、10-400核苷酸、10-300核苷酸、15-900核苷酸、15-100核苷酸、15-80核苷酸、15-60核苷酸、15-40核苷酸或者15-20核苷酸的长度。
CTO的3’-末端可以具有3’-OH末端。优选地，CTO的3’-末端被阻断成防止其延伸。通过以往方法就能够达到阻断CTO的非-延伸。例如，可以通过在CTO的最后核苷酸的3’-羟基追加如生物素、标记、磷酸基、烷基、非-核苷酸连接肽、磷硫酰或者烷烃-二醇残基等的化学性的部分（moiety）来实施阻断。择一性地，阻断可通过去除最后核苷酸的3’-羟基或者利用如双脱氧核苷酸这种没有3’-羟基的核苷酸来实施。
从PTO放出的片段与CTO杂交，提供适合于片段的延伸的形态。并且，即使非切割PTO通过其5’-标记部位来与CTO的捕捉部位杂交，由于PTO的3’-靶向部位不会与CTO杂交，因而防止延伸二聚物的形成。
参照对步骤（a）中的杂交的说明，就能够更详细地说明步骤（c）中的杂交。
步骤（d）：PTO片段的延伸及核酸切割酶的切割位点的生成
利用模板-依赖性核酸聚合酶以及步骤（c）的结果物来实施延伸反应。与CTO的捕捉部位杂交的PTO片段，通过被延伸来形成延伸二聚物，并生成被核酸切割酶切割的切割位点（site）。相反，与CTO的捕捉部位杂交的非切割PTO则不被延伸也不会因此而生成被核酸切割酶切割的切割位点（site）。
在本说明中使用的术语“延伸二聚物”意味着基于将模板-依赖性核酸聚合酶和CTO的模板化部位利用为模板使与CTO的捕捉部位杂交的片段被延伸的延伸反应而形成的二聚物。
通过形成延伸二聚物来生成可被核酸切割酶切割的切割位点。本领域所知，有着对二聚物起到特异性作用的许多核酸切割酶。本发明的核酸切割酶提供表示靶核酸序列的存在的信号。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是限制酶，CTO的模板化部位包含被限制酶识别的序列，步骤（d）中的延伸二聚物的形成用于生成限制酶的切割位点。生成限制酶切割位点的延伸二聚物被限制酶切割而形成切割片段，这将表示靶核酸序列的存在。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是核糖核酸酶，CTO的模板化部位包含RNA序列，上述步骤（d）中，通过形成延伸二聚物来形成DNA-RNA混合二聚物，由此生成核糖核酸酶的切割位点。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是5’→3’外切核酸酶，通过形成步骤（d）的延伸二聚物，在CTO上生成5’→3’外切核酸酶的切割位点。CTO上的切割位点在形成延伸二聚物之后生成，并且被5’→3’外切核酸酶切割而形成包含CTO的5’-末端的切割片段，这将表示靶核酸序列的存在。
根据本发明的优选实施例，被通过形成延伸二聚物来生成的核酸切割酶切割的切割位点是用于切割DNA二聚物、RNA二聚物或DNA-RNA混合二聚物的核酸切割酶的切割位点。
PTO和/或CTO用于生成所需种类的核酸切割酶的切割位点。
优选地，要生成作用于DNA二聚物的核酸切割酶（例如，限制酶及5’→3’外切核酸酶）的切割位点的情况下，分别利用由DNA分子组成的PTO及CTO。由DNA分子组成的PTO片段利用dNTPs而被延伸，来形成延伸二聚物，由此生成作用于DNA二聚物的核酸切割酶（例如，限制酶及5’→3’外切核酸酶）的切割位点。
优选地，要生成作用于RNA二聚物的核酸切割酶的切割位点的情况下，利用由RNA分子组成的PTO或包含由RNA分子组成的5’-标记部位的PTO以及由RNA分子组成的CTO。与由RNA分子组成的CTO进行杂交的由RNA分子组成的PTO片段利用NTPs而被延伸，来形成延伸二聚物，由此生成作用于RNA二聚物的核酸切割酶的切割位点。
优选地，要生成作用于DNA-RNA混合二聚物的核酸切割酶的切割位点的情况下，利用由DNA分子组成的PTO及包含由RNA分子组成的模板化部位的CTO。模板化部位的RNA分子包含1-10个核糖核苷酸。与包含由RNA分子组成的模板化部位的CTO进行杂交的由DNA分子组成的PTO片段利用dNTPs而被延伸，来形成延伸二聚物，由此生成作用于DNA-RNA混合二聚物的核酸切割酶（例如，RNase H）的切割位点。
在步骤（d）中使用于延伸反应的模板-依赖性核酸聚合酶包含任何核酸聚合酶，例如，E.coli DNA聚合酶I的“克列诺（Klenow）”片段、热稳定性DNA聚合酶以及噬菌体T7DNA聚合酶。优选地，上述核酸聚合酶是能够从多种细菌种得到的热稳定性DNA聚合酶，其包含Thermus aquaticus（Taq）、Thermus thermophilus（Tth）、Thermusfiliformis、Thermis flavus、Thermococcus literalis、Thermus antranikianii、Thermus caldophilus、Thermus chliarophilus、Thermus flavus、Thermusigniterrae、Thermus lacteus、Thermus oshimai、Thermus ruber、Thermusrubens、Thermus scotoductus、Thermus silvanus、Thermus species Z05、Thermus species sps17、Thermus thermophilus、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana、Thermosipho africanus、Thermococcus litoralis、Thermococcus barossi、Thermococcus gorgonarius、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana、Thermosiphoafricanus、Pyrococcus furiosus（Pfu）、Pyrococcus woesei、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus abyssi、Pyrodictium occultum、Aquifex pyrophilus以及Aquifex aeolieus。最为优选地，模板-依赖性核酸聚合酶为Taq聚合酶。
根据本发明的优选实施例，在步骤（b）中利用的具有5’核酸酶活性的酶与在步骤（d）中利用的模板-依赖性核酸聚合酶是相同的。更为优选地，在步骤（b）中利用的具有5’核酸酶活性的酶、为了使上游引物延伸而利用的模板-依赖性核酸聚合酶以及在步骤（d）中利用的模板-依赖性核酸聚合酶是相同的。
步骤（e）：利用核酸切割酶的延伸二聚物的切割
通过形成延伸二聚物来生成核酸切割酶的切割部位之后，利用适当的核酸切割酶来切割延伸二聚物，形成切割片段。
根据本发明的优选实施例，延伸二聚物的切割片段可以是单链或者双链，可通过切割延伸二聚物来形成至少2种的片段。例如，基于限制酶切割延伸二聚物来形成双链形态的2种的切割片段，上述双链片段可根据反应条件分离为单链形态。在利用5’→3’外切核酸酶的切割反应中，可形成单一切割片段。
本说明书中，步骤（b）的切割反应为第一次切割反应，步骤（e）的切割反应是第二次切割反应。
第二次切割反应中利用的核酸切割酶也包含本领域公知的任何酶。
根据本发明的优选实施例，第二次切割反应中利用的核酸切割酶是5’→3’外切核酸酶、限制酶及核糖核酸酶，更优选为热稳定性5’→3’外切核酸酶、限制酶或核糖核酸酶。
根据本发明的优选实施例，第二次切割反应中利用的核酸切割酶包含特异性地作用于二聚物分子的核酸切割酶。
上述核酸切割酶中，5’→3’外切核酸酶切割DNA二聚物的5’-末端。如图2及图5所示，通过切割与靶核酸序列进行杂交的PTO来形成的PTO片段与CTO进行杂交之后被延伸而形成延伸二聚物。延伸二聚物中，CTO的5’-末端被5’→3’外切核酸酶切割而形成切割片段，这将表示靶核酸序列的存在。
具有5’核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶具有5’→3’外切核酸酶活性，一些聚合酶也具有5’→3’内切核酸酶活性。
具有5’核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶在步骤（b）中可诱导上游寡核苷酸-依赖性切割反应（参照美国专利第5,210,015号）。并且，这些还可以诱导上游寡核苷酸-独立性切割反应（参照lawyer et al，Genome Res.1993，2：275-287及WO2008/011004）。
根据本发明的优选实施例，5’→3’外切核酸酶是具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶，更优选为热稳定性DNA聚合酶。参照步骤（b）的记载内容，可详细说明热稳定性DNA聚合酶。优选地，用于切割延伸二聚物的5’→3’外切核酸酶是Taq聚合酶。
根据本发明的优选实施例，具有5’核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶诱导上游寡核苷酸-独立性切割反应，由此可在步骤（e）中切割延伸二聚物。
根据本发明的优选实施例，具有5’核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶不仅在步骤（b）中诱导上游寡核苷酸-依赖性切割，还可在步骤（e）中诱导延伸二聚物的上游寡核苷酸-独立性切割。
根据本发明的优选实施例，基于模板-依赖性DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性的延伸二聚物的上游寡核苷酸-独立性切割由于提供表示延伸二聚物发生切割的信号，因而呈现充分的效率。
根据本发明的优选实施例，基于具有上游寡核苷酸-独立性5’核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶进行的延伸二聚物的切割受到存在于延伸二聚物的标记的位点或标记的结合类型的影响。优选地，标记与延伸二聚物的CTO的5’-末端相结合的情况下，基于具有5’核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶的延伸二聚物的切割，在标记与CTO的5’-末端的磷酸基相连接的情况下，尤其是，以碳间隔区（carbonspacer）为媒介相连接的情况下更有效。标记与CTO的5’-末端的碱基相连接或者不以碳间隔区为媒介相连接的情况下，延伸二聚物有可能不发生切割。
优选地，利用5’→3’外切核酸酶作为核酸切割酶的情况下，用于检测延伸二聚物是否发生切割的标记不与PTO相结合。
在核酸切割酶中的限制酶用于切割在上述步骤（d）中通过形成延伸二聚物而生成的限制酶切割位点。如图3、图6及图8所示，通过切割与靶核酸序列进行杂交的PTO的片段而形成的PTO片段与CTO（包含被限制酶识别的序列）进行杂交之后被延伸，由此形成具有限制酶切割位点的延伸二聚物。限制酶以核酸内部切割方式（endonucleolytically）切割这种延伸二聚物来形成切割片段，这将表示靶核酸序列的存在。
根据本发明的优选实施例，限制酶是能够特异性地识别二聚物的特定序列来切割该序列的限制酶，更优选为热稳定性限制酶。可利用本领域公知的多种限制酶。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是核糖核酸酶，CTO的模板化部位包含RNA序列，步骤（d）中，通过形成延伸二聚物来形成DNA-RNA混合二聚物，由此生成核糖核酸酶的切割位点。核糖核酸酶的切割位点在步骤（e）中被核糖核酸酶切割而形成表示靶核酸序列的存在的切割片段。
根据本发明的优选实施例，本发明中利用的核糖核酸酶是RNaseH或ExoⅢ。
RNase H是可切割DNA-RNA混合二聚物的RNA部位的内切核糖核酸酶之一。优选地，在本发明中利用RNase H的情况下，CTO在模板化部位包含RNA分子。如图4、图7及图9所示，通过切割与靶核酸序列进行杂交的PTO而形成的PTO片段与CTO的模板化部位进行杂交之后被延伸来形成DNA-RNA混合延伸二聚物。RNase H以核酸内部切割方式（endonucleolytically）切割DNA-RNA混合延伸二聚物来形成切割片段，这将表示靶核酸序列的存在。
众所周知，ExoⅢ具有RNase活性（Mol CD，et al.，Nature374（6520）：381–386（1995））。在本发明中利用ExoⅢ的情况下，以与RNase H相同的方式形成表示靶核酸序列的存在的切割片段。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是热稳定性核酸切割酶。
步骤（e）：检测表示靶核酸序列的存在的延伸二聚物是否发生切割
延伸二聚物的切割反应之后，检测延伸二聚物是否发生切割，从而确认靶核酸序列的存在。
可通过多种方法来检测延伸二聚物是否发生切割。
可通过直接分析延伸二聚物的切割片段来检测延伸二聚物是否发生切割，例如，有毛细管电泳（capillary electrophoresis）。在这种情况下，优选地，PTO和/或CTO被制作成使切割片段具有单一荧光标记，由此能够以更方便的方式检测切割片段。
根据本发明的优选实施例，利用信号化系统来检测延伸二聚物是否发生切割。本发明中采用的信号化系统的特征在于，使延伸二聚物的切割和信号发生同步化（synchronization）。即，通过诱导延伸二聚物的切割来提供可检测的信号。
根据本发明的优选实施例，本发明中利用的信号化系统根据延伸二聚物的切割来发生信号变化。仅在靶核酸序列存在时发生延伸二聚物的切割，表示靶核酸序列的存在的信号与信号变化同时被提供。因此，必要的情况下，以实时方式实施本发明。
根据本发明的优选实施例，延伸二聚物具有至少1种的标记，上述标记是与上述PTO或CTO相连接的标记，或是来源于嵌入染料（intercalating dye）的标记，通过从上述至少1种的标记中检测信号来切割上述延伸二聚物。
适合于本发明的标记的例子能够如下详细说明。
（ⅰ）单一标记
本发明利用单一标记可提供表示靶核酸序列存在的延伸二聚物切割相关信号。
单一标记不受特别限制，包含荧光标记、发光（luminescent）标记、化学发光（chemiluminescent）标记或者电化学（electrochemical）标记。优选地，上述单一标记优选为荧光标记。
目前有根据是否与寡核苷酸相结合或者是否从寡核苷酸放出的情况表示不同信号的一些单一标记。在利用这种单一标记的情况下，本发明可制造在液相中也与延伸二聚物的切割同步化的信号化系统。例如，荧光铽螯合物（fluorescent terbium chelate）根据是否与寡核苷酸相结合或者是否从寡核苷酸放出的情况提供不同的信号（Nurmi et al，Nucleic Acids Research，2000，Vol.28No.8e28）。作为其他例子，单一标记为通过基于平面偏振光（plane polarized light）的激发而放出偏振的荧光（a polarized fluorescence）的染料（dye）时，可利用荧光偏振（FP，Fluorescence polarization）方法来检测切割片段。放出的荧光的偏振程度受到与标记相连接的分子的移动（motion）的影响。一般而言，若移动变快，则偏振程度变低（Latif等，Genome Research，11：436-440，2001）。
根据本发明的优选实施例CTO具有单一标记，步骤（e）中的延伸二聚物的切割用于形成包含单一标记的切割片段，来自延伸二聚物被切割之前的单一标记的信号与来自延伸二聚物被切割之后的单一标记的信号不同，可通过这些信号之差来检测延伸二聚物是否发生切割。
根据本发明的优选实施例，PTO具有单一标记，步骤（e）中的延伸二聚物的切割用于形成包含单一标记的切割片段，来自延伸二聚物被切割之前的单一标记的信号与来自延伸二聚物被切割之后的单一标记的信号不同，可通过这些信号之差来检测延伸二聚物是否发生切割。
根据本发明的优选实施例，根据延伸二聚物的切割而提供不同信号的单一标记是荧光铽螯合物或者是放出偏振荧光的单一标记。
根据本发明的优选实施例，单一标记与CTO相连接，更优选地，与CTO的模板化部位相连接，进而优选地，与CTO的模板化部位的5’-末端相连接。
根据本发明的优选实施例，单一标记与PTO相连接，更优选地，与PTO的5’-标记部位相连接。优选地，单一标记位于PTO上，使得PTO片段具有单一标记。
在本发明中利用单一标记的情况下，优选地，利用固定化的CTO在固相中实施本发明。利用单一标记在固相中实施本发明的情况下，与PTO或CTO相结合的单一标记可提供表示延伸二聚物发生切割的信号。
根据本发明的优选实施例，CTO通过其5’-末端或3’-末端固定于固相基质上。
根据本发明的优选实施例，CTO具有单一标记，步骤（e）中的延伸二聚物的切割用于形成包含单一标记的切割片段，切割片段从固相基质放出，并在固相基质上引起信号的变化，来提供表示延伸二聚物发生切割的信号。
更优选地，CTO通过其3’-末端固定于固相基质上，PTO具有单一标记，步骤（e）中的延伸二聚物的切割用于形成包含单一标记的切割片段，切割片段从固相基质放出，并在固相基质上引起信号的变化，来提供表示延伸二聚物发生切割的信号。
CTO通过3’-末端被固定化且利用单一标记的情况下，单一标记与CTO的模板化部位相结合，核酸切割酶的切割位点优选为5’→3’外切核酸酶、限制酶或核糖核酸酶的切割位点。
如图5所示，若PTO片段与通过3’-末端固定于固相基质上的CTO进行杂交而被延伸来形成延伸二聚物，则生成5’→3’外切核酸酶的切割位点。5’→3’外切核酸酶对切割位点进行切割，由此切割延伸二聚物，由此从CTO的5’-末端放出荧光报道分子。在靶核酸序列存在的情况下，在包含固定化的CTO的位置上荧光被减少或者消灭。在靶核酸序列不存在的情况下，在包含固定化的CTO的位置上荧光不会被减少或者消灭。
选择性地，CTO通过其5’-末端固定于固相基质上，PTO具有单一标记，步骤（e）中的延伸二聚物的切割用于形成包含单一标记的切割片段，切割片段从固相基质放出，并在固相基质上引起信号的变化，来提供表示延伸二聚物发生切割的信号。
如图6所示，若PTO片段与通过5’-末端固定于固相基质上的CTO（在模板化部位包含被限制酶识别的序列）进行杂交而被延伸来形成延伸二聚物，则生成限制酶的切割位点。限制酶通过切割延伸二聚物，从CTO的3’-末端放出荧光报道分子。在靶核酸序列存在的情况下，在包含固定化的CTO的位置上荧光被减少或者消灭。在靶核酸序列不存在的情况下，在包含固定化的CTO的位置上荧光被减少或者消灭。
图7表示利用RNase H的例子。若PTO片段与通过5’-末端固定于固相基质上的CTO（在模板化部位包含RNA分子）进行杂交而被延伸来形成延伸二聚物，则生成RNase H的切割位点。RNase H通过切割延伸二聚物，从CTO的3’-末端放出荧光报道分子。在靶核酸序列存在的情况下，在包含固定化的CTO的位置上荧光被减少或者消灭。在靶核酸序列不存在的情况下，在包含固定化的CTO的位置上荧光不会被减少或者消灭。
根据本发明的优选实施例，CTO通过其5’-末端固定于固相基质上，PTO具有单一标记，步骤（e）中的延伸二聚物的切割用于形成包含单一标记的切割片段，切割片段从固相基质放出，并在固相基质上引起信号的变化，来提供表示延伸二聚物发生切割的信号。
根据本发明的优选实施例，单一标记与PTO相连接，更优选地，与PTO的5’-标记部位相连接。优选地，单一标记位于PTO上，使得PTO片段具有单一标记。
图8及图9表示利用具有单一标记的PTO的例子。在图8中，若PTO片段与通过5’-末端固定于固相基质上的CTO（在模板化部位包含被限制酶识别的序列）进行杂交而被延伸来形成延伸二聚物，则生成限制酶的切割位点。限制酶通过切割延伸二聚物，从PTO的5’-末端放出荧光报道分子。在靶核酸序列存在的情况下，包含被固定化的CTO的位置上荧光被减少或者消灭。在靶核酸序列不存在的情况下，在包含固定化的CTO的位置上荧光被减少或者消灭。在图9中，若PTO片段与通过5’-末端固定于固相基质上的CTO（在模板化部位包含RNA分子）进行杂交而被延伸来形成延伸二聚物，则生成RNase H的切割位点。RNase H通过切割延伸二聚物，从PTO的5’-末端放出荧光报道分子。在靶核酸序列存在的情况下，在包含固定化的CTO的位置上荧光被减少或者消灭。在靶核酸序列不存在的情况下，在包含固定化的CTO的位置上荧光不会被减少或者消灭。
优选地，CTO通过5’-末端固定于固相基质上，并利用单一标记的情况下，单一标记与CTO或PTO相结合，并生成如限制酶或核糖核酸酶等核酸切割酶的切割位点。
固相反应中利用的单一标记不要求特定的特征，为了实现固相反应，可以利用任何单一标记。之所以如此是因为，延伸二聚物被切割之后，根据固相基质上的单一标记的存在与否而诱导切割单一延伸二聚物时产生的信号之差。
如上所述，通过分析与第二次切割反应相关的单一标记所提供的信号的存在与否或者信号的变化（强度的增加或减少），可检测靶核酸序列。
上述荧光单一标记的优选例子如下：Cy2TM（506）、YO-PROTM-1（509）、YOYOTM-1（509）、Calcein（517）、FITC（518），FluorXTM（519）、AlexaTM（520）、Rhodamine110（520）、Oregon GreenTM500（522）、Oregon GreenTM488（524）、RiboGreenTM（525）、Rhodamine GreenTM（527）、Rhodamine123（529）、Magnesium GreenTM（531）、Calcium GreenTM（533）、TO-PROTM-1（533）、TOTO1（533）、JOE（548）、BODIPY530/550（550）、Dil（565）、BODIPYTMR（568）、BODIPY558/568（568）、BODIPY564/570（570）、Cy3TM（570）、AlexaTM546（570）、TRITC（572）、Magnesium OrangeTM（575）、Phycoerythrin R&B（575）、Rhodamine Phalloidin（575）、Calcium OrangeTM（576）、Pyronin Y（580）、Rhodamine B（580）、TAMRA（582）、Rhodamine RedTM（590）、Cy3.5TM（596）、ROX（608）、Calcium CrimsonTM（615）、AlexaTM594（615）、Texas Red（615）、Nile Red（628）、YO-PROTM-3（631）、YOYOTM-3（631）、Rphycocyanin（642）、C-Phycocyanin（648）、TO-PROTM-3（660）、TOTO3（660）、DiD DilC（5）（665）、Cy5TM（670）、Thiadicarbocyanine（671）、Cy5.5（694）、HEX（556）、TET（536）、Biosearch Blue（447）、CAL Fluor Gold540（544）、CAL Fluor Orange560（559）、CAL Fluor Red590（591）、CAL Fluor Red610（610）、CAL Fluor Red635（637）、FAM（520）、Fluorescein（520）、Fluorescein-C3（520）、Pulsar650（566）、Quasar570（667）、Quasar670（705）以及Quasar705（610）。括号内的数字为以纳米为单位表示的最大的发光波长。
优选为JOE、FAM、TAMRA、ROX及基于荧光素的标记（fluorescein-based label）。
单一标记利用以往方法可与CTO或PTO相结合。优选地，标记以包含至少3个碳原子的间隔区（spacer）（例如，3-碳间隔区、6-碳间隔区或12-碳间隔区）为媒介与CTO或PTO相结合。
根据本发明的优选实施例，与CTO相结合的单一标记位于5’-末端或从其5’-末端隔开1-5核苷酸的位点。选择性地，与CTO相结合的单一标记位于3’-末端或从3’-末端隔开1-5核苷酸的位点。
根据本发明的优选实施例，与PTO相结合的单一标记位于5’-末端或从5’-末端隔开1-5核苷酸的位点。
（ⅱ）相互作用性双重标记
上述相互作用性标记系统为能量非-放射性地（non-radioacively）传达到供体分子及受体分子之间的信号产生系统。作为相互作用性标记系统的代表性例子，荧光共振能量转移技术（FRET，fluorescenceresonance energy transfer）标记系统包含荧光报道分子（供体分子）及猝灭分子（受体分子）。在荧光共振能量转移技术中，能量供体为荧光性，但是，能量受体可以是荧光性或者非-荧光性。在相互作用性标记系统的再一形态中，能量供体为非-荧光性，例如，为发色团（chromophore），能量受体为荧光性。在相互作用性标记系统的另一形态中，能量供体为发光性（luminescent），例如，生物发光性、化学发光性或者电化学发光性，受体为荧光性。供体分子以及受体分子在本说明书中可分别被说明为报道分子以及猝灭分子。
优选地，表示延伸二聚物的存在（即，靶核酸序列的存在）的信号基于相互作用性标记系统来产生，更优选为荧光共振能量转移（FRET）标记系统（即，相互作用性双重标记系统）。
根据本发明的优选实施例，相互作用性标记与CTO相结合。
根据本发明的优选实施例，被核酸切割酶切割的切割位点位于与CTO相结合的报道分子及猝灭分子之间，在形成延伸二聚物之前，猝灭分子对来自报道分子的信号进行猝灭，通过切割延伸二聚物来使报道分子和猝灭分子相互分离，通过测定来自标记的信号来检测延伸二聚物是否发生切割。
本发明的相互作用性标记系统在液相及固相中有用。
利用相互作用性标记系统的情况下，步骤（d）中生成的切割位点优选为5’→3’外切核酸酶、限制酶或核糖核酸酶的切割位点。
图2表示基于延伸二聚物形成的5’→3’外切核酸酶切割位点的导入。PTO片段与CTO进行杂交而被延伸来形成延伸二聚物，由此生成5’→3’外切核酸酶的切割位点。5’→3’外切核酸酶的切割位点位于与CTO相结合的报道分子及猝灭分子之间。
形成延伸二聚物之前，猝灭分子位于适合对来自报道分子的信号进行猝灭的位点。优选地，上述两个标记根据CTO上的距离接近或者形成无规卷曲（coli）或发夹结构等立体结构（conformational structure）来以三维方式接近的情况下，会发生猝灭。
5’→3’外切核酸酶通过切割延伸二聚物的5’-末端并放出荧光报道分子来引起来自荧光报道分子的信号变化。通过测定荧光信号变化来检测延伸二聚物是否发生切割，这将决定靶核酸序列的存在与否。
在猝灭分子具有荧光性的情况下，优选地，利用来自猝灭分子的信号来进行测定。
图3表示基于延伸二聚物形成的限制酶切割位点的导入。PTO片段与CTO进行杂交而被延伸来形成延伸二聚物，由此生成限制酶的切割位点。限制酶的切割位点位于与CTO相结合的报道分子及猝灭分子之间。限制酶对切割位点进行切割，由此切割延伸二聚物，并放出荧光报道分子，来引起来自荧光报道分子的信号的变化。通过测定荧光信号变化来检测延伸二聚物是否发生切割，这将决定靶核酸序列的存在与否。
图4表示基于延伸二聚物形成的RNase的切割位点的导入。PTO片段与CTO（在模板化部位包含RNA分子）进行杂交而被延伸来形成延伸二聚物，由此生成RNase的切割位点。RNase的切割位点位于与CTO相结合的报道分子及猝灭分子之间。RNase对切割位点进行切割，由此切割延伸二聚物，并放出荧光报道分子，由此引发来自荧光报道分子的信号的变化。通过测定荧光信号变化来检测延伸二聚物是否发生切割，这将决定靶核酸序列的存在与否。
根据本发明的优选实施例，报道分子及猝灭分子中的至少一个与CTO的模板化部位相结合，更详细地，与CTO的5’-末端相结合。
根据本发明的优选实施例，报道分子及猝灭分子均与CTO的模板化部位相结合。
根据本发明的优选实施例，报道分子及猝灭分子中的一个与CTO的5’-末端相结合，而另一个与3’-末端相结合。
根据本发明的优选实施例，与CTO的模板化部位相结合的报道分子或猝灭分子位于其5’-末端或者从5’-末端隔开1-5核苷酸的位点。例如，猝灭分子可位于CTO的模板化部位的5’-末端或者从5’-末端隔开1-5核苷酸的位点，报道分子可位于从猝灭分子隔开5-50核苷酸的位点。
根据本发明的优选实施例，相互作用性双重标记位于适合的位点，即，在形成延伸二聚物的情况下，维持相互作用性双重标记之间的猝灭状态，通过切割延伸二聚物来放出标记的情况下，相互作用性双重标记之间处于不猝灭状态。
鉴于延伸二聚物的切割期间的实时信号发生，报道分子及猝灭分子位于相互隔开最大25核苷酸的位点，更优选为最大20核苷酸，进而优选为最大15核苷酸，最优选为最大10核苷酸。根据本发明的优选实施例，报道分子及猝灭分子位于相互隔开至少3核苷酸的位点，更优选为至少4核苷酸，进而优选为至少5核苷酸，最优选为至少6核苷酸。
在形成延伸二聚物的情况下，CTO上的报道分子及猝灭分子在结构上隔开，以使猝灭分子不对来自报道分子的信号进行猝灭。通过切割延伸二聚物，从猝灭分子中完全分离报道分子，由此可加大因不猝灭而引起的信号的变化。
并且，由于生成具有标记（例如，报道分子）的切割片段，因而在更加柔韧或方便的条件（例如，高-严格条件或固相中洗涤后的条件）下，直接检测来自与切割片段相结合的标记的信号，由此可分析延伸二聚物的切割。
根据本发明的优选实施例，与固定化的CTO相结合的相互作用性双重标记中的一个，在切割延伸二聚物之后残留于固相基质上。
根据本发明的优选实施例，固定于固相基质上的CTO具有相互作用性双重标记并利用5’→3’外切核酸酶作为核酸切割酶的情况下，对从二聚物分离出CTO的片段赋予适当的条件，或在CTO的内部核苷酸赋予对于5’→3’外切核酸酶活性的耐性，从而切割延伸二聚物之后，使相互作用性双重标记中的一个确切地残留在固相基质上。
根据本发明的优选实施例，对于5’→3’外切核酸酶活性的耐性通过带有对5’→3’外切核酸酶活性具有耐性的主链的核苷酸赋予，包含多种硫代磷酸酯（phosphorodithioate）连接（linkage）、膦酸酯（phosphonate）连接、磷酰胺酯（phosphoramidate）连接及2’-碳水化合物（2’-carbohydrate）变形，更优选地包含硫代磷酸酯（phosphorodithioate）连接、烷基磷酸三酯（alkyl phosphotriester）连接、芳基磷酸三酯（aryl phosphotriester）连接、膦酸烷基酯（alkylphosphonate）连接、膦酸芳基酯（aryl phosphonate）连接、氢膦酸酯（hydrogen phosphonate）连接、烷基磷酰胺酯（alkyl phosphoramidate）连接、芳基磷酰胺酯（aryl phosphoramidate）连接、硒代磷酸酯（phosphoroselenate）连接、2’-O-氨基丙基（2’-O-aminopropyl）变形、2’-O-烷基（2’-O-alkyl）变形、2’-O-芳基（2’-O-aryl）变形、2’-O-丁基（2’-O-butyl）变形、α-异头寡脱氧核苷酸（α-anomericOligodeoxynucleotide）及1-（4’-硫代-β-D-呋喃核糖）（1-（4’-thio-β-D-ribofuranosyl））变形。
本发明中可利用的报道分子及猝灭分子可包含本领域公知的任何物质，参照有关上述荧光单一标记的说明，可说明其例子。
适合的一对报道分子-猝灭分子公开在许多文献中：Pesce等，editors，Fluorescence Spectroscopy（Marcel Dekker，New York，1971）;White等，Fluorescence Analysis:A Practical Approach（Marcel Dekker，New York，1970）；Berlman，Handbook of Fluorescence Spectra ofAromatic Molecules，2nd Edition（Academic Press，New York，1971）；Griffiths，Color AND Constitution of Organic Molecules（Academic Press，New York，1976）;Bishop，editor，Indicators（Pergamon Press，Oxford，1972）；Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals（Molecular Probes，Eugene，1992）；Pringsheim，Fluorescenceand Phosphorescence（Interscience Publishers，New York，1949）；Haugland，R.P.，Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals，6th Edition（Molecular Probes，Eugene，Oreg.，1996）；美国专利第3,996,345号以及第4,351,760号。
在本发明中，值得关注的是可以利用能够对广范围波长或者特定波长的荧光进行猝灭的非-荧光黑猝灭分子。非-荧光黑猝灭分子的例子为黑洞猝灭剂（BHQ：black hole quencher）以及4-[4-（二甲基氨基）苯偶氮]苯甲酸（DABCYL：4-[4-（Dimethylamino）phenylazo]benzoicacid）。
用于本发明的荧光共振能量转移（FRET）标记中，报道分子包含荧光共振能量转移（FRET）的供体，猝灭分子包含荧光共振能量转移（FRET）的剩余伙伴（受体）。例如，荧光素染料（fluorescein dye）被利用为报道分子，罗丹明染料（rhodamine dye）被利用为猝灭分子。
（ⅲ）嵌入标记（Intercalating label）
本发明可使用嵌入标记（intercalating label）来联系第二次切割反应和表示靶核酸序列的存在的信号发生。
由于试料内的双-链核酸分子能够产生信号，因而，嵌入标记在利用固定化的CTO的固相反应中更为有用。
根据本发明的优选实施例，CTO通过其5’-末端或3’-末端固定于固相基质上，嵌入染料用作标记，步骤（e）中的延伸二聚物的切割用于形成包含嵌入染料的切割片段，切割片段从固相基质放出，并在固相基质上引起信号的变化，来提供表示延伸二聚物发生切割的信号。在这种情况下，优选地，利用限制酶或RNase来实施步骤（e）中的第二次切割反应。
根据本发明的优选实施例，未固定于固相基质上的切割片段从固相基质分离。
在本发明中有用的嵌入染料的例包含：SYBRTMGreen I、PO-PROTM-1、BO-PROTM-1、SYTOTM43、SYTOTM44、SYTOTM45、SYTOXTMBlue、POPOTM-1、POPOTM-3、BOBOTM-1、BOBOTM-3、LO-PROTM-1、JO-PROTM-1、YO-PROTM1、TO-PROTM1、SYTOTM11、SYTOTM13、SYTOTM15、SYTOTM16、SYTOTM20、SYTOTM23、TOTOTM-3、YOYOTM3、GelStarTM以及thiazole orange。信号通过嵌入染料特异性地夹入双-链核酸分子内来产生。
PTO以及CTO可由天然（naturally occurring）dNMPs构成。择一性地，PTO以及CTO可包含变形核苷酸或者非-天然核苷酸，例如PNA（Peptide Nucleic Acid，参照PCT申请第WO92/20702号）以及LNA（Locked Nucleic Acid，参照PCT申请第WO98/22489号、第WO98/39352号以及第WO99/14226号）。PTO以及CTO可包含如同脱氧肌苷（deoxyinosine）、肌苷（inosine）、1-（2’-脱氧-β-D-呋喃核糖）-3-硝基吡咯（1-（2’-deoxybeta-D-ribofuranosyl）-3-nitropyrrole）以及5-硝基吲哚（5-nitroindole）等的通用碱基。术语“通用碱基”意味着分别对DNA/RNA碱基能够几乎没有区别地形成碱基对。
如上所述，PTO能够在从PTO的5’-标记部位的3’-末端沿着3’-方向隔开的位置被切割。切割位点能够位于PTO的3’-靶向部位的5’-末端的一部分。在PTO片段包含PTO的3’-靶向部位的5’-末端的一部分的情况下，与3’-靶向部位的5’-末端的一部分杂交的CTO的位置能够包含通用碱基、退化性序列（degenerate sequence）或者它们的组合。例如，PTO在从PTO的5’-标记部位的3’-末端沿着3’-方向隔开一个核苷酸的位置被切割，为了与上述核苷酸的杂交，有利地，CTO的捕捉部位的5’-末端的一部分包含通用碱基。万一，PTO在从PTO的5’-标记部位的3’-末端沿着3’-方向隔开两个核苷酸的位置被切割，有利地，CTO的捕捉部位的5’-末端包含退化性序列，沿着其3’-方向邻近的核苷酸包含通用碱基。像这样，在3’-靶向部位的5’-末端的一部分的多个位置上产生PTO的切割的情况下，对CTO利用通用碱基或者退化性序列将具有用处。并且，在诱导上游引物延伸-依赖性切割的情况下，将具有相同的5’-标记部位的PTO利用到多个靶核酸序列筛选时，3’-靶向部位的5’-末端的一部分能够生成互不相同的PTO片段。在这种情况下，通用碱基以及退化性序列将被有用地使用到CTO。为了实现多个靶核酸序列的筛选，在对CTO利用通用碱基以及退化性序列的战略中使用一个类型的CTO或者最小数量的类型的CTO。
根据本发明的优选实施例，本发明的方法在上述反复循环之间包括变性过程，还包括反复进行上述步骤（a）-步骤（b）、步骤（a）-步骤（d）或者步骤（a）-步骤（f）的步骤，优选地，一同包含下游引物。这种反复能够扩增靶核酸序列和/或靶信号。
根据本发明的优选实施例，本发明的方法中，步骤（a）-步骤（b）及步骤（c）-步骤（f）或者步骤（a）-步骤（d）及步骤（e）-步骤（f）在一个反应容器或者个别反应容器中实施。
根据本发明的优选实施例，本发明的方法在反复循环之间包括变性过程，还包括反复进行上述步骤（a）-步骤（b）或者步骤（a）-步骤（d）的步骤。
根据本发明的优选实施例，步骤（a）-步骤（f）在一个反应容器或者个别反应容器中实施。例如，步骤（a）-步骤（b）、步骤（c）-步骤（d）或者步骤（e）-步骤（f）能够在个别反应容器中实施。
根据本发明的优选实施例，步骤（a）-步骤（b）以及步骤（c）-步骤（f）根据反应条件（尤其，温度）能够在一个反应容器同时或者个别进行。
特定步骤的反复、反复时变性的介入、特定步骤的个别实施及检测时间点能够以多种方式变更，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
利用上游引物实施反复的情况下，优选地，在下游引物的存在之下实施反复，更优选地，根据PCR方法实施反复。利用上游探针实施反复的情况下，优选地，在下游引物的存在之下实施反复。
本发明中要检测和/或扩增的靶核酸序列包括所有DNA（gDNA及cDNA）分子以及RNA分子均不要求具有任何特定序列或者长度。
当把mRNA用作初期物质时，在实施退火步骤之前必需进行反转录步骤，以上详细的内容公开在Joseph Sambrook等、MolecularCloning、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.（2001）；以及Noonan、K.F等，Nucleic AcidsRes.16:10366（1988）。为了实现反转录反应，可利用与随机六聚体或者mRNA杂交的寡核苷酸dT引物。
在本发明中可检测和/或扩增的靶核酸序列还都包含任何自然（naturally occurring）原核细胞核酸、真核细胞（例如，原生动物和寄生动物、菌类、酵母、高等植物、低等动物及包含哺乳动物和人类的高等动物）核酸、病毒（例如，疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV：HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS）、流感病毒、EB病毒（Epstein-Barr virus）、肝炎病毒以及脊髓灰质炎病毒等）核酸或者类病毒核酸。
并且，本发明对核苷酸变异的检测非常有用。优选地，靶核酸序列包含核苷酸变异。在本说明书中使用的术语“核苷酸变异”意味着在连续的DNA片段或者序列类似的DNA片段中存在于特定位点的DNA序列的所有单一或者多个核苷酸置换、缺失、或者插入。这种连续的DNA片段包含一个基因或者一个染色体的任意其他部位。这种核苷酸变异可以是突变（mutant）或者多态性等位基因变异（polymorphicallele variations）。例如，在本发明中检测的核苷酸变异包括：单核苷酸多态性（SNP，single nucleotide polymorphism）、突变（mutation）、缺失、插入、置换以及移位。核苷酸变异的例子包括：人类基因组的多种变异（例如，亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR：methylenetetrahydrofolate reductase）基因的变异）、病原体的药物耐性相关的变异以及癌产生-相关的变异。本说明书中使用的术语核苷酸变异包含DNA分子内特定位点上的任何变异。即，术语核苷酸变异包含野生型及其DNA分子内特定位点上的任何突变类型。
在检测靶核酸序列的核苷酸变异的本发明中，所使用的引物或者探针具有对靶核酸序列的上述核苷酸变异互补的序列的情况下，包含上述核苷酸变异的靶核酸序列在本说明书中将被记载为匹配模板（matching template）。在所使用的引物或者探针具有对靶核酸序列的核苷酸变异非-互补的序列的情况下，包含上述核苷酸变异的靶核酸序列在本说明书中将被记载为错配模板（mismatching template）。
为了检测核苷酸变异，可将上游引物的3’-末端设计成位于靶核酸序列中的核苷酸变异位置的对面。根据本发明的优选实施例，上游引物的3’-末端具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列。具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列的上游引物的3’-末端通过被匹配模板退火并被延伸来诱导PTO切割。作为其结果物，PTO片段通过与CTO杂交来提供靶信号。相反，上游引物的3’-末端在错配模板中与核苷酸变异错配的情况下，即使上游引物与错配模板杂交，为了实现延伸反应，在需要对引物的3’-末端进行退火的条件下也不会被延伸，由此不会产生靶信号。
择一性地，可利用对具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列的PTO的杂交有着依赖性的PTO切割。例如，在已调节的条件下，具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列的PTO与匹配模板杂交后被切割。作为结果物，PTO片段通过与CTO杂交来提供靶信号。相反，在已调节的条件下，PTO不会与具有对核苷酸变异位置非-互补的序列的错配模板杂交，并且不会被切割。在这种情况下，优选地，对PTO的核苷酸变异互补的序列位于PTO的3’-靶向部位的中间。
择一性地，本发明为了实现对于特定核苷酸变异的PTO的筛选性，利用位于3’-靶向部位的5’-末端一部分的核苷酸变异区别位点（nucleotide variation discrimination site）的PTO。为了检测核苷酸变异，PTO的3’-靶向部位的5’-末端的一部分位于靶核酸序列的核苷酸变异，PTO的3’-靶向部位的5’-末端的一部分具有对靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列。
具有与核苷酸变异区别位点互补的核苷酸变异的靶核酸序列（即，匹配模板（match template））与PTO进行杂交的情况下，3’-靶向部位的5’-末端一部分形成匹配模板和双链；具有与核苷酸变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列（即，错配模板（mismatchtemplate））与PTO进行杂交的情况下，3’-靶向部位的5’-末端一部分不形成错配模板和双链。
本说明书中涉及到PTO时所使用的术语“核苷酸变异区别位点（nucleotide variation discrimination site）”是与PTO的3’-靶向部位的5’-末端一部分的靶核酸序列的核苷酸变异互补的序列。
如此关注的核苷酸变异的明显的杂交模式提供了PTO的初期切割位点上的差异，据此生成2种PTO片段，由此根据关注的核苷酸变异的存在与否发生信号差异是值得瞩目的。
根据关注的核苷酸变异的存在与否，分别生成通过切割PTO及匹配模板之间的混合物（hybrid）来生成的第一片段及通过切割PTO及错配模板之间的混合物（hybrid）来生成的第二片段。第二片段包含追加的3’-末端，以生成与第一片段不同的第二片段。
在用于检测单一核苷酸变异的实施例中，PTO的3’-靶向部位的5’-末端具有对靶核酸序列的单一核苷酸变异互补的序列。如上所述，与匹配模板杂交的PTO的切割，例如，在上游引物延伸-依赖性切割诱导下，可在沿着3’-方向与PTO的3’-靶向部位的5’-末端仅邻近（immediately adjacent）的位置被诱导。PTO片段的3’-末端具有对单一核苷酸变异互补的核苷酸。PTO片段通过与具有包含相当于核苷酸变异的序列的捕捉部位的CTO杂交后被延伸来形成延伸二聚物，由此来提供靶信号。假如，同样的PTO与除核苷酸变异外对匹配模板具有相同的序列的错配模板杂交，有可能在从PTO的3’-靶向部位的5’-末端沿着3’-方向隔开两个核苷酸的位置产生PTO的切割。PTO片段的3’-末端除具有与单一核苷酸变异互补的核苷酸以外还具有被追加切割的核苷酸。在与追加被切割的核苷酸杂交的CTO的位置被设计成对上述追加被切割的核苷酸具有非-互补的序列的情况下，PTO片段的3’-末端不与CTO杂交，在已调节的条件下，PTO片段不会被延伸。
根据本发明的优选实施例，在PTO的3’-靶向部位的5’-末端的一部分具有对核苷酸变异互补的序列的PTO的切割位点，在与匹配模板或者与错配模板的杂交上依赖性地不同，由此从上述两个杂交结果放出的PTO片段具有不同的序列，优选地，在其3’-末端一部分，更为优选地，在其3’-末端具有不同的序列。
根据本发明的优选实施例，通过选择考虑PTO片段的3’-末端的一部分的差异的CTO的核苷酸序列，能够区分匹配模板和错配模板。
根据本发明的优选实施例，某一种PTO片段的生成可通过CTO上的延伸反应而明确得到检测。
根据本发明的优选实施例，第二片段与CTO的捕捉部位进行杂交的情况下，由于CTO具有筛选的序列，因而CTO不与第二片段的追加的3’-末端部位进行杂交，并防止第二片段延伸。
如本发明所述，通过切割延伸二聚物来检测第一片段的延伸。
根据本发明的优选实施例，优选地，PTO的3’-靶向部位的5’-末端一部分包含位于从核苷酸变异区别位点隔开1-10以内的核苷酸的位点的非-碱基配对部分（non-base pairing moiety）（更优选为1-5以内的核苷酸）。
具有与变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列与PTO进行杂交的情况下，非-碱基配对部分防止3’-靶向部位的5’-末端一部分形成靶核酸序列和双链。
通过利用非-碱基配对部分（例如，错配核苷酸）来提高对于核苷酸变异的PTO的区别能力。
根据本发明的优选实施例，具有与核苷酸变异区别位点互补的核苷酸变异的靶核酸序列与PTO进行杂交的情况下，非-碱基配对部分不抑制5’-末端一部分形成靶核酸序列和双链。
根据本发明的优选实施例，非-碱基配对部分用来放大PTO和匹配模板的混合物上的初期切割位点及PTO和错配模板的混合物上的初期切割位点之间的距离。
非-碱基配对部分包含在靶核酸序列之间不形成碱基对的任何部分。优选地，非-碱基配对部分是以下内容：（ⅰ）包含人为错配碱基、变形为无法碱基配对的非-碱基配对碱基或通用碱基的核苷酸，（ⅱ）变形为无法碱基配对的非-碱基配对核苷酸或者（ⅲ）非-碱基配对化合物。
例如，非-碱基配对部分包含亚烷基（alkylene group）、呋喃核糖萘（ribofuranosyl naphthalene），脱氧呋喃核糖萘（deoxy ribofuranosylnaphthalene）、偏磷酸盐（metaphosphate）、硫代磷酸酯连接、烷基磷酸三酯连接、芳基磷酸三酯连接、膦酸烷基酯连接、膦酸芳基酯连接、氢膦酸酯连接、烷基磷酰胺酯连接及芳基磷酰胺酯连接。常规的碳间隔区也被利用为非-碱基配对部分。作为非-碱基配对部分的通用碱基对调节PTO的切割位点有用。
导入5’-末端一部分的非-碱基配对部分优选地具有1-10个部分，更优选地具有1-5个部分，进而优选地具有1-2个部分。5’-末端一部分的多个非-碱基配对部分能够连续或不连续地存在。优选地，非-碱基配对部分具有2-5个连续的部分。
优选地，非-碱基配对部分是非-碱基配对化合物。
根据本发明的优选实施例，核苷酸变异区别位点及PTO的非-碱基配对部分位于从3’-靶向部位的5’-末端隔开10以内的核苷酸的位点（更优选为8核苷酸、7核苷酸、6核苷酸、5核苷酸、4核苷酸、3核苷酸、2核苷酸或1核苷酸，进而优选为1核苷酸）。
根据本发明的一实施例，PTO具有阻断剂（blocker）部位，该阻断剂部位包含对具有5’核酸酶活性的酶引起的切割具有耐性的至少1个核苷酸阻断剂（blocker）。上述阻断剂部位位于错配模板和根据PTO的杂交而初期被切割的部位。上述阻断剂部位防止切割位点上发生的切割及连续的切割。
阻断剂部位中所包含的的阻断剂的数量不受限制，优选为1-10阻断剂，更优选为2-10阻断剂，进而优选为3-8阻断剂，最优选为3-6阻断剂。存在于探针的阻断剂能够以连续或不连续的方式存在，优选为连续的方式。作为阻断剂的核苷酸，即包含对5’→3’外切核酸酶活性具有耐性的主链的核苷酸包含本领域公知的任何部分。例如，上述核苷酸包含多种硫代磷酸酯连接、膦酸酯连接、磷酰胺酯连接及2’-碳水化合物变形。根据本发明的更优选的实施例，包含对5’→3’外切核酸酶具有耐性的主链的核苷酸包含硫代磷酸酯连接、烷基磷酸三酯连接、芳基磷酸三酯连接、膦酸烷基酯连接、膦酸芳基酯连接、氢膦酸酯连接、烷基磷酰胺酯连接、芳基磷酰胺酯连接、硒代磷酸酯（phosphoroselenate）连接、2’-O-氨基丙基变形、2’-O-烷基变形、2’-O-芳基变形、2’-O-丁基变形、α-异头寡脱氧核苷酸及1-（4’-硫代-β-D-呋喃核糖）变形。
不具有PTO结构的、在5’-末端部位具有核苷酸变异区别部位的常规的线性探针（linear probe）与错配模板进行杂交的情况下，其5’-末端部位在特定条件下可形成单链。这种探针可相当于PTO。通过本发明的PTO试验可发生信号。这种接近法，可对具有与探针的核苷酸变异区别位点非-互补的核苷酸变异的靶核酸序列的检测有用。
根据本发明的优选实施例，在本发明中所利用的靶核酸序列为预-扩增的核酸序列。利用预-扩增的核酸序列，能够大大提高本发明的靶检测的灵敏度以及特异性。
根据本发明的优选实施例，上述方法在存在下游异物的情况下实施。
能够同时检测（多重检测）至少两种的靶核酸序列使得本发明的优点更为突出。
根据本发明的优选实施例，上述方法是为了检测至少两种靶核酸序列而实施的（更优选为至少三种，进而优选为至少五种）。
根据本发明的优选实施例，上述方法为了检测至少两种靶核酸序列而实施（更优选为至少三种，进而优选为至少五种）；上述上游寡核苷酸包含至少两种寡核苷酸（更优选为至少三种，进而优选为至少五种），PTO包含至少两种PTO（更优选为至少三种，进而优选为至少五种），CTO包含至少一种CTO（更优选为至少两种，进而优选为至少三种，最优选为至少五种）。
至少2种PTO的5’-标记部位能够具有相同的序列。例如，本发明在靶核酸序列的筛选中实施的情况下，PTO的5’-标记部位可以具有相同的序列。
尤其，能够将一种CTO利用到多个靶核酸序列的检测上。例如，将在5’-标记部位具有相同的序列的PTO利用于靶核酸序列的筛选的情况下，可以利用一种CTO。
根据本发明的优选实施例，本发明利用至少2种的下游引物来实施。
本发明可在液相或固相中实施。
利用在固相上实现固定化的CTO的靶检测
根据本发明的优选实施例，本发明的方法在固相中实施，CTO通过其5’-末端或者3’-末端在固相基质上实现固定化。在固相中，测定由固相基质上提供的靶信号。
利用在固相基质上实现固定化的CTO的情况下，可利用化学标记（例如，生物素）或者酶标记（例如碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶以及β-葡萄糖苷酶）。
为了实现固相反应，CTO基于其5’-末端或者3’-末端（优选为，3’-末端）在固相基质的表面直接或者间接（优选为间接）实现固定化。并且，CTO能够以共价键或者非共价键方式，在固相基质表面上实现固定化。在固定化的CTO在固相基质表面间接性地实现固定化的情况下，利用合适的连接肽。在本发明中有用的连接肽可包含利用于固相基质表面上的探针固定化的任何连接肽。例如，具有胺基的烷基或者芳基化合物、或者具有硫醇基的烷基或者芳基化合物可作为连接肽利用于CTO固定化。并且，可将聚尾（poly T tail）或者聚腺苷酸尾（polyA tail）使用为连接肽。
根据本发明的优选实施例，在本发明中利用的固体基质为微阵列。提供本发明的反应环境的微阵列包括在本发明所属的技术领域中公知的任何微阵列。本发明的全部过程，即与靶序列的杂交、切割、延伸、解链以及荧光的检测在微阵列上实施。在微阵列上实现固定化的CTO会被利用为杂交阵列因素（hybridizable array element）。用于制备微阵列的固体基质包括，金属（例如，金、金与铜的合金及铝）、金属氧化物、玻璃、陶瓷、石英、硅、半导体、Si/SiO2晶圆、锗、砷化镓、碳、碳纳米管、聚合物（例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯以及聚丙烯酰胺）、琼脂糖凝胶（sepharose）、琼脂糖（agarose）及胶体（colloids），但是不局限于此。本发明的多个固定化CTO可固定于固体基质上的一个寻址（addressable）部位或者多个寻址部位，固体基质可包括2-1000000个寻址部位。为了基于如光刻法、喷墨打印法、机械点样法及与其类似的方法等现有制备技术，生产用于特定应用的阵列而可以组装（fabricate）固定化的CTO。
在固相中实施的本发明，由于固定化的CTO上的标记物理性地隔开，因而即使利用一种标记也能够同时检测多个靶核酸序列。因此，在固相中基于本发明可检测的靶核酸序列的数量不受限制。
若在固相中使用共焦检测（confocal detection）设备等，则不会受到基于液相中存在的标记的信号的影响，由此能够仅测定固相基质上的信号。
在本发明中，PTO片段通过切割与靶核酸序列进行杂交的PTO而被生成，PTO片段被CTO退火，且在CTO上被延伸而形成延伸链。
并且，利用包含如下部位的追加的PTO，可提供根据追加的5’核酸酶切割反应来增加延伸链的数量的、在CTO上可延伸的追加的片段，其中，上述部位包含：（ⅰ）3’-靶向部位，其包含与延伸链互补的杂交核苷酸序列，以及（ⅱ）5’-标记部位，包含与延伸链非-互补，但与CTO的捕捉部位互补的核苷酸序列。为了实现5’核酸酶切割反应，优选地，包含与延伸链互补的杂交核苷酸序列，并利用存在于追加的PTO的上游的追加的上游寡核苷酸。
上述优选实施例的特征在于，形成追加的片段依赖于延伸链的形成。
择一性地，利用追加的PTO可提供追加的片段，其中，上述PTO包含：（ⅰ）3’-靶向部位，其包含与CTO的模板化部位互补的杂交核苷酸序列；以及（ⅱ）5’-标记部位，其与CTO的模板化部位非-互补但是与CTO的捕捉部位互补的核苷酸序列。
根据本发明的优选实施例，追加的延伸二聚物是通过延伸链的追加生成而生成的，这将贡献于固相基质上的靶信号的扩增。
利用靶核酸序列扩增的优选实施例
优选地，本发明利用能够合成靶核酸序列的上游引物以及包含下游的一对引物，并通过靶核酸序列的扩增来同时实施。
根据本发明的再一实施方式，本发明提供一种基于PCEC（PTO切割及延伸-依赖性切割）试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：
步骤（a），将上述靶核酸序列与包含上游引物及下游引物引物的一对引物以及探测和标记的寡核苷酸（PTO，Probing and TaggingOligonucleotide）进行杂交；上述上游引物及上述下游引物分别包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述PTO包含：（i）3’-靶向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及（ii）5’-标记部位，其包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；上述PTO位于上述上游引物以及上述下游引物之间；上述PTO因其3’-末端被阻断，因而防止延伸；
步骤（b），在用于延伸上述引物以及切割上述PTO的条件下，将步骤（a）的结果物与具有5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶相接触；在上述PTO与上述靶核酸序列杂交的情况下，上述上游引物被延伸，上述延伸链诱导基于具有上述5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的上述PTO的切割，这种上述切割放出包含上述PTO的上述5’-标记部位或者上述5’-标记部位的一部分的片段；
步骤（c），将从上述PTO放出的上述片段和捕捉和模板化寡核苷酸（CTO，Capturing and Templating Oligonucleotide）进行杂交；上述CTO沿着3’→5’方向包含：（i）捕捉部位，其包含与上述PTO的上述5’-标记部位或者上述5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及（ii）模板化部位，其包含与上述5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述PTO放出的上述片段与上述CTO的上述捕捉部位杂交；
步骤（d），利用步骤（c）的结果物以及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应；杂交于上述CTO的上述捕捉部位的上述片段，通过被延伸来形成延伸二聚物，并生成被核酸切割酶切割的切割位点（cleavage site）；
步骤（e），利用上述核酸切割酶来切割上述延伸二聚物，用于生成切割的片段；以及
步骤（f），检测上述延伸二聚物是否发生（occurrence）切割，上述延伸二聚物发生切割表示上述靶核酸序列存在。
由于本发明的优选实施例实施上述的本发明的步骤，因此，为了避免本说明书的过度的复杂性，省略它们之间共同的内容。
根据本发明的优选实施例，上述方法在反复循环之间包括变性过程，还包括反复进行步骤（a）-步骤（b）、步骤（a）-步骤（d）或者步骤（a）-步骤（f）的步骤。反应的反复伴随着靶核酸序列的扩增。优选地，上述扩增根据在美国专利第4,683,195号、第4,683,202号以及第4,800,159号中公开的聚合酶链式反应（PCR，polymerase chainreaction）来实施。
根据本发明的优选实施例，上述方法是为了检测至少两种靶核酸序列而实施。
用于靶检测的试剂盒
根据本发明的还一实施方式，本发明提供一种基于PCEC（PTO切割及延伸-依赖性切割）试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，包含：
（a）PTO，上述PTO包含：（i）3’-靶向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及（ii）5’-标记部位，其包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；
（b）上游寡核苷酸，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，上述上游寡核苷酸位于上述PTO的上游；上述上游寡核苷酸或者其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的上述PTO的切割，这种上述切割放出包含上述PTO的上述5’-标记部位或者上述5’-标记部位的一部分的片段；以及
（c）CTO，上述CTO沿着3’→5’方向包含：（i）捕捉部位，其包含与上述PTO的上述5’-标记部位或者上述5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列；以及（ii）模板化部位，其包含与上述PTO的上述5’-标记部位以及上述3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述PTO放出的上述片段与上述CTO的上述捕捉部位杂交；并且，与上述CTO的捕捉部位杂交的上述片段被延伸来形成延伸二聚物，并生成被核酸切割酶切割的切割位点。
由于本发明的试剂盒是为了实施如上所述的本发明的方法而构成的，因此，为了避免本说明书的过度的复杂性，省略它们之间共同的内容。
根据本发明的优选实施例，试剂盒还包含用于切割与靶核酸序列进行杂交的PTO的具有5’核酸酶活性的酶。
根据本发明的优选实施例，试剂盒为了切割通过与CTO的捕捉部位进行杂交的上述片段的延伸而形成的延伸二聚物，还包含核酸切割酶。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是5’→3’外切核酸酶、限制酶或核糖核酸酶。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是限制酶，CTO的模板化部位包含被限制酶识别的序列，步骤（d）中，通过形成延伸二聚物来生成限制酶的切割位点。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是核糖核酸酶，CTO的模板化部位包含RNA序列，步骤（d）中，通过形成延伸二聚物来形成DNA-RNA混合二聚物，由此生成上述核糖核酸酶的切割位点。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是5’→3’外切核酸酶，通过形成延伸二聚物，在CTO上生成5’→3’外切核酸酶的切割位点。
根据本发明的优选实施例，被核酸切割酶切割的切割位点是用于切割DNA二聚物、RNA二聚物或DNA-RNA混合二聚物的核酸切割酶的切割部位。
根据本发明的优选实施例，核糖核酸酶是RNase H或ExoⅢ。
根据本发明的优选实施例，5’→3’外切核酸酶是具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶。
根据本发明的优选实施例，核酸切割酶是热稳定性核酸切割酶。
根据本发明的优选实施例，延伸二聚物具有至少1种标记，上述标记是与PTO或CTO相连接的标记或是来源于嵌入染料（intercalatingdye）的标记，通过检测来自上述至少1种标记的信号来检测延伸二聚物是否发生切割。
根据本发明的优选实施例，CTO具有单一标记，通过切割延伸二聚物来形成包含单一标记的切割片段，来自延伸二聚物被切割之前的单一标记的信号不同于来自延伸二聚物被切割之后的单一标记的信号，这种信号之差用于检测延伸二聚物是否发生切割。
根据本发明的优选实施例，单一标记是荧光标记。
根据本发明的优选实施例，被核酸切割酶切割的切割位点位于与CTO相连接的报道分子及猝灭分子之间，形成延伸二聚物之前，猝灭分子对来自报道分子的信号进行猝灭，通过切割延伸二聚物来使报道分子和猝灭分子相互分离，通过测定来自标记的信号来检测延伸二聚物是否发生切割。
根据本发明的优选实施例，报道分子及猝灭分子中的至少一个与CTO的5’-末端相连接。
根据本发明的优选实施例，CTO通过其5’-末端或3’-末端固定于固相基质上。
根据本发明的优选实施例，CTO具有单一标记，通过切割上述延伸二聚物来形成包含上述单一标记的切割片段，上述切割片段从上述固相基质放出，在上述固相基质上引起信号的变化，来提供用于表示上述延伸二聚物发生切割的信号。
根据本发明的优选实施例，CTO通过其5’-末端固定于固相基质上，上述PTO具有单一标记，通过切割上述延伸二聚物来形成包含上述单一标记的切割片段，上述切割片段从上述固相基质放出，在上述固相基质上引起信号的变化，来提供用于表示上述延伸二聚物发生切割的信号。
根据本发明的优选实施例，单一标记是荧光标记。
根据本发明的优选实施例，CTO通过其5’-末端或3’-末端固定于固相基质上，嵌入染料用作标记，通过切割上述延伸二聚物来形成包含上述嵌入染料的切割片段，上述切割片段从上述固相基质放出，在上述固相基质上引起信号的变化，来提供用于表示上述延伸二聚物发生切割的信号。
根据本发明的优选实施例，PTO和/或CTO因其3’-末端被阻断而防止延伸。
根据本发明的优选实施例，上游寡核苷酸是上游引物或者上游探针。
根据本发明的优选实施例，上游寡核苷酸位于与上述PTO相邻近的部位，以能够基于具有5’核酸酶活性的上述酶来诱导上述PTO的切割。
根据本发明的优选实施例，上游引物通过其延伸链来诱导基于具有5’核酸酶活性的上述酶的上述PTO的切割。
根据本发明的优选实施例，CTO的捕捉部位在其5’-末端部位包含与上述PTO的3’-靶向部位的一部分互补的核苷酸序列。
根据本发明的优选实施例，与PTO的3’-靶向部位的一部分互补的核苷酸序列为1-5个核苷酸。
根据本发明的优选实施例，利用上述试剂盒来检测至少2种靶核酸序列，上述上游寡核苷酸包含至少2种寡核苷酸，上述PTO包含至少2种PTO，上述CTO包含至少2种CTO。
根据本发明的优选实施例，至少2种PTO的5’-标记部位具有相同的序列或者不同的序列。
根据本发明的优选实施例，上游寡核苷酸是上游引物，上述试剂盒是为了实现上述上游引物的上述延伸而利用模板-依赖性核酸聚合酶。
根据本发明的优选实施例，具有5’核酸酶活性的酶是具有5’核酸酶活性的热稳定性DNA聚合酶或结构特异性（FEN，flapendo/exonuclease）核酸酶。
根据本发明的优选实施例，试剂盒还包含下游引物。
在本说明书中，上述的本发明的所有试剂盒可选择性地包含，如同缓冲液、DNA聚合酶辅因子以及脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸酯等的，实施靶扩增PCR反应（例如，聚合酶链式反应）所需的试剂。选择性地，本发明的试剂盒还可包含多种多聚核苷酸分子、反转录酶、多种缓冲液及试剂以及抑制DNA聚合酶活性的抗体。并且，试剂盒可包含实施阳性对照组及阴性对照组反应时所必需的试剂。熟知本说明书的公开事项的本技术领域的普通技术人员能够容易地决定在特定反应中使用的试剂的最适量。典型的是，本发明的试剂盒由包含在前面揭示的组成成分的额外的包装体或者组分（compartment）所制备。
简要说明本发明的特征及优点如下：
（a）本发明的特征在于，在根据靶核酸序列的存在与否形成的延伸二聚物上生成被核酸切割酶切割的切割位点。本发明检测延伸二聚物是否发生切割，由此决定靶核酸序列的存在。
（b）多种方法可用于检测核酸切割酶引起的延伸二聚物发生切割。鉴于延伸二聚物上的切割位点，可将单一标记、相互作用性双重标记或嵌入标记适用于表示靶核酸序列存在的信号的产生。在这种观点上，本发明很好地适用于靶核酸序列的实时检测。
（c）由于本发明的方法用来切割延伸二聚物，因而不受像常规方法一样通常需要利用维持二聚物结构的条件的限制。因此，对于本发明的方法而言，靶核酸序列的检测可在多种条件（例如，温度范围相对大的温度）下实施。
（d）值得关注的是，可以不用考虑靶核酸序列而选择PTO的5’-标记部位的序列以及CTO的序列。据此能够事先-设计（pre-design）对PTO的5’-标记部位以及CTO的全部序列。虽然PTO的3’-靶向部位需要考虑靶核酸序列来制备，但是CTO可以不用考虑靶核酸序列的信息或者靶核酸序列而以已有方式（ready-made fashion）来制备。这种特征能够在多重靶检测，特别是，利用在固相基质上实现固定化的CTO的微阵列中提供突出的优点。
以下，通过实施例对本发明进行更为详细的说明。这些实施例仅是用于更加具体地说明本发明的，根据本发明的主旨本发明的范围不局限于这些实施例，这对本发明所属的技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
实施例
实施例1：利用5’→3’外切核酸酶的PCEC（PTO Cleavage andExtension-dependent Cleavage）试验的评价
评价了作为新试验的本发明的PCEC（PTO Cleavage andExtension-dependent Cleavage）试验是否可利用Taq DNA聚合酶的5’→3’外切核酸酶活性来检测靶核酸序列（参照图2）。
为了实现上游引物的延伸、PTO的切割及PTO片段的延伸，利用具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶。将具有5’核酸酶活性的TaqDNA聚合酶用于切割延伸二聚物。
PTO及CTO的3’-末端用碳间隔区（carbon spacer）来阻断。PTO不具有标记。CTO在其5’-末端具有荧光报道分子（FAM），并在模板化（templating）部位具有猝灭分子（BHQ-1）。实施试验期间形成的延伸二聚物具有相互作用性双重标记。延伸二聚物在其5’-末端部位具有通过Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性而被切割的切割位点（site）。由FAM标记的5’-末端通过Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性而被切割，上述FAM从BHQ-1分离。将对淋病奈瑟菌（NG，Neisseria gonorrhoeae）基因的合成寡核苷酸用作靶模板。
本实施例中利用的合成模板、上游引物、PTO及CTO的序列如下：
NG-T
5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’（SEQ ID NO：1）
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’（SEQ ID NO：2）
NG-PTO-15’-ACGACGGCTAGGCTTTACTGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’（SEQ ID NO：3）
NG-CTO-15’-[FAM]CCTCCTCCTCCTCC[T（BHQ-1）]CCAGTAAAGCCTAGCCGTCGT[C3spacer]-3’（SEQID NO：4）
（标有下划线的文字是指PTO的5’-标记部位）
用含有对淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）基因的合成模板（SEQ ID NO：1）2pmole（皮摩尔）、上游引物（SEQ ID NO：2）10pmole、PTO（SEQ ID NO：3）5pmole、CTO（SEQ ID NO：4）2.5pmole、含有2.5mM MgCl2的2X主混合液10μl、dNTPs200μM以及H-TaqDNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国（Solgent，Korea））1.6单元（unit）的20μl的最终体积实施了反应；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃下进行15分钟变性后，将在95℃下30秒、在60℃下63秒、在72℃下30秒的过程反复进行了60次。检测到各循环的变性步骤（95℃）中产生的信号。变性步骤中的检测可确认信号是否根据因延伸二聚物被切割而引起的双重标记的分离而产生。
如图10所示，有模板的情况下，检测到荧光信号。无模板或者无PTO或CTO的情况下，未检测到信号。
这些结果表示，可通过利用5’→3’外切核酸酶活性的PCEC试验来检测靶核酸序列。
实施例2：利用限制酶的PCEC试验的评价
本发明进一步评价了PCEC试验是否可利用限制酶来检测靶核酸序列（参照图3）。
为了实现上游引物的延伸、PTO的切割及PTO片段的延伸，利用具有5’核酸酶活性的Taq DNA聚合酶。将热稳定性限制酶（PspGI）用于切割延伸二聚物。
PTO及CTO的3’-末端用碳间隔区（carbon spacer）来阻断。PTO不具有标记。CTO在其5’-末端具有荧光报道分子（Cal Fluoro Red610），并在模板化（templating）部位具有猝灭分子（BHQ-1）。在形成延伸二聚物时，设计CTO来对PspGI提供限制酶切割位点。实施试验期间形成的延伸二聚物具有由限制酶切割位点划分的相互作用性双重标记。限制酶位点的切割引起荧光报道分子（Cal Fluoro Red 610）从猝灭分子（BHQ-1）中分离。
据本发明人所知，由荧光报道分子（Cal Fluoro Red610）标记的延伸二聚物的5’-末端对上游寡核苷酸具有耐性，其中，上述上游寡核苷酸与Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性独立。将对淋病奈瑟菌（NG，Neisseria gonorrhoeae）基因的合成寡核苷酸用作靶模板。
在本实施例中利用的合成模板、上游引物、PTO及CTO的序列如下：
NG-T5’-AAATATGCGAAACACGCCAATGAGGGGCATGATGCTTTCTTTTTGTTCTTGCTCGGCAGAGCGAGTGATA
CCGATCCATTGAAAAA-3’（SEQ ID NO：1）
NG-R5’-CAATGGATCGGTATCACTCGC-3’（SEQ ID NO：2）
NG-PTO-25’-ACGACGGCTTGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3spacer]-3’（SEQ ID NO：5）
NG-CTO-25’-[CAL Fluor Red610]CCTCCCTCCTCC[T（BHQ-2）]CCTCCAGTAAAGCC
AAGCCGTCGT[C3Spacer]-3’（SEQ ID NO：6）
（标有下划线的文字是指PTO的5’-标记部位）
（粗体字是指有关PspGI的限制酶切割位点）
用含有对淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）基因的合成模板（SEQ ID NO：1）2pmole（皮摩尔）、上游引物（SEQ ID NO：2）10pmole、PTO（SEQ ID NO：3）5pmole、CTO（SEQ ID NO：4）2pmole、含有2.5mM MgCl2的2X主混合液10μl、dNTPs200μM、H-Taq DNA聚合酶（索尔杰恩特公司，韩国（Solgent，Korea））1.6单元（unit）及PspGI（新英格兰生物实验室（New England Biolabs），美国（US））1单元的20μl的最终体积实施了反应；将含有上述反应混合物的管位于实时热循环仪（CFX96，伯乐公司：Bio-Rad）；将上述反应混合物在95℃下进行15分钟变性后，将在95℃下30秒、在60℃下63秒、在72℃下30秒的过程反复进行了60次。检测到各循环的变性步骤（95℃）中产生的信号。
有模板的情况下，检测到荧光信号。无模板或者无PTO或CTO的情况下，未检测到信号。
这些结果表示，可通过利用限制酶的PCEC试验来检测靶核酸序列。
对本发明的优选实施例进行了详细记述，可以进行根据本发明的原理的变形及修正，本发明的范围基于所附的发明要求保护范围和与其等同的内容而定义，这对于本发明所属的技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。

Claims (30)

1.一种基于PCEC(PTO切割及延伸-依赖性切割)试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，将上述靶核酸序列与上游寡核苷酸以及PTO(探测和标记的寡核苷酸)进行杂交；上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述PTO包含：(i)3’-靶向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及(ii)5’-标记部位，其包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；上述上游寡核苷酸位于上述PTO的上游；
步骤(b)，在用于切割上述PTO的条件下，将上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；上述上游寡核苷酸或者其延伸链诱导基于具有上述5’核酸酶活性的酶的上述PTO的切割，这样上述切割放出包含上述PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，将从上述PTO放出的上述片段与CTO(捕捉和模板化寡核苷酸)进行杂交；上述CTO沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含与上述PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，其包含与上述PTO的5’-标记部位以及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述PTO放出的上述片段与上述CTO的捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用步骤(c)的结果物以及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应；杂交于上述CTO的捕捉部位的上述片段，通过被延伸来形成延伸二聚物，并生成被核酸切割酶切割的切割位点；
步骤(e)，利用上述核酸切割酶来切割上述延伸二聚物，以生成切割的片段；以及
步骤(f)，检测上述延伸二聚物是否发生切割，上述延伸二聚物发生切割表示上述靶核酸序列存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述核酸切割酶为限制酶，上述CTO的模板化部位包含被上述限制酶识别的序列，上述步骤(d)中，通过形成延伸二聚物来生成上述限制酶的切割位点。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述核酸切割酶是核糖核酸酶，上述CTO的模板化部位包含RNA序列，通过形成上述步骤(d)的延伸二聚物来形成DNA-RNA混合二聚物，从而生成上述核糖核酸酶的切割位点。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述核酸切割酶是5’→3’外切核酸酶，通过形成上述步骤(d)的延伸二聚物，在上述CTO上生成5’→3’外切核酸酶的切割位点。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，被上述核酸切割酶切割的切割位点是用于切割DNA二聚物、RNA二聚物或DNA-RNA混合二聚物的核酸切割酶的切割位点。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，上述5’→3’外切核酸酶是具有5’→3’外切核酸酶活性的模板-依赖性DNA聚合酶。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述延伸二聚物具有至少1种标记，上述标记来源于与上述PTO或CTO相连接的标记或来源于嵌入染料(intercalating dye)，通过检测来自上述至少1种标记的信号来检测上述延伸二聚物是否发生切割。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，上述CTO具有单一标记，上述步骤(e)中，通过切割延伸二聚物来形成包含上述单一标记的切割片段，来自上述延伸二聚物被切割之前的单一标记的信号不同于来自上述延伸二聚物被切割之后的单一标记的信号，这种信号之差用于检测上述延伸二聚物是否发生切割。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，被上述核酸切割酶切割的切割位点位于与上述CTO相连接的报道分子及猝灭分子之间，在形成上述延伸二聚物之前，上述猝灭分子对来自上述报道分子的信号进行猝灭，通过切割上述延伸二聚物来使上述报道分子和上述猝灭分子相互分离，通过测定来自上述标记的信号来检测上述延伸二聚物是否发生切割。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述CTO通过其5’-末端或3’-末端固定于固相基质上。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，上述CTO具有单一标记，上述步骤(e)中，通过切割延伸二聚物来形成包含上述单一标记的切割片段，上述切割片段从上述固相基质放出，在上述固相基质上引起信号的变化，来提供用于表示上述延伸二聚物发生切割的信号。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，上述CTO通过其5’-末端固定于固相基质上，上述PTO具有单一标记，上述步骤(e)中，通过切割延伸二聚物来形成包含上述单一标记的切割片段，上述切割片段从上述固相基质放出，在上述固相基质上引起信号的变化，来提供用于表示上述延伸二聚物发生切割的信号。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，上述CTO通过其5’-末端或3’-末端固定于固相基质上，嵌入染料用作标记，上述步骤(e)中，通过切割延伸二聚物来形成包含上述嵌入染料的切割片段，上述切割片段从上述固相基质放出，在上述固相基质上引起信号的变化，来提供用于表示上述延伸二聚物发生切割的信号。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述PTO和/或CTO因其3’-末端被阻断而防止延伸。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述上游寡核苷酸是上游引物或者上游探针。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述方法还包括反复进行步骤(a)-步骤(b)、步骤(a)-步骤(d)、步骤(a)-步骤(e)或者步骤(a)-步骤(f)，其中在反复循环之间包括变性过程。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
通过实施上述方法来检测至少2种靶核酸序列；
上述上游寡核苷酸包含至少2种寡核苷酸；
上述PTO包含至少2种PTO；
上述CTO包含至少2种CTO。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，上述上游寡核苷酸是上游引物，上述步骤(b)是为了实现上述上游引物的上述延伸而利用模板-依赖性核酸聚合酶。
19.根据权利要求1至18中的任一项所述的方法，其特征在于，上述方法在下游引物的存在之下实施。
20.一种基于PCEC(PTO切割及延伸-依赖性切割)试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，将上述靶核酸序列与包含上游引物以及下游引物的一对引物以及PTO(探测和标记的寡核苷酸)进行杂交；上述上游引物以及上述下游引物分别包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；上述PTO包含：(i)3’-靶向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及(ii)5’-标记部位，其包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位则不与上述靶核酸序列杂交；上述PTO位于上述上游引物以及上述下游引物之间；上述PTO因其3’-末端被阻断而防止延伸；
步骤(b)，在用于延伸上述引物以及切割上述PTO的条件下，将步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶相接触；在上述PTO与上述靶核酸序列杂交的情况下，上述上游引物被延伸，上述延伸链诱导基于具有上述5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的上述PTO的切割，这样上述切割放出包含上述PTO的上述5’-标记部位或者上述5’-标记部位的一部分的片段；
步骤(c)，将从上述PTO放出的上述片段与CTO(捕捉和模板化寡核苷酸)进行杂交；上述CTO沿着3’→5’方向包含(i)捕捉部位，其包含与上述PTO的上述5’-标记部位或者上述5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及(ii)模板化部位，其包含与上述PTO的5’-标记部位以及上述3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述PTO放出的上述片段与上述CTO的捕捉部位杂交；
步骤(d)，利用步骤(c)的结果物以及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应；杂交于上述CTO的捕捉部位的上述片段被延伸而形成延伸二聚物，并生成被核酸切割酶切割的切割位点；
步骤(e)，利用上述核酸切割酶来切割上述延伸二聚物，以生成切割的片段；以及
步骤(f)，检测上述延伸二聚物是否发生切割，上述延伸二聚物发生切割表示上述靶核酸序列存在。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，上述方法还包括反复进行步骤(a)-步骤(b)、步骤(a)-步骤(d)、步骤(a)-步骤(e)或步骤(a)-步骤(f)，其中在反复循环之间包括变性过程。
22.一种基于PCEC(PTO切割及延伸-依赖性切割)试验来从DNA或者核酸混合物中检测靶核酸序列的试剂盒，其特征在于，包含：
(a)PTO(探测和标记的寡核苷酸)，上述PTO包含：(i)3’-靶向部位，其包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及(ii)5’-标记部位，其包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列；上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；
(b)上游寡核苷酸，上述上游寡核苷酸包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，上述上游寡核苷酸位于上述PTO的上游；上述上游寡核苷酸或者其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的上述PTO的切割，这样上述切割放出包含上述PTO的5’-标记部位或者5’-标记部位的一部分的片段；以及
(c)CTO(捕捉和模板化寡核苷酸)，上述CTO沿着3’→5’方向包含：(i)捕捉部位，其包含与上述PTO的上述5’-标记部位或者上述5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列；以及(ii)模板化部位，其包含与上述PTO的上述5’-标记部位以及上述3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；从上述PTO放出的上述片段与上述CTO的捕捉部位杂交；并且，与上述CTO的捕捉部位杂交的上述片段被延伸来形成延伸二聚物，并生成被核酸切割酶切割的切割位点。
23.根据权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒还包含用于切割与上述靶核酸序列杂交的PTO的具有5’核酸酶活性的酶。
24.根据权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒为了切割通过延伸与上述CTO的捕捉部位杂交的上述片段而形成的延伸二聚物，还包含核酸切割酶。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其特征在于，上述核酸切割酶是5’→3’外切核酸酶、限制酶或核糖核酸酶。
26.根据权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，上述延伸二聚物具有至少1种标记，上述标记来源于与上述PTO或CTO相连接的标记或来源于嵌入染料(intercalating dye)的标记，通过检测来自上述至少1种标记的信号来检测上述延伸二聚物是否发生切割。
27.根据权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，上述CTO通过其5’-末端或3’-末端固定于固相基质上。
28.根据权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，上述上游寡核苷酸是上游引物或者上游探针。
29.根据权利要求22所述的试剂盒，其特征在于，
上述试剂盒用于检测至少2种靶核酸序列；
上述上游寡核苷酸包含至少2种寡核苷酸；
上述PTO包含至少2种PTO；
上述CTO包含至少2种CTO。
30.根据权利要求22至29中的任一项所述的试剂盒，其特征在于，上述试剂盒还包含下游引物。
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