JP2014515604A - Ｐｔｏ切断及び延長−依存的切断によるターゲット核酸配列の検出 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＰＣＥＣアッセイによるターゲット核酸配列の検出に関するものである。本発明は、ターゲット核酸配列の存否によって形成される延長二量体上に核酸切断酵素によって切断される切断位置が生成されることに特徴がある。本発明は、延長二量体切断の発生を検出し、これにより、ターゲット核酸配列の存在を決定する。
【選択図】図２

Description

本発明は、ＰＴＯ切断及び延長−依存的切断（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｌｅａｖａｇｅ：ＰＣＥＣ）アッセイによるターゲット核酸配列の検出に関する。

ＤＮＡハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）は、分子生物学の基本的な過程であり、イオン強度、塩基構成、核酸断片の長さ、ミスマッチング程度、及び変性剤の存在によって影響を受ける。ＤＮＡハイブリダイゼーションベースの技術は、特定核酸配列の決定に非常に有用な道具となり、臨床診断、遺伝子研究、及び法医学的な実験分析に明確に役に立つ。

しかし、ハイブリダイゼーションにのみ依存する従来の方法及び過程では、プローブと非ターゲット配列との間の非特異的なハイブリダイゼーションによる擬陽性の結果が発生する可能性が高い。したがって、従来の方法及び過程は、信頼度を改善しなければならない問題点が残っている。

プローブハイブリダイゼーション過程以外にも、追加的に酵素的反応を利用した幾つかの接近法、例えば、ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブ方法が提示された。

ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブ方法で、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされた標識プローブは、アップストリームプライマー依存的ＤＮＡ重合酵素の５’ヌクレアーゼ活性によって切断されて、ターゲット配列の存在を示すシグナルを発生させる（米国特許第５，２１０，０１５号、第５，５３８，８４８号、及び第６，３２６，１４５号）。ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブ方法は、シグナル発生のための２つの接近法を提示する：重合依存的切断（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｅａｖａｇｅ）及び重合独立的切断（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｅａｖａｇｅ）。重合依存的切断で、アップストリームプライマーの延長は、必ず核酸重合酵素が標識プローブの５’−末端に接触する前に発生しなければならない。延長反応が進行しながら、重合酵素は、標識プローブの５’−末端を次第に切断する。重合独立的切断で、アップストリームプライマー及び標識プローブは、非常に近接してターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、アップストリームプライマーの３’−末端と核酸重合酵素の結合は、前記核酸重合酵素を標識プローブの５’−末端に接触させて、標識が放出される。また、ＴａｑＭａｎ^ＴＭプローブ方法は、その５’−末端部位にターゲット配列とハイブリダイズされない５’−テイル区域を有する標識プローブが切断されて、５’−テイル区域を含む断片が形成されることを開示している。

ターゲット配列に非相補的な５’−テイル区域を有するプローブが、５’ヌクレアーゼによって切断されて、５’−テイル区域を含む断片が放出される幾つかの方法が報告された。

例えば、特許文献１は、ＤＮＡ重合酵素の５’ヌクレアーゼ活性によって切断される切断構造を開示している。鋳型に対して非相補的な５’部位、及び鋳型に対して相補的な３’部位を含むオリゴヌクレオチドが鋳型にハイブリダイズされ、アップストリームオリゴヌクレオチドは、非常に近接して鋳型にハイブリダイズされる切断構造が例示されている。切断構造は、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素、または減少した合成活性を有する変形ＤＮＡ重合酵素によって切断されて、鋳型に非相補的な５’部位が放出される。次いで、放出された５’部位は、ヘアピン構造を有するオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされて切断構造を形成し、これにより、漸進的な切断反応が誘導されてターゲット配列が検出される。

特許文献２は、３’−末端がブロッキングされたアップストリームオリゴヌクレオチドを有する切断構造が、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼによって切断されて、非相補的な５’フラップ（ｆｌａｐ）部位が放出され、該放出された５’フラップ部位は、サイズ分析または相互作用的二重標識によって検出される過程を開示している。特許文献３は、検出可能な放出されたフラップが核酸合成依存的な、フラップ媒介連続的増幅方法によって生成されることを開示している。この方法で、最初の切断構造から放出されたフラップは、核酸合成依存的な方式で２番目の切断構造を切断してフラップを放出させ、該放出されたフラップを検出する。

特許文献４は、ターゲット核酸配列に非相補的な５’部位を有するプローブの切断及びキャプチャー（ｃａｐｔｕｒｅ）プローブのハイブリダイゼーションを利用したターゲット検出方法を開示している。標識は、非相補的な５’部位に位置する。ターゲット配列にハイブリダイズされた標識プローブは、切断されて断片を放出し、以後、断片は、キャプチャープローブにハイブリダイズされてターゲット配列の存在が検出される。この方法で、非切断された／完全な（ｕｎｃｌｅａｖｅｄ／ｉｎｔａｃｔ）プローブは、キャプチャープローブにハイブリダイズされないことが必須的である。そのためには、短い長さを有するキャプチャープローブが、固相基質上に固定化されなければならない。しかし、このような制限は、固相基質でのハイブリダイゼーションの効率性を低め、また反応条件の最適化も難しくする。

したがって、より便利かつ信頼性及び再現性のある方式で、ハイブリダイゼーションだけではなく、５’ヌクレオ切断反応（５’ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ）のような酵素的反応によって、液相及び固相でターゲット配列、より望ましくは、複数のターゲット配列を検出するための新規な接近法に対する開発要求が台頭しつつある。また、当業界で標識（特に、蛍光標識）種類の数に制限されない新規なターゲット検出方法が要求されている。

本明細書の全般に亘って多数の特許及び文献が参照され、その引用がカッコで囲まれている。このような特許及び文献の公開は、その全体として本明細書に参照して含まれて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。

米国特許第５，６９１，１４２号 米国特許第７，３８１，５３２号 米国特許第６，８９３，８１９号 米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号

本発明者らは、より改善された正確性及び便宜性を有し、特に、マルチプレックス方式でターゲット配列を検出する新規な接近法を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ターゲット配列を検出するための新規なプロトコルを定立し、このようなターゲット検出は、プローブハイブリダイゼーションだけではなく、連続した切断反応、すなわち、ＰＴＯの５’核酸切断反応及び延長二量体の核酸切断反応によって達成される。本発明のプロトコルは、固相反応だけではなく、液相反応にも優れているように適用され、より改善された正確性及び便宜性を有し、複数のターゲット配列を検出させる。

したがって、本発明の目的は、ＰＣＥＣ（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｌｅａｖａｇｅ）アッセイを用いて、ＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供することである。

本発明の他の目的は、ＰＣＥＣアッセイを用いて、ＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキットを提供することである。

本発明の他の目的及び利点は、添付した特許請求の範囲及び図面と共に下記の詳細な説明によってより明確になる。

本発明の一態様によれば、本発明は、次の段階を含み、ＰＣＥＣ（ＰＴＯ切断及び延長−依存的切断）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：（ａ）前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階であって、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位と、（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位と、を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置し、（ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導し、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し、（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイズさせる段階であって、前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位と、（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位と、を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ、（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長二量体を形成し、核酸切断酵素によって切断される切断位置（ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）が生成され、（ｅ）前記核酸切断酵素を用いて、前記延長二量体を切断する段階であって、切断された断片が生成され、そして、（ｆ）前記延長二量体の切断の発生（ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）を検出する段階であって、前記延長二量体の切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。

本発明者らは、より改善された正確性及び便宜性を有し、特に、マルチプレックス方式でターゲット配列を検出する新規な接近法を開発するために鋭意研究した。その結果、本発明者らは、ターゲット配列を検出するための新規なプロトコルを定立し、このようなターゲット検出は、プローブハイブリダイゼーションだけではなく、連続した切断反応、すなわち、ＰＴＯの５’核酸切断反応及び延長二量体の核酸切断反応によって達成される。本発明のプロトコルは、固相反応だけではなく、液相反応にも優れているように適用され、より改善された正確性及び便宜性を有し、複数のターゲット配列を検出させる。

本発明は、次の連続した核酸切断反応、すなわち、５’核酸切断反応によるＰＴＯの１次切断及び核酸切断反応による延長二量体の２次切断を利用し、これにより、ターゲットシグナルが生成される。したがって、本発明は、ＰＣＥＣアッセイと名付けられる。

本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
（ａ）本発明は、ターゲット核酸配列の存否によって形成される延長二量体上に核酸切断酵素によって切断される切断位置が生成されることに特徴がある。本発明は、延長二量体切断の発生を検出し、これにより、ターゲット核酸配列の存在を決定する。
（ｂ）多様な方法を核酸切断酵素による延長二量体の切断発生検出に利用できる。延長二量体上に切断位置を考慮して、単一標識、相互作用的二重標識、またはインターカレーティング標識をターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを発生させるのに適用することができる。このような観点で、本発明は、ターゲット核酸配列のリアルタイム検出に非常によく適用される。
（ｃ）本発明の方法は、延長二量体を切断させるので、通常の方法において、一般的に経験する二量体構造を保持する条件を利用しなければならない制限もない。したがって、本発明の方法において、ターゲット核酸配列の検出は、多様な条件（例えば、相対的に広範囲の温度）下で実施される。
（ｄ）ターゲット核酸配列を考慮せず、ＰＴＯの５’−タギング部位の配列及びＣＴＯの配列を選択できるということは、注目すべきことである。これは、ＰＴＯの５’−タギング部位及びＣＴＯに対する配列全体を事前デザイン（ｐｒｅ−ｄｅｓｉｇｎ）を可能にする。たとえＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、ターゲット核酸配列を考慮して製作しなければならないが、ＣＴＯは、ターゲット核酸配列の情報またはターゲット核酸配列に対する考慮なしに既存の方式（ｒｅａｄｙ−ｍａｄｅ ｆａｓｈｉｏｎ）で製作することができる。このような特徴は、マルチプレックスターゲット検出、特に、固相基質上に固定化されたＣＴＯを利用するマイクロアレイ上で顕著な利点を提供する。

ＰＣＥＣアッセイに利用されるＰＴＯ及びＣＴＯの図式的な構造を示す。望ましくは、ＰＴＯ及びＣＴＯの３’−末端は、ブロッキングされて延長が防止される。 ５’→３’エキソヌクレアーゼによって切断される切断位置を利用するＰＣＥＣアッセイの具現例を図式的に示す。ＣＴＯは、そのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を有する。 制限酵素によって切断される切断位置を利用するＰＣＥＣアッセイの具現例を図式的に示す。ＣＴＯは、そのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を有する。 ＲＮａｓｅ Ｈによって切断される切断位置を利用するＰＣＥＣアッセイの具現例を図式的に示す。ＣＴＯは、そのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を有する。 ５’→３’エキソヌクレアーゼによって切断される切断位置を利用するＰＣＥＣアッセイの具現例を図式的に示す。ＣＴＯは、そのテンプレーティング部位に蛍光単一標識を有する。ＣＴＯは、その３’−末端を通じて固相基質上に固定化される。 制限酵素によって切断される切断位置を利用するＰＣＥＣアッセイの具現例を図式的に示す。ＣＴＯは、そのキャプチャリング部位に蛍光単一標識を有する。ＣＴＯは、その５’−末端を通じて固相基質上に固定化される。 ＲＮａｓｅ Ｈによって切断される切断位置を利用するＰＣＥＣアッセイの具現例を図式的に示す。ＣＴＯは、そのキャプチャリング部位に蛍光単一標識を有する。ＣＴＯは、その５’−末端を通じて固相基質上に固定化される。 制限酵素によって切断される切断位置を利用するＰＣＥＣアッセイの具現例を図式的に示す。ＰＴＯは、そのタギング部位に蛍光単一標識を有する。ＣＴＯは、その５’−末端を通じて固相基質上に固定化される。 ＲＮａｓｅ Ｈによって切断される切断位置を利用するＰＣＥＣアッセイの具現例を図式的に示す。ＰＴＯは、そのタギング部位に蛍光単一標識を有する。ＣＴＯは、その５’−末端を通じて固相基質上に固定化される。 ＰＣＥＣアッセイによるＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ遺伝子のリアルタイム検出結果を示す。ＣＴＯは、そのテンプレーティング部位にレポーター分子及びクエンチャー分子を有する。

本発明のＰＣＥＣアッセイをより詳細に説明すれば、次の通りである：
段階（ａ）：ターゲット核酸配列とアップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯとのハイブリダイゼーション
本発明によれば、まず、ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯとハイブリダイズさせる。

本明細書で使われる用語“ターゲット核酸”、“ターゲット核酸配列”、または“ターゲット配列”は、検出しようとする核酸配列を意味し、ハイブリダイゼーション、アニーリング、または増幅条件下でプローブまたはプライマーとアニーリングまたはハイブリダイズされる。

本明細書で使われる用語“プローブ（ｐｒｏｂｅ）”は、ターゲット核酸配列に実質的に相補的な部位または部位を含む一本鎖核酸分子を意味する。

本明細書で使われる用語“プライマー”は、オリゴヌクレオチドを意味するものであって、核酸鎖（鋳型）に相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件、すなわち、ヌクレオチドとＤＮＡ重合酵素のような重合剤の存在、そして、適した温度とｐＨの条件とで合成の開始点として作用する。

望ましくは、プローブ及びプライマーは、一本鎖デオキシリボヌクレオチド分子である。本発明で利用されるプローブまたはプライマーは、天然（ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）ｄＮＭＰ（すなわち、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＣＭＰ、及びｄＴＭＰ）、変形ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチドを含みうる。また、プローブまたはプライマーは、リボヌクレオチドを含みうる。

プライマーは、重合剤の存在下で延長産物の合成をプライミングさせることができる程度に十分に長くなければならない。プライマーの適した長さは、例えば、温度、応用分野及びプライマーのソース（ｓｏｕｒｃｅ）を含んだ複数の要素によって決定される。本明細書で使われる用語“アニーリング”または“プライミング”は、鋳型核酸にオリゴデオキシヌクレオチドまたは核酸が並置（ａｐｐｏｓｉｔｉｏｎ）されることを意味し、前記並置は、重合酵素がヌクレオチドを重合させて、鋳型核酸またはその一部に相補的な核酸分子を形成させる。

本明細書で使われる用語“ハイブリダイズ”は、相補的な一本鎖核酸が二本鎖核酸を形成することを意味する。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸鎖間の相補性が完全である場合（ｐｅｒｆｅｃｔ ｍａｔｃｈ）に起こるか、または一部のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）塩基が存在しても起こりうる。ハイブリダイゼーションに必要な相補性の程度は、ハイブリダイゼーション条件によって変わり、特に、温度によって調節される。

アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯとターゲット核酸配列のハイブリダイゼーションは、最適化手続きによって一般的に決定される適したハイブリダイゼーション条件下で実施される。温度、成分の濃度、ハイブリダイゼーション及び洗浄回数、バッファ成分、及びこれらのｐＨ及びイオン強度のような条件は、オリゴヌクレオチド（アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ）の長さ、ＧＣ量及びターゲットヌクレオチド配列を含んだ多様な因子によって変わりうる。例えば、相対的に短いオリゴヌクレオチドを利用する場合、低い厳格条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）を選択することが望ましい。ハイブリダイゼーションのための詳細な条件は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＭ．Ｌ．Ｍ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９９）で確認することができる。

用語“アニーリング”と“ハイブリダイズ”は、差がなく、本明細書で混用される。

アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯは、ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する。本明細書で使われる用語“相補的”は、所定のアニーリング条件または厳格条件下でプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイズする程度に十分に相補的であることを意味し、“実質的に相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”及び“完全に相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”であることをいずれも包括する意味を有し、望ましくは、完全に相補的であることを意味する。

ＰＴＯの５’−タギング部位は、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有する。ＣＴＯのテンプレーティング部位は、ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を有する。本明細書で使われる用語“非相補的”は、所定のアニーリング条件または厳格条件下でプライマーまたはプローブがターゲット核酸配列に選択的にハイブリダイズされない程度に十分に非相補的であることを意味し、“実質的に非相補的（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”及び“完全に非相補的（ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ ｎｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）”であることをいずれも包括する意味を有し、望ましくは、完全に非相補的であることを意味する。

本明細書で使われる用語“ＰＴＯ”は、（ｉ）プローブとしての役割をする３’−ターゲッティング部位と、（ｉｉ）ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション以後に切断されてＰＴＯから放出され、ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を有する５’−タギング部位とを含むオリゴヌクレオチドを意味する。ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位は、必ず５’→３’順序で位置する。図１で、ＰＴＯを図式的に示す。

望ましくは、３’−ターゲッティング部位が、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、５’−タギング部位は、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされない厳格条件下で段階（ａ）のハイブリダイゼーションが実施される。

ＰＴＯは、如何なる特定長さも要求しない。例えば、ＰＴＯの長さは、１５−１５０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、２０−１５０ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−６０ヌクレオチド、２０−５０ヌクレオチド、３０−１５０ヌクレオチド、３０−１００ヌクレオチド、３０−８０ヌクレオチド、３０−６０ヌクレオチド、３０−５０ヌクレオチド、３５−１００ヌクレオチド、３５−８０ヌクレオチド、３５−６０ヌクレオチド、または３５−５０ヌクレオチドの長さを有しうる。ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位がターゲット核酸配列に特異的にハイブリダイズされる限り、如何なる長さも有しうる。例えば、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、１０−１００ヌクレオチド、１０−８０ヌクレオチド、１０−５０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−５０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−５０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチド、または２０−３０ヌクレオチドの長さを有しうる。５’−タギング部位は、ＣＴＯのテンプレーティング部位に特異的にハイブリダイズされた後に延長される限り、如何なる長さも有しうる。例えば、ＰＴＯの５’−タギング部位は、５−５０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、５−２０ヌクレオチド、１０−５０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１０−２０ヌクレオチド、１５−５０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、または１５−２０ヌクレオチドの長さを有しうる。

ＰＴＯの３’−末端は、３’−ＯＨターミナル（ｔｅｒｍｉｎａｌ）を有することもある。望ましくは、ＰＴＯの３’−末端は、“ブロッキング”されて、その延長が防止される。

ブロッキングは、従来の方法によって達成されうる。例えば、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基に、ビオチン、標識、ホスフェート基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート、またはアルカンジオール残基のような化学的モイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）を追加して実施することができる。択一的に、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか、またはジデオキシヌクレオチドのように、３’−ヒドロキシル基がないヌクレオチドを用いて実施することができる。

択一的に、ＰＴＯが、ヘアピン構造を有するようにデザインすることができる。

ＰＴＯの５’−タギング部位及びターゲット核酸配列間の非ハイブリダイゼーションは、特定ハイブリダイゼーション条件下でそれらの間に安定した二本鎖が非形成されることを意味する。本発明の望ましい具現例によれば、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーションに関与しないＰＴＯの５’−タギング部位は、一本鎖を形成する。

アップストリームオリゴヌクレオチドは、ＰＴＯのアップストリームに位置する。

また、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたアップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を誘導する。

アップストリームオリゴヌクレオチドによるＰＴＯ切断の誘導は、２つの方式で達成されうる：（ｉ）アップストリームオリゴヌクレオチド延長−独立的切断誘導；及び（ｉｉ）アップストリームオリゴヌクレオチド延長−依存的切断誘導。

アップストリームオリゴヌクレオチドが、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導するのに十分な程度にＰＴＯに近接して位置する場合、アップストリームオリゴヌクレオチドに結合した前記酵素は、延長反応なしにＰＴＯを切断する。一方、アップストリームオリゴヌクレオチドが、ＰＴＯから離隔している場合、重合酵素活性を有する酵素（例えば、鋳型−依存的重合酵素）は、アップストリームオリゴヌクレオチド（例えば、アップストリームプライマー）の延長を促進させ、延長産物に結合された５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、ＰＴＯを切断する。

したがって、アップストリームオリゴヌクレオチドは、２つの方式でＰＴＯに対して相対的に位置しうる。アップストリームオリゴヌクレオチドは、延長−独立した方式でＰＴＯの切断を誘導するのに十分な程度にＰＴＯに近接した位置に位置しうる。択一的に、アップストリームオリゴヌクレオチドは、延長−依存的な方式でＰＴＯ切断を誘導するのに十分な程度にＰＴＯから離隔した位置に位置しうる。

本明細書で、地点（ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）または位置（ｌｏｃａｔｉｏｎｓ）を言及しながら使われる用語“近接（ａｄｊａｃｅｎｔ）”は、アップストリームオリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’−ターゲッティング部位のすぐ近くに位置して、ニック（ｎｉｃｋ）を形成することを意味する。また、前記用語は、アップストリームオリゴヌクレオチドがＰＴＯの３’−ターゲッティング部位から１−３０ヌクレオチド、１−２０ヌクレオチド、または１−１５ヌクレオチド離隔して位置することを意味する。

本明細書で、地点または位置を言及しながら使われる用語“離隔（ｄｉｓｔａｎｔ）”は、延長反応が起こるのに十分な程度の如何なる地点または位置を含む。

本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームオリゴヌクレオチドは、延長−依存的な方式でＰＴＯの切断を誘導するのに十分な程度にＰＴＯから離隔して位置しうる。

本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブである。アップストリームプライマーは、延長−独立的切断誘導または延長−依存的切断に適し、アップストリームプローブは、延長−独立的切断誘導に適している。

択一的に、アップストリームオリゴヌクレオチドは、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−一部と部分的に重なる配列（ｐａｒｔｉａｌ−ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有しうる。望ましくは、重なる配列は、１−１０ヌクレオチド長さであり、より望ましくは、１−５ヌクレオチド、さらに望ましくは、１−３ヌクレオチドである。アップストリームオリゴヌクレオチドが、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−一部と部分的に重なる配列を有する場合、段階（ｂ）の切断反応で３’−ターゲッティング部位は、５’−タギング部位と共に部分的に切断される。また、重なる配列は、３’−ターゲッティング部位の所望の特定位置を切断させる。

本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームプライマーは、その延長鎖を通じて５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を誘導する。

アップストリームオリゴヌクレオチドがターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯの切断を誘導して、ＰＴＯの５’−タギング部位またはＰＴＯの５’−タギング部位の一部を含む断片が放出される限り、アップストリームオリゴヌクレオチドによる切断反応関連の従来技術は、本発明に適用可能である。例えば、米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号、第７，３８１，５３２号、及び米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号は、本発明に応用することができる。

本発明の望ましい具現例によれば、前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施する。ダウンストリームプライマーは、ＰＴＯにハイブリダイズされるターゲット核酸配列を追加的に生成させ、ターゲット検出の敏感度を向上させる。

本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーを利用する場合、プライマーの延長のために、追加的に鋳型−依存的核酸重合酵素を使う。

本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームオリゴヌクレオチド（アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブ）、ダウンストリームプライマー及び／またはＰＴＯの５’−タギング部位は、本発明者によって開発された二重プライミングオリゴヌクレオチド（ＤＰＯ）構造を有する。ＤＰＯ構造を有するオリゴヌクレオチドは、従来のプライマー及びプローブに比べて、非常に改善されたターゲット特異度を示す（参照：ＷＯ ２００６／０９５９８１；Ｃｈｕｎら、Ｄｕａｌ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ＣＹＰ２Ｃ１９ ｇｅｎｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３５：６ｅ４０（２００７））。

本発明の望ましい具現例によれば、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、本発明者によって開発された変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造を有する。変形二重特異性オリゴヌクレオチド（ｍＤＳＯ）構造は、従来のプローブに比べて、非常に改善されたターゲット特異性を示す（参照：ＷＯ ２０１１／０２８０４１）。

段階（ｂ）：ＰＴＯから断片の放出
引き続き、ＰＴＯの切断のための条件下で段階（ａ）の結果物を５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に接触させる。ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によって切断されて、ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する。

本明細書で使われる用語“ＰＴＯの切断のための条件”は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によってターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯの切断が発生するのに十分な条件、例えば、温度、ｐＨ、イオン強度、及びバッファ、オリゴヌクレオチドの長さ及び配列、そして、酵素を意味する。例えば、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素としてＴａｑ ＤＮＡ重合酵素が利用される場合、ＰＴＯの切断のための条件は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ_２、及び温度を含む。

ＰＴＯが、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、その３’−ターゲッティング部位は、ハイブリダイゼーションに含まれるが、５’−タギング部位は、ターゲット核酸配列にハイブリダイゼーションされず、一本鎖を形成する（参照：図２）。このように、一本鎖及び二本鎖構造いずれもを含むオリゴヌクレオチドは、当業界に知られた多様な技術によって５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素を用いて切断されうる。

ＰＴＯの切断位置は、アップストリームオリゴヌクレオチド（アップストリームプローブまたはアップストリームプライマー）の種類、アップストリームオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション位置及び切断条件によって多様になる（参照：米国特許第５，２１０，０１５号、第５，４８７，９７２号、第５，６９１，１４２号、第５，９９４，０６９号、及び第７，３８１，５３２号、または米国出願公開番号第２００８−０２４１８３８号）。

ＰＴＯの切断反応のために、多数の従来技術を利用することができ、５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出する。

総合すれば、段階（ｂ）の切断反応で、３種の切断位置があり得る。最初の切断位置は、ＰＴＯのハイブリダイゼーション部位（３’−ターゲッティング部位）及び非ハイブリダイゼーション部位（５’−タギング部位）間のジャンクション位置（ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）である。二番目の切断位置は、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から３’−方向に一部ヌクレオチド離隔した位置である。二番目の切断位置は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に位置する。三番目の切断位置は、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から５’−方向に一部ヌクレオチド離隔した位置である。

本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームプライマーが延長されながら、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的重合酵素によってＰＴＯの切断が始まる位置は、ＰＴＯ及びターゲット核酸配列間の二本鎖が始まる地点、またはその開始地点から１−３ヌクレオチド離隔した位置である。

したがって、本明細書で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素によるＰＴＯの切断を言及しながら使われる用語“ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片”は、（ｉ）５’−タギング部位、（ｉｉ）５’−タギング部位、及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部、及び（ｉｉｉ）５’−タギング部位の一部を含む意味として使われる。また、本明細書で、用語“ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片”は、“ＰＴＯ断片”と表現される。

本明細書で、ＰＴＯの５’−タギング部位の一部、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部、及びＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端の一部のように、ＰＴＯまたはＣＴＯを言及しながら使われる用語“一部（ｐａｒｔ）”は、１−４０、１−３０、１−２０、１−１５、１−１０、または１−５ヌクレオチドで構成されたヌクレオチド配列を意味し、望ましくは、１、２、３、または４ヌクレオチドである。

本明細書の望ましい具現例によれば、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼであり、より望ましくは、５’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼである。

本発明に適した５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素は、多様なバクテリア種から得た熱安定性ＤＮＡ重合酵素であり、これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ、Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ、及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓを含む。最も望ましくは、熱安定性ＤＮＡ重合酵素は、Ｔａｑ重合酵素である。

択一的に、本発明は、重合酵素活性をより少なく有するように変形された、５’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素を使うことができる。

使われるＦＥＮ（ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）ヌクレアーゼは、５’フラップ−特異的ヌクレアーゼ（５’ｆｌａｐ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅ）である。

本発明に適したＦＥＮヌクレアーゼは、多様なバクテリア種から得たＦＥＮヌクレアーゼを含み、これは、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓ、Ａｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ｂｒｉｅｒｌｙｉ、Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ａｍｂｉｖａｌｅｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｂｒｏｃｋｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ ｋａｎｄｌｅｒｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｉｇｎｅｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ、及びＡｒｃｈａｅａｇｌｏｂｕｓ ｖｅｎｅｆｉｃｕｓを含む。

段階（ａ）でアップストリームプライマーを利用する場合、ＰＴＯの切断のための条件は、アップストリームプライマーの延長反応を含むことが望ましい。

本発明の望ましい具現例によれば、段階（ａ）でアップストリームプライマーを利用し、前記アップストリームプライマーの延長のために、鋳型−依存的重合酵素を利用し、前記鋳型−依存的重合酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素と同一な酵素である。

選択的に、段階（ａ）でアップストリームプライマーを利用し、前記アップストリームプライマーの延長のために、鋳型−依存的重合酵素を利用し、前記鋳型−依存的重合酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素と異なる酵素である。

択一的に、本発明は、アップストリームオリゴヌクレオチドを利用せずとも実施可能である。ＰＴＯは、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性によって切断されうる。このような場合、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性を有する従来の酵素を利用できる。５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的重合酵素のうちで、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性を有する一部酵素があり、例えば、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素である。

ターゲット核酸配列の増幅及びＰＴＯの切断効率を考慮して、望ましくは、アップストリームオリゴヌクレオチドを用いて、本発明のＰＣＥＣアッセイを実施する。

段階（ｃ）：ＰＴＯから放出された断片とＣＴＯとのハイブリダイゼーション
ＰＴＯから放出された断片は、ＣＴＯとハイブリダイズされる。

ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位と、（ｉｉ）ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位とを含む。

ＣＴＯは、ＰＴＯから放出された断片の延長のための鋳型の役割を果たす。プライマーとしての役割をする前記断片は、ＣＴＯにハイブリダイズされ、延長されて延長二量体を形成する。

テンプレーティング部位がＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的な配列を有する限り、如何なる配列も含みうる。また、テンプレーティング部位がＰＴＯから放出された断片の延長のための鋳型の役割ができる限り、如何なる配列も含みうる。

前述したように、ＰＴＯの５’−タギング部位を有する断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることが望ましい。５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部を有する断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることが望ましい。ＰＴＯの５’−タギング部位の一部を有する断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインすることが望ましい。

一方、ＰＴＯの切断位置を予想することによって、ＣＴＯのキャプチャリング部位をデザインすることができる。例えば、ＣＴＯのキャプチャリング部位が５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインする場合、５’−タギング部位の一部を有する断片、または５’−タギング部位を有する断片は、キャプチャリング部位とハイブリダイズされ、以後延長される。５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部を含む断片が放出される場合、前記断片は、５’−タギング部位に相補的なヌクレオチド配列を含むようにデザインされたＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ、前記断片の３’−末端部位にミスマッチヌクレオチドが存在するにも拘らず、成功的に延長されうる。これは、プライマーの３’−末端が一部のミスマッチヌクレオチド（例えば、１−３ミスマッチヌクレオチド）を含むにも拘らず、プライマーが反応条件によって延長されるためである。

５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部を含む断片が放出される場合、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端の一部は、前記切断された３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に相補的なヌクレオチド配列を有するようにデザインすることによって、ミスマッチヌクレオチドと関連した問題を解決することができる（参照：図１）。

望ましくは、切断された３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に相補的なＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端の一部のヌクレオチド配列は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位上の予想される切断位置によって選択されうる。切断された３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に相補的なＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端の一部のヌクレオチド配列は、１−１０ヌクレオチドであることが望ましく、より望ましくは、１−５ヌクレオチド、さらに望ましくは、１−３ヌクレオチドである。

ＣＴＯの３’−末端は、断片とのハイブリダイゼーションに含まれない追加的なヌクレオチドを含みうる。また、ＣＴＯが、前記断片と安定してハイブリダイズされる限り、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、前記断片の一部（例えば、断片の３’−末端部位を含む断片の一部）にのみ相補的なヌクレオチド配列を含みうる。

本明細書で使われる用語“５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位”は、前述したように、ＣＴＯのキャプチャリング部位の多様なデザイン及び構成を含んで説明する。

ＣＴＯは、ヘアピン構造を有するようにデザインすることができる。

ＣＴＯの長さは、多様になりうる。例えば、ＣＴＯは、７−１０００ヌクレオチド、７−５００ヌクレオチド、７−３００ヌクレオチド、７−１００ヌクレオチド、７−８０ヌクレオチド、７−６０ヌクレオチド、７−４０ヌクレオチド、１５−１０００ヌクレオチド、１５−５００ヌクレオチド、１５−３００ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、２０−１０００ヌクレオチド、２０−５００ヌクレオチド、２０−３００ヌクレオチド、２０−１００ヌクレオチド、２０−８０ヌクレオチド、２０−６０ヌクレオチド、２０−４０ヌクレオチド、３０−１０００ヌクレオチド、３０−５００ヌクレオチド、３０−３００ヌクレオチド、３０−１００ヌクレオチド、３０−８０ヌクレオチド、３０−６０ヌクレオチド、または３０−４０ヌクレオチドの長さである。ＣＴＯのキャプチャリング部位は、ＰＴＯから放出された断片に特異的にハイブリダイズされる限り、如何なる長さも有しうる。例えば、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、５−１００ヌクレオチド、５−６０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、５−２０ヌクレオチド、１０−１００ヌクレオチド、１０−６０ヌクレオチド、１０−４０ヌクレオチド、１０−３０ヌクレオチド、１０−２０ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、１５−３０ヌクレオチド、または１５−２０ヌクレオチドの長さを有しうる。ＣＴＯのテンプレーティング部位は、ＰＴＯから放出された断片の延長反応で鋳型の役割ができる限り、如何なる長さも有しうる。例えば、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、１−９００ヌクレオチド、１−４００ヌクレオチド、１−３００ヌクレオチド、１−１００ヌクレオチド、１−８０ヌクレオチド、１−６０ヌクレオチド、１−４０ヌクレオチド、１−２０ヌクレオチド、２−９００ヌクレオチド、２−４００ヌクレオチド、２−３００ヌクレオチド、２−１００ヌクレオチド、２−８０ヌクレオチド、２−６０ヌクレオチド、２−４０ヌクレオチド、２−２０ヌクレオチド、５−９００ヌクレオチド、５−４００ヌクレオチド、５−３００ヌクレオチド、５−１００ヌクレオチド、５−８０ヌクレオチド、５−６０ヌクレオチド、５−４０ヌクレオチド、５−３０ヌクレオチド、１０−９００ヌクレオチド、１０−４００ヌクレオチド、１０−３００ヌクレオチド、１５−９００ヌクレオチド、１５−１００ヌクレオチド、１５−８０ヌクレオチド、１５−６０ヌクレオチド、１５−４０ヌクレオチド、または１５−２０ヌクレオチドの長さを有しうる。

ＣＴＯの３’−末端は、３’−ＯＨターミナルを有しうる。望ましくは、ＣＴＯの３’−末端は、その延長が防止されるようにブロッキングされる。ＣＴＯの非延長ブロッキングは、従来の方法によって達成されうる。例えば、ブロッキングは、ＣＴＯの最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基に、ビオチン、標識、ホスフェート基、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート、またはアルカンジオール残基のような化学的モイエティを追加して実施することができる。択一的に、ブロッキングは、最後のヌクレオチドの３’−ヒドロキシル基を除去するか、またはジデオキシヌクレオチドのように、３’−ヒドロキシル基がないヌクレオチドを用いて実施することができる。

ＰＴＯから放出された断片は、ＣＴＯとハイブリダイズされ、断片の延長に適した形態を提供する。また、非切断ＰＴＯが、その５’−タギング部位を通じてＣＴＯのキャプチャリング部位とハイブリダイズされるとしても、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位は、ＣＴＯにハイブリダイズされず、延長二量体の形成が防止される。

段階（ｃ）でのハイブリダイゼーションは、段階（ａ）でのハイブリダイゼーションについての説明を参照して詳細に説明される。

段階（ｄ）：ＰＴＯ断片の延長及び核酸切断酵素の切断位置生成
鋳型−依存的核酸重合酵素及び段階（ｃ）の結果物を用いて延長反応を実施する。ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされたＰＴＯ断片は、延長されて延長二量体を形成し、核酸切断酵素によって切断される切断位置（ｓｉｔｅ）が生成される。一方、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた非切断ＰＴＯは、延長されず、これにより、核酸切断酵素によって切断される切断位置も生成されない。

本明細書で使われる用語“延長二量体（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｄｕｐｌｅｘ）”は、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた断片が鋳型−依存的核酸重合酵素とＣＴＯのテンプレーティング部位を鋳型として用いて延長される延長反応によって形成された二量体を意味する。

延長二量体の形成によって、核酸切断酵素によって切断される切断位置が生成される。二量体に特異的に作用する多くの核酸切断酵素が当業界に知られている。本発明の核酸切断酵素は、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを提供する。

本発明の望ましい具現例によれば、核酸切断酵素は、制限酵素であり、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、制限酵素によって認識される配列を含み、段階（ｄ）の延長二量体の形成は、制限酵素の切断位置を生成させる。制限酵素切断位置が生成された延長二量体は、制限酵素によって切断されて、切断断片を形成し、これは、ターゲット核酸配列の存在を示す。

本発明の望ましい具現例によれば、核酸切断酵素は、リボヌクレアーゼであり、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、ＲＮＡ配列を含み、前記段階（ｄ）の延長二量体の形成は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二量体を形成させて、リボヌクレアーゼの切断位置が生成される。

本発明の望ましい具現例によれば、核酸切断酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼであり、段階（ｄ）の延長二量体の形成は、ＣＴＯ上に５’→３’エキソヌクレアーゼの切断位置を生成させる。ＣＴＯ上の切断位置は、延長二量体の形成以後に生成され、５’→３’エキソヌクレアーゼによって切断されて、ＣＴＯの５’−末端を含む切断断片を形成し、これは、ターゲット核酸配列の存在を示す。

本発明の望ましい具現例によれば、延長二量体形成によって生成された核酸切断酵素によって切断される切断位置は、ＤＮＡ二量体、ＲＮＡ二量体、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二量体を切断する核酸切断酵素の切断位置である。

ＰＴＯ及び／またはＣＴＯは、所望の種類の核酸切断酵素の切断位置が生成されるように製作及び構成することができる。

ＤＮＡ二量体に作用する核酸切断酵素（例えば、制限酵素及び５’→３’エキソヌクレアーゼ）の切断位置を生成させようとする場合、それぞれＤＮＡ分子からなるＰＴＯ及びＣＴＯを利用することが望ましい。ＤＮＡ分子からなるＰＴＯ断片は、ｄＮＴＰｓを用いて延長されて延長二量体が形成され、これにより、ＤＮＡ二量体に作用する核酸切断酵素（例えば、制限酵素及び５’→３’エキソヌクレアーゼ）の切断位置が生成される。

ＲＮＡ二量体に作用する核酸切断酵素の切断位置を生成させようとする場合、ＲＮＡ分子からなるＰＴＯ、またはＲＮＡ分子からなる５’−タギング部位を含むＰＴＯ、及びＲＮＡ分子からなるＣＴＯを利用することが望ましい。ＲＮＡ分子からなるＣＴＯにハイブリダイズされたＲＮＡ分子からなるＰＴＯ断片は、ＮＴＰｓを用いて延長されて延長二量体が形成され、これにより、ＲＮＡ二量体に作用する核酸切断酵素の切断位置が生成される。

ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二量体に作用する核酸切断酵素の切断位置を生成させようとする場合、ＤＮＡ分子からなるＰＴＯ、及びＲＮＡ分子からなるテンプレーティング部位を含むＣＴＯを利用することが望ましい。テンプレーティング部位のＲＮＡ分子は、１−１０つのリボヌクレオチドを含む。ＲＮＡ分子からなるテンプレーティング部位を含むＣＴＯにハイブリダイズされたＤＮＡ分子からなるＰＴＯ断片は、ｄＮＴＰｓを用いて延長されて延長二量体が形成され、これにより、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二量体に作用する核酸切断酵素（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）の切断位置が生成される。

段階（ｄ）で延長反応に利用される鋳型−依存的核酸重合酵素は、如何なる核酸重合酵素も含まれ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ重合酵素Ｉの“クレノウ”断片、熱安定性ＤＮＡ重合酵素及びバクテリオファージＴ７ＤＮＡ重合酵素を含む。望ましくは、前記核酸重合酵素は、多様なバクテリア種から得られる熱安定性ＤＮＡ重合酵素であり、これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｉｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｅｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｎｔｒａｎｉｋｉａｎｉｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃｈｌｉａｒｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｉｇｎｉｔｅｒｒａｅ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｏｓｈｉｍａｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｓ １７、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｂａｒｏｓｓｉ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ、Ａｑｕｉｆｅｘ ｐｙｒｏｐｈｉｌｕｓ、及びＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｅｕｓを含む。最も望ましくは、鋳型−依存的核酸重合酵素は、Ｔａｑ重合酵素である。

本発明の望ましい具現例によれば、段階（ｂ）で利用される５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、段階（ｄ）で利用される鋳型−依存的核酸重合酵素と同一である。より望ましくは、段階（ｂ）で利用される５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素、アップストリームプライマーの延長のために利用される鋳型−依存的核酸重合酵素、及び段階（ｄ）で利用される鋳型−依存的核酸重合酵素は、互いに同一である。

段階（ｅ）：核酸切断酵素を利用した延長二量体の切断
延長二量体形成によって核酸切断酵素の切断部位を生成させた後、適した核酸切断酵素を用いて延長二量体を切断し、切断断片が形成される。

本発明の望ましい具現例によれば、延長二量体の切断断片は、一本鎖または二本鎖であり、延長二量体の切断は、少なくとも２種の断片を形成させることができる。例えば、制限酵素による延長二量体の切断は、二本鎖状態の２種の切断断片を形成し、前記二本鎖断片は、反応条件によって一本鎖形態で分離されうる。５’→３’エキソヌクレアーゼを利用する切断反応で、単一切断断片が形成されうる。

本明細書で、段階（ｂ）の切断反応は、１次切断反応、段階（ｅ）の切断反応は、２次切断反応と言及される。

２次切断反応で利用される核酸切断酵素は、当業界に公知の如何なる酵素も含む。

本発明の望ましい具現例によれば、２次切断反応で利用される核酸切断酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ、制限酵素及びリボヌクレアーゼであり、より望ましくは、熱安定性５’→３’エキソヌクレアーゼ、制限酵素またはリボヌクレアーゼである。

本発明の望ましい具現例によれば、２次切断反応で利用される核酸切断酵素は、二量体分子に特異的に作用する核酸切断酵素を含む。

前記核酸切断酵素のうちから、５’→３’エキソヌクレアーゼは、ＤＮＡ二量体の５’−末端を切断する。図２及び図５に示したように、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯの切断によって形成されたＰＴＯ断片がＣＴＯにハイブリダイズされた後、延長されて延長二量体が形成される。延長二量体でＣＴＯの５’−末端は、５’→３’エキソヌクレアーゼによって切断されて、切断断片を形成し、これは、ターゲット核酸配列の存在を示す。

５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的ＤＮＡ重合酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、幾つかの重合酵素は、５’→３’エンドヌクレアーゼ活性度を有する。

５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的ＤＮＡ重合酵素は、段階（ｂ）でアップストリームオリゴヌクレオチド−依存的切断反応を誘導することができる（米国特許第５，２１０，０１５号参照）。また、これらは、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的切断反応も誘導することができる（ｌａｗｙｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１９９３，２：２７５−２８７、及びＷＯ ２００８／０１１００４参照）。

本発明の望ましい具現例によれば、５’→３’エキソヌクレアーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的ＤＮＡ重合酵素であり、より望ましくは、熱安定性ＤＮＡ重合酵素である。熱安定性ＤＮＡ重合酵素は、段階（ｂ）の記載内容を参照して詳しく説明される。望ましくは、延長二量体の切断のための５’→３’エキソヌクレアーゼは、Ｔａｑ重合酵素である。

本発明の望ましい具現例によれば、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的ＤＮＡ重合酵素は、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的切断反応を誘導して段階（ｅ）で延長二量体を切断することができる。

本発明の望ましい具現例によれば、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存性ＤＮＡ重合酵素は、段階（ｂ）でアップストリームオリゴヌクレオチド−依存的切断を誘導するだけではなく、段階（ｅ）で延長二量体のアップストリームオリゴヌクレオチド−独立的切断を誘導することができる。

本発明の望ましい具現例によれば、鋳型−依存的ＤＮＡ重合酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による延長二量体のアップストリームオリゴヌクレオチド−独立的切断は、延長二量体の切断の発生を示すシグナルを提供するのに十分な効率を示す。

本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームオリゴヌクレオチド−独立的５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的ＤＮＡ重合酵素による延長二量体の切断は、延長二量体に存在する標識の位置または標識の結合類型に影響を受ける。望ましくは、延長二量体のＣＴＯの５’−末端に標識が結合される場合、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的ＤＮＡ重合酵素による延長二量体の切断は、ＣＴＯの５’−末端のホスフェート基に標識が連結された場合、特に、カーボンスぺーサ（ｃａｒｂｏｎ ｓｐａｃｅｒ）を介して連結された場合によりも効率的であり得る。標識が、ＣＴＯの５’−末端の塩基に連結されるか、カーボンスぺーサを介して連結されない場合、延長二量体の切断が起こらないこともある。

核酸切断酵素として５’→３’エキソヌクレアーゼを利用する場合、延長二量体の切断発生検出のための標識は、ＰＴＯに結合されないことが望ましい。

核酸切断酵素のうち、制限酵素は、前記段階（ｄ）で延長二量体の形成によって生成された制限酵素切断位置を切断する。図３、図６及び図８に示したように、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯの切断によって形成されたＰＴＯ断片が、ＣＴＯ（制限酵素によって認識される配列含む）にハイブリダイズされた後に延長されて、制限酵素切断位置を有する延長二量体が形成される。制限酵素は、このような延長二量体を核酸内部切断方式で（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）切断して、切断断片を形成し、これは、ターゲット核酸配列の存在を示す。

本発明の望ましい具現例によれば、制限酵素は、二量体の特定配列を特異的に認識して、これを切断することができる制限酵素であり、より望ましくは、熱安定性制限酵素である。当業界に知られた多様な制限酵素を利用できる。

本発明の望ましい具現例によれば、核酸切断酵素は、リボヌクレアーゼであり、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、ＲＮＡ配列を含み、段階（ｄ）の延長二量体の形成は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二量体を形成させて、リボヌクレアーゼの切断位置が生成される。リボヌクレアーゼの切断位置は、リボヌクレアーゼによって段階（ｅ）で切断されて、ターゲット核酸配列の存在を示す切断断片を形成する。

本発明の望ましい具現例によれば、本発明で利用されるリボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ ＨまたはＥｘｏ ＩＩＩである。

ＲＮａｓｅ Ｈは、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二量体のＲＮＡ部位を切断することができるエンドリボヌクレアーゼの１つである。本発明で、ＲＮａｓｅ Ｈが利用される場合、ＣＴＯは、テンプレーティング部位にＲＮＡ分子を含むことが望ましい。図４、図７及び図９に示したように、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯの切断によって形成されたＰＴＯ断片が、ＣＴＯのテンプレーティング部位にハイブリダイズされた後に延長されて、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド延長二量体が形成される。ＲＮａｓｅ Ｈが、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド延長二量体を核酸内部切断方式で切断して、切断断片を形成し、これは、ターゲット核酸配列の存在を示す。

Ｅｘｏ ＩＩＩは、ＲＮａｓｅ活性を有すると知られている（Ｍｏｌ ＣＤ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３７４（６５２０）：３８１−３８６（１９９５））。本発明で、Ｅｘｏ ＩＩＩが利用される場合、ＲＮａｓｅ Ｈと同一な方式でターゲット核酸配列の存在を示す切断断片を形成する。

本発明の望ましい具現例によれば、核酸切断酵素は、熱安定性核酸切断酵素である。

段階（ｆ）：ターゲット核酸配列の存在を示す延長二量体の切断の発生検出
延長二量体の切断反応後、延長二量体の切断の発生を検出することによって、ターゲット核酸配列の存在を確認する。

延長二量体の切断発生の検出は、多様な方法を通じて実施することができる。

延長二量体の切断発生は、延長二量体の切断断片を直接に分析して検出し、例えば、毛細管電気泳動（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）がある。このような場合、ＰＴＯ及び／またはＣＴＯは、切断断片が単一蛍光標識を有するように製作することが望ましく、これにより、より便利な方式で切断断片を検出することができる。

本発明の望ましい具現例によれば、延長二量体の切断発生の検出は、シグナリングシステムを用いて実施される。本発明から採択されたシグナリングシステムは、延長二量体切断と共にシグナル発生を連動（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ）させたことに特徴がある。すなわち、延長二量体の切断を誘導して検出可能なシグナルが提供される。

本発明の望ましい具現例によれば、本発明で利用されるシグナリングシステムは、延長二量体の切断によってシグナルの変化を発生させる。延長二量体の切断は、ターゲット核酸配列が存在する場合にのみ発生するので、ターゲット核酸配列の存在を示すシグナルは、シグナル変化と共に同時に提供される。したがって、必要な場合、本発明は、リアルタイム方式で実施される。

本発明の望ましい具現例によれば、延長二量体は、少なくとも１種の標識を有し、前記標識は、前記ＰＴＯまたはＣＴＯに連結された標識、またはインターカレーティング染料（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｄｙｅ）から由来され、前記延長二量体の切断の発生は、前記少なくとも１種の標識からのシグナルを検出して実施する。

本発明に適した標識の例は、次のように詳細に説明される：
（ｉ）単一標識
本発明は、単一標識を用いてターゲット核酸配列の存在を示す延長二量体切断発生に対するシグナルを提供することができる。

単一標識は、特に制限されず、蛍光標識、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）標識、化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）標識、または電気化学的（ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ）標識を含む。望ましくは、前記単一標識は、蛍光標識である。

オリゴヌクレオチドとの結合またはオリゴヌクレオチドから放出されるか否かによって、異なるシグナルを示す単一標識がある。このような単一標識を利用する場合、本発明は、液相でも延長二量体の切断に連動されたシグナリングシステムを作ることができる。例えば、蛍光性テルビウムキレート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｔｅｒｂｉｕｍ ｃｈｅｌａｔｅ）は、オリゴヌクレオチドに結合またはオリゴヌクレオチドから放出されるか否かによって、異なるシグナルを提供する（Ｎｕｒｍｉ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，Ｖｏｌ．２８ Ｎｏ．８ ｅ２８）。他の例としては、単一標識が偏光された光（ｐｌａｎｅ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｇｈｔ）による励起を通じて偏光された蛍光（ａ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を放出する染料（ｄｙｅ）である場合、切断断片は、ＦＰ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）方法を用いて検出されうる。放出された蛍光の偏光程度は、標識が連結された分子の動き（ｍｏｔｉｏｎ）に影響を受ける。一般的に、動きが速くなれば、偏光の程度が低くなる（Ｌａｔｉｆら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１：４３６−４４０，２００１）。

本発明の望ましい具現例によれば、ＣＴＯは、単一標識を有し、段階（ｅ）の延長二量体切断は、単一標識を含む切断断片を形成し、延長二量体が切断される以前の単一標識から出るシグナルは、延長二量体が切断された以後の単一標識から出るシグナルと異なって、このようなシグナルの差が延長二量体の切断発生を検出させる。

本発明の望ましい具現例によれば、ＰＴＯは、単一標識を有し、段階（ｅ）の延長二量体切断は、単一標識を含む切断断片を形成し、延長二量体が切断される以前の単一標識から出るシグナルは、延長二量体が切断された以後の単一標識から出るシグナルと異なって、このようなシグナルの差が延長二量体の切断発生を検出させる。

本発明の望ましい具現例によれば、延長二量体の切断によって異なるシグナルを提供する単一標識は、蛍光性テルビウムキレートまたは偏光された蛍光を放出する単一標識である。

本発明の望ましい具現例によれば、単一標識は、ＣＴＯに連結されており、より望ましくは、ＣＴＯのテンプレーティング部位、さらに望ましくは、ＣＴＯのテンプレーティング部位の５’−末端である。

本発明の望ましい具現例によれば、単一標識は、ＰＴＯに連結されており、より望ましくは、ＰＴＯの５’−タギング部位である。望ましくは、ＰＴＯ断片が、単一標識を有するように単一標識がＰＴＯ上に位置する。

本発明で、単一標識を利用する場合、本発明は、固定化されたＣＴＯを用いて固相で実施することが望ましい。本発明で、単一標識を用いて固相で実施する場合、ＰＴＯまたはＣＴＯに結合された単一標識は、延長二量体の切断の発生を示すシグナルを提供することができる。

本発明の望ましい具現例によれば、ＣＴＯは、その５’−末端または３’−末端を通じて固相基質上に固定化される。

本発明の望ましい具現例によれば、ＣＴＯは、単一標識を有し、段階（ｅ）の延長二量体切断は、単一標識を含む切断断片を形成し、切断断片は、固相基質から放出されて、固相基質上でシグナルの変化をもたらして、延長二量体の切断の発生を示すシグナルを提供する。

より望ましくは、ＣＴＯは、その３’−末端を通じて固相基質上に固定化されており、ＰＴＯは、単一標識を有し、段階（ｅ）の延長二量体切断は、単一標識を含む切断断片を形成し、切断断片は、固相基質から放出されて、固相基質上でシグナルの変化をもたらして、延長二量体の切断の発生を示すシグナルを提供する。

ＣＴＯが、３’−末端を通じて固定化されており、単一標識を利用する場合、単一標識は、ＣＴＯのテンプレーティング部位に結合されており、核酸切断酵素の切断位置は、５’→３’エキソヌクレアーゼ、制限酵素またはリボヌクレアーゼの切断位置であることが望ましい。

図５に示したように、３’−末端を通じて固相基質上に固定化されたＣＴＯにＰＴＯ断片がハイブリダイズされ、延長されて延長二量体が形成になれば、５’→３’エキソヌクレアーゼの切断位置が生成される。５’→３’エキソヌクレアーゼが切断位置を切断することによって、延長二量体が切断されて、ＣＴＯの５’−末端から蛍光レポーター分子が放出される。ターゲット核酸配列が存在する場合、固定化されたＣＴＯを含むスポットで蛍光が減少するか、消滅する。ターゲット核酸配列が不存在である場合、固定化されたＣＴＯを含むスポットで蛍光が減少するか、消滅しない。

択一的に、ＣＴＯは、その５’−末端を通じて固相基質上に固定化されており、ＰＴＯは、単一標識を有し、段階（ｅ）の延長二量体切断は、単一標識を含む切断断片を形成し、切断断片は、固相基質から放出されて、固相基質上でシグナルの変化をもたらして、延長二量体の切断の発生を示すシグナルを提供する。

図６に例示されたように、５’−末端を通じて固相基質上に固定化されたＣＴＯ（テンプレーティング部位に制限酵素によって認識される配列を含む）にＰＴＯ断片がハイブリダイズされ、延長されて延長二量体が形成になれば、制限酵素の切断位置が生成される。制限酵素は、延長二量体を切断してＣＴＯの３’−末端から蛍光レポーター分子を放出させる。ターゲット核酸配列が存在する場合、固定化されたＣＴＯを含むスポットで蛍光が減少するか、消滅する。ターゲット核酸配列が不存在である場合、固定化されたＣＴＯを含むスポットで蛍光が減少するか、消滅しない。

図７は、ＲＮａｓｅ Ｈを利用する例を示す。５’−末端を通じて固相基質上に固定化されたＣＴＯ（テンプレーティング部位にＲＮＡ分子を含む）にＰＴＯ断片がハイブリダイズされ、延長されて延長二量体が形成になれば、ＲＮａｓｅ Ｈの切断位置が生成される。ＲＮａｓｅ Ｈは、延長二量体を切断してＣＴＯの３’−末端から蛍光レポーター分子を放出させる。ターゲット核酸配列が存在する場合、固定化されたＣＴＯを含むスポットで蛍光が減少するか、消滅する。ターゲット核酸配列が不存在である場合、固定化されたＣＴＯを含むスポットで蛍光が減少するか、消滅しない。

本発明の望ましい具現例によれば、ＣＴＯは、その５’−末端を通じて固相基質上に固定化されており、ＰＴＯは、単一標識を有し、段階（ｅ）の延長二量体切断は、単一標識を含む切断断片を形成し、切断断片は、固相基質から放出されて、固相基質上でシグナルの変化をもたらして、延長二量体の切断の発生を示すシグナルを提供する。

本発明の望ましい具現例によれば、単一標識は、ＰＴＯに連結されており、より望ましくは、ＰＴＯの５’−タギング部位である。望ましくは、ＰＴＯ断片が、単一標識を有するように単一標識がＰＴＯ上に位置する。

図８及び図９は、単一標識を有するＰＴＯを利用する例を示す。図８で、５’−末端を通じて固相基質上に固定化されたＣＴＯ（テンプレーティング部位に制限酵素によって認識される配列を含む）にＰＴＯ断片がハイブリダイズされ、延長されて延長二量体が形成になれば、制限酵素の切断位置が生成される。制限酵素は、延長二量体を切断してＰＴＯの５’−末端から蛍光レポーター分子を放出させる。ターゲット核酸配列が存在する場合、固定化されたＣＴＯを含むスポットで蛍光が減少するか、消滅する。ターゲット核酸配列が不存在である場合、固定化されたＣＴＯを含むスポットで蛍光が減少するか、消滅しない。図９で、５’−末端を通じて固相基質上に固定化されたＣＴＯ（テンプレーティング部位にＲＮＡ分子を含む）にＰＴＯ断片がハイブリダイズされ、延長されて延長二量体が形成になれば、ＲＮａｓｅ Ｈの切断位置が生成される。ＲＮａｓｅ Ｈは、延長二量体を切断してＰＴＯの５’−末端から蛍光レポーター分子を放出させる。ターゲット核酸配列が存在する場合、固定化されたＣＴＯを含むスポットで蛍光が減少するか、消滅する。ターゲット核酸配列が不存在である場合、固定化されたＣＴＯを含むスポットで蛍光が減少するか、消滅しない。

５’−末端を通じて固相基質上にＣＴＯが固定化され、単一標識を利用する場合、単一標識は、ＣＴＯまたはＰＴＯに結合され、制限酵素またはリボヌクレアーゼのような核酸切断酵素の切断位置が生成されることが望ましい。

固相反応に利用される単一標識は、特定の特徴が要求されない。固相反応のためには、如何なる単一標識も利用されうる。これは、延長二量体の切断以後、固相基質上の単一標識の存否によって単一延長二量体の切断発生によるシグナルの差が誘導されることができるためである。

前述したように、２次切断反応と連携された単一標識が提供するシグナルの存否、またはシグナルの変化（強度の増加または減少）を分析することによって、ターゲット核酸配列を検出することができる。

前記蛍光単一標識の望ましい例は、次の通りである：Ｃｙ２^ＴＭ（５０６）、ＹＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−１（５０９）、ＹＯＹＯ^ＴＭ−１（５０９）、Ｃａｌｃｅｉｎ（５１７）、ＦＩＴＣ（５１８）、ＦｌｕｏｒＸ^ＴＭ（５１９）、Ａｌｅｘａ^ＴＭ（５２０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １１０（５２０）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ ５００（５２２）、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ ４８８（５２４）、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ^ＴＭ（５２５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ（５２７）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ １２３（５２９）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ（５３１）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｇｒｅｅｎ^ＴＭ（５３３）、ＴＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−１（５３３）、ＴＯＴＯ１（５３３）、ＪＯＥ（５４８）、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０（５５０）、Ｄｉｌ（５６５）、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８（５６８）、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０（５７０）、Ｃｙ３^ＴＭ（５７０）、Ａｌｅｘａ^ＴＭ ５４６（５７０）、ＴＲＩＴＣ（５７２）、Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ^ＴＭ（５７５）、Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ Ｒ＆Ｂ（５７５）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（５７５）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｏｒａｎｇｅ^ＴＭ（５７６）、Ｐｙｒｏｎｉｎ Ｙ（５８０）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ（５８０）、ＴＡＭＲＡ（５８２）、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｒｅｄ^ＴＭ（５９０）、Ｃｙ３．５^ＴＭ（５９６）、ＲＯＸ（６０８）、Ｃａｌｃｉｕｍ Ｃｒｉｍｓｏｎ^ＴＭ（６１５）、Ａｌｅｘａ^ＴＭ ５９４（６１５）、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（６１５）、Ｎｉｌｅ Ｒｅｄ（６２８）、ＹＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−３（６３１）、ＹＯＹＯ^ＴＭ−３（６３１）、Ｒ−ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４２）、Ｃ−Ｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（６４８）、ＴＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−３（６６０）、ＴＯＴＯ３（６６０）、ＤｉＤ ＤｉｌＣ（５）（６６５）、Ｃｙ５^ＴＭ（６７０）、Ｔｈｉａｄｉｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ（６７１）、Ｃｙ５．５（６９４）、ＨＥＸ（５５６）、ＴＥＴ（５３６）、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｂｌｕｅ（４４７）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｇｏｌｄ ５４０（５４４）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｏｒａｎｇｅ ５６０（５５９）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ５９０（５９１）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０（６１０）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６３５（６３７）、ＦＡＭ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（５２０）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−Ｃ３（５２０）、Ｐｕｌｓａｒ６５０（５６６）、Ｑｕａｓａｒ ５７０（６６７）、Ｑｕａｓａｒ ６７０（７０５）、及びＱｕａｓａｒ ７０５（６１０）。カッコの数字は、ナノメートル単位で表示した発光最大波長である。

望ましくは、ＪＯＥ、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、及びフルオレセインベースの標識（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｂａｓｅｄ ｌａｂｅｌ）である。

単一標識は、従来の方法を用いてＣＴＯまたはＰＴＯに結合されうる。望ましくは、標識は、少なくとも３つの炭素原子を含むスぺーサ（ｓｐａｃｅｒ）（例えば、３−カーボンスぺーサ、６−カーボンスぺーサ、または１２−カーボンスぺーサ）を介してＣＴＯまたはＰＴＯに結合される。

本発明の望ましい具現例によれば、ＣＴＯに結合される単一標識は、５’−末端またはそれから１−５ヌクレオチド離隔した位置にある。択一的に、ＣＴＯに結合される単一標識は、３’−末端またはそれから１−５ヌクレオチド離隔した位置にある。

本発明の望ましい具現例によれば、ＰＴＯに結合される単一標識は、５’−末端またはそれから１−５ヌクレオチド離隔した位置にある。

（ｉｉ）相互作用的二重標識
相互作用的標識システムは、供与体分子及び受容体分子の間にエネルギーが非放射能的（ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｉｖｅｌｙ）に伝達されるシグナル発生システムである。相互作用的標識システムの代表的な例として、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識システムは、蛍光レポーター分子（供与体分子）及びクエンチング分子（受容体分子）を含む。ＦＲＥＴでエネルギー供与体は、蛍光性であるが、エネルギー受容体は、蛍光性または非蛍光性であり得る。相互作用的標識システムの他の形態で、エネルギー供与体は、非蛍光性、例えば、クロモフォア（ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ）であり、エネルギー受容体は、蛍光性である。相互作用的標識システムのさらに他の形態で、エネルギー供与体は、発光性（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）、例えば、生物発光性、化学発光性、または電気化学発光性であり、受容体は、蛍光性である。供与体分子及び受容体分子は、本発明でそれぞれレポーター分子及びクエンチャー分子で説明される。

望ましくは、延長二量体の切断発生（すなわち、ターゲット核酸配列の存在）を示すシグナルは、相互作用的標識システムによって発生し、より望ましくは、ＦＲＥＴ標識システム（すなわち、相互作用的二重標識システム）によって発生する。

本発明の望ましい具現例によれば、相互作用的標識は、ＣＴＯに結合される。

本発明の望ましい具現例によれば、核酸切断酵素によって切断される切断位置は、ＣＴＯに結合されたレポーター分子及びクエンチャー分子の間に位置し、延長二量体が形成される以前には、クエンチャー分子はレポーター分子からのシグナルをクエンチングし、延長二量体の切断は、レポーター分子とクエンチャー分子とを互いに分離させ、延長二量体の切断の発生は、標識からのシグナルを測定して検出される。

本発明の相互作用的標識システムは、液相及び固相で有用である。

相互作用的標識システムを利用する場合、望ましくは、段階（ｄ）から生成される切断位置は、５’→３’エキソヌクレアーゼ、制限酵素またはリボヌクレアーゼの切断位置である。

図２は、延長二量体形成による５’→３’エキソヌクレアーゼ切断位置の導入を示す。ＰＴＯ断片がＣＴＯにハイブリダイズされ、延長されて延長二量体が形成され、これにより、５’→３’エキソヌクレアーゼの切断位置が生成される。５’→３’エキソヌクレアーゼの切断位置は、ＣＴＯに結合されたレポーター分子及びクエンチャー分子の間に位置する。

延長二量体が形成される前に、クエンチャー分子はレポーター分子からのシグナルをクエンチングするのに適した位置に位置する。望ましくは、前記２つの標識が、ＣＴＯ上の距離によって近接しているか、またはランダムコイル（ｃｏｌｉ）及びヘアピン構造のような立体的構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を形成して、３次元的な方式で近接している場合、クエンチングが発生する。

５’→３’エキソヌクレアーゼは、延長二量体の５’−末端を切断し、蛍光レポーター分子を放出させて、蛍光レポーター分子からのシグナルの変化を招く。蛍光シグナルの変化を測定して、延長二量体の切断発生を検出し、これは、ターゲット核酸配列の存否を決定する。

クエンチャー分子が蛍光性である場合、クエンチャー分子からのシグナルを用いて測定することが望ましい。

図３は、延長二量体形成による制限酵素切断位置の導入を示す。ＰＴＯ断片がＣＴＯにハイブリダイズされ、延長されて延長二量体が形成され、これにより、制限酵素の切断位置が生成される。制限酵素の切断位置は、ＣＴＯに結合されたレポーター分子及びクエンチャー分子の間に位置する。制限酵素が切断位置を切断することによって、延長二量体を切断し、蛍光レポーター分子を放出させて、蛍光レポーター分子からのシグナルの変化を招く。蛍光シグナルの変化を測定して、延長二量体の切断発生を検出し、これは、ターゲット核酸配列の存否を決定する。

図４は、延長二量体形成によるＲＮａｓｅの切断位置の導入を示す。ＰＴＯ断片がＣＴＯ（テンプレーティング部位にＲＮＡ分子を含む）にハイブリダイズされ、延長されて延長二量体が形成され、これにより、ＲＮａｓｅの切断位置が生成される。ＲＮａｓｅの切断位置は、ＣＴＯに結合されたレポーター分子及びクエンチャー分子の間に位置する。ＲＮａｓｅが切断位置を切断することによって、延長二量体を切断し、蛍光レポーター分子を放出させて、蛍光レポーター分子からのシグナルの変化を招く。蛍光シグナルの変化を測定して、延長二量体の切断発生を検出し、これは、ターゲット核酸配列の存否を決定する。

本発明の望ましい具現例によれば、レポーター分子及びクエンチャー分子のうち少なくとも１つは、ＣＴＯのテンプレーティング部位に結合されており、より望ましくは、ＣＴＯの５’−末端である。

本発明の望ましい具現例によれば、レポーター分子及びクエンチャー分子いずれもは、ＣＴＯのテンプレーティング部位に結合されている。

本発明の望ましい具現例によれば、レポーター分子及びクエンチャー分子のうち１つは、ＣＴＯの５’−末端に、他の１つは、３’−末端に結合されている。

本発明の望ましい具現例によれば、ＣＴＯのテンプレーティング部位に結合されたレポーター分子またはクエンチャー分子は、その５’−末端または５’−末端から１−５ヌクレオチド離隔した位置に位置している。例えば、クエンチャー分子は、ＣＴＯのテンプレーティング部位の５’−末端または５’−末端から１−５離隔した位置に位置し、レポーター分子は、クエンチャー分子から５−５０ヌクレオチド離隔した位置に位置しうる。

本発明の望ましい具現例によれば、相互作用的二重標識は、延長二量体が形成される場合には、相互作用的二重標識間のクエンチング状態が保持され、延長二量体の切断によって標識が放出される場合には、相互作用的二重標識間のアンクエンチング状態になる適した位置に位置する。

延長二量体の切断の間のリアルタイムシグナル発生を考慮して、レポーター分子及びクエンチャー分子は、最大２５ヌクレオチドほど互いに離隔した位置に位置し、より望ましくは、最大２０ヌクレオチド、さらに望ましくは、最大１５ヌクレオチド、最も望ましくは、最大１０ヌクレオチドである。本発明の望ましい具現例によれば、レポーター分子及びクエンチャー分子は、少なくとも３ヌクレオチドほど互いに離隔した位置に位置し、より望ましくは、少なくとも４ヌクレオチド、さらに望ましくは、少なくとも５ヌクレオチド、最も望ましくは、少なくとも６ヌクレオチドである。

延長二量体が形成される場合、ＣＴＯ上のレポーター分子及びクエンチャー分子は、構造的に離隔してクエンチャー分子がレポーター分子からのシグナルをアンクエンチングさせうる。延長二量体の切断は、レポーター分子をクエンチャー分子から完全に分離させ、アンクエンチングされながら招かれるシグナルの変化をより大きくできる。

また、標識（例えば、レポーター分子）を有する切断断片が生成されるので、より柔軟であるか、便利な条件（例えば、高−厳格条件または固相で洗浄後の条件）下で、切断断片に結合された標識からのシグナルを直接検出して、延長二量体の切断発生を分析することができる。

本発明の望ましい具現例によれば、固定化されたＣＴＯに結合された相互作用的二重標識のうちの１つは、延長二量体の切断後、固相基質上に残留する。

本発明の望ましい具現例によれば、固相基質上に固定化されたＣＴＯが相互作用的二重標識を有し、核酸切断酵素として５’→３’エキソヌクレアーゼを利用する場合、二量体からＣＴＯの断片が分離するのに適した条件を付与するか、またはＣＴＯの内部ヌクレオチドに５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する耐性を付与することによって、延長二量体の切断後、相互作用的二重標識のうちの１つを固相基質上に確実に残留させうる。

本発明の望ましい具現例によれば、５’→３’エキソヌクレアーゼに活性に対する耐性は、５’→３’エキソヌクレアーゼに活性に対する耐性を有するバックボーンがあるヌクレオチドによって付与され、多様なホスホロチオエート連結（ｌｉｎｋａｇｅ）、ホスホネート連結、ホスホロアミダート連結、及び２’−カーボーハイドレート変形を含み、より望ましくは、ホスホロチオエート連結、アルキルホスホトリエステル連結、アリールホスホトリエステル連結、アルキルホスホネート連結、アリールホスホネート連結、ハイドロゲンホスホネート連結、アルキルホスホロアミダート連結、アリールホスホロアミダート連結、ホスホロセレネート連結、２’−Ｏ−アミノプロピル変形、２’−Ｏ−アルキル変形、２’−Ｏ−アリル変形、２’−Ｏ−ブチル変形、α−アノマーオリゴデオキシヌクレオチド、及び１−（４’−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）変形を含む。

本発明に利用されるレポーター分子及びクエンチャー分子は、当業界に公知されている如何なる物質も含み、その例は、前述した蛍光単一標識の説明を参照して説明することができる。

適したレポーター−クエンチャー対は、次のように多くの文献に開示されている：Ｐｅｓｃｅら、ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｗｈｉｔｅら、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７０）；Ｂｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２^ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃｏｌｏｒ ＡＮＤ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７６）；Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，１９９２）；Ｐｒｉｎｇｓｈｅｉｍ，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９４９）；Ｈａｕｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｐ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，６^ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．，１９９６）；米国特許第３，９９６，３４５号、及び第４，３５１，７６０号。

本発明で、広範囲波長または特定波長の蛍光をクエンチングできる非蛍光ブラッククエンチャー分子が利用されるということは、注目すべきことである。非蛍光ブラッククエンチャー分子の例は、ＢＨＱ及びＤＡＢＣＹＬである。

本発明のためのＦＲＥＴ標識で、レポーターは、ＦＲＥＴの供与体を含み、クエンチャーは、ＦＲＥＴの残りのパートナー（受容体）を含む。例えば、フルオレセイン色素（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｙｅ）は、レポーターとして利用され、ローダミン色素（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ ｄｙｅ）は、クエンチャーとして利用される。

（ｉｉｉ）インターカレーティング標識（Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ｌａｂｅｌ）
本発明では、インターカレーティング標識を用いて２次切断反応とターゲット核酸配列の存在を示すシグナルの発生とを連携させることができる。

試料内に存在する二本鎖核酸分子が、シグナルを発生させることができるために、固定化されたＣＴＯを利用する固相反応では、インターカレーティング標識がより有用である。

本発明の望ましい具現例によれば、ＣＴＯは、その５’−末端または３’−末端を通じて固相基質上に固定化されており、インターカレーティング染料が標識として利用され、段階（ｅ）の延長二量体切断は、インターカレーティング染料を含む切断断片を形成し、切断断片は、固相基質から放出されて、固相基質上でシグナルの変化をもたらして、延長二量体の切断の発生を示すシグナルを提供する。このような場合、段階（ｅ）の２次切断反応は、制限酵素またはＲＮａｓｅを用いて実施することが望ましい。

本発明の望ましい具現例によれば、固相基質上に固定化されていない切断断片は、固相基質から解離される。

本発明で、有用なインターカレーティング染料の例は、ＳＹＢＲ^ＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｉ、ＰＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−１、ＢＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−１、ＳＹＴＯ^ＴＭ４３、ＳＹＴＯ^ＴＭ４４、ＳＹＴＯ^ＴＭ４５、ＳＹＴＯＸ^ＴＭＢｌｕｅ、ＰＯＰＯ^ＴＭ−１、ＰＯＰＯ^ＴＭ−３、ＢＯＢＯ^ＴＭ−１、ＢＯＢＯ^ＴＭ−３、ＬＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−１、ＪＯ−ＰＲＯ^ＴＭ−１、ＹＯ−ＰＲＯ^ＴＭ１、ＴＯ−ＰＲＯ^ＴＭ１、ＳＹＴＯ^ＴＭ１１、ＳＹＴＯ^ＴＭ１３、ＳＹＴＯ^ＴＭ１５、ＳＹＴＯ^ＴＭ１６、ＳＹＴＯ^ＴＭ２０、ＳＹＴＯ^ＴＭ２３、ＴＯＴＯ^ＴＭ−３、ＹＯＹＯ^ＴＭ３、ＧｅｌＳｔａｒ^ＴＭ、及びｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅを含む。インターカレーティング染料が、二本鎖核酸分子内に特異的に割り込んでシグナルを発生させる。

ＰＴＯ及びＣＴＯは、天然ｄＮＭＰｓで構成することができる。択一的に、ＰＴＯ及びＣＴＯは、変形ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチド、例えば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、参照：ＰＣＴ出願第ＷＯ ９２／２０７０２号）及びＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ、参照：ＰＣＴ出願第ＷＯ ９８／２２４８９号、第ＷＯ ９８／３９３５２号、及び第ＷＯ ９９／１４２２６号）を含みうる。ＰＴＯ及びＣＴＯは、デオキシイノシン、イノシン、１−（２’−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３−ニトロピロール、及び５−ニトロインドールのようなユニバーサル塩基を含みうる。用語“ユニバーサル塩基”は、天然ＤＮＡ／ＲＮＡ塩基のそれぞれに対してほぼ区別なしに塩基対を形成できることを意味する。

前述したように、ＰＴＯは、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から３’−方向に離隔した一位置で切断されうる。切断位置は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に位置しうる。ＰＴＯ断片が、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部を含む場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部にハイブリダイズされるＣＴＯの位置は、ユニバーサル塩基、縮退性配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはそれらの組合わせを含みうる。例えば、ＰＴＯが、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から３’−方向に１つのヌクレオチドほど離隔した一位置で切断されるならば、前記ヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのために、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端の一部は、ユニバーサル塩基を含むことが有利である。もし、ＰＴＯが、ＰＴＯの５’−タギング部位の３’−末端から３’−方向に２つのヌクレオチドほど離隔した一位置で切断されるならば、ＣＴＯのキャプチャリング部位の５’−末端は、縮退性配列を含み、その３’−方向に隣接したヌクレオチドは、ユニバーサル塩基を含むことが有利である。このように、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部の多様な位置でＰＴＯの切断が起こる場合、ＣＴＯにユニバーサル塩基及び縮退性配列を利用することが有用である。また、アップストリームプライマー延長−依存的切断誘導下で、同一な５’−タギング部位を有するＰＴＯを複数のターゲット核酸配列スクリーニングに利用する場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部が、互いに異なるＰＴＯ断片を生成することができる。このような場合、ユニバーサル塩基及び縮退性配列は、ＣＴＯに有用に使われる。ＣＴＯにユニバーサル塩基及び縮退性配列を利用する戦略は、複数のターゲット核酸配列のスクリーニングのために、一タイプのＣＴＯまたは最小限のタイプのＣＴＯを使う。

本発明の望ましい具現例によれば、本発明の方法は、反復サイクルの間に変性過程を含み、段階（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｄ）、（ａ）−（ｅ）、または（ａ）−（ｆ）を繰り返す段階をさらに含み、望ましくは、ダウンストリームプライマーを共に含む。このような繰り返しは、ターゲット核酸配列及び／またはターゲットシグナルを増幅させる。

本発明の望ましい具現例によれば、本発明の方法は、段階（ａ）−（ｂ）及び段階（ｃ）−（ｆ）または段階（ａ）−（ｄ）、及び段階（ｅ）−（ｆ）は、１つの反応容器または個別反応容器で実施する。

本発明の望ましい具現例によれば、本発明の方法は、反復サイクルの間に変性過程を含み、前記段階（ａ）−（ｂ）または（ａ）−（ｄ）を繰り返す段階をさらに含む。

本発明の望ましい具現例によれば、段階（ａ）−（ｆ）は、１つの反応容器または個別反応容器で実施する。例えば、段階（ａ）−（ｂ）、（ｃ）−（ｄ）、または（ｅ）−（ｆ）を個別反応容器で実施することができる。

本発明の望ましい具現例によれば、段階（ａ）−（ｂ）及び（ｃ）−（ｆ）は、反応条件（特に、温度）によって１つの反応容器でも同時的、または個別的に進行しうる。

特定段階の繰り返し、繰り返し時に変性の介入、特定段階の個別実施及び検出時点が多様に変更されうるということは、当業者によく認識される。

アップストリームプライマーを用いて繰り返しを実施する場合、繰り返しは、ダウンストリームプライマーの存在下で実施することが望ましく、より望ましくは、ＰＣＲ方法によって実施する。アップストリームプローブを用いて繰り返しを実施する場合、繰り返しは、ダウンストリームプライマーの存在下で実施することが望ましい。

本発明では、検出及び／または増幅しようとするターゲット核酸配列があらゆるＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を含み、如何なる特定配列または長さを有するように要求しない。

ｍＲＮＡを初期物質として利用する場合、アニーリング段階の実施以前に逆転写段階が必須的であり、その詳細な内容は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）；及びＮｏｏｎａｎ，Ｋ．Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：１０３６６（１９８８）に開示されている。逆転写反応のためには、ランダムヘキサマーまたはｍＲＮＡにハイブリダイズされるオリゴｄＴプライマーが利用されうる。

本発明で、検出及び／または増幅することができるターゲット核酸配列は、如何なる天然の原核細胞核酸、真核細胞（例えば、原生動物と寄生動物、菌類、酵母、高等植物、下等動物、及び哺乳動物と人間とを含む高等動物）核酸、ウイルス（例えば、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、エプスタインバーウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）核酸、またはウイロイド核酸もいずれも含む。

また、本発明は、ヌクレオチド変異の検出に有用である。望ましくは、ターゲット核酸配列は、ヌクレオチド変異を含む。本明細書で使われる用語“ヌクレオチド変異”は、連続的ＤＮＡセグメント（ｓｅｇｍｅｎｔ）、または配列が類似したＤＮＡセグメントで特定位置のＤＮＡ配列でのあらゆる単一または複数のヌクレオチド置換、欠失または挿入を意味する。このような連続的ＤＮＡセグメントは、１つの遺伝子または１つの染色体の如何なる他の部位も含む。このようなヌクレオチド変異は、突然変異（ｍｕｔａｎｔ）または多形成対立遺伝子変異（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ａｌｌｅｌｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）であり得る。例えば、本発明から検出されるヌクレオチド変異は、ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）、欠失、挿入、置換、及び転座を含む。ヌクレオチド変異の例は、ヒトゲノムにある多様な変異（例えば、ＭＴＨＦＲ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子の変異）、病原体の薬剤耐性と関連した変異及び癌発生−関連変異を含む。本明細書で使われる用語“ヌクレオチド変異”は、ＤＮＡ分子内の特定位置での如何なる変異も含む。すなわち、用語“ヌクレオチド変異”は、野生型及びそのＤＮＡ分子内の特定位置での如何なる突然変異類型も含む。

ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異を検出する本発明で、使われるプライマーまたはプローブが、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有する場合、前記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列は、本明細書でマッチング鋳型（ｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ）で記載される。使われるプライマーまたはプローブが、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して非相補的な配列を有する場合、前記ヌクレオチド変異を含むターゲット核酸配列は、本明細書でミスマッチング鋳型（ｍｉｓｍａｔｃｈｉｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ）で記載される。

ヌクレオチド変異の検出のために、アップストリームプライマーの３’−末端は、ターゲット核酸配列でのヌクレオチド変異位置の対向側に位置するようにデザインすることができる。本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームプライマーの３’−末端は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有する。ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有するアップストリームプライマーの３’−末端は、マッチング鋳型にアニーリングされ、延長されてＰＴＯ切断を誘導する。結果物としてＰＴＯ断片は、ＣＴＯにハイブリダイズされてターゲットシグナルを提供する。逆に、アップストリームプライマーの３’−末端が、ミスマッチング鋳型でヌクレオチド変異にミスマッチされる場合、アップストリームプライマーがミスマッチング鋳型にハイブリダイズされるとしても、延長反応のために、プライマーの３’−末端のアニーリングが必須的な条件下では、延長されず、これにより、ターゲットシグナルが発生しない。

択一的に、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有するＰＴＯのハイブリダイゼーションに依存的なＰＴＯ切断を利用できる。例えば、調節された条件下で、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有するＰＴＯは、マッチング鋳型にハイブリダイズされた後に切断される。結果物としてＰＴＯ断片は、ＣＴＯにハイブリダイズされてターゲットシグナルを提供する。一方、調節された条件下で、ＰＴＯは、ヌクレオチド変異位置に非相補的な配列を有するミスマッチング鋳型には、ハイブリダイズされず、切断されない。このような場合、望ましくは、ＰＴＯのヌクレオチド変異に対する相補的な配列は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の中間に位置する。

択一的に、本発明は、特定ヌクレオチド変異に対するＰＴＯの選別性のために、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部に位置するヌクレオチド変異区別位置（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）を有するＰＴＯを利用する。ヌクレオチド変異の検出のために、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部が、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に位置し、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部は、ターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有する。

ヌクレオチド変異区別位置に相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列（すなわち、マッチ鋳型（ｍａｔｃｈ ｔｅｍｐｌａｔｅ））にＰＴＯがハイブリダイズされる場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部が、マッチ鋳型と二本鎖とを形成するが；ヌクレオチド変異区別位置に非相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列（すなわち、ミスマッチ鋳型（ｍｉｓｍａｔｃｈ ｔｅｍｐｌａｔｅ））にＰＴＯがハイブリダイズされる場合、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部が、ミスマッチ鋳型と二本鎖とを形成しない。

本明細書で、ＰＴＯを言及しながら使われる用語“ヌクレオチド変異区別位置（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）”は、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部のターゲット核酸配列のヌクレオチド変異に対して相補的な配列である。

このように関心のあるヌクレオチド変異の明らかなハイブリダイゼーションパターンが、ＰＴＯの初期切断位置での差を提供し、これにより、２種のＰＴＯ断片が生成されて関心のあるヌクレオチド変異の存否によってシグナル差が発生するということは、注目すべきことである。

関心のあるヌクレオチド変異の存否によって、ＰＴＯ及びマッチング鋳型間のハイブリッド（ｈｙｂｒｉｄ）の切断によって生成された１次断片、及びＰＴＯ及びミスマッチング鋳型間のハイブリッドの切断によって生成された２次断片が、それぞれ生成される。２次断片は、１次断片とは異なる２次断片を生成させる追加的な３’−末端を含む。

単一ヌクレオチド変異の検出のための一具現例で、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端は、ターゲット核酸配列の単一ヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有する。前述したように、マッチング鋳型にハイブリダイズされたＰＴＯの切断は、例えば、アップストリームプライマー延長−依存的切断誘導下で、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端に３’−方向に直ちに近接（ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ａｄｊａｃｅｎｔ）して一位置で誘導されうる。ＰＴＯ断片の３’−末端は、単一ヌクレオチド変異に対して相補的なヌクレオチドを有する。ＰＴＯ断片は、ヌクレオチド変異に該当する配列を含むキャプチャリング部位を有するＣＴＯにハイブリダイズされた後、延長されて延長二量体を形成して、ターゲットシグナルを提供する。もし、同一なＰＴＯが、単一ヌクレオチド変異を除いては、マッチング鋳型に対して同一な配列を有するミスマッチング鋳型にハイブリダイズされるならば、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端から３’−方向に２つのヌクレオチドほど離隔した位置でＰＴＯの切断が発生しうる。ＰＴＯ断片の３’−末端は、単一ヌクレオチド変異に相補的なヌクレオチド以外に追加的に切断されるヌクレオチドを有する。追加的に切断されたヌクレオチドにハイブリダイズされるＣＴＯの位置が、前記追加的に切断されるヌクレオチドに対して非相補的な配列を有するようにデザインされた場合、ＰＴＯ断片の３’−末端は、ＣＴＯにハイブリダイズされず、調節された条件でＰＴＯ断片が延長されない。

本発明の望ましい具現例によれば、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部にヌクレオチド変異に対して相補的な配列を有するＰＴＯの切断位置は、マッチング鋳型またはミスマッチング鋳型とのハイブリダイゼーションに依存的に異なり、これにより、前記２つのハイブリダイゼーションイベントから放出されるＰＴＯ断片は、異なる配列を有し、望ましくは、その３’−末端の一部、より望ましくは、その３’−末端で異なる配列を有する。

本発明の望ましい具現例によれば、ＰＴＯ断片の３’−末端の一部の差を考慮したＣＴＯのヌクレオチド配列の選択でマッチング鋳型とミスマッチング鋳型とを区別することができる。

本発明の望ましい具現例によれば、何れか１つのＰＴＯ断片の生成は、ＣＴＯ上の延長反応によって明白に検出されうる。

本発明の望ましい具現例によれば、２次断片が、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされる場合、ＣＴＯが選別された配列を有していて、ＣＴＯは、２次断片の追加的な３’−末端部位にハイブリダイズされず、２次断片を延長から防止する。

本発明で記載したように、延長二量体の切断発生によって１次断片の延長が検出される。

本発明の望ましい具現例によれば、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部は、ヌクレオチド変異区別位置から１−１０以内のヌクレオチドほど離隔した位置に位置する非塩基ペアリングモイエティ（ｎｏｎ−ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）を含むことが望ましい（より望ましくは、１−５以内のヌクレオチド）。

変異区別位置に対して非相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列にＰＴＯがハイブリダイズされる場合、非塩基ペアリングモイエティは、３’−ターゲッティング部位の５’−末端の一部がターゲット核酸配列と二本鎖を形成することを防止する。

非塩基ペアリングモイエティ（例えば、ミスマッチヌクレオチド）の利用は、ヌクレオチド変異に対するＰＴＯの区別能力を向上させる。

本発明の望ましい具現例によれば、ヌクレオチド変異区別位置に対して相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列にＰＴＯがハイブリダイズされる場合、非塩基ペアリングモイエティは、５’−末端の一部がターゲット核酸配列と二本鎖を形成することを抑制しない。

本発明の望ましい具現例によれば、非塩基ペアリングモイエティは、ＰＴＯとマッチング鋳型のハイブリッド上の初期切断位置、及びＰＴＯとミスマッチング鋳型のハイブリッド上の初期切断位置間の距離を拡大させる。

非塩基ペアリングモイエティは、ターゲット核酸配列間に塩基対を形成しない如何なるモイエティも含む。望ましくは、非塩基ペアリングモイエティは、（ｉ）人為的なミスマッチ塩基、塩基ペアリングができないように変形された非塩基ペアリング塩基またはユニバーサル塩基を含むヌクレオチド、（ｉｉ）塩基ペアリングができないように変形された非塩基ペアリングヌクレオチド、または（ｉｉｉ）非塩基ペアリング化合物である。

例えば、非塩基ペアリングモイエティは、アルキレン基、リボフラノシルナフタリン、デオキシリボフラノシルナフタリン、メタリン酸塩、ホスホロチオエート連結、アルキルホスホトリエステル連結、アリールホスホトリエステル連結、アルキルホスホネート連結、アリールホスホネート連結、ハイドロゲンホスホネート連結、アルキルホスホロアミダート連結、及びアリールホスホロアミダート連結を含む。通常のカーボンスぺーサも非塩基ペアリングモイエティとして利用される。非塩基ペアリングモイエティとしてのユニバーサル塩基は、ＰＴＯの切断位置の調整に有用である。

５’−末端の一部に導入された非塩基ペアリングモイエティは、望ましくは、１−１０つのモイエティを有し、より望ましくは、１−５つのモイエティ、さらに望ましくは、１−２つのモイエティである。５’−末端の一部の多数の非塩基ペアリングモイエティは、連続して、または不連続して存在することができる。望ましくは、非塩基ペアリングモイエティは、２−５つの連続したモイエティを有する。

望ましくは、非塩基ペアリングモイエティは、非塩基ペアリング化合物である。

本発明の望ましい具現例によれば、ヌクレオチド変異区別位置及びＰＴＯの非塩基ペアリングモイエティは、３’−ターゲッティング部位の５’−末端から１０以内のヌクレオチドほど離隔した位置に位置する（より望ましくは、８ヌクレオチド、７ヌクレオチド、６ヌクレオチド、５ヌクレオチド、４ヌクレオチド、３ヌクレオチド、２ヌクレオチド、または１ヌクレオチド、さらに望ましくは、１ヌクレオチド）。

本発明の一具現例によれば、ＰＴＯは、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による切断に対して耐性を有する少なくとも１つのヌクレオチドブロッカー（ｂｌｏｃｋｅｒ）を含むブロッカー部位を有する。前記ブロッカー部位は、ミスマッチ鋳型とＰＴＯとのハイブリダイゼーションによって初期に切断される部位に位置する。前記ブロッカー部位は、切断位置での切断及び連続した切断を防止する。

ブロッカー部位に含まれるブロッカーの個数は、制限されず、望ましくは、１−１０ブロッカー、より望ましくは、２−１０ブロッカー、さらに望ましくは、３−８ブロッカー、最も望ましくは、３−６ブロッカーである。プローブに存在するブロッカーは、連続して、または不連続した方式で存在し、望ましくは、連続した方式である。ブロッカーとしてのヌクレオチド、すなわち、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性を有するバックボーンを含むヌクレオチドは、当業界に知られた如何なるものも含む。例えば、前記ヌクレオチドは、多様なホスホロチオエート連結、ホスホネート連結、ホスホロアミダート連結、及び２’−カーボーハイドレート変形を含む。本発明のより望ましい具現例によれば、５’→ ３’エキソヌクレアーゼに対して耐性を有するバックボーンを含むヌクレオチドは、ホスホロチオエート連結、アルキルホスホトリエステル連結、アリールホスホトリエステル連結、アルキルホスホネート連結、アリールホスホネート連結、ハイドロゲンホスホネート連結、アルキルホスホロアミダート連結、アリールホスホロアミダート連結、ホスホロセレネート連結、２’−Ｏ−アミノプロピル変形、２’−Ｏ−アルキル変形、２’−Ｏ−アリル変形、２’−Ｏ−ブチル変形、α−アノマーオリゴデオキシヌクレオチド、及び１−（４’−チオ−β−Ｄ−リボフラノシル）変形である。

ＰＴＯ構造を有さない、５’−末端部位にヌクレオチド変異区別部位を有する通常の線形プローブ（ｌｉｎｅａｒ ｐｒｏｂｅ）が、ミスマッチ鋳型にハイブリダイズされる場合、その５’−末端部位は、特定条件下で一本鎖を形成しうる。このようなプローブは、ＰＴＯに該当する。本発明のＰＴＯアッセイによってシグナルが発生しうる。このような接近法は、プローブのヌクレオチド変異区別位置に対して非相補的なヌクレオチド変異を有するターゲット核酸配列の検出に有用である。

本発明の望ましい具現例によれば、本発明で利用されるターゲット核酸配列は、前−増幅された核酸配列である。前−増幅された核酸配列の利用は、本発明のターゲット検出の敏感度、及び特異性を非常に高く増加させる。

本発明の望ましい具現例によれば、前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施される。

少なくとも２種のターゲット核酸配列が同時に検出（マルチプレックス検出）されるという点で、本発明の利点がさらに目立つ。

本発明の望ましい具現例によれば、前記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するために実施される（より望ましくは、少なくとも３種、さらに望ましくは、少なくとも５種）。

本発明の望ましい具現例によれば、前記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するために実施され（より望ましくは、少なくとも３種、さらに望ましくは、少なくとも５種）；前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み（より望ましくは、少なくとも３種、さらに望ましくは、少なくとも５種）、ＰＴＯは、少なくとも２種のＰＴＯを含み（より望ましくは、少なくとも３種、さらに望ましくは、少なくとも５種）、ＣＴＯは、少なくとも１種のＣＴＯを含む（より望ましくは、少なくとも２種、さらに望ましくは、少なくとも３種、最も望ましくは、少なくとも５種）。

少なくとも２種のＰＴＯの５’−タギング部位は、互いに同一な配列を有しうる。例えば、本発明をターゲット核酸配列のスクリーニングに実施する場合、ＰＴＯの５’−タギング部位は、同一な配列を有しうる。

さらに、一種のＣＴＯを多数のターゲット核酸配列の検出に利用できる。例えば、５’−タギング部位に同一な配列を有するＰＴＯをターゲット核酸配列のスクリーニングに利用する場合、一種のＣＴＯを利用できる。

本発明の望ましい具現例によれば、本発明は、少なくとも２種のダウンストリームプライマーを用いて実施される。

本発明は、液相または固相で実施することができる。

固相で固定化されたＣＴＯを利用したターゲット検出
本発明の望ましい具現例によれば、本発明の方法は、固相で実施され、ＣＴＯは、その５’−末端または３’−末端を通じて固相基質上に固定化される。固相では、固相基質上で提供されるターゲットシグナルを測定する。

固相基質上に固定化されたＣＴＯを利用する場合、化学的標識（例えば、ビオチン）または酵素的標識（例えば、アルカリホスファターゼ、ペロキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、及びβ−グルコシダーゼ）を利用できる。

固相反応のために、ＣＴＯは、その５’−末端または３’−末端（望ましくは、３’−末端）を通じて固相基質の表面に直接的または間接的に（望ましくは、間接的）固定化される。また、ＣＴＯは、共有または非共有結合方式で固相基質表面上に固定化されうる。固定化されたＣＴＯが、固相基質表面に間接的に固定化される場合、適したリンカーを利用する。本発明で有用なリンカーは、固相基質表面上のプローブ固定化に利用される如何なるリンカーも含みうる。例えば、アミン基を有するアルキルまたはアリール化合物、またはチオール基を有するアルキルまたはアリール化合物がリンカーとしてＣＴＯ固定化に利用されうる。また、ポリ（Ｔ）テイルまたはポリ（Ａ）テイルがリンカーとして使われる。

本発明の望ましい具現例によれば、本発明で利用される固相基質は、マイクロアレイである。本発明の反応環境を提供するマイクロアレイは、当業界に公知の如何なるものも含みうる。本発明のあらゆる過程、すなわち、ターゲット核酸配列とのハイブリダイゼーション、切断、延長、メルティング及び蛍光検出は、マイクロアレイ上で実施される。マイクロアレイ上に固定化されたＣＴＯは、ハイブリダイズアレイ要素（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ ａｒｒａｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）として利用される。マイクロアレイを製作するための固相基質は、金属（例えば、金、金と銅との合金、アルミニウム）、金属オキシド、ガラス、セラミック、石英、シリコン、半導体、Ｓｉ／ＳｉＯ_２ウェーハ、ゲルマニウム、ガリウムアルセニド、カーボン、炭素ナノチューブ、ポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、及びポリアクリルアミド）、セファロース、アガロース及びコロイドを含むが、これらに限定されるものではない。本発明の多数の固定化されたＣＴＯは、固相基質上の１つのアドレサブル（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）部位または複数のアドレサブル部位に固定化され、固相基質は、２−１，０００，０００つのアドレサブル部位を含みうる。フォトリソグラフィー、インクジェッティング、機械的マイクロスポッティング、及びその類似方法のような従来の製作技術により、アレイまたは特定応用のためのアレイを生産するために、固定化されたＣＴＯが組み立て（ｆａｂｒｉｃａｔｅ）られうる。

固相で実施する本発明は、固定化されたＣＴＯ上の標識は物理的に離隔しているために、一種の標識を利用するとしても、多数のターゲット核酸配列を同時的に検出することができる。したがって、固相で、本発明によって検出可能なターゲット核酸配列の数は、制限されない。

固相で、共焦点検出（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）装備などを使うならば、液相に存在する標識によるシグナルに影響を受けず、固相基質上のみのシグナルを測定することができる。

本発明で、ＰＴＯ断片は、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯの切断によって生成され、ＰＴＯ断片は、ＣＴＯにアニーリングされ、ＣＴＯ上で延長されて延長鎖が形成される。

また、（ｉ）延長鎖に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）延長鎖には、非相補的であるが、ＣＴＯのキャプチャリング部位には、相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含む追加的なＰＴＯを用いて、追加的な５’ヌクレアーゼ切断反応によって延長鎖の数を増加させる、ＣＴＯ上で延長可能な追加的な断片を提供することができる。５’ヌクレアーゼ切断反応のために、延長鎖に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、追加的なＰＴＯのアップストリームに存在する追加的なアップストリームオリゴヌクレオチドを利用することが望ましい。

前記望ましい具現例は、追加的な断片の形成が延長鎖の形成に依存的なことに特徴がある。

択一的に、（ｉ）ＣＴＯのテンプレーティング部位に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位、及び（ｉｉ）ＣＴＯのテンプレーティング部位には、非相補的であるが、ＣＴＯのキャプチャリング部位には、相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位を含む追加的なＰＴＯを用いて、追加的な断片を提供することができる。

本発明の望ましい具現例によれば、追加的な延長二量体は、延長鎖の追加的な生成によって生成され、これは、固相基質上のターゲットシグナルの増幅に寄与する。

ターゲット核酸配列増幅を利用した望ましい具現例
望ましくは、本発明は、ターゲット核酸配列を合成することができるアップストリームプライマー及びダウンストリームを含む一対のプライマーを用いてターゲット核酸配列の増幅と同時的に実施される。

本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、次の段階を含み、ＰＣＥＣ（ＰＴＯ切断及び延長−依存的切断）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法を提供する：
（ａ）前記ターゲット核酸配列をアップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーを含む一対のプライマー及びＰＴＯとハイブリダイズさせる段階であって、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーのそれぞれは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位と、（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位と、を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記ＰＴＯは、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーの間に位置し、前記ＰＴＯは、その３’−末端がブロッキングされて延長が防止され、（ｂ）前記プライマーの延長及び前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素に段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、前記ＰＴＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記アップストリームプライマーは延長され、前記延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導し、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し、（ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯとをハイブリダイズさせる段階であって、前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位と、（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位と、を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ、（ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長二量体を形成し、核酸切断酵素によって切断される切断位置が生成され、（ｅ）前記核酸切断酵素を用いて、前記延長二量体を切断する段階であって、切断された断片が生成され、そして、（ｆ）前記延長二量体の切断の発生を検出する段階であって、前記延長二量体の切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。

本発明の望ましい具現例は、前述した本方法の段階を従うために、これらの間の共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

本発明の望ましい具現例によれば、前記方法は、反復サイクルの間に変性過程を含み、段階（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｄ）、（ａ）−（ｅ）、または（ａ）−（ｆ）を繰り返す段階をさらに含む。反応反復は、ターゲット核酸配列の増幅を伴う。望ましくは、前記増幅は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，８００，１５９号に開示されたＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって実施する。

本発明の望ましい具現例によれば、前記方法は、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出するために実施される。

ターゲット検出のためのキット
本発明のさらに他の態様によれば、本発明は、次を含み、ＰＣＥＣ（ＰＴＯ切断及び延長−依存的切断）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキット：
（ａ）ＰＴＯ；前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位と、（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位と、を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、（ｂ）アップストリームオリゴヌクレオチド；前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し、（ｃ）ＣＴＯ；前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの前記５’−タギング部位または前記５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位と、（ｉｉ）前記ＰＴＯの前記５’−タギング部位及び前記３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位と、を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長二量体を形成し、核酸切断酵素によって切断される切断位置が生成される。

本発明のキットは、前述した本発明の方法を実施するために構成されたものであって、この２つの間に共通した内容は、本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。

本発明の望ましい具現例によれば、キットは、ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯを切断するための５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む。

本発明の望ましい具現例によれば、キットは、ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片の延長によって形成された延長二量体の切断のために、核酸切断酵素をさらに含む。

本発明の望ましい具現例によれば、核酸切断酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ、制限酵素またはリボヌクレアーゼである。

本発明の望ましい具現例によれば、核酸切断酵素は、制限酵素であり、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、制限酵素によって認識される配列を含み、段階（ｄ）の延長二量体の形成は、制限酵素の切断位置を生成させる。

本発明の望ましい具現例によれば、核酸切断酵素は、リボヌクレアーゼであり、ＣＴＯのテンプレーティング部位は、ＲＮＡ配列を含み、段階（ｄ）の延長二量体の形成は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二量体を形成させて、前記リボヌクレアーゼの切断位置が生成される。

本発明の望ましい具現例によれば、核酸切断酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼであり、延長二量体の形成は、ＣＴＯ上に５’→３’エキソヌクレアーゼの切断位置を生成させる。

本発明の望ましい具現例によれば、核酸切断酵素によって切断される切断位置は、ＤＮＡ二量体、ＲＮＡ二量体、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二量体を切断する核酸切断酵素の切断部位である。

本発明の望ましい具現例によれば、リボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ ＨまたはＥｘｏＩＩＩである。

本発明の望ましい具現例によれば、５’→３’エキソヌクレアーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的ＤＮＡ重合酵素である。

本発明の望ましい具現例によれば、核酸切断酵素は、熱安定性核酸切断酵素である。

本発明の望ましい具現例によれば、延長二量体は、少なくとも１種の標識を有し、前記標識は、ＰＴＯまたはＣＴＯに連結された標識、またはインターカレーティング染料から由来され、延長二量体の切断の発生は、前記少なくとも１種の標識からのシグナルを検出して実施する。

本発明の望ましい具現例によれば、ＣＴＯは、単一標識を有し、延長二量体の切断は、単一標識を含む切断断片を形成し、延長二量体が切断される以前の単一標識から出るシグナルは、延長二量体が切断された以後の単一標識から出るシグナルと異なって、このようなシグナルの差が延長二量体の切断の発生を検出させる。

本発明の望ましい具現例によれば、単一標識は、蛍光標識である。

本発明の望ましい具現例によれば、核酸切断酵素によって切断される切断位置は、ＣＴＯに連結されたレポーター分子及びクエンチャー分子の間に位置し、延長二量体が形成される以前には、クエンチャー分子はレポーター分子からのシグナルをクエンチングし、延長二量体の切断は、レポーター分子とクエンチャー分子とを互いに分離させ、延長二量体の切断の発生は、標識からのシグナルを測定して検出する。

本発明の望ましい具現例によれば、レポーター分子及びクエンチャー分子のうち少なくとも１つは、ＣＴＯの５’−末端に連結される。

本発明の望ましい具現例によれば、ＣＴＯは、その５’−末端または３’−末端を通じて固相基質上に固定される。

本発明の望ましい具現例によれば、ＣＴＯは、単一標識を有し、前記延長二量体切断は、前記単一標識を含む切断断片を形成し、前記切断断片は、前記固相基質から放出されて、前記固相基質上でシグナルの変化をもたらして、前記延長二量体の切断の発生を示すシグナルを提供する。

本発明の望ましい具現例によれば、ＣＴＯは、その５’−末端を通じて固相基質上に固定化されており、前記ＰＴＯは、単一標識を有し、前記延長二量体の切断は、前記単一標識を含む切断断片を形成し、前記切断断片は、前記固相基質から放出されて、前記固相基質上でシグナルの変化をもたらして、前記延長二量体の切断の発生を示すシグナルを提供する。

本発明の望ましい具現例によれば、単一標識は、蛍光標識である。

本発明の望ましい具現例によれば、ＣＴＯは、その５’−末端または３’−末端を通じて固相基質上に固定化されており、インターカレーティング染料が標識として利用され、前記延長二量体切断は、前記インターカレーティング染料を含む切断断片を形成し、前記切断断片は、前記固相基質から放出されて、前記固相基質上でシグナルの変化をもたらして、前記延長二量体の切断の発生を示すシグナルを提供する。

本発明の望ましい具現例によれば、ＰＴＯ及び／またはＣＴＯは、その３’−末端がブロッキングされて延長が防止される。

本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブである。

本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームオリゴヌクレオチドは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって前記ＰＴＯの切断を誘導する程度に前記ＰＴＯに近接している。

本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームプライマーは、その延長鎖を通じて５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導する。

本発明の望ましい具現例によれば、ＣＴＯのキャプチャリング部位は、その５’−末端部位に前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含む。

本発明の望ましい具現例によれば、ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列は、１〜５つのヌクレオチドである。

本発明の望ましい具現例によれば、前記キットを用いて少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＰＴＯは、少なくとも２種のＰＴＯを含み、前記ＣＴＯは、少なくとも２種のＣＴＯを含む。

本発明の望ましい具現例によれば、少なくとも２種のＰＴＯの５’−タギング部位は、互いに同一な配列または互いに異なる配列を含む。

本発明の望ましい具現例によれば、アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーであり、前記キットは、前記アップストリームプライマーの前記延長のために、鋳型−依存的核酸重合酵素をさらに含む。

本発明の望ましい具現例によれば、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼである。

本発明の望ましい具現例によれば、キットは、ダウンストリームプライマーをさらに含む。

本明細書で、前述した本発明のあらゆるキットは、バッファ、ＤＮＡ重合酵素助因子及びデオキシリボヌクレオチド−５−トリホスフェートのようなターゲット増幅ＰＣＲ反応（例えば、ＰＣＲ反応）の実施に必要な試薬を選択的に含みうる。選択的に、本発明のキットは、また多様なポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様なバッファ及び試薬、及びＤＮＡ重合酵素活性を抑制する抗体を含みうる。また、キットは、陽性対照群及び陰性対照群の反応の実施に必須的な試薬を含みうる。特定反応で使われる試薬の最適量は、本明細書の開示事項を習得した当業者によって容易に決定されうる。典型的に、本発明のキットは、先立って言及された構成成分を含む別途の包装またはコンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）で製作される。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。

実施例１：５’→３’エキソヌクレアーゼを利用するＰＣＥＣ（ＰＴＯ Ｃｌｅａｖａｇｅ ａｎｄ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｃｌｅａｖａｇｅ）アッセイの評価
新規なアッセイである本発明のＰＣＥＣアッセイが、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を用いてターゲット核酸配列を検出できるか否かについて評価した（図２参照）。

アップストリームプライマーの延長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長のために、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を利用した。また、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を延長二量体の切断に利用した。

ＰＴＯ及びＣＴＯの３’−末端は、カーボンスぺーサでブロッキングした。ＰＴＯは、標識を有さない。ＣＴＯは、その５’−末端に蛍光レポーター分子（ＦＡＭ）を、そして、テンプレーティング（ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ）部位には、クエンチャー分子（ＢＨＱ−１）を有する。アッセイを実施する間に形成された延長二量体は、相互作用的二重標識を有する。延長二量体は、その５’−末端部位に、ＴａｑＤＮＡ重合酵素の５’ヌクレアーゼ活性で切断される切断位置を有する。ＦＡＭで標識された５’−末端は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、前記ＦＡＭは、ＢＨＱ−１から解離される。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドをターゲット鋳型として利用した。

本実施例で利用された合成鋳型、アップストリームプライマー、ＰＴＯ、及びＣＴＯの配列は、次の通りである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＴＯ−１ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＡＧＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）
ＮＧ−ＣＴＯ−１ ５’−［ＦＡＭ］ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣ［Ｔ（ＢＨＱ−１）］ＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＴＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）
（下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング部位を示す）

ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、アップストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）２．５ｐｍｏｌｅ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２含有した２Ｘ マスターミックス１０μｌ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、及びＨ−Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）１．６ｕｎｉｔを含有した２０μｌの最終体積で反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブを実時間熱循環器（ＣＦＸ９６，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６３秒、及び７２℃で３０秒の過程を６０回繰り返した。各サイクルの変性段階（９５℃）で発生したシグナルを検出した。変性段階での検出は、延長二量体の切断されながら招かれた二重標識の分離によってシグナルが発生するか否かを確認可能にする。

図１０で示したように、鋳型がある場合、蛍光シグナルが検出された。鋳型がないか、ＰＴＯまたはＣＴＯがない場合には、シグナルが検出されなかった。

このような結果は、ターゲット核酸配列が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を利用するＰＣＥＣアッセイによって検出されるということを表わす。

実施例２：制限酵素を利用するＰＣＥＣアッセイの評価
本発明者らは、ＰＣＥＣアッセイが制限酵素を用いてターゲット核酸配列を検出できるか否かについてさらに評価した（図３参照）。

アップストリームプライマーの延長、ＰＴＯの切断及びＰＴＯ断片の延長のために、５’ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑ ＤＮＡ重合酵素を利用した。熱安定性制限酵素（ＰｓｐＧＩ）を延長二量体の切断に利用した。

ＰＴＯ及びＣＴＯの３’−末端は、カーボンスぺーサでブロッキングした。ＰＴＯは、標識を有さない。ＣＴＯは、その５’−末端に蛍光レポーター分子（Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒｏ Ｒｅｄ ６１０）を、そして、テンプレーティング部位には、クエンチャー分子（ＢＨＱ−１）を有する。延長二量体の形成時に、ＣＴＯは、ＰｓｐＧＩに対する制限酵素切断サイトを提供するようにデザインされる。アッセイを実施する間に形成された延長二量体は、制限酵素切断サイトによって分けられている相互作用的二重標識を有する。制限酵素サイトでの切断は、クエンチャー分子（ＢＨＱ−１）からの蛍光レポーター分子（Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒｏ Ｒｅｄ ６１０）の分離を招く。

本発明者が分かっているところによれば、Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒｏ Ｒｅｄ ６１０で標識された延長二量体の５’−末端は、Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素の５’ヌクレアーゼ活性に独立したアップストリームオリゴヌクレオチドに対して耐性を有する。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）遺伝子に対する合成オリゴヌクレオチドをターゲット鋳型として利用した。

本実施例で利用された合成鋳型、アップストリームプライマー、ＰＴＯ、及びＣＴＯの配列は、次の通りである：
ＮＧ−Ｔ ５’−ＡＡＡＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＡＣＧＣＣＡＡＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＣＴＣＧＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＡＣＣＧＡＴＣＣＡＴＴＧＡＡＡＡＡ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）
ＮＧ−Ｒ ５’−ＣＡＡＴＧＧＡＴＣＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＣ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）
ＮＧ−ＰＴＯ−２ ５’−ＡＣＧＡＣＧＧＣＴＴＧＧＣＣＣＣＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＴＴＴＣＧ［Ｃ３ ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）
ＮＧ−ＣＴＯ−２ ５’−［ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０］ＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＣＣＴＣＣ［Ｔ（ＢＨＱ−２）］ＣＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＣＧＴＣＧＴ［Ｃ３ Ｓｐａｃｅｒ］−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５において、下線を引いた文字は、ＰＴＯの５’−タギング部位を示す）
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６において、下線を引いた文字は、ＰｓｐＧＩに対する制限酵素切断サイトを示す）

ＮＧ遺伝子に対する合成鋳型（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）２ｐｍｏｌｅ、アップストリームプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）１０ｐｍｏｌｅ、ＰＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）５ｐｍｏｌｅ、ＣＴＯ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）２ｐｍｏｌｅ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２含有した２Ｘ マスターミックス１０μｌ、ｄＮＴＰｓ２００μＭ、Ｈ−ＴａｑＤＮＡ重合酵素（Ｓｏｌｇｅｎｔ，Ｋｏｒｅａ）１．６ｕｎｉｔ、及びＰｓｐＧＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳ）１ｕｎｉｔを含有した２０μｌの最終体積で反応を実施した；前記反応混合物を含有しているチューブを実時間熱循環器（ＣＦＸ９６，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に位置させた；前記反応混合物を９５℃で１５分間変性させ、９５℃で３０秒、６０℃で６３秒、及び７２℃で３０秒の過程を６０回繰り返した。各サイクルの変性段階（９５℃）で発生したシグナルを検出した。

鋳型がある場合、蛍光シグナルが検出された。鋳型がないか、ＰＴＯまたはＣＴＯがない場合には、シグナルが検出されなかった。

このような結果は、ターゲット核酸配列が制限酵素を利用するＰＣＥＣアッセイによって検出されるということを表わす。

本発明の望ましい具現例を詳しく記述し、本発明の原理による変形及び修正が可能であり、本発明の範囲は、添付の請求項とその均等物とによって定義されるということは、当業者によく認識される。

Claims (66)

1. 次の段階を含み、ＰＣＥＣ（ＰＴＯ切断及び延長−依存的切断）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法：
   （ａ）前記ターゲット核酸配列を、アップストリームオリゴヌクレオチド及びＰＴＯ（Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｎｄ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とハイブリダイズさせる段階であって、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位と、（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位と、を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置し、
   （ｂ）前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素に前記段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導し、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し、
   （ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯ（Ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｍｐｌａｔｉｎｇ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とをハイブリダイズさせる段階であって、前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位と、（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位と、を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ、
   （ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長二量体を形成し、核酸切断酵素によって切断される切断位置が生成され、
   （ｅ）前記核酸切断酵素を用いて、前記延長二量体を切断する段階であって、切断された断片が生成され、そして、
   （ｆ）前記延長二量体の切断の発生を検出する段階であって、前記延長二量体の切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
2. 前記核酸切断酵素は、制限酵素であり、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位は、前記制限酵素によって認識される配列を含み、前記段階（ｄ）の延長二量体の形成は、前記制限酵素の切断位置を生成させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記核酸切断酵素は、リボヌクレアーゼであり、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位は、ＲＮＡ配列を含み、前記段階（ｄ）の延長二量体の形成は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二量体を形成させて、前記リボヌクレアーゼの切断位置が生成されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. 前記核酸切断酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼであり、前記段階（ｄ）の延長二量体の形成は、前記ＣＴＯ上に５’→３’エキソヌクレアーゼの切断位置を生成させることを特徴とする請求項１に記載の方法。
5. 前記核酸切断酵素によって切断される切断位置は、ＤＮＡ二量体、ＲＮＡ二量体、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二量体を切断する核酸切断酵素の切断位置であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
6. 前記リボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ ＨまたはＥｘｏ ＩＩＩであることを特徴とする請求項３に記載の方法。
7. 前記５’→３’エキソヌクレアーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的ＤＮＡ重合酵素であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
8. 前記核酸切断酵素は、熱安定性核酸切断酵素であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
9. 前記延長二量体は、少なくとも１種の標識を有し、前記標識は、前記ＰＴＯまたはＣＴＯに連結された標識、またはインターカレーティング染料から由来され、前記延長二量体の切断の発生の検出は、前記少なくとも１種の標識からのシグナルを検出して実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. 前記ＣＴＯは、単一標識を有し、前記段階（ｅ）の延長二量体切断は、前記単一標識を含む切断断片を形成し、前記延長二量体が切断される以前の単一標識から出るシグナルは、前記延長二量体が切断された以後の単一標識から出るシグナルと異なって、このようなシグナルの差が、前記延長二量体の切断の発生を検出させることを特徴とする請求項９に記載の方法。
11. 前記単一標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
12. 前記核酸切断酵素によって切断される切断位置は、前記ＣＴＯに連結されたレポーター分子及びクエンチャー分子の間に位置し、前記延長二量体が形成される以前には、前記クエンチャー分子は前記レポーター分子からのシグナルをクエンチングし、前記延長二量体の切断は、前記レポーター分子と前記クエンチャー分子とを互いに分離させ、前記延長二量体の切断の発生は、前記標識からのシグナルを測定して検出することを特徴とする請求項９に記載の方法。
13. 前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のうち少なくとも１つは、前記ＣＴＯの５’−末端に連結されることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 前記ＣＴＯは、その５’−末端または３’−末端を通じて固相基質上に固定化されたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
15. 前記ＣＴＯは、単一標識を有し、前記段階（ｅ）の延長二量体切断は、前記単一標識を含む切断断片を形成し、前記切断断片は、前記固相基質から放出されて、前記固相基質上でシグナルの変化をもたらして、前記延長二量体の切断の発生を示すシグナルを提供することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
16. 前記ＣＴＯは、その５’−末端を通じて固相基質上に固定化されており、前記ＰＴＯは、単一標識を有し、前記段階（ｅ）の延長二量体切断は、前記単一標識を含む切断断片を形成し、前記切断断片は、前記固相基質から放出されて、前記固相基質上でシグナルの変化をもたらして、前記延長二量体の切断の発生を示すシグナルを提供することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
17. 前記単一標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項１５または１６に記載の方法。
18. 前記ＣＴＯは、その５’−末端または３’−末端を通じて固相基質上に固定化されており、インターカレーティング染料が標識として利用され、前記段階（ｅ）の延長二量体切断は、前記インターカレーティング染料を含む切断断片を形成し、前記切断断片は、前記固相基質から放出されて、前記固相基質上でシグナルの変化をもたらして、前記延長二量体の切断の発生を示すシグナルを提供することを特徴とする請求項１４に記載の方法。
19. 前記ＰＴＯ及び／またはＣＴＯは、その３’−末端がブロッキングされて延長が防止されたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
20. 前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
21. 前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって前記ＰＴＯの切断を誘導する程度に前記ＰＴＯに近接していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
22. 前記アップストリームプライマーは、その延長鎖を通じて５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導することを特徴とする請求項２０に記載の方法。
23. 前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、その５’−末端部位に前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
24. 前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列は、１−５つのヌクレオチドであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。
25. 前記方法は、反復サイクルの間に変性過程を含み、前記段階（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｄ）、（ａ）−（ｅ）、または（ａ）−（ｆ）を繰り返す段階をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
26. 前記段階（ａ）−（ｂ）及び段階（ｃ）−（ｆ）、または前記段階（ａ）−（ｄ）及び段階（ｅ）−（ｆ）は、１つの反応容器または個別反応容器で実施することを特徴とする請求項１に記載の方法。
27. 前記方法は、反復サイクルの間に変性過程を含み、前記段階（ａ）−（ｂ）または（ａ）−（ｄ）を繰り返す段階をさらに含むことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
28. 前記方法を実施して、少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＰＴＯは、少なくとも２種のＰＴＯを含み、前記ＣＴＯは、少なくとも２種のＣＴＯを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
29. 前記少なくとも２種のＰＴＯの５’−タギング部位は、互いに同一な配列または互いに異なる配列を含むことを特徴とする請求項２８に記載の方法。
30. 前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーであり、前記段階（ｂ）は、前記アップストリームプライマーの前記延長のために、鋳型−依存的核酸重合酵素を利用することを特徴とする請求項１に記載の方法。
31. 前記段階（ｂ）の切断反応のための前記５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的ＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
32. 前記方法は、ダウンストリームプライマーの存在下で実施することを特徴とする請求項１から３１のいずれかに記載の方法。
33. 次の段階を含み、ＰＣＥＣ（ＰＴＯ切断及び延長−依存的切断）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出する方法：
    （ａ）前記ターゲット核酸配列をアップストリームプライマー及びダウンストリームプライマーを含む一対のプライマー及びＰＴＯとハイブリダイズさせる段階であって、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーのそれぞれは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位と、（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位と、を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、前記ＰＴＯは、前記アップストリームプライマー及び前記ダウンストリームプライマーの間に位置し、前記ＰＴＯは、その３’−末端がブロッキングされて延長が防止され、
    （ｂ）前記プライマーの延長及び前記ＰＴＯの切断のための条件下で、５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素に段階（ａ）の結果物を接触させる段階であって、前記ＰＴＯが、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされる場合、前記アップストリームプライマーは延長され、前記延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的核酸重合酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導し、このような前記切断は、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し、
    （ｃ）前記ＰＴＯから放出された前記断片とＣＴＯとをハイブリダイズさせる段階であって、前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位と、（ｉｉ）前記ＰＴＯの５’−タギング部位及び３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位と、を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ、
    （ｄ）前記段階（ｃ）の結果物及び鋳型−依存的核酸重合酵素を用いて延長反応を実施する段階であって、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長二量体を形成し、核酸切断酵素によって切断される切断位置が生成され、
    （ｅ）前記核酸切断酵素を用いて、前記延長二量体を切断する段階であって、切断された断片が生成され、そして、
    （ｆ）前記延長二量体の切断の発生を検出する段階であって、前記延長二量体の切断の発生は、前記ターゲット核酸配列の存在を示す。
34. 前記方法は、反復サイクルの間に変性過程を含み、前記段階（ａ）−（ｂ）、（ａ）−（ｄ）、（ａ）−（ｅ）、または（ａ）−（ｆ）を繰り返す段階をさらに含むことを特徴とする請求項３３に記載の方法。
35. 次を含み、ＰＣＥＣ（ＰＴＯ切断及び延長−依存的切断）アッセイによってＤＮＡまたは核酸混合物からターゲット核酸配列を検出するためのキット：
    （ａ）ＰＴＯ；前記ＰＴＯは、（ｉ）前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む３’−ターゲッティング部位と、（ｉｉ）前記ターゲット核酸配列に非相補的なヌクレオチド配列を含む５’−タギング部位と、を含み、前記３’−ターゲッティング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされ、前記５’−タギング部位は、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされず、
    （ｂ）アップストリームオリゴヌクレオチド；前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ターゲット核酸配列に相補的なハイブリダイズするヌクレオチド配列を含み、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、前記ＰＴＯのアップストリームに位置し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドまたはその延長鎖は、前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導して、前記ＰＴＯの５’−タギング部位または５’−タギング部位の一部を含む断片を放出し、
    （ｃ）ＣＴＯ；前記ＣＴＯは、３’→５’方向に（ｉ）前記ＰＴＯの前記５’−タギング部位または前記５’−タギング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むキャプチャリング部位と、（ｉｉ）前記ＰＴＯの前記５’−タギング部位及び前記３’−ターゲッティング部位に非相補的なヌクレオチド配列を含むテンプレーティング部位と、を含み、前記ＰＴＯから放出された前記断片は、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされ、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片は、延長されて延長二量体を形成し、核酸切断酵素によって切断される切断位置が生成される。
36. 前記キットは、前記ターゲット核酸配列にハイブリダイズされたＰＴＯを切断するための５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含むことを特徴とする請求項３５に記載のキット。
37. 前記キットは、前記ＣＴＯのキャプチャリング部位にハイブリダイズされた前記断片の延長によって形成された延長二量体の切断のために、核酸切断酵素をさらに含むことを特徴とする請求項３５に記載のキット。
38. 前記核酸切断酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ、制限酵素またはリボヌクレアーゼであることを特徴とする請求項３７に記載のキット。
39. 前記核酸切断酵素は、制限酵素であり、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位は、前記制限酵素によって認識される配列を含み、前記段階（ｄ）の延長二量体の形成は、前記制限酵素の切断位置を生成させることを特徴とする請求項３８に記載のキット。
40. 前記核酸切断酵素は、リボヌクレアーゼであり、前記ＣＴＯのテンプレーティング部位は、ＲＮＡ配列を含み、前記延長二量体の形成は、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二量体を形成させて、前記リボヌクレアーゼの切断位置が生成されることを特徴とする請求項３８に記載のキット。
41. 前記核酸切断酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼであり、前記延長二量体の形成は、前記ＣＴＯ上に５’→３’エキソヌクレアーゼの切断位置を生成させることを特徴とする請求項３８に記載のキット。
42. 前記核酸切断酵素によって切断される切断位置は、ＤＮＡ二量体、ＲＮＡ二量体、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二量体を切断する核酸切断酵素の切断部位であることを特徴とする請求項３５に記載のキット。
43. 前記リボヌクレアーゼは、ＲＮａｓｅ ＨまたはＥｘｏ ＩＩＩであることを特徴とする請求項３８に記載のキット。
44. 前記５’→３’エキソヌクレアーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する鋳型−依存的ＤＮＡ重合酵素であることを特徴とする請求項３８に記載のキット。
45. 前記核酸切断酵素は、熱安定性核酸切断酵素であることを特徴とする請求項３７に記載のキット。
46. 前記延長二量体は、少なくとも１種の標識を有し、前記標識は、前記ＰＴＯまたはＣＴＯに連結された標識、またはインターカレーティング染料から由来され、前記延長二量体の切断の発生の検出は、前記少なくとも１種の標識からのシグナルを検出して実施することを特徴とする請求項３５に記載のキット。
47. 前記ＣＴＯは、単一標識を有し、前記延長二量体の切断は、前記単一標識を含む切断断片を形成し、前記延長二量体が切断される以前の単一標識から出るシグナルは、前記延長二量体が切断された以後の単一標識から出るシグナルと異なって、このようなシグナルの差が、前記延長二量体の切断の発生を検出させることを特徴とする請求項４６に記載のキット。
48. 前記単一標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項４７に記載のキット。
49. 前記核酸切断酵素によって切断される切断位置は、前記ＣＴＯに連結されたレポーター分子及びクエンチャー分子の間に位置し、前記延長二量体が形成される以前には、前記クエンチャー分子は前記レポーター分子からのシグナルをクエンチングし、前記延長二量体の切断は、前記レポーター分子と前記クエンチャー分子とを互いに分離させ、前記延長二量体の切断の発生は、前記標識からのシグナルを測定して検出することを特徴とする請求項４６に記載のキット。
50. 前記レポーター分子及び前記クエンチャー分子のうち少なくとも１つは、前記ＣＴＯの５’−末端に連結されることを特徴とする請求項４９に記載のキット。
51. 前記ＣＴＯは、その５’−末端または３’−末端を通じて固相基質上に固定化されたことを特徴とする請求項３５に記載のキット。
52. 前記ＣＴＯは、単一標識を有し、前記延長二量体切断は、前記単一標識を含む切断断片を形成し、前記切断断片は、前記固相基質から放出されて、前記固相基質上でシグナルの変化をもたらして、前記延長二量体の切断の発生を示すシグナルを提供することを特徴とする請求項５１に記載のキット。
53. 前記ＣＴＯは、その５’−末端を通じて固相基質上に固定化されており、前記ＰＴＯは、単一標識を有し、前記延長二量体の切断は、前記単一標識を含む切断断片を形成し、前記切断断片は、前記固相基質から放出されて、前記固相基質上でシグナルの変化をもたらして、前記延長二量体の切断の発生を示すシグナルを提供することを特徴とする請求項５１に記載のキット。
54. 前記単一標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項５２または５３に記載のキット。
55. 前記ＣＴＯは、その５’−末端または３’−末端を通じて固相基質上に固定化されており、インターカレーティング染料が標識として利用され、前記延長二量体切断は、前記インターカレーティング染料を含む切断断片を形成し、前記切断断片は、前記固相基質から放出されて、前記固相基質上でシグナルの変化をもたらして、前記延長二量体の切断の発生を示すシグナルを提供することを特徴とする請求項５１に記載のキット。
56. 前記ＰＴＯ及び／またはＣＴＯは、その３’−末端がブロッキングされて延長が防止されたことを特徴とする請求項３５に記載のキット。
57. 前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーまたはアップストリームプローブであることを特徴とする請求項３５に記載のキット。
58. 前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素によって前記ＰＴＯの切断を誘導する程度に前記ＰＴＯに近接していることを特徴とする請求項５７に記載のキット。
59. 前記アップストリームプライマーは、その延長鎖を通じて５’ヌクレアーゼ活性を有する前記酵素による前記ＰＴＯの切断を誘導することを特徴とする請求項５７に記載のキット。
60. 前記ＣＴＯのキャプチャリング部位は、その５’−末端部位に前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項３５に記載のキット。
61. 前記ＰＴＯの３’−ターゲッティング部位の一部に相補的なヌクレオチド配列は、１−５つのヌクレオチドであることを特徴とする請求項６０に記載のキット。
62. 前記キットを用いて少なくとも２種のターゲット核酸配列を検出し、前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含み、前記ＰＴＯは、少なくとも２種のＰＴＯを含み、前記ＣＴＯは、少なくとも２種のＣＴＯを含むことを特徴とする請求項３５に記載のキット。
63. 前記少なくとも２種のＰＴＯの５’−タギング部位は、互いに同一な配列または互いに異なる配列を含むことを特徴とする請求項６２に記載のキット。
64. 前記アップストリームオリゴヌクレオチドは、アップストリームプライマーであり、前記キットは、前記アップストリームプライマーの前記延長のために、鋳型−依存的核酸重合酵素をさらに含むことを特徴とする請求項３５に記載のキット。
65. 前記５’ヌクレアーゼ活性を有する酵素は、５’ヌクレアーゼ活性を有する熱安定性ＤＮＡ重合酵素またはＦＥＮヌクレアーゼであることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
66. 前記キットは、ダウンストリームプライマーをさらに含むことを特徴とする請求項３５から６５のいずれかに記載のキット。