CN107208143A - 用于核酸扩增和分析的组合物、方法、系统和试剂盒 - Google Patents

用于核酸扩增和分析的组合物、方法、系统和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本公开内容提供了用于扩增和测定核酸的组合物、方法、系统和试剂盒，以及用于生成和分析包含颗粒和核酸的复合体的试剂盒和方法及系统。

Description

用于核酸扩增和分析的组合物、方法、系统和试剂盒
交叉引用
本申请要求2014年11月20日提交的第62/082,534号美国临时专利申请、2014年11月20日提交的第62/082,538号美国临时专利申请和2014年11月20日提交的第62/082,541号美国临时专利申请的优先权，这些申请均通过引用以其全文并入本文以用于所有目的。
背景技术
核酸扩增方法允许扩增样品如生物样品中的核酸分子。核酸分子可以经由例如基于热循环的方法(例如，聚合酶链反应(PCR))或经由等温方法来扩增。核酸分子扩增后，可以检测扩增产物并由最终用户解释检测的结果。核酸扩增还可以用于制备核酸分子以供与核酸分析相关的许多应用中的后续分析，这些应用例如是检测靶核酸序列、单核苷酸多态性(SNP)、序列突变(例如，缺失、插入)，检测样品中的罕见核酸分子/序列和/或制备用于测序反应的核酸分子。因此，由于核酸扩增对于广泛应用的适用性，对于可用于扩增核酸分子和/或可用于分析由核酸扩增生成的扩增的核酸分子的组合物、试剂盒、方法和系统存在需要。
发明内容
本公开内容提供了用于核酸的扩增和分析的组合物、试剂盒、方法和系统。此外，本公开内容提供了用于生成和分析包含颗粒和核酸的复合体的组合物、试剂盒、方法和系统。本文公开的方法和组合物在例如研究、环境测试、法医鉴定和临床诊断中得到广泛应用。
本公开内容的一方面提供了用于核酸扩增的颗粒组。该颗粒组可包含第一颗粒，该第一颗粒包含具有5’端和3’端的第一引物，其中第一引物经由该第一引物的5’端与第一颗粒连接，并且其中第一引物在靶核酸链的5’端显示出与靶核酸链的序列同源性。该颗粒组还可包含第二颗粒，该第二颗粒包含具有5’端和3’端的第二引物，其中第二引物经由该第二引物的5’端与第二颗粒连接，并且其中第二引物在靶核酸链的互补核酸链的5’端显示出与该互补核酸链的序列同源性。此外，第一引物与之显示出同源性的靶核酸链上的序列可不同于第二引物与之显示出同源性的互补核酸链上的序列。
在一些实施方案中，第一颗粒和/或第二颗粒可被包含在分区(partition)中，该分区可以是例如乳液中的小滴、孔或容器。在该分区为孔的情况下，该孔可以是孔阵列中的孔。在一些实施方案中，第一引物的3’端可适合于在引物延伸反应中延伸以形成靶核酸链或其一部分的拷贝。在一些实施方案中，第二引物的3’端可适合于在引物延伸反应中延伸以形成互补核酸链或其一部分。在一些实施方案中，第一颗粒可包含至少两个第一引物和/或第二颗粒可包含至少两个第二引物。在一些实施方案中，该颗粒组可进一步包含第三颗粒，该第三颗粒可包含第一引物和/或第二引物。
在一些实施方案中，第一和/或第二颗粒可选自固体颗粒、多孔颗粒、纳米颗粒、珠粒、微粒、金属颗粒、磁性颗粒、半导体颗粒、聚合物颗粒和核酸颗粒。在一些实施方案中，第一或第二引物可与第一和第二颗粒中相应的一个直接连接。在一些实施方案中，第一或第二引物可通过至少一个连接体与第一和第二颗粒中相应的一个连接。该连接体可以选自核酸、磷酸部分、氨基酸、肽、烃链、聚乙二醇(PEG)、多糖及其组合。在一些实施方案中，第一和/或第二颗粒可包含选自金、银、铜、铂、钯、金属氧化物、聚合物、碳及其组合的材料。在一些实施方案中，第一颗粒和/或第二颗粒可具有约0.5nm至约100nm的尺寸。在一些实施方案中，第一颗粒和/或第二颗粒可具有约1nm至约20nm的尺寸。
本公开内容的附加方面提供了用于核酸扩增的颗粒组。该颗粒组可包含第一颗粒，该第一颗粒包含具有5’端和3’端的第一引物，其中第一引物经由该第一引物的5’端与第一颗粒连接，并且其中第一引物在靶核酸链的5’端显示出与该靶核酸链的序列同源性。该颗粒组还可包含第二颗粒，该第二颗粒包含具有5’端和3’端的第二引物，其中第二引物经由该第二引物的5’端与第二颗粒连接，并且其中第二引物在靶核酸链的互补核酸链的5’端显示出与该互补核酸链的序列同源性。此外，第一引物与之显示出同源性的靶核酸链的序列可以与第二引物与之显示出互补性的靶核酸链的序列相隔至少约10个核苷酸。
在一些实施方案中，第一引物与之显示出同源性的靶核酸链上的序列可以与第二引物与之显示出互补性的靶核酸链上的序列相隔至少约25个核苷酸、至少约50个核苷酸或至少约100个核苷酸。在一些实施方案中，第一颗粒和/或第二颗粒可被包含在分区中，例如乳液中的小滴、孔或容器中。在该分区为孔的情况下，该孔可以在孔阵列中。
在一些实施方案中，第一颗粒可包含至少两个第一引物和/或第二颗粒可包含至少两个第二引物。在一些实施方案中，第一和/或第二颗粒可选自固体颗粒、多孔颗粒、纳米颗粒、珠粒、微粒、金属颗粒、磁性颗粒、半导体颗粒、聚合物颗粒和核酸颗粒。在一些实施方案中，第一和/或第二颗粒可包含选自金、银、铜、铂、钯、金属氧化物、聚合物、碳及其组合的材料。在一些实施方案中，第一颗粒和/或第二颗粒可具有约0.5nm至约100nm的尺寸。在一些实施方案中，第一颗粒和/或第二颗粒可具有约1nm至约20nm的尺寸。
本公开内容的附加方面提供了分离的核酸复合体。该分离的核酸复合体可包含具有至少第一链和至少部分互补于该第一链的第二链的双链核酸分子。该第一链可在该第一链的5’端与第一颗粒偶联，并且该第二链可在该第二链的5’端与单独的第二颗粒偶联。
在一些实施方案中，所述双链核酸分子可包含第一端序列和第二端序列，其中第一端序列经由与第一颗粒连接的第一捕获序列而与第一颗粒复合。第二端序列可经由与第二颗粒连接的第二捕获序列而与第二颗粒复合。此外，第一捕获序列可至少部分互补于第一端序列，并且第二捕获序列可至少部分互补于第二端序列。
在一些实施方案中，第一捕获序列可在该第一捕获序列的3’端与第一颗粒连接和/或第二捕获序列可在该第二捕获序列的3’端与第二颗粒连接。在一些实施方案中，第一链可在该第一链的5’端与第一颗粒共价连接和/或第二链可在该第二链的5’端与第二颗粒共价连接。在一些实施方案中，所述核酸复合体可以不固定于支持物上。
在一些实施方案中，所述分离的核酸复合体可进一步包含至少三个颗粒、至少五个颗粒或至少十个颗粒，所述颗粒中的每一个可通过与该双链核酸分子基本相同的附加双链核酸分子而与另一颗粒连接。在一些实施方案中，第一颗粒和/或第二颗粒可包含约0.5纳米(nm)至约100纳米的尺寸。在一些实施方案中，第一颗粒和/或第二颗粒可包含约1nm至约20nm的尺寸。
在一些实施方案中，所述核酸复合体可被包含在分区中，例如乳液中的小滴、孔或容器中。在该分区为孔的情况下，该孔可以是孔阵列中的孔。在一些实施方案中，第一和/或第二颗粒可选自固体颗粒、多孔颗粒、纳米颗粒、珠粒、微粒、金属颗粒、磁性颗粒、半导体颗粒、聚合物颗粒和核酸颗粒。在一些实施方案中，第一和/或第二颗粒可包含选自金、银、铜、铂、钯、金属氧化物、聚合物、碳及其组合的材料。
本公开内容的附加方面提供了用于测定在具有或怀疑具有靶核酸链的样品中存在或不存在靶核酸链的试剂盒。该试剂盒可包含第一颗粒和第二颗粒。第一颗粒可包含具有与靶核酸链的一部分显示出序列同源性的第一核酸序列的第一引物，并且第二颗粒可包含具有与靶核酸链的互补核酸链的一部分显示出序列同源性的第二核酸序列的第二引物。此外，第一核酸序列可不同于第二核酸序列。该试剂盒还可包含关于使用第一和第二颗粒经由引物延伸反应来鉴定样品中靶核酸链的存在或不存在的说明书。
在一些实施方案中，第一和/或第二颗粒可被包含在容器中。在一些实施方案中，第一和/或第二颗粒可选自固体颗粒、多孔颗粒、纳米颗粒、珠粒、微粒、金属颗粒、磁性颗粒、半导体颗粒、聚合物颗粒和核酸颗粒。在一些实施方案中，第一和/或第二颗粒可包含选自金、银、铜、铂、钯、金属氧化物、聚合物、碳及其组合的材料。
在一些实施方案中，该试剂盒可进一步包含适合于生成油包水乳液的一种或多种试剂。此类试剂包括，例如，缓冲液、油和表面活性剂。在一些实施方案中，该试剂盒可进一步包含允许鉴定靶核酸链的可检测物质。该可检测物质可以是，例如，光学响应性物质。在一些实施方案中，该试剂盒可进一步包含进行该引物延伸反应所需的试剂。此类试剂包括，例如，聚合酶和核苷酸。
本公开内容的附加方面提供了用于测定在具有或怀疑具有靶核酸分子的样品中靶核酸分子的存在与否的方法。该方法可包括在产生与至少第一颗粒和第二颗粒连接的扩增的靶核酸分子的条件下使样品在反应混合物中经历核酸扩增反应，该扩增的靶核酸分子包含靶核酸分子的序列的至少一部分。该反应混合物可包含具有带有5’端和3’端的第一引物的第一颗粒。第一引物可经由该第一引物的5’端与第一颗粒连接，并且第一引物可在靶核酸分子链的5’端显示出与靶核酸分子链的序列同源性。该反应混合物还可包含具有带有5’端和3’端的第二引物的第二颗粒。第二引物可经由该第二引物的5’端与第二颗粒连接，并且第二引物可在靶核酸分子链的互补链的5’端显示出与该互补链的序列同源性。第一引物与之显示出同源性的靶核酸分子链上的序列可不同于第二引物与之显示出同源性的互补链的序列。此外，第一引物和第二引物可适合于在引物延伸反应中延伸以形成靶核酸分子或其一部分的拷贝。
在一些实施方案中，所述反应混合物可进一步包含聚合酶。这样的聚合酶可在引物延伸反应中延伸第一引物的3’端以形成靶核酸链或其一部分的拷贝。此外，这样的聚合酶可在引物延伸反应中延伸第二引物的3’端以形成互补链或其一部分。在一些实施方案中，该反应混合物可进一步包含光学响应性物质，例如染料或荧光蛋白。在一些实施方案中，该反应混合物可被包含在分区中，例如乳液中的小滴、孔或容器中。在该分区为孔的情况下，该孔可以是孔阵列中的孔。
在一些实施方案中，所述方法可进一步包括检测与第一颗粒和第二颗粒连接的扩增的靶核酸分子。例如，可光学地、电学地、物理地、光谱学地、电化学地或静电学地检测该扩增的靶核酸分子。在一些实施方案中，检测到多个扩增的靶核酸分子。在一些实施方案中，该靶核酸分子可以是单链的。
本公开内容的附加方面提供了用于生成包含靶核酸分子的核酸复合体的方法。该方法可包括在产生该核酸复合体的条件下在反应混合物中用正向引物和反向引物扩增靶核酸分子。该核酸复合体可包含扩增的靶核酸分子，其中该扩增的靶核酸分子包含第一链和至少部分互补于该第一链的第二链。第一链可在该第一链的5’端与第一颗粒偶联，并且第二链可在该第二链的5’端与第二颗粒偶联。
在一些实施方案中，所述正向引物可与第一颗粒连接且所述反向引物可与第二颗粒连接。在一些实施方案中，所述反应混合物可包含该第一颗粒和该第二颗粒。在一些实施方案中，所述方法可进一步包括采用在其上连接有该正向引物或反向引物的第三颗粒来扩增靶核酸分子以产生该核酸复合体。该核酸复合体可进一步包含经由附加的扩增的靶核酸分子与第一颗粒和/或第二颗粒偶联的第三颗粒。
在一些实施方案中，所述方法可进一步包括检测核酸复合体。例如，可光学地、光谱学地、物理地、电学地、电化学地或静电学地检测该核酸复合体。在一些实施方案中，第一颗粒和第二颗粒可以是金属颗粒，并且该核酸复合体的检测可通过目视检查来实现。在一些实施方案中，该方法可进一步包括借助于光学响应性物质来检测该核酸复合体。
在一些实施方案中，所述方法可进一步包括通过核酸复合体的离心、磁分离、沉降、过滤、色谱法、毛细管作用或亲和捕获来分离所述核酸复合体。在一些实施方案中，该方法可进一步包括通过将该核酸复合体亲和捕获于支持物之上来分离该核酸复合体。在一些实施方案中，该反应混合物可被包含在分区中，例如乳液中的小滴或孔中。在一些实施方案中，该方法可进一步包括将该核酸复合体从该分区释放并检测所释放的核酸复合体。
本公开内容的另一方面提供了用于鉴定样品中靶核酸分子的存在或不存在的方法。该方法可包括提供怀疑含有靶核酸分子的溶液。该靶核酸分子可包含与第一颗粒连接的第一核酸链和与第二颗粒连接的第二核酸链。第二链可经由序列互补性与第一链杂交以产生核酸复合体。该方法可进一步包括检测指示在溶液中存在或不存在该核酸复合体的信号，从而鉴定靶核酸分子的存在。
在一些实施方案中，提供溶液可包括向检测器提供该溶液，并且该检测器可检测指示在该溶液中存在或不存在靶核酸复合体的信号。在一些实施方案中，该信号可指示核酸复合体的光学性质、物理性质、电性质、静电性质或电化学性质。在一些实施方案中，第一颗粒和第二颗粒可以是金属颗粒，并且可通过目视检查检测该信号。在一些实施方案中，该信号可由光学响应性物质例如染料或荧光蛋白的活动生成。染料的实例包括SYBR绿I、SYBR绿II、SYBR金、溴化乙锭、亚甲蓝、Pyronin Y、DAPI、吖啶橙、Blue View或藻红蛋白。
在一些实施方案中，所述溶液可被包含在分区内，例如乳液中的小滴或孔(例如，孔阵列中的孔)中。在一些实施方案中，该溶液可包含多个含有两个或更多个颗粒的核酸复合体。在一些实施方案中，该核酸复合体可以不附着于支持物上。
本公开内容的另一方面提供了用于测定样品中靶核酸序列的存在或不存在的方法。该方法可包括接受测定样品中靶核酸序列的存在或不存在的请求。该方法可进一步包括通过检测包含与至少第一颗粒和第二颗粒连接的双链核酸分子的至少一个核酸复合体来测定样品中靶核酸序列的存在或不存在。该双链核酸分子可包含第一单链核酸分子和互补于该第一单链核酸分子的第二单链核酸分子。第一单链核酸分子和第二单链核酸分子中的至少一个可包含靶核酸序列。此外，该方法可进一步包括生成指示在该样品中存在或不存在靶核酸序列的报告。
在一些实施方案中，测定样品中靶核酸序列的存在或不存在可包括检测指示存在或不存在所述核酸复合体的信号。例如，该信号可指示该核酸复合体的光学性质、物理性质、电性质、光谱性质、静电性质或电化学性质。在一些实施方案中，该信号可由光学响应性物质例如染料的活动生成。染料的实例包括SYBR绿I、SYBR绿II、SYBR金、溴化乙锭、亚甲蓝、Pyronin Y、DAPI、吖啶橙、Blue View或藻红蛋白。
在一些实施方案中，所述核酸复合体可在分区，例如乳液中的小滴或孔(例如，孔阵列中的孔)中被检测到。在一些实施方案中，该核酸复合体可包含多个与超过两个颗粒连接的双链核酸分子。在一些实施方案中，所述报告是可呈现在电子设备的电子显示器的用户界面上的电子报告。
本公开内容的附加方面提供了用于生成包含靶核酸分子的核酸复合体的方法。该方法可包括在反应混合物中用正向引物和反向引物扩增靶核酸分子以产生扩增的靶核酸分子。该正向引物和该反向引物可各自包含能够在引物延伸反应中延伸的3’端和发夹结构。该扩增的靶核酸分子可包含在该扩增的靶核酸分子的一端含有第一突出端序列的第一链，以及在该扩增的靶核酸分子的另一端含有第二突出端序列的第二链。此外，该方法可进一步包括使该扩增的靶核酸分子与第一颗粒和第二颗粒接触以产生核酸复合体。该核酸复合体可包含扩增的靶核酸分子，该扩增的靶核酸分子经由第一突出端序列与连接第一颗粒的第一捕获序列之间的序列互补性而与第一颗粒复合；以及经由第二突出端序列与连接第二颗粒的第二捕获序列之间的序列互补性而与第二颗粒复合。
在一些实施方案中，所述正向引物和反向引物可进一步包含不能经由引物延伸反应拷贝的间隔区。这样的间隔区可选自C3间隔区、脱碱基位点、碳质连接体、聚乙二醇(PEG)及其组合。在一些实施方案中，该方法可进一步包括将第一链与第二捕获序列连接和/或将第二链与第一捕获序列连接。
本公开内容的另一方面提供了用于核酸扩增的方法。该方法可包括将与第一颗粒连接的正向引物与核酸链退火，以及将与第二颗粒连接的反向引物与该核酸链的互补链退火。该方法可进一步包括以模板指导的方式延伸该正向引物和反向引物以产生与第一颗粒连接的第一双链核酸分子和与第二颗粒连接的第二双链核酸分子。该方法可进一步包括使第一双链核酸分子和第二双链核酸分子变性以生成与第一颗粒连接的第一单链分子和与第二颗粒连接的第二单链分子。该方法可进一步包括重复如上所述的退火、延伸和变性，其可通过将正向引物与第二单链分子退火和将反向引物与第一单链分子退火来重复，以产生包含扩增的双链核酸分子的核酸复合体。该扩增的双链核酸分子可在一端与第一颗粒连接且在其另一端与第二颗粒连接。
在一些实施方案中，所述方法在分区中进行。在一些实施方案中，该方法可进一步包括采用在其上连接有正向引物或反向引物的第三颗粒来扩增核酸链以产生核酸复合体，该核酸复合体进一步包含经由附加的扩增的双链核酸分子与第一颗粒和/或第二颗粒偶联的第三颗粒。在一些实施方案中，该方法可进一步包括光学地、光谱学地、物理地、电学地、电化学地或静电学地检测该核酸复合体。
本公开内容的附加方面提供了用于分析溶液的内含物的系统。该系统可包含适合于包含或引导含有核酸复合体的溶液的检测池，该核酸复合体包含与至少第一颗粒和第二颗粒连接的双链核酸分子。该双链核酸分子可包含第一单链核酸分子和与该第一单链核酸分子的至少一部分互补的第二单链核酸分子。该系统可进一步包含检测器，它可与该检测池连接并检测指示在溶液中存在或不存在核酸复合体的信号。此外，该系统可进一步包含可与该检测器连接并且被编程为接收来自该检测器的信号的计算机处理器，该信号指示存在或不存在该核酸复合体。该计算机处理器还可被编程为根据所检测到的信号来确定在该溶液中存在或不存在该核酸复合体。
在一些实施方案中，所述检测池可包含容器或孔阵列。在一些实施方案中，该检测池可包含支持物。在一些实施方案中，该检测池可包含可以是例如微流体通道的流体流动路径。在一些实施方案中，该检测器可选自光学检测器、光谱检测器和电化学检测器。
在一些实施方案中，所述检测池可进一步包含溶液。在一些实施方案中，该溶液可被包含在分区内，例如孔(例如，孔阵列中的孔)或乳液中的小滴内。在一些实施方案中，所述核酸复合体可包含多个与超过两个颗粒连接的双链核酸分子。
通过以下仅示出并描述了本公开内容的说明性实施方案的详细描述，本公开内容的附加方面和优势对于本领域技术人员是显而易见的。应当认识到，本公开内容能够具有其他且不同的实施方案，并且在均不脱离本公开内容的情况下其若干细节能够在各个明显方面进行修改。因此，附图和说明书在本质上应被视为说明性的，而非限制性的。
援引并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同具体地且单独地指出每一个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求中具体地描述。通过参考以下对利用本发明原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述以及附图(本文也称为“图”)将会获得对本发明的特征和优点的更好的理解，在附图中：
图1是分离和检测核酸复合体和/或核酸复合体的核酸分子的示例方法的示意性描述；
图2是分离和检测核酸复合体和/或核酸复合体的核酸分子的示例方法的示意性描述；
图3A和图3B是用于核酸扩增的示例引物的示意性描述；
图3C是在核酸扩增中使用示例引物的示例方法的示意性描述；
图4是用于核酸扩增以产生核酸复合体的示例方法的示意性描述；
图5是用于核酸扩增以产生核酸复合体的示例方法的示意性描述；
图6是用于核酸扩增以产生核酸复合体以及该核酸复合体的分离的示例方法的示意性描述；
图7是用于多重核酸扩增的示例方法的示意性描述；
图8是用于多重核酸扩增的示例方法的示意性描述；
图9是用于处理核酸复合体以供完成测序反应的示例方法的示意性描述；以及
图10是包含计算机处理器的示例计算机系统的示意性描述。
具体实施方式
虽然本文已示出并描述了本发明的各种实施方案，但此类实施方案仅通过实例的方式予以提供对于本领域技术人员是显而易见的。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案。
除非上下文另有明确规定，如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。例如，术语“一个核酸分子”包括多个核酸分子，包括其混合物。
如本文所用，术语“扩增(amplify)”和“扩增(amplication)”可互换使用且通常是指产生核酸的一个或多个拷贝。
如本文所用，术语“退火”通常是指一个核酸分子(例如，引物)经由核酸分子之间的互补性与另一个核酸分子(例如，模板核酸分子)的结合。
如本文所用，术语“捕获序列”通常是指这样一种核酸序列，它与支持物结合并且能够经由序列互补性与核酸分子偶联(例如，杂交)，使得该核酸分子与该捕获序列的偶联将该核酸分子固定于该支持物上。
“互补性”或“互补的”通常是指核酸分子通过Watson-Crick或其他类型的碱基配对与另一个核酸分子形成氢键的能力。“部分互补”通常意指第一核酸序列的一部分将与第二核酸序列的一部分进行氢键键合。
如本文所用，术语“变性(denaturing)”和“变性(denaturation)”可互换使用且通常是指双链核酸的螺旋结构的全部或部分解旋，并且在一些实施方案中是指单链核酸的二级结构的解旋。
如本文所用，“可检测物质”通常是指产生可检测信号的组合物，其存在或不存在可用来检测核酸和/或核酸的拷贝的存在与否。在一些实施方案中，可检测物质可以是光学响应性物质。如本文所用，术语“光学响应性物质”通常是指在电磁辐射例如光的存在(或不存在)下产生可检测信号的可检测物质。本文别处提供了可检测部分的实例。
如本文所用，术语“连接”和“偶联”可互换使用且通常是指两种物质的缔合。两种物质可以以任何合适的方式连接或偶联，其包括直接连接或偶联(例如，物质之间的直接附接)、间接连接或偶联(例如，经由与两种物质偶联的连接体附接)、共价附接或非共价附接(例如，核酸分子之间的杂交、亲和结合对的成员的结合、离子相互作用、疏水相互作用、范德华力等)及其组合。
如本文所用，术语“解链温度”(Tm)通常是指杂交并形成双链分子的两个单链核酸分子彼此解离时的温度。在一些实施方案中，解链温度可指一群相同的双链核酸分子的约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多的相同核酸链与它们的互补链解离时的温度。例如，引物的解链温度可指一群与核酸分子杂交的相同引物中约一半的引物分子与它们各自的核酸分子上它们的互补序列解离时的温度。在一些实施方案中，引物的解链温度可以为约20℃至约80℃。在一些实施方案中，引物的解链温度可以为约25℃至约75℃。在一些实施方案中，引物的解链温度可以为约25℃至约60℃。在一些实施方案中，引物的解链温度可以为约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃或更高。
如本文所用，术语“核酸”和“核酸分子”可互换使用且通常是指任何长度的聚合物形式的核苷酸——脱氧核糖核苷酸(dNTP)或核糖核苷酸(rNTP)或其类似物。核酸可具有任何三维结构，并且可行使任何已知或未知的功能。核酸的非限制性实例包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析定义的基因座(多个基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组核酸、支链核酸、质粒、载体、分离的任何序列的DNA、分离的任何序列的RNA、核酸探针和引物。核酸可以包含一个或多个修饰的核苷酸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，例如锁定核酸(LNA)、氟化核酸(FNA)、桥连核酸和硫代核苷酸。如果存在的话，可在核酸的组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核酸的核苷酸的序列可被非核苷酸组分例如连接体或其他类型的间隔区中断。核酸可以在聚合反应之后例如通过与可检测物质的缀合或结合进一步修饰。在一些实施方案中，核酸可以为在一些实施方案中可用来扩增另一个核酸分子的引物。
如本文所用，术语“核酸复合体”通常是指包含经由一个或多个双链核酸分子连接在一起的多个颗粒的复合体。核酸复合体可包含与1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个双链核酸分子缔合的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个颗粒。
如本文所用，术语“引物”通常是指能够与模板核酸分子杂交且能够经由该模板核酸分子以模板指导的方式延伸的核酸分子。
“引物延伸反应”通常是指引物与核酸链的结合(例如，“退火”)，然后使用核酸链作为模板将核苷酸随该引物掺入(例如，该引物的“延伸”或“延伸”该引物)。引物延伸反应可借助于例如聚合酶的酶来完成。
如本文所用，术语“反应混合物”通常是指包含完成双链核酸分子的变性、引物与核酸链的退火、在引物延伸反应中引物的延伸和/或核酸扩增所需的一种或多种试剂的组合物，此类试剂的非限制性实例包括对于靶核酸具有特异性的一种或多种引物、聚合酶、合适的缓冲液、辅因子(例如，二价和单价阳离子)、核苷酸(例如，脱氧核糖核苷酸(dNTP))、任何其他的酶、表面活性剂以及可调节核酸杂交的添加剂。在一些实施方案中，反应混合物还可以包含一种或多种可检测物质。
如本文所用，术语“序列同源性”通常是指两个或更多个核酸分子之间序列一致的程度。例如，当与一个或多个核酸分子最佳比对时，核酸分子可显示出与一个或多个其他核酸分子至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同源性。序列同源性可出现在多个核酸分子的5’端(例如，两个核酸分子可在各自核酸分子的5’端各自具有共同的核酸序列)，出现在多个核酸分子的3’端(例如，两个核酸分子可在各自核酸分子的3’端各自具有共同的核酸序列)；或可出现在不同核酸分子的不同位置(例如，一个核酸分子可在其5’端具有共同的核酸序列而另一个核酸分子可在其5’端与3’端之间具有该共同的核酸序列)。
如本文所用，术语“支持物”通常是指在其上面可固定另一种物质的物质。支持物的非限制性实例包括颗粒、孔的表面、容器的表面、固体表面、平面、阵列的表面、多孔表面(例如，多孔表面的微腔)、树脂(例如，柱中的树脂)和纤维(例如，膜或支持物中的纤维)。此外，支持物可包含任何合适的材料，其非限制性的实例包括金属、金属氧化物、碳质材料和聚合物质。支持物可用来例如固定核酸分子和/或可用来固定核酸复合体。
如本文所用，术语“靶核酸”和“靶核酸分子”可互换使用且通常是指具有靶序列的核酸分子的起始群体中的核酸分子，需要确定该核酸分子的存在、量和/或核苷酸序列或其中一项或多项的变化。在一些实施方案中，靶核酸分子可以是双链的。在一些实施方案中，靶核酸分子可以是单链的。通常，术语“靶核酸链”是指单链靶核酸分子。通常，术语“靶核酸序列”是指靶核酸链上的核酸序列。靶核酸分子或靶核酸序列可以是基因、调节序列、基因组DNA、cDNA、包括mRNA、miRNA、rRNA在内的RNA，或其他的一部分。靶核酸序列或靶核酸分子可以是来自样品或二级靶标如扩增反应的产物的靶核酸序列或靶核酸分子。
本公开内容的各个方面提供了用于核酸扩增的颗粒组以及包含与多个颗粒连接的核酸分子的分离的核酸复合体。颗粒组可包含各自与核酸分子如引物和/或捕获序列缔合的第一和第二颗粒。分离的核酸复合体可包含第一颗粒和第二颗粒，该第一和第二颗粒经由连接至该第一颗粒和第二颗粒二者上的双链核酸分子来连接。
一方面，本公开内容提供了用于核酸扩增的颗粒组，其包含第一颗粒和第二颗粒。第一颗粒可包含第一引物，该第一引物具有5’端和3’端且经由该第一引物的5’端与第一颗粒连接。第一引物可在靶核酸链的5’端显示出与靶核酸链的序列同源性。第二颗粒可包含第二引物，该第二引物具有5’端和3’端且经由该第二引物的5’端与第二颗粒连接。第二引物可在靶核酸链的互补核酸链的5’端显示出与该互补核酸链的序列同源性。此外，第一引物与之显示出同源性的靶核酸链上的序列可不同于第二引物与之显示出同源性的互补核酸链上的序列。
在另一方面，本公开内容提供了用于核酸扩增的颗粒组，其包含第一颗粒和第二颗粒。第一颗粒可包含第一引物，该第一引物具有5’端和3’端且经由该第一引物的5’端与第一颗粒连接。第一引物可在靶核酸链的5’端显示出与靶核酸链的序列同源性。第二颗粒可包含第二引物，该第二引物具有5’端和3’端且经由该第二引物的5’端与第二颗粒连接。第二引物可在靶核酸链的互补核酸链的5’端显示出与该互补核酸链的序列同源性。此外，第一引物与之显示出同源性的靶核酸链的序列可以与第二引物与之显示出互补性的靶核酸链的序列相隔至少约10个核苷酸。
在本文所述的任何颗粒组中，第一引物与之显示出同源性的靶核酸链上的序列可与第二引物与之显示出互补性的靶核酸链上的序列相隔至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个或更多个核苷酸。此外，在本文所述的任何颗粒组中，当与靶核酸链最佳比对时，第一引物可在靶核酸链的5’端显示出与靶核酸链至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同源性。类似地，在本文所述的任何颗粒组中，当与靶核酸链的互补核酸链最佳比对时，第二引物可在该互补核酸链的5’端显示出与该互补核酸链至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同源性。
在本文所述的任何颗粒组中，第一颗粒可包含至少约1、2、10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000个或更多个第一引物分子。此外，第二颗粒可包含至少约1、2、10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000个或更多个第二引物分子。在本文所述的任何颗粒组中，第一颗粒和第二颗粒还可以分别包含第二引物和第一引物。此外，分别与该第一和第二颗粒连接的第一引物和第二引物的长度可根据具体应用而变化。例如，该第一或第二引物的长度可以为约1个核苷酸至约100个核苷酸长；约5至约50个核苷酸长；约5至约30个核苷酸长；或约15至约30个核苷酸长。在一些实施方案中，该第一引物或第二引物的长度可以为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个核苷酸长。
此外，包括经由直接附接或经由例如至少一个连接体的间接附接，第一引物可与第一颗粒连接且第二引物可与第二颗粒连接。此类连接体的非限制性实例包括聚合物质、核酸、磷酸部分、氨基酸、肽、烃链、多糖、聚乙二醇(PEG)及其组合。引物与颗粒之间的直接和间接附接可经由共价键(例如，引物与颗粒之间的共价键、连接体与颗粒和/或引物之间的共价键)或非共价相互作用(例如，核酸分子之间的杂交、亲和结合对(例如，链霉亲和素/生物素)的成员的结合、离子相互作用、疏水相互作用、范德华力等)及其组合。
此外，本文所述的任何颗粒组中的颗粒可经由任何合适的化学法或化学法的组合与各自的引物连接(例如，以供采用可用于连接引物和颗粒的基团使颗粒功能化)。此类化学法的非限制性实例包括巯基化学法、膦酸化学法(例如，在颗粒包含金属氧化物的情况下)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)化学法、醛化学法、环氧化学法、同双功能交联剂化学法(例如，经由胺官能团、经由巯基官能团)、异双功能交联剂化学法(例如，经由胺官能团、经由巯基官能团)、1,4-亚苯基二异硫氰酸酯(PDC)化学法、有机硅烷化、电离气体处理、UV照射、点击化学法、双丙酮丙烯酰胺交联及其组合。
在本文所述的任何颗粒组中，第一引物的3’端可适合于在引物延伸反应中延伸以形成靶核酸链或其一部分的拷贝。此外，第二引物的3’端可适合于在引物延伸反应中延伸以形成互补核酸链或其一部分。此外，本文所述的任何颗粒组还可以包含比第一颗粒和第二颗粒更多的颗粒，其中每个附加颗粒包含第一和/或第二引物。例如，本文所述的颗粒组可包含约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000、100000000、500000000、1000000000个或更多个各自包含第一和/或第二引物的颗粒。
在另一方面，本公开内容提供了分离的核酸复合体。该分离的核酸复合体可包含具有至少第一链和至少部分互补于该第一链的第二链的双链核酸分子。该第一链可在该第一链的5’端与第一颗粒偶联，并且该第二链可在该第二链的5’端与单独的第二颗粒偶联。
在一些实施方案中，包括经由如本文别处所述的供连接引物和颗粒的直接附接或间接附接，所述双链核酸分子的第一链可与第一颗粒偶联且所述双链核酸分子的第二链可与第二颗粒偶联。第一和第二链与各自颗粒之间的直接和间接附接可经由也如本文别处所述的共价键、非共价相互作用及其组合。例如，第一链可在该第一链的5’端与第一颗粒共价连接和/或第二链可在该第二链的5’端与第二颗粒共价连接。此外，在一些实施方案中，分离的核酸复合体可不固定于支持物上，而是例如悬浮或自由漂浮在液体介质中。
在一些实施方案中，所述双链核酸分子可包含第一端序列和第二端序列。该第一和第二端序列中的每一个可以是分别与该双链核酸分子的第一和第二链的5’或3’端连接的单链核酸序列。第一端序列可经由与第一颗粒连接的第一捕获序列而与第一颗粒复合，且第二端序列可经由与第二颗粒连接的第二捕获序列而与第二颗粒复合。第一捕获序列可以是与第一颗粒连接且被配置为经由序列互补性与该双链核酸分子的第一端序列杂交的寡核苷酸。第一捕获序列可以完全或至少部分互补于第一端序列。此外，第二捕获序列可以是与第二颗粒连接且被配置为经由序列互补性与该双链核酸分子的第二端序列杂交的寡核苷酸。第二捕获序列可以完全或至少部分互补于第二端序列。在一些实施方案中，第一和/或第二捕获序列可包含锁定核酸(LNA)。
在一些实施方案中，第一捕获序列可在该第一捕获序列的3’端与第一颗粒连接和/或第二捕获序列可在该第二捕获序列的3’端与第二颗粒连接。此外，包括经由如本文别处所述的供连接引物和颗粒的直接附接或间接附接，第一捕获序列可与第一颗粒连接且第二捕获序列可与第二颗粒连接。捕获序列与颗粒之间的直接和间接附接可经由也如本文别处所述的共价键、非共价相互作用及其组合。
在一些实施方案中，第一颗粒可包含至少约1、2、10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000个或更多个第一捕获序列的分子。此外，第二颗粒可包含至少约1、2、10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000个或更多个第二捕获序列的分子。在一些实施方案中，第一颗粒和第二颗粒还可以分别包含第二捕获序列和第一捕获序列。
此外，第一和第二捕获序列的长度可根据具体应用而变化。例如，第一或第二捕获序列的长度可以为约1个核苷酸至约100个核苷酸长；约5至约50个核苷酸长；约5至约30个核苷酸长；或约15至约30个核苷酸长。在一些实施方案中，第一或第二捕获序列的长度可以为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个核苷酸长。
第一和第二端序列的长度可根据具体应用而变化。例如，第一或第二端序列的长度可以为约1个核苷酸至约100个核苷酸长；约5至约50个核苷酸长；约5至约30个核苷酸长；或约15至约30个核苷酸长。在一些实施方案中，第一或第二端序列的长度可以为约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或更多个核苷酸长。
在一些实施方案中，所述分离的核酸复合体可包含与约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个双链核酸分子缔合的至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个颗粒。该分离的核酸复合体的每一个颗粒可通过与所述双链核酸基本上相同的附加的双链核酸分子而与该分离的核酸复合体中的另一个颗粒连接。如本文所用的术语“基本上相同”是指该双链核酸分子与该附加的双链核酸分子之间的序列同源性的程度为至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。
本文所述的任何颗粒、颗粒组或核酸复合体可包含任何合适类型的颗粒。颗粒类型的非限制性实例包括固体颗粒、多孔颗粒、纳米颗粒(例如，纳米管、纳米棒、纳米壳、球形纳米颗粒)、微粒、珠粒、金属颗粒、磁性颗粒(磁性纳米颗粒)、半导体颗粒(例如，量子点)、聚合物颗粒、核酸颗粒(例如，含DNA的颗粒、含RNA的颗粒等)、荧光颗粒、比色颗粒、其复合物及其组合。此外，本文所述的任何颗粒、颗粒组的颗粒或分离的核酸复合体的颗粒可包含任何合适的材料或多种材料(例如，涂覆有另一种材料的一种材料的颗粒、由复合材料制成的颗粒等)。颗粒可包含的材料的非限制性实例包括金属(例如，银、金、铂、铜、钯)、金属氧化物(例如，Al2O3、NiO、Fe2O3、ZrO2、MoO3、CeO2、Y2O3、TiO2、ZnO、SnO、ITO、Co3O4)、聚合物(例如，聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、右旋糖、聚苯胺、聚吡咯、聚乙炔)、荧光蛋白、碳、其复合物及其组合。在一些实施方案中，颗粒组和/或核酸复合体中的第一颗粒和第二颗粒可包含相同的材料。在一些实施方案中，颗粒组和/或核酸复合体中的第一颗粒和第二颗粒可包含不同的材料。例如，颗粒组或核酸复合体可包含含有金的第一颗粒和含有银的第二颗粒。
本文所述的任何颗粒、颗粒组的颗粒或分离的核酸复合体的颗粒可根据例如设想的具体应用而具有不同的颗粒大小。通常，如本文所用的“颗粒大小”通常指颗粒的尺寸的大小。例如，这样的尺寸可以是颗粒的直径、圆周、周长、流体动力学直径、半径、长度、宽度或深度。在一些实施方案中，颗粒可具有约0.1纳米(nm)至约100nm；约0.5nm至约100nm；约1nm至约20nm；约1nm至约10nm；或约1nm至5nm的尺寸。在一些实施方案中，颗粒可具有至多100nm、至多50nm、至多20nm、至多10nm或至多5nm的尺寸。在一些实施方案中，颗粒可具有约0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100nm的尺寸，或根据具体的颗粒该尺寸可以更大或更小。
本文所述的任何颗粒、颗粒组的颗粒或分离的核酸复合体的颗粒可具有任何合适的形状/构型，它可以是规则的形状/构型，或者可以是不规则的形状/构型。颗粒形状的非限制性实例包括球、杆、空心壳、管、椭圆形颗粒，芯-壳颗粒(例如，涂覆的颗粒)、较小颗粒的凝聚及其组合。此外，本文所述的任何颗粒、颗粒组的颗粒或分离的核酸复合体的颗粒可以与或可以不与支持物连接。在颗粒、颗粒组的颗粒或分离的核酸复合体的颗粒不与支持物连接的实施方案中，该颗粒可以例如自由漂浮或悬浮在液体介质(例如，水性介质)中。
在一些实施方案中，本文所述的颗粒、颗粒组的颗粒或分离的核酸复合体的颗粒可包含被配置为与结合配偶体结合的亲和捕获剂。该亲和捕获剂对于其结合配偶体的合适的亲和力通常可允许此两种物质结合。如本文别处所述，亲和捕获剂可用于分离颗粒、颗粒组或核酸复合体的颗粒。亲和捕获剂的非限制性实例包括结合对的非核酸成员(例如，来自链霉亲和素-生物素结合对的链霉亲和素或生物素)、捕获序列(例如，包含锁定核酸(LNA)的捕获序列，抗体-抗原对(例如，抗荧光素抗体和荧光素、抗洋地黄毒苷抗体和洋地黄毒苷)、瘦素-糖对、适体和结合对、多肽与其结合对和/或其他类型的聚合物与其结合对。
例如，本文所述的颗粒、颗粒组的颗粒或分离的核酸复合体的颗粒可包含未与另一个核酸分子偶联的游离引物或捕获序列。在另一个实例中，本文所述的颗粒、颗粒组的颗粒或分离的核酸复合体的颗粒可包含结合对的成员，例如，链霉亲和素或生物素的其中之一或两者。此外，包括经由如本文别处所述的供连接引物和颗粒的直接附接或间接附接，亲和捕获剂可与颗粒连接。亲和捕获序列与颗粒之间的直接和间接附接可经由也如本文别处所述的共价键、非共价相互作用及其组合。
此外，本文所述的任何颗粒、颗粒组或分离的核酸复合体可被包含在分区中。该分区可以是任何合适类型的分区，其中分区的非限制性实例包括小滴(例如，乳液中的小滴，例如，油包水乳液或水包油乳液)、容器(例如，任何合适类型的管、毛细管、离心管、小杯(cuvette)、移液管尖端、袋子、盒子、器皿(container))及其组合。
在一些实施方案中，分区可以是孔(例如，孔阵列中的孔如微孔板中的孔、微孔、纳米孔)。可以将孔微加工在基底例如硅基底中(例如，蚀刻到硅基底中)或它的上面(例如，将孔材料沉积在基底上)。此外，孔内的表面可具有不同于在其中或其上包含孔的大部分表面基底的性质。例如，孔表面可以是亲水性的而大部分基底表面可以是疏水性的，反之亦然。此外，在一些实施方案中，孔和大部分基底的表面可采用不同的官能团进行差异修饰，使得它们各自选择性地捕获特定的化学剂(例如，对于颗粒、颗粒组、核酸复合体等具有亲和力的化学剂)。
包含孔的基底可以置于流动池隔室中或作为流动池隔室的一部分被包含在内，该隔室具有用于液体转移的进口和出口。在一些实施方案中，这样的流动池还可以包含平的或弯曲的内表面，在该内表面中孔被图案化。液相溶液可以穿过流动池，使得孔暴露于溶液。根据该溶液的物理和/或化学性质以及孔和/或其他流动池表面的表面性质，可以将该溶液分配到孔中或选择性地阻止其进入孔。例如，当孔表面含有亲水性表面时，流经孔的油溶液可以避免分配，而流经孔的水溶液则可以分配到孔中。孔的尺寸可以是任何合适的尺寸。例如，孔的尺寸可以为约1纳米(“nm”)至约1毫米(“mm”)、10nm至1mm、100nm至1mm、1微米(“μm”)至1mm、10μm至1mm或100μm至1mm。
在分区为乳液中的小滴的情况下，可以以任何合适的方式生成该小滴，包括批量(bulk)乳化方法和/或借助于微流体装置。批量乳化和/或微流体装置还可以用于将颗粒分配到小滴中。此外，小滴的体积可以是任何合适的体积。例如，该小滴的体积可以为约1飞升(“fL”)至100μL微升(“μL”)、10fL至10μL、100fL至10μL、1皮升(“pL”)至1μL、1纳升(“nL”)至10μL、10nL至10μL、100nL至10μL或1μL至10μL。
本公开内容的附加方面提供了用于测定或鉴定样品中靶核酸分子/靶核酸序列的存在与否的方法、用于生成包含靶核酸分子的核酸复合体的方法和用于核酸扩增的方法。
在另一方面，本公开内容提供了用于测定在具有或怀疑具有靶核酸分子的样品中该靶核酸分子的存在与否的方法。该方法包括在产生与至少第一颗粒和第二颗粒连接的扩增的靶核酸分子的条件下使该样品在反应混合物中经历核酸扩增反应，其中该扩增的靶核酸分子包含该靶核酸分子的序列的至少一部分。该反应混合物可包含该第一颗粒和第二颗粒。该第一颗粒可具有第一引物，该第一引物具有5’端和3’端，其中经由该第一引物的5’端与第一颗粒连接。第一引物可在靶核酸分子链的5’端显示出与靶核酸分子链的序列同源性。第二颗粒可具有第二引物，该第二引物具有5’端和3’端，其中经由该第二引物的5’端与第二颗粒连接。第二引物可在靶核酸分子链的互补链的5’端显示出与该互补链的序列同源性。此外，第一引物与之显示出同源性的靶核酸分子链上的序列可不同于第二引物与之显示出同源性的互补链的序列。此外，第一引物和第二引物可适合于在引物延伸反应中延伸以形成靶核酸分子或其一部分的拷贝。
在一些实施方案中，当与靶核酸分子链最佳比对时，第一引物可显示出与靶核酸分子链的5’端至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同源性。类似地，当与所述互补链最佳比对时，第二引物可显示出与该互补链的5’端至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同源性。此外，在一些实施方案中，靶核酸分子可以是单链的，或在一些实施方案中，靶核酸分子可以是双链的。此外，包括经由如本文别处所述的直接附接或间接附接，第一引物可与第一颗粒连接且第二引物可与第二颗粒连接。引物与颗粒之间的直接和间接附接可经由也如本文别处所述的共价键、非共价相互作用及其组合。
所述反应混合物还可以包含扩增靶核酸分子所需的试剂，该试剂包括聚合酶以及本文别处所述扩增核酸分子所需的其他此类试剂。聚合酶可以在引物延伸反应中延伸第一引物的3’端以形成靶核酸链或其一部分的拷贝和/或可以在第二引物延伸反应中延伸第二引物的3’端以形成互补链或其一部分。此外，在一些实施方案中，该反应混合物可被包含在分区中。可使用任何合适的分区来包含反应混合物，其包括本文别处所述的分区的实例类型。
在一些实施方案中，所述方法可进一步包括检测与第一颗粒和第二颗粒连接的扩增的靶核酸分子。包括经由本文别处所述的检测方式，例如，光学检测，可以检测该扩增的靶核酸分子。例如，所述反应混合物可进一步包含光学响应性物质，并且检测可经由光学响应性物质(例如，染料或本文别处所述的其他光学响应性物质)来实现。该光学响应性物质可与该扩增的靶核酸分子相互作用，使得在成功扩增靶核酸时，可从光学响应性物质检测到可检测的信号(或缺乏可检测的信号)。在一些实施方案中，通过检测到第一或第二颗粒中的任一者或两者或该扩增的靶核酸分子与第一和第二颗粒的组装，可检测到该扩增的靶核酸分子(例如，如本文别处所述的核酸复合体的检测)。在一些实施方案中，扩增的靶核酸分子与第一和第二颗粒的组装可在检测之前使用例如本文别处所述的分离方式来分离。
在一些实施方案中，该方法可包括产生多个扩增的靶核酸分子，并且在一些实施方案中包括检测多个扩增的靶核酸分子。在这种情况下，反应混合物可包含多个扩增的核酸分子可与之连接的超过两个的颗粒。每个附加的颗粒可包含第一引物和第二引物中的任一者或两者。
在另一方面，本公开内容提供了用于鉴定样品中靶核酸分子的存在或不存在的方法。该方法包括提供怀疑含有靶核酸分子的溶液，其中该靶核酸分子包含与第一颗粒连接的第一核酸链和与第二颗粒连接的第二核酸链。该第二核酸链可经由序列互补性与该第一核酸链杂交以产生核酸复合体。此外，该方法还包括检测指示在溶液中存在或不存在该核酸复合体的信号，从而鉴定该靶核酸分子的存在。
在一些实施方案中，可向检测器提供溶液，并且该检测器可检测指示在该溶液中存在或不存在核酸复合体的信号。检测指示在溶液中存在或不存在核酸复合体的信号可经由任何合适的检测方法完成，并且在一些实施方案中经由检测器来完成。在本文别处描述了检测方式和检测的实例。在一些实施方案中，指示存在或不存在核酸复合体的信号可以指示核酸复合体的光学性质(例如，与核酸复合体缔合的光学响应性物质，例如，本文别处所述的示例染料)、物理性质(例如，该核酸复合体的密度、大小)、电性质(例如，电导率、阻抗)、静电性质和/或电化学性质。在一些实施方案中，第一和第二颗粒可以是金属颗粒，并且可如本文别处所述通过目视检查来检测信号。
包含核酸复合体的溶液可以是任何合适的溶液，例如，如本文别处所述的核酸扩增反应混合物或经处理的反应混合物(例如，用稀释剂如水、缓冲液、其他液体介质或其组合稀释的反应混合物)。在一些实施方案中，该溶液可以是包含该核酸复合体的水溶液。在一些实施方案中，该溶液可包含已使用任何合适的分离方式从反应混合物中分离出的核酸复合体，所述分离方式包括本文别处所述的分离核酸复合体的实例。在一些实施方案中，该溶液可被包含在分区内。可使用任何合适类型的分区来包含该溶液，其包括本文别处所述的分区的示例类型。在一些实施方案中，该溶液可包含含有两个或更多个颗粒的核酸复合体(例如，包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个颗粒的核酸复合体)。在一些实施方案中，该溶液可包含多个含有两个或更多个颗粒的核酸复合体，其中在一些实施方案中，所检测到的信号指示多个核酸复合体的存在或不存在。在一些实施方案中，该核酸复合体可以或可以不固定或附着(例如，连接)于该溶液中的支持物上。在该核酸复合体不固定或附着于该溶液中的支持物上的实施方案中，该核酸复合体可以悬浮和/或自由漂浮在该溶液内。
此外，包括经由如本文别处所述的直接附接或间接附接，第一核酸链可与第一颗粒连接且第二核酸链可与第二颗粒连接。靶核酸链与颗粒之间的直接和间接附接可经由也如本文别处所述的共价键、非共价相互作用及其组合。
在另一方面，本公开内容提供了用于测定样品中靶核酸序列的存在或不存在的方法。该方法包括接受测定样品中该靶核酸序列的存在或不存在的请求，以及测定该样品中该靶核酸序列的存在或不存在。测定可通过检测包含与至少第一颗粒和第二颗粒连接的双链核酸分子的至少一个核酸复合体来完成。该双链核酸分子可包含第一单链核酸分子和互补于该第一单链核酸分子的第二单链核酸分子。此外，该第一单链核酸分子和该第二单链核酸分子中的至少一个可包含靶核酸序列。此外，该方法可进一步包括生成指示在该样品中存在或不存在靶核酸序列的报告。
在一些实施方案中，测定可进一步包括检测指示存在或不存在该核酸复合体的信号。检测指示在溶液中存在或不存在核酸复合体的信号可经由任何合适的检测方法例如本文别处所述的示例检测方式完成。所检测到的信号可以指示该核酸复合体的光学性质(例如，由与该核酸复合体缔合的光学响应性物质(例如，染料或本文别处所述的其他光学响应性物质)的活动生成的信号)、物理性质(例如，密度或大小)、电性质(例如，电导率、阻抗)、静电性质和/或电化学性质。在一些实施方案中，该核酸复合体可以在分区中被检测到。该核酸复合体可以在任何合适类型的分区中被检测到，该分区包括本文别处所述的分区的示例类型。在一些实施方案中，如本文别处所述，该核酸可以在检测之前分离(例如，从反应混合物中分离)。在一些实施方案中，如本文别处所述，该核酸复合体可包含多个与超过两个颗粒连接的双链核酸分子。
此外，生成的报告可以是任何适当类型的报告。报告可包含任何数目的所需元素，其非限制性实例包括关于样品中靶核酸序列的存在或不存在、样品中靶核酸复合体的存在或不存在、靶核酸序列、在样品中所检测到的核酸分子的数目、在样品中所检测到的靶核酸序列的拷贝数目等的信息。该报告可以以打印报告(例如，硬拷贝)的形式提供和/或可以以电子报告的形式提供。电子报告可以呈现在用户界面(UI)上，如在电子设备的电子显示器上的UI。在一些实例中，电子设备可包括电阻式或电容式触摸屏。电子显示器的非限制性实例包括监视器或电视、与检测器可操作地连接的屏幕、平板电脑屏幕、移动设备屏幕、便携式计算机屏幕等。在一些实施方案中，UI可以是被配置用于向用户提供报告的图形用户界面(GUI)。GUI可包括文本、图形和/或音频组件。打印报告和电子报告均可分别存储在文件或数据库中，使得它们是可访问的以供将来应用。此外，可使用包括例如网络连接、无线连接和/或互联网连接的任何合适的通信介质将报告传输至本地或远程位置。
在一些实施方案中，可接受来自任何类型的请求者测定样品的请求，其中请求者的非限制性类型包括研究专业人员(例如，科学家、实验室技术员、教授等)、医疗保健专业人员(例如，护士、医生、医生助手、医疗技术人员等)、研究组织(例如，实验室、研究医院、研究中心、研究所和学术机构、大学)、医疗保健组织(例如，医院、疗养院、临终安养院(hospice)、医疗中心、诊所)、公共卫生组织(例如，政府机构，如美国疾病控制中心(CDC))及其组合。在一些实施方案中，可向该请求者和/或任何其他期望的接收者提供所生成的报告。上述请求者的示例类型还可以是报告的接收者。
在另一方面，本公开内容提供了用于生成包含靶核酸分子的核酸复合体的方法。该方法包括在产生该核酸复合体的条件下在反应混合物中用正向引物和反向引物扩增靶核酸分子。该核酸复合体可包含扩增的靶核酸分子，其中所述扩增的靶核酸分子包含第一链和至少部分互补于该第一链的第二链。该第一链可在该第一链的5’端与第一颗粒偶联，并且该第二链可在该第二链的5’端与第二颗粒偶联。
在一些实施方案中，正向引物可与第一颗粒连接且反向引物可与第二颗粒连接。包括经由如本文别处所述的直接附接或间接附接，正向和反向引物可分别与第一颗粒和第二颗粒连接。引物与颗粒之间的直接和间接附接可经由也如本文别处所述的共价键、非共价相互作用及其组合。
在一些实施方案中，所述反应混合物还可以包含第一颗粒和第二颗粒，以及如本文别处所述的扩增靶核酸分子所需的任何其他试剂。此外，如本文别处所述，该反应混合物可包含与附加的正向和/或反向引物偶联的附加的颗粒，以产生包含超过两个与附加的扩增靶核酸分子偶联的颗粒的核酸复合体。例如，在一些实施方案中，该方法可进一步包括采用在其上连接有正向引物或反向引物的第三颗粒来扩增靶核酸分子以产生核酸复合体。在此类实施方案中，该核酸复合体可进一步包含经由附加的扩增靶核酸分子与第一颗粒和/或第二颗粒偶联的第三颗粒。
此外，在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测核酸复合体。该核酸复合体的检测可以经由任何合适的方式来实现，所述方式包括本文别处所述的检测的示例方式(例如，光学(例如，借助于光学响应性物质)、光谱学、电化学、静电、物理、电等)。在一些实施方案中，第一和第二颗粒可以是金属颗粒，并且核酸复合体的检测可通过目视检查来实现。
在一些实施方案中，所述反应混合物可被包含在分区中。可使用任何合适的分区类型来包含反应混合物，该分区类型包括本文别处所述的分区的示例类型。在该反应混合物被包含在分区中的实施方案中，该方法可进一步包括将核酸复合体从该分区释放并检测所释放的核酸复合体。在一些实施方案中，该方法进一步包括分离该核酸复合体，该分离可在核酸复合体的任何检测之前、期间或之后进行。可以使用分离核酸复合体的任何合适的方式，其包括本文别处所述的分离的示例方式(例如，离心、磁分离、色谱法、毛细管作用、色谱法、过滤、沉降、亲和捕获(例如，亲和捕获于支持物之上)等)。
在另一方面，本公开内容提供了用于生成包含靶核酸分子的核酸复合体的方法。该方法包括在反应混合物中用正向引物和反向引物扩增靶核酸分子以产生扩增的靶核酸分子。该正向引物和该反向引物可各自包含能够在引物延伸反应中延伸的3’端和发夹结构。此外，该扩增的靶核酸分子可包含在该扩增的靶核酸分子的一端含有第一突出端序列的第一链，以及在该扩增的靶核酸分子的另一端含有第二突出端序列的第二链。此外，该方法进一步包括使扩增的靶核酸分子与第一颗粒和第二颗粒接触以产生核酸复合体。该核酸复合体可包含与第一颗粒和第二颗粒复合的扩增的靶核酸分子。该扩增的靶核酸分子可经由第一突出端序列与连接至第一颗粒的第一捕获序列之间的序列互补性而与第一颗粒复合，以及经由第二突出端序列与连接至第二颗粒的第二捕获序列之间的序列互补性而与第二颗粒复合。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括将第一链与第二捕获序列连接和/或将第二链与第一捕获序列连接。连接可经由任何合适的方法来实现，其包括经由反应混合物中存在的连接酶例如DNA连接酶的作用。此外，该反应混合物可包含扩增靶核酸分子所需的一种或多种试剂，如本文别处所述的核酸扩增所需的试剂。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括分离和/或检测核酸复合体。核酸复合体的分离和/或检测可使用任何合适的分离和检测方式来完成，所述方式包括本文别处所述的分离和检测的示例方式。
如本文所用，“突出端序列”通常是指与双链核酸分子的5’或3’端缔合的单链序列。突出端序列可以用于连接(例如，通过经由序列互补性的杂交)双链核酸分子与另一核酸分子。
此外，在一些实施方案中，正向引物和/或反向引物可包含不能经由引物延伸反应拷贝的间隔区。引物的间隔区可用于在衍生自引物的扩增的靶核酸分子上生成突出端序列。可以生成突出端序列是因为在间隔区5’侧的任何引物序列也可能不被拷贝，这是由于间隔区的存在阻止了引物延伸反应期间聚合酶的进一步作用。间隔区可包含单个核苷酸、一系列的核苷酸和/或非核酸物质。可被包含在间隔区中的物质的非限制性实例包括聚乙二醇(PEG)、1’,2’-二脱氧核糖(脱碱基位点)、碳质连接体(例如，可从Integrated DNATechnologies获得的多碳连接体、C3间隔区，间隔区、间隔区9，间隔区18)及其组合。
图3A示意性地描述了具有能够在引物延伸反应中延伸的3’端、具有发夹结构和间隔区的正向或反向引物的实例。如图3A所示，引物300被配置为包含发夹结构且包含能够在引物延伸反应中延伸的3’端。在发夹结构的环区301中，引物300的序列包含不能经由引物延伸反应拷贝的间隔区302。该引物还包含茎区303。此外，图3B示意性地描述了图3A中所示的引物的线性构型。如图3B所示，该引物包含处于间隔区的5’侧的突出端序列区304，以及间隔区302的3’侧的引发序列区305。在图3A中所示的发夹构型中，突出端序列区304的一部分与引发序列区305的一部分杂交，这形成了茎区303。
突出端序列304在与核酸分子上的靶核酸序列杂交时的解链温度(Tm,1)可低于与茎区303中的引发序列区305的一部分杂交的突出端序列区304的一部分的解链温度(Tm,2)，所述解链温度均可低于引发序列305在与模板核酸分子上的其靶核酸序列杂交时的解链温度(Tm,3)。当暴露于高于Tm,2的温度时，图3A中所示的引物300可采取图3B中所示的线性构型。此外，在这样的温度也低于Tm,3的情况下，引发序列305可引发靶核酸序列，因为引发序列305在低于Tm,3的温度下不与靶核酸序列解链。对于图3A和图3B中所示的示例引物300，Tm,1为28℃，Tm,2为55℃且Tm,3为59℃。
图3C示意性地描述了图3A和图3B中所示的引物300的功能性的实例。如图3C中所示，在反应混合物中提供引物300，且在暴露310于适当的温度(T)(例如，Tm,1和Tm,2<T<Tm,3)时，引物300被线性化。线性化的引物300随后可经由引发序列区305以及也被包含在反应混合物中的核酸分子306上针对引发区305的核酸序列而引发320核酸分子306。引发序列305可在引物延伸反应中在其3’端得以延伸307(例如，经由聚合酶的作用)。此外，由于间隔区302的存在，在引物延伸反应(或后续的引物延伸反应)中，核酸分子306不被延伸为包含互补于突出端序列304的序列。引物延伸反应产生包含引物300、与单链突出端序列304连接的核酸分子306的双链核酸分子。
该反应混合物还可以包含与捕获序列309在该捕获序列的3’端偶联的颗粒308。捕获序列309可包含至少部分互补于突出端序列304的序列。在这种情况下，突出端序列304可与捕获序列309杂交330，使得与突出端序列304连接的双链分子与颗粒308偶联。在突出端序列304与捕获序列309杂交之后，该双链核酸分子的核酸分子306的3’端可与捕获序列309在其5’端连接，使得该双链分子共价固定于颗粒308上。
图4示意性地描述了用类似于图3A/图3B中所示引物300的引物扩增双链核酸分子(例如，靶核酸分子)并且生成核酸复合体的示例方法。如图4所示，在反应混合物中可提供双链核酸分子401、正向引物402、反向引物403和扩增双链核酸分子401所需的其他试剂(例如，聚合酶、dNTP、辅因子等)。正向引物402和反向引物403被配置为包含发夹结构和可在引物延伸反应中延伸的3’端，类似于图3A和图3B中描述的示例引物300。
该反应混合物随后可经受适合于经由正向引物402和反向引物403扩增双链核酸分子401的条件410，以生成多个扩增的双链核酸分子404。例如，该反应混合物的温度可以循环，使得双链核酸分子401经由正向引物402和反向引物403来扩增。单独的扩增双链核酸分子的一条链可在其5’端包含第一突出端序列405，并且该单独的扩增双链核酸分子的另一条链可在其5’端包含第二突出端序列406。
扩增的双链核酸分子404随后可与一个或多个第一颗粒406和一个或多个第二颗粒407接触。在一些情况下，在双链核酸分子401的扩增之前，该反应混合物可初始包含第一颗粒406和第二颗粒407。在其他情况下，在双链核酸分子401扩增期间或之后，可将第一颗粒406和第二颗粒407添加至反应。此外，第一颗粒406的单独第一颗粒包含第一捕获序列408的一个或多个拷贝，第一捕获序列408在其3’端与单独第一颗粒偶联。第一捕获序列408至少部分互补于扩增的双链核酸分子404的突出端序列405。此外，第二颗粒407的单独第二颗粒包含第二捕获序列409的一个或多个拷贝，第二捕获序列409在其3’端与该单独第二颗粒偶联。第二捕获序列409至少部分互补于扩增的双链核酸分子404的突出端序列406。
在与第一颗粒406和第二颗粒407接触时，突出端序列405和406可经由序列互补性分别与捕获序列408和409杂交，使得单独的扩增双链核酸分子404与单独第一颗粒406和/或单独第二颗粒407偶联。由于突出端序列位于单独的扩增双链核酸分子404的每条链的5’端，因此每一个扩增的双链核酸分子404在其互补链之一的5’端与单独第一颗粒406和单独第二颗粒407偶联。在第一颗粒406和第二颗粒407的其中之一或两者分别包含多个捕获序列408和409的情况下，多个扩增的双链核酸分子404可与每个颗粒偶联，使得可以生成核酸复合体411。在捕获序列与突出端序列杂交之后，每一个扩增的双链核酸分子的每条链的3’端可与其相邻的捕获序列408或409连接(例如，经由连接酶的作用)，使得该双链分子共价附接至各自的捕获序列。如果可以，可随后如本文别处所述来分离和/或检测核酸复合体411和/或核酸复合体411的扩增双链核酸分子。
在另一方面，本公开内容提供了用于核酸扩增的方法。该方法包括将与第一颗粒连接的正向引物与核酸链退火，以及将与第二颗粒连接的反向引物与该核酸链的互补链退火。然后，该方法进一步包括以模板指导的方式延伸正向引物和反向引物以产生与第一颗粒连接的第一双链核酸分子和与第二颗粒连接的第二双链核酸分子。此外，该方法进一步包括使第一双链核酸分子和第二双链核酸分子变性以生成与第一颗粒连接的第一单链分子和与第二颗粒连接的第二单链分子。此外，该方法进一步包括将正向引物与第二单链分子退火和将反向引物与第一单链分子退火以产生包含扩增的双链核酸分子的核酸复合体。该扩增的双链核酸分子可在一端与第一颗粒连接且在其另一端与第二颗粒连接。
所述方法的步骤可在反应混合物中进行，该反应混合物包含与正向引物连接的第一颗粒、与第二引物连接的第二颗粒、核酸链以及核酸扩增所需的一种或多种试剂。此外，这样的反应混合物还可以包含与正向和/或反向引物连接的附加的颗粒(例如，第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十或更多的颗粒)，使得生成包含与附加的扩增双链核酸分子连接的附加颗粒的核酸复合体。例如，在一些实施方案中，该方法可进一步包括采用在其上连接有正向引物或反向引物的第三颗粒来扩增该核酸链以产生核酸复合体，其中所述核酸进一步包含经由附加的扩增双链核酸分子与第一颗粒和/或第二颗粒偶联的第三颗粒。
在一些实施方案中，所述方法的一个或多个步骤可以在分区中进行。在一些实施方案中，整个方法可以在分区中进行。该方法的一个或多个步骤或整个方法可以在任何合适类型的分区中进行，所述合适类型包括本文别处所述的分区的示例类型。此外，该方法的一个或多个步骤(直到该方法的所有步骤)可重复一个或多个循环，由此可以生成包含超过两个颗粒和/或多个核酸复合体的核酸复合体。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括分离和/或检测核酸复合体。该核酸复合体的分离和/或检测可使用任何合适的分离和/或检测方式来完成，所述方式包括本文别处所述的分离和检测的示例方式(例如，光学检测、光谱检测、物理检测、电检测、电化学检测、静电检测)。
图5示意性地描述了采用与颗粒偶联的正向和反向引物来扩增双链核酸分子以产生核酸复合体的实例方法。如图5中所示，在反应混合物中可以提供双链核酸分子501；多个第一颗粒502，每一个均与正向引物503的一个或多个拷贝在其5’端偶联(例如，共价偶联)；多个第二颗粒504，每一个均与反向引物505的一个或多个拷贝在其5’端偶联(例如，共价偶联)；以及扩增双链核酸分子501所需的其他试剂(例如，聚合酶、dNTP、辅因子等)。正向引物503显示出与双链核酸分子501的链501a的5’端的序列同源性，并且还至少部分互补于双链核酸分子501的链501b的3’端的至少一部分。反向引物504显示出与双链核酸分子501的链501b的5’端的序列同源性，并且还至少部分互补于双链核酸分子501的链501a的3’端的至少一部分。该反应混合物可经受适合于使双链核酸分子501变性为其组成链501a和501b的条件510。例如，可使该反应混合物达到适合于使双链核酸分子501变性的变性温度。
在双链核酸分子501变性之后，可使链501a和501b分别与单独第二颗粒504及单独第一颗粒502接触。该反应混合物随后可经受合适的条件，使得正向引物503的单独拷贝可与它在链501b的3’端的互补序列退火，并且使得反向引物505的单独拷贝可与它在链501a的3’端的互补序列退火。例如，可使该反应混合物的温度达到退火温度，使得正向引物503和反向引物504与它们在链501b和501a上的相应序列退火。
在正向引物503和反向引物505退火之后，可使反应混合物处于条件520下，使得正向引物503和反向引物505的3’端在引物延伸反应中以模板指导的方式延伸(例如，经由聚合酶的作用)。例如，可使反应混合物的温度达到延伸温度，在该温度下可发生引物延伸反应。在正向引物503的延伸和反向引物505的延伸之后，单独第一颗粒502和单独第二颗粒504与扩增的双链核酸分子偶联，该扩增的双链核酸分子包含与双链核酸分子501的链501a和501b相同或基本上相同的组成链。经由与双链核酸分子501的核酸链501a相同或基本上相同的核酸链的5’端，单独第一颗粒502与其扩增的双链核酸分子偶联。经由与双链核酸分子501的核酸链501b相同或基本上相同的核酸链的5’端，单独第二颗粒504与其扩增的双链核酸分子偶联。
可通过使反应混合物经受适当的条件530，针对每一个扩增的双链核酸分子重复正向引物503和反向引物505的附加拷贝的变性、退火的循环，以生成附加的扩增双链核酸分子。例如，如上所述，该反应混合物的温度可通过合适的变性、退火和延伸温度进行循环。可在该反应混合物中通过附加的单独第一颗粒502和单独第二颗粒504提供正向引物503和反向引物505的附加拷贝。与附加的单独第一颗粒502偶联的正向引物503的拷贝以及与附加的单独第二颗粒504偶联的反向引物505的拷贝可分别与偶联于单独第二颗粒504和单独第一颗粒502的核酸链上的互补序列退火。该引物随后可在后续的引物延伸反应中延伸，使得生成与单独第一颗粒502和单独第二颗粒504均偶联的附加的扩增双链核酸分子。该过程可重复所需的循环数，使得在反应混合物中经由分别与第一颗粒502和第二颗粒504偶联的正向引物503和反向引物504的附加拷贝生成核酸复合体506。如果可以，随后可如本文别处所述检测核酸复合体506和/或核酸复合体506的双链核酸分子。
在本文所述的各个方面，方法可进一步包括分离核酸复合体。例如，核酸复合体可在扩增反应之后从反应混合物中分离。在一些实施方案中，核酸复合体可在检测核酸复合体之前、期间或之后从反应混合物中分离。可以使用分离核酸复合体的任何合适的方式。分离核酸复合体的方式的非限制性实例包括离心、磁分离(例如，经由颗粒或核酸复合体的颗粒的磁性)、色谱法(例如，尺寸色谱法、亲和色谱法)、电泳、毛细管作用(例如，通过固体基质如滤纸或妊娠试纸的毛细管作用)、过滤、沉降、亲和捕获及其组合。
在使用亲和捕获来分离核酸复合体的情况下，核酸复合体的一个或多个颗粒可包含与其结合配偶体结合的亲和捕获剂，该亲和捕获剂可以例如固定在支持物上。核酸复合体的亲和捕获剂与其固定于支持物上的结合对的结合可将核酸复合体固定于该支持物上。例如，核酸复合体的一个或多个颗粒可包含未经延伸的引物或未与另一核酸分子偶联的捕获序列。这样的引物或捕获序列可与可固定于支持物上的互补序列杂交，使得该引物或捕获序列与该互补序列的杂交通过将该核酸复合体固定于支持物上而分离所缔合的核酸复合体。在另一实例中，核酸复合体的一个或多个颗粒可包含与固定于支持物上的各个生物素部分结合的一个或多个链霉亲和素部分。或者，例如，所述一个或多个颗粒可包含生物素且该支持物可包含链霉亲和素。在任一情况下，链霉亲和素与生物素的结合可将该核酸复合体固定于该支持物上。
图6示意性地描述了生成核酸复合体和分离核酸复合体的实例。如图6所示，油包水乳液601提供于容器602中。该油包水乳液包含在连续油相603中的多个小滴，其中每一个小滴包含含有多个两种类型的颗粒605和606的水性反应混合物604。第一种类型的颗粒605可包含正向引物，第二种类型的颗粒606可包含反向引物。或者，第一种类型的颗粒605和第二种类型的颗粒606可包含如本文别处所述能够与扩增的核酸分子的突出端序列杂交的第一和第二捕获序列。每一个小滴中的颗粒在小滴反应混合物中是游离的，并且最初未与核酸复合体结合。此外，阳性小滴607包含模板核酸分子608，而阴性小滴609不包含模板核酸分子608。模板核酸分子可以是单链的或可以是双链的。
阳性小滴607和阴性小滴609经受适合于扩增模板核酸分子608的条件610，以生成与核酸复合体611缔合的扩增的核酸分子。由于阳性小滴607包含模板核酸分子，因此在扩增模板核酸分子608之后在阳性小滴607中生成核酸复合体611。此外，在阴性小滴609中未生成核酸复合体611，因为阴性小滴609不包含模板核酸分子608，并因此没有发生扩增。
油包水乳液601随后可被打破620成连续油相603和水相612，水相612包含来自油包水乳液601的阳性小滴607和阴性小滴609的水性反应混合物604的合并物。水相612可与连续油相603分离，例如通过经由分液漏斗将油从水相中倒出或经由移液从容器602中移出。随后可将分离的水相612涂覆630于固定于亲和捕获剂614的表面(例如，阵列，如核酸阵列)613，使得水相612中的核酸复合体611固定于该表面。例如，亲和捕获剂614可以是捕获序列，该捕获序列互补于与核酸复合体611的一个或多个颗粒缔合的引物或捕获序列。在另一实例中，亲和捕获剂614可以是结合对的成员，该成员与该结合对的另一成员结合，该另一成员与核酸复合体611的一个或多个颗粒偶联。可随后检测分离的复合体611，其包括经由本文别处所述的检测的示例方式。
在本文所述的各个方面，方法可包括检测一个或多个核酸分子(例如，扩增的核酸分子、双链核酸分子、单链核酸分子、靶核酸分子、与核酸复合体结合的核酸分子)、核酸序列(例如，靶核酸序列)和/或核酸复合体。这些物质中的任何一种的检测可以是定性的，而在一些实施方案中是定量的。在一些实施方案中，核酸复合体的检测可用来确定或测定作为核酸复合体的组分的核酸分子(例如，靶核酸分子)和/或核酸序列(例如，靶核酸序列)的不存在或存在。例如，检测到的核酸复合体数目可指示样品中被扩增以生成核酸复合体的靶核酸分子的拷贝数。核酸分子、核酸序列或核酸复合体的检测可以采用任何合适的检测方法或方式来实现。在一些实施方案中，核酸复合体可在检测之前、期间或之后分离。所使用的检测方法的具体类型可依赖于例如被检测的具体物质、检测期间存在的其他物质、可检测的物质是否存在、待使用的可检测物质的具体类型和/或具体应用。
检测方法的非限制性实例包括光学检测、电检测、物理检测、光谱检测、静电检测和电化学检测。因此，可通过检测指示存在或不存在核酸分子、核酸序列和/或核酸复合体的信号(例如，指示核酸分子、核酸序列和/或核酸复合体或相关的可检测物质的光学性质、光谱性质、静电性质或电化学性质的信号)检测核酸复合体、核酸分子或核酸序列。光学检测方法包括但不限于目视检查(例如，经由眼睛的检测、未借助于光学检测器观察光学性质或光学事件)、荧光测定法(例如，荧光、荧光能量转移、猝灭的荧光)、UV-可见光吸光度和比色检测。配备有光学检测方式(例如，荧光显微镜检查、光学显微镜检查等)的成像(例如，显微镜检查)也可以用于光学检测。光谱检测方法包括但不限于质谱法、核磁共振(NMR)光谱法和红外光谱法。静电检测方法包括但不限于基于凝胶的技术，例如，凝胶电泳。这样的凝胶技术还可用于分离如本文别处所述的核酸复合体。电化学检测方法包括但不限于安培滴定法。电化学检测方法包括但不限于电导率或阻抗的检测。物理检测方法包括但不限于颗粒大小、密度、沉降速率和/或粘度的检测。
在一些实施方案中，核酸分子、颗粒、颗粒组或核酸复合体的检测可采用流体流动来实现。包含待检测物质的流体(例如，溶液、反应混合物)可以流过合适的检测器，使得在流体流过检测器时该检测器检测该物质。或者，由于向检测器提供包含待检测物质的流体且检测在没有流体流动的情况下进行，因此检测可以静态地完成。例如，待检测物质可以涂覆于载玻片或其他表面，并使用配备有合适检测器的照相机进行成像。
颗粒、颗粒组或包含颗粒的核酸的检测可至少部分地基于颗粒或核酸复合体的一个或多个物理性质来实现。在一些实施方案中，一个或多个颗粒或包含颗粒的核酸复合体的检测可至少部分地基于颗粒的大小、核酸复合体中颗粒的大小或核酸复合体的大小。在一些实施方案中，一个或多个颗粒或包含颗粒的核酸复合体的检测可至少部分地基于颗粒的密度、核酸复合体中颗粒的密度或核酸复合体的密度。在一些实施方案中，一个或多个颗粒或核酸复合体的检测可基于核酸复合体的颗粒的沉降速率和/或粘度。此外，一个或多个颗粒或包含颗粒的核酸的检测可至少部分地基于颗粒或核酸复合体的一个或多个电性质来实现。
在一些实施方案中，检测核酸分子、核酸序列或核酸复合体可借助于可检测物质来实现。可检测物质可与核酸分子、与核酸复合体缔合的核酸分子和/或核酸复合体的任何其他组分连接或偶联，包括共价地和非共价地(例如，包括双链核酸分子的嵌入)。此外，如本文别处所述，可检测物质可被包含在用来生成核酸复合体和/或用于核酸扩增的反应混合物中。可检测物质的非限制性实例包括光学响应性物质(例如，光学响应性染料、光学响应性寡核苷酸探针(例如，TaqMan探针、TaqMan Tamara探针、TaqMan MGB探针、Lion探针、分子信标))和放射性标记(例如，14C、123I、124I、125I、131I、99mTc、35S或3H)。
在一些实施方案中，可检测物质可以是当经受适当条件时生成(或不能生成)信号的光学响应性染料(例如，荧光染料)。染料的非限制性实例包括SYBR绿、SYBR蓝、DAPI、碘化丙锭、Hoeste、SYBR金、溴化乙锭、吖啶、原黄素、吖啶橙、吖啶黄素、氟香豆素(fluorcoumanin)、玫瑰树碱、道诺霉素、氯喹、偏端霉素D、色霉素、乙菲啶、光神霉素、聚吡啶钌、氨茴霉素、亚甲蓝、菲啶和吖啶、碘化丙锭、碘化己锭(hexidium iodide)、二氢乙锭、乙锭同型二聚体-1和-2、单叠氮化乙锭和ACMA、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst34580、DAPI、派洛宁Y、Blue View、吖啶橙、7-AAD、放线菌素D、LDS751、藻红蛋白、羟芪巴脒、SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRO-1、YO-PRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR金、SYBR绿I、SYBR绿II、SYBR DX、SYTO-40、-41、-42、-43、-44、-45(蓝)、SYTO-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(绿)、SYTO-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙)、SYTO-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(红)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、罗丹明、四甲基罗丹明、R-藻红蛋白、Cy-2、Cy-3、Cy-3.5、Cy-5、Cy5.5、Cy-7、德克萨斯红、Phar-Red、别藻蓝蛋白(APC)、CellTracker绿、7-AAD、乙锭同源二聚体I、乙锭同源二聚体II、乙锭同源二聚体III、伞形酮、曙红、荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白)、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、芪、荧光黄、级联蓝、二氯三嗪基胺荧光素、丹酰氯、诸如包含铕和铽的那些的荧光镧系元素络合体、羧基四氯荧光素、5和/或6-羧基荧光素(FAM)、5-(或6-)碘乙酰胺荧光素、5-{[2(和3)-5-(乙酰巯基)-琥珀酰基]氨基}荧光素(SAMSA-荧光素)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、5和/或6羧基罗丹明(ROX)、7-氨基-甲基-香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、BODIPY荧光团、8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐、3,6-二磺酸盐-4-氨基-萘酰亚胺、藻胆蛋白、AlexaFluor 350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790染料、DyLight 350、405、488、550、594、633、650、680、755和800染料或其他荧光团。
在一些实施方案中，核酸复合体可以经由在核酸复合体形成时观察到的光学变化来检测。例如，如本文别处所述，核酸复合体可由多个颗粒生成。该颗粒可以是例如金属颗粒(例如，金属纳米颗粒)，例如，金纳米颗粒或银纳米颗粒。游离颗粒在核酸复合体的形成之前可以显示第一颜色，并且包含相同颗粒的核酸复合体可以显示第二颜色。可以检测(例如，采用目视检查和/或检测器)第二颜色来鉴定/定量该核酸复合体，并且第一颜色到第二颜色的颜色变化(或不存在颜色变化)可用来测定该核酸复合体的存在或不存在。在一些实施方案中，该核酸复合体可以从其他物质中分离出以便观察任何颜色变化。此外，颗粒的其他合适的光学性质可以用于检测核酸复合体，例如，从半导体颗粒接收的光信号。
在一些实施方案中，核酸复合体可包含至少两种不同类型的颗粒(例如，具有两种不同材料成分的颗粒，例如金颗粒和银颗粒)。核酸复合体的光学检测可经由这两种类型的颗粒之间的能量转移进行。例如，第一种类型的颗粒可具有波长1a和发射波长1e。例如，第二种类型的颗粒可具有吸收波长2a和发射波长2e。可以检测发射波长2e，当包含该核酸复合体的溶液在波长1a下被激发(当核酸复合体存在时)时可以检测到发射波长2e。在不存在核酸复合体的情况下，当颗粒在波长1a下被激发时，第一颗粒和第二颗粒是分离的并且未检测到发射波长2e。
图1示意性地描述了经由核酸扩增生成核酸复合体、分离所生成的核酸复合体和检测该核酸复合体的实例。提供了两种反应混合物101和102。两种反应混合物包含含有正向引物的第一种类型的颗粒103和含有反向引物的第二种类型的颗粒104。或者，颗粒103和颗粒104可包含如本文别处所述能够与扩增的核酸分子的突出端序列杂交的第一和第二捕获序列。颗粒103和104在反应混合物中是游离的且最初未与核酸复合体缔合。在一些实施方案中，颗粒103和104均为金属颗粒，例如金或银纳米颗粒。反应混合物101包含可在颗粒104和105的存在下扩增的模板核酸分子105，使得生成包含一个或多个扩增的核酸分子和颗粒104和105的核酸复合体。反应混合物102不包含模板核酸分子105。模板核酸分子可以是单链的或者可以是双链的。此外，两种反应混合物的颜色由于颗粒103和104的颜色而呈红色。
反应混合物101和102经受适合于扩增模板核酸分子105的条件106，以生成与核酸复合体107缔合的扩增的核酸分子。由于反应混合物101包含模板核酸分子，因此在扩增模板核酸分子105之后在反应混合物101中生成核酸复合体107。此外，因为反应混合物102未包含模板核酸分子105，所以在反应混合物102中未生成核酸复合体107，并因此没有发生扩增。在核酸复合体107形成时，反应混合物101的颜色因核酸复合体107中颗粒104和105的偶联而由红色变为蓝色。由于未生成核酸复合体，故反应混合物102的颜色仍然为红色。
可以采用目视检查来检测反应混合物101的蓝色，以确定反应混合物101包含核酸复合体107(并因此包含扩增的核酸分子)。可以采用目视检查来检测反应混合物102的红色，以确定反应混合物102不包含核酸复合体107(并因此不包含扩增的核酸分子)。在核酸复合体107的分离有助于观察其蓝色的情况下(例如，由于例如来自反应混合物101中其他物质的可能的干扰)，可以从反应混合物101中(例如，经由色谱法或过滤)分离108核酸107。
蓝色带的存在109指示反应混合物中核酸复合体107(并因此，反应混合物中模板核酸分子105)的蓝色。蓝色带的不存在110指示反应混合物102不包含核酸复合体107(并因此不包含核酸分子105)。核酸复合体107的蓝色是颗粒104和105聚集(经由扩增)而生成核酸复合体107的结果。
图2示意性地描述了分离和检测核酸复合体的实例。如图所示，反应混合物201被包含在容器202中且包含核酸复合体。容器202被封装在密封容器203中。密封容器203可用来防止反应混合物201的污染。容器203还包含固体基质204(例如，一片滤纸或妊娠试纸)和能够在容器202的底部形成出口的机构205(例如，穿孔机构)。形成206出口以使得反应混合物201涂覆207于固体基质204。通过因毛细管作用210而产生的流动，将反应混合物201的内含物分离。由于反应混合物201中的核酸复合体与反应混合物201中的其他试剂(例如，游离颗粒、用于引物延伸反应的试剂、引物等)相比尺寸较大，它的移动与其他试剂相比比较迟缓。因此，在固体基质204上可生成对应于核酸复合体的带208，并将带208与在该固体基质的更远的下部生成的且表示反应混合物201中其他试剂的带209分离。可以在目视检查(如果可行)时检测带208与209的分离，或采用合适类型的检测器(例如，光学检测器)进行检测。此外，带208的不存在指示反应混合物201不包含核酸复合体。
本文所述的各个方面可用于进行多重核酸扩增反应。多重核酸扩增可用于各种不同的应用，其非限制性实例包括精确检测和定量小百分比基因拷贝数差异；检测和定量序列突变(例如，插入、缺失)和罕见突变(例如，与癌症相关的低患病率靶标中的罕见突变)；检测和定量病原体(例如，检测和绝对定量细菌和病毒载量，检测和定量污染食物和水供应的低水平病原体)；生成参考和标准(例如，生成遗传测量、计量和交叉实验室测量的绝对参考标准)；制备测序文库；在有或没有参考标准的情况下定量测序文库(例如，在没有参考标准的情况下绝对定量测序文库和验证测序结果)；检测和定量基因表达变化(例如，在没有参考基因的情况下检测基因表达变化，以供绝对转录物定量)；检测和定量转基因生物(GMO)(例如，检测和绝对定量植物中的外源基因)；检测和定量血液中可能存在的循环肿瘤细胞(CTC)或其他罕见核酸；分析样品中的基因拷贝数；分析生物样品中的病原体载量和病原体载量变化；分析响应于药物治疗的转录水平；环境测试；法医鉴定；临床诊断以及检测核苷酸多态性或基因型，如HLA或HMC分型。
在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法可用于RNA分析。在这样的分析中，RNA可经由逆转录酶的作用进行逆转录以生成cDNA。随后可使用本文别处所述的颗粒或颗粒组扩增该cDNA以生成核酸复合体。核酸复合体一旦形成便可随后使用任何合适的方法进行分离和/或检测，所述方法包括本文别处所述的那些。
图7示意性地描述了多重核酸扩增的示例方法。如图7所示，怀疑包含或包含一个或多个靶核酸序列的核酸样品701(例如，包含DNA的样品)提供于容器702中。可以向多个容器703中的每一个提供核酸样品701的等分试样。在图7所示的实例中，将核酸样品等分至四个容器中，然而可向任何合适数目的容器提供核酸样品701的等分试样。在每一个容器中，提供了被配置为扩增包含独特靶核酸序列的核酸分子的引物组(例如，至少包含正向引物和反向引物的引物组)。例如，可提供至少部分互补于靶核酸序列的正向引物，并且可提供至少部分互补于该靶核酸序列的互补序列的反向引物。
在图7所示的实例中，每一个引物组由“A”、“B”、“C”和“D”表示，并且每一个组被配置为扩增包含四个独特靶核酸序列中的一个的核酸分子。此外，如本文别处所述，每一个引物组中的引物可以按照与颗粒偶联(例如，经由引物的5’端偶联)的方式提供，或如本文别处所述以游离于颗粒的方式提供。在该引物以游离于颗粒的方式提供的情况下，该引物可被配置成发夹结构，并且该发夹结构还可以包含对于特定引物的特定引发序列独特的突出端序列(并因此包含特定的靶核酸序列)。除了引物组之外，还向容器703提供扩增核酸分子所需的附加试剂(例如，聚合酶、dNTP、合适的缓冲液、辅因子)以及生成核酸复合体所需的附加试剂(例如，与互补于任何突出端序列的捕获序列偶联的颗粒，等)以在每个容器中生成预反应混合物704。
随后可向每个预反应混合物704中添加710适合于生成油包水乳液的试剂(例如，油、表面活性剂等)，使得在每个容器中生成在连续油相中包含多个水性小滴的油包水乳液705。每个油包水乳液705中的水性小滴包含水性反应混合物，该水性反应混合物包含相应的预反应混合物704的内含物。在一些实施方案中，可以生成油包水乳液705，使得油包水乳液705中的一些水性小滴不包含待扩增的核酸分子。可以例如通过控制预反应混合物704中样品的稀释水平和/或为了生成油包水乳液705而添加710的试剂的量来实现这种控制。
来自每个油包水乳液705的小滴随后可合并720至提供给共同的容器707的共同的油包水乳液706中。如本文别处所述，该共同的油包水乳液706(或油包水乳液703)可随后经受适合于扩增每个小滴中的核酸分子(例如，经由每个小滴中存在的引物组)以及在扩增期间或之后生成核酸复合体的条件730。例如，如本文别处所述，共同的油包水乳液706的温度可以循环。作为扩增的结果，可在小滴中生成740核酸复合体(例如，对应于740中的闭环)，该小滴包含特定的引物组和包含相应的靶核酸序列的一个或多个核酸分子。在不存在核酸分子或不存在包含对应于小滴中引物组的靶核酸序列的核酸分子的小滴中，可能由于缺乏靶核酸序列而不能在小滴中生成核酸复合体(例如，对应于740中的开环)。
随后可打破750共同的油包水乳液706，使得两相混合物包含来自共同的油包水乳液706的连续油相的油708以及合并的水性混合物709，该水性混合物709包含共同的油包水乳液706的小滴的水性反应混合物。合并的水性混合物709可与油708分离并提供760给阵列711。阵列711的每个位置可包含表面，在该表面上固定有至少部分互补于游离引物的一个或多个捕获序列或与特定靶核酸序列(并因此与核酸复合体)缔合的捕获序列。可以安排阵列的位置，使得特定列、行或位置的其他配置对应于特定捕获序列或捕获序列组，并且因此对应于特定靶核酸序列。
在图7所示的实例中，阵列711的每一列对应于与特定靶核酸序列相对应的特定引物组(例如，上述的“A”、“B”、“C”和“D”)并标记为“A”、“B”、“C”和“D”。经由固定于阵列711的捕获序列，生成的核酸复合体的相应游离引物或捕获序列可与它们在阵列711上的合适位置结合。由于特定核酸复合体的每一个游离引物或捕获序列对于特定靶核酸序列是独特的，因此可根据该核酸复合体在阵列711上结合哪个(哪些)位点，将它鉴定为对应于特定靶核酸序列。在图7所示的实例中，在阵列位置处的闭环表示核酸复合体的结合，而在阵列位置处的开环表示在该阵列位置没有核酸复合体的结合。核酸复合体的结合可经由任何合适的方式检测，所述方式包括本文别处所述的检测方式。可以计数770(例如，数字计数)包含特定的结合的靶核酸复合体(并因此，特定的靶核酸序列)的位置，并将计数数据用于下游应用。
图8示意性地描述了多重核酸扩增及其在核酸测序中的可能用途的附加实例。如图8所示，怀疑包含或包含一个或多个靶核酸序列的核酸样品801(例如，包含DNA的样品)提供于容器802中。可以向多个容器803中的每一个提供核酸样品801的等分试样。在图8所示的实例中，将核酸样品等分至四个容器中，然而可向任何合适数目的容器提供核酸样品801的等分试样。在每一个容器中，提供了被配置用于扩增包含独特靶核酸序列的核酸分子的引物组(例如，至少包含正向引物和反向引物的引物组)。例如，可提供至少部分互补于靶核酸序列的正向引物，并且可提供至少部分互补于该靶核酸序列的互补序列的反向引物。
在图8所示的实例中，每一个引物组由“A”、“B”、“C”和“D”表示，并且每一个组被配置用于扩增包含四个独特靶核酸序列之一的核酸分子。此外，如本文别处所述，每个引物组中的引物可以以游离于颗粒的方式提供。在该引物以游离于颗粒的方式提供的情况下，该引物可被配置成发夹结构(例如，如在图3和图4所示的实例中)，并且该发夹结构还可以包含对于该特定引物的特定引发序列独特的突出端序列(并因此包含特定的靶核酸序列)。除了该引物组之外，还向容器803提供扩增核酸分子所需的附加试剂(例如，聚合酶、dNTP、合适的缓冲液、辅因子)以及生成核酸复合体所需的附加试剂(例如，与互补于任何突出端序列的捕获序列偶联的颗粒)以在每个容器中生成预反应混合物804。在一些实施方案中，与捕获序列一起提供的颗粒还可以包含共同的亲和捕获剂，如结合对的成员(例如，生物素)。
随后可向每个预反应混合物804中添加810适合于生成油包水乳液的试剂(例如，油、表面活性剂等)，使得在每个容器中生成在连续油相中包含多个水性小滴的油包水乳液805。每个油包水乳液805中的水性小滴包含水性反应混合物，该水性反应混合物包含相应的预反应混合物804的内含物。在一些实施方案中，可以生成油包水乳液805，使得油包水乳液805中的一些水性小滴不包含待扩增的核酸分子。可以例如通过控制预反应混合物804中样品的稀释水平和/或为了生成油包水乳液805而添加810的试剂的量来实现这种控制。
来自每个油包水乳液805的小滴随后可合并820至提供给共同的容器807的共同的油包水乳液806中。如本文别处所述，该共同的油包水乳液806(或油包水乳液803)可随后经受适合于扩增每个小滴中的核酸分子(例如，经由每个小滴中存在的引物组)以及在扩增期间或之后生成核酸复合体的条件830。例如，如本文所述，共同的油包水乳液806的温度可以循环。作为扩增的结果，可在小滴中生成840核酸复合体(例如，对应于840中的闭环)，该小滴包含特定的引物组和包含相应的靶核酸序列的一个或多个核酸分子。在不存在核酸分子或不存在包含对应于该小滴中引物组的靶核酸序列的核酸分子的小滴中，可能由于缺乏靶核酸序列而不能在该小滴中生成核酸复合体(例如，对应于840中的开环)。生成的核酸复合体在结构上可类似于图4所示的示例核酸复合体411，因为生成的核酸复合体的扩增的双链核酸分子可经由颗粒的捕获序列与扩增的双链核酸分子的突出端序列之间的杂交而与生成的核酸复合体的颗粒偶联。
随后可打破850共同的油包水乳液806，使得两相混合物包含来自共同的油包水乳液806的连续油相的油808以及合并的水性混合物809，所述水性混合物809包含共同的油包水乳液806的小滴的水性反应混合物。必要时，合并的水性混合物809可与油808分离。此外，合并的水性混合物809可经受适合于将与核酸复合体缔合的扩增双链核酸分子(例如，经由向合并的水性混合物809中加入连接酶或经由合并的水性混合物809中已经存在的连接酶)连接860至与该扩增双链核酸分子缔合的相应捕获序列的条件。在将扩增的双链核酸分子与捕获序列连接之后，核酸复合体可变性870为包含扩增的双链核酸分子的单链的组分颗粒，使得颗粒和单链不再在核酸复合体中缔合。
随后可将组分颗粒和链提供880给测序阵列811。测序阵列811的每个位置可包含表面，在该表面上固定有可与核酸复合体结合的一个或多个亲和捕获剂。在一些实施方案中，例如，所述一个或多个亲和捕获剂可包含至少部分互补于与特定靶核酸序列缔合或甚至至少部分互补于该靶核酸本身的游离引物或捕获序列。可以安排阵列的位置，使得特定列、行或位置的其他配置对应于特定捕获序列或捕获序列组，并且因此对应于特定靶核酸序列。在组分颗粒包含共同的亲和捕获剂(例如，生物素)的情况下，亲和捕获剂可包含能够结合共同的亲和捕获剂(例如，生物素)的试剂(例如，链霉亲和素)。
经由固定于测序阵列811的亲和捕获剂，组分颗粒的相应结合物质(例如，游离引物、捕获序列、共同的亲和捕获剂或与颗粒偶联的单链核酸分子的序列)可与测序阵列811上的位置结合。在图8所示的实例中，在阵列位置的闭环表示颗粒的结合，而在阵列位置的开环表示在该阵列位置没有颗粒的结合。与组分颗粒偶联的单链核酸分子可随后在核酸测序反应890例如合成测序反应中用作模板。从测序反应获得的序列可经由任何合适的方式来检测，所述方式包括本文别处所述的实例检测方式。
图9显示了处理核酸复合体以用于测序反应的实例。如图9所示，核酸扩增期间生成的核酸复合体901可包含与扩增的双链核酸分子903偶联的多个颗粒902，所述偶联经由与所述颗粒(例如，在捕获序列的3’端)偶联的捕获序列和与扩增的双链核酸分子903(例如，在扩增的双链核酸分子的组分链的5’端)偶联的突出端序列的杂交。核酸复合体901随后可经受适合于将扩增的双链核酸分子903与各自的捕获序列连接的条件。
在连接之后，核酸复合体可(例如，在变性温度下和/或在添加变性剂(例如，碱剂)的情况下)变性920为组分颗粒904。变性可通过将扩增的双链核酸分子903的链分离成组分单链核酸分子905，而将扩增的双链核酸分子903分离成组分颗粒904。如图9所示，将示例组分颗粒904分离并使之与单链核酸分子905在单链分子905的3’端偶联。
随后可将组分颗粒904提供给与一个或多个亲和捕获剂907和908缔合的表面906。在图9所示的实例中，表面906包含至少部分互补于组分颗粒904上的游离捕获序列或组分颗粒904上的其他序列的捕获序列907和908。捕获序列907和908可经由与偶联至组分颗粒904的合适物质的杂交而结合组分颗粒904。在一些实施方案中，组分颗粒904可包含结合对的共同成员(例如，生物素)且表面906的亲和捕获剂可包含该结合对的另一成员(例如，链霉亲和素)。该结合对的两个成员可以结合，使得组分颗粒904与表面906结合。
如图9所示，结合使与组分颗粒缔合的单链核酸分子905固定于表面906。单链分子905可在测序反应例如合成测序反应中用作模板。该测序反应的检测可经由任何合适的检测方式来完成，所述方式包括本文别处所述的示例检测方式。
在本文所述的各个方面，方法可包括核酸分子的扩增。通常，核酸扩增可在反应混合物中进行，其中待扩增的核酸分子与扩增核酸分子所需的附加的试剂(例如，正向引物、反向引物、聚合酶、dNTP、辅因子、合适的缓冲液等)一起提供。该反应混合物随后可经受适合于扩增该核酸分子的条件(例如，合适的温度、热的添加/移除、缓冲液浓度等)。
例如，可在反应混合物中提供单链或双链核酸分子，该反应混合物还包含附加试剂(例如，本文别处所述的正向引物和反向引物，聚合酶、dNTP、辅因子、缓冲液、扩增单链或双链核酸分子所需的其他的酶(例如，用于由RNA生成cDNA的逆转录酶、连接酶等))。在一些实施方案中，反应混合物的温度可经过变性温度(例如，以使双链核酸分子变性、分离或解链为组分核酸链)、退火温度(例如，以使引物与组分核酸链中的每一个退火或杂交)和延伸温度(例如，以在引物延伸反应中经由聚合酶的作用将核苷酸延伸或添加至退火的引物)重复循环，以便扩增该单链或双链核酸分子。反应混合物的温度循环可以例如借助于任何合适的热循环仪仪器或其他类型的加热装置来实现。在一些实施方案中，双链核酸分子的变性可以经由变性剂例如碱剂(例如，氢氧化钠(NaOH))来实现。在一些情况下，核酸的扩增可以等温地，例如在没有反应混合物的温度变化的情况下实现。
核酸扩增反应可以包括聚合酶的使用和作用。在引物延伸反应期间，聚合酶可通常以模板指导的方式将核苷酸添加至与单链核酸分子退火的引物的3’端。任何合适的聚合酶可以用于引物延伸反应，包括商购可得的聚合酶。聚合酶的非限制性实例包括Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、VENT聚合酶、DEEPVENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Expand聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、Pho聚合酶、Phusion DNA聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Hi-Fi聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段、具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶、KleTaq DNA聚合酶及其变体、经修饰的产物和衍生物。
在一些实施方案中，合适的变性温度可以为例如，约60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃或更高。在一些实施方案中，合适的退火温度可以为例如，约45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高。在一些实施方案中，合适的延伸温度可以为例如，约45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高。在一些实施方案中，退火和变性步骤可以合并，使得它们在相同的温度下进行。
任何合适类型的核酸扩增反应可以用来扩增核酸分子。核酸扩增反应的一个实例是聚合酶链反应(PCR)，它依赖于如上所述的引物退火、引物延伸和扩增的核酸分子的变性的重复循环。核酸扩增反应类型的附加非限制性实例包括逆转录、连接酶链反应、巢式扩增、多重扩增、解旋酶依赖性扩增、不对称扩增、滚环扩增、多重置换扩增(MDA)；以及PCR的变化形式，其包括实时PCR、热启动PCR、反向PCR、甲基化特异性PCR、等位基因特异性PCR、装配PCR、不对称PCR、微引物PCR、多重PCR、嵌套式PCR、重叠延伸PCR、数字PCR、乳液PCR、拨出PCR、解旋酶依赖性PCR、巢式PCR、热不对称交错PCR和降落(touchdown)PCR。在一些实施方案中，数字PCR和其他扩增过程可以与本文所述的任一种扩增方法、颗粒、引物和/或捕获序列一起使用。
本公开内容的附加方面提供了用于测定或鉴定样品中靶核酸分子/靶核酸序列的存在与否和/或执行本公开内容的方法的系统。一方面，本公开内容提供了用于分析溶液的内含物的系统。该系统可包含适合于包含或引导含有核酸复合体的溶液的检测池，该核酸复合体包含至少与第一颗粒和第二颗粒连接的双链核酸分子。该双链核酸分子可包含第一单链核酸分子和互补于该第一单链核酸分子的至少一部分的第二单链核酸分子。此外，该系统还可以包含检测器，该检测器与检测池连接并检测指示在溶液中存在或不存在该核酸复合体的信号。此外，该系统还可以包含计算机处理器，该计算机处理器与该检测器连接且被编程为接收来自该检测器的信号(例如，指示存在或不存在该核酸复合体的信号)，以及根据所检测到的信号确定在溶液中存在或不存在该核酸复合体。
在一些实施方案中，该检测池可包含容器(例如，本文别处所述的容器的实例类型)、孔(例如，微孔、机器微孔、微加工的微孔或腔)、孔阵列(例如，微孔板、模制微孔)和/或支持物(例如，本文别处所述的支持物的示例类型)。在一些实施方案中，该检测池可包含流体流动路径，如微流体装置的一个或多个通道。在这样的实施方案中，该溶液可以经由流体流动提供给和/或引导至检测池内和/或其他系统组件内。在一些实施方案中，系统还可以包含可被配置为使溶液流动至和/或流过检测池和任何其他系统组件的一个或多个泵。在一些实施方案中，所述一个或多个泵可以与检测池和/或检测器流体连接，以便将溶液提供给检测池。核酸复合体的检测可以在核酸复合体流过流体流动路径中的检测器时进行。在一些实施方案中，该系统可包含一个或多个试剂储器，其中单独的试剂储器可含有溶液和/或用于在该核酸复合体(例如，可检测物质)包含在溶液和/或试剂中之前对其进行检测的任何其他试剂。该试剂储器可以经由流体流动路径如微流体装置的一个或多个通道与检测池流体连接。
在一些实施方案中，所述检测池可包含溶液。此外，该溶液可以或可以不被包含在分区内。在该溶液包含在分区中的情况下，该分区可以是任何合适类型的分区，其包括本文别处所述的分区的示例类型(例如，乳液的小滴、孔、腔)。在一些实施方案中，如本文别处所述，所述核酸复合体可包含多个与超过两个颗粒连接的双链核酸分子。在一些实施方案中，该溶液可包含多个核酸复合体。所述检测器可以被配置用于检测多个核酸复合体，并且所述计算机处理器可以被编程为用于确定所述多个核酸复合体(和/或与该核酸复合体缔合的任何缔合的核酸分子)的存在与否。
此外，所述检测器可以是任何合适类型的检测器，该检测器的类型可依赖于使用的具体检测方式。例如，在系统被配置用于光学检测的情况下，该检测器可以是光学检测器(例如，分光光度计、UV-可见光吸光度分光光度计、荧光计、色度计、照相机(例如，电荷耦合器件(CCD)照相机、电子倍增电荷耦合器件(EMCCD)照相机)、光电二极管、光电二极管阵列等)。检测器的附加的非限制性实例包括光谱检测器(例如，质谱仪、核磁共振(NMR)光谱仪、粒度仪、电检测器、红外光谱仪、电子顺磁共振(EPR)光谱仪)和电化学检测器。
各个系统组件之间的连接可依赖于所连接的具体系统组件。检测池和检测器可以电子连接，使得该检测池与检测器进行电子通信。此外，该检测器与检测池之间的连接可依赖于例如具体的检测方式。例如，检测器和检测池可以光学连接，使得光从检测池到检测器和/或从检测器到检测池穿过。此外，所述计算机处理器可以与检测器电子连接，使得由该检测器检测到的信号由该检测器进行电子传输并由该计算机处理器进行电子接收。在一些实施方案中，该检测池还可与该计算机处理器连接(例如，电子连接)。此外，该计算机处理器还可被编程为用于控制检测器操作(例如，检测时机、用于特定的检测模式或溶液的检测器配置等)、检测池操作或任何其他组件(例如，泵)的操作。此外，该系统的各种组件可以被包含在外壳中。在一些实施方案中，该检测器和检测池可以被包含在同一外壳中或可以被包含在不同的外壳中。在一些实施方案中，该计算机处理器可以与检测器和/或检测池被包含在同一外壳中，或可以被包含在不同的外壳中。在一些实施方案中，该系统的所有组件都可以被包含在单个外壳中。
在一些实施方案中，所述计算机处理器可以作为计算机系统的一部分被包含在内。该计算机系统可以与检测器和/或检测池分开安置，或可以与组件中的一个或两者安置在一起。例如，如图10所示，计算机处理器1005(例如，中央处理单元(CPU))可以作为计算机系统1001的一部分被包含在内，并且可以是单核或多核处理器以及用于并行处理的多个处理器。计算机系统1001还可以包含存储器或存储器位置1010(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪速存储器)，电子存储单元1015(例如，硬盘)，用于与一个或多个其他系统通信的通信接口1020(例如，网络适配器)，以及外围设备1025，如高速缓存、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器1010、存储单元1015、接口1020和外围设备1025(例如，键盘、鼠标、语音系统、麦克风、打印机或其他输入或输出设备)可以通过通信总线(实线)如主板与计算机处理器1005进行通信。存储单元1015可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。计算机系统1001可以借助于通信接口1020与计算机网络(“网络”)1030可操作地耦合。网络1030可以是因特网、互联网和/或外联网，或者与因特网通信的内联网和/或外联网。在一些实施方案中，网络1030可以是电信和/或数据网络。网络1030可以包括可以实现分布式计算如云计算的一个或多个计算机服务器。在一些实施方案中，网络1030可以借助于计算机系统1001实现对等网络，该对等网络可以使与计算机系统1001耦合的设备能够起到客户端或服务器的作用。
计算机处理器1005可以执行可在程序或软件中体现的一系列机器可读指令。该指令可以存储在存储器位置如存储器1010中。计算机处理器1005进行的操作的实例可以包括读取、解码、执行和回写。存储单元1015可以存储文件，如驱动程序、程序库和保存的程序。存储单元1015可以存储由用户生成的程序以及记录的会话，以及与该程序相关的输出。存储单元1015可以存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些实施方案中，计算机系统1001可以包括计算机系统1001外部的一个或多个附加数据存储单元，如位于通过内联网或因特网与计算机系统1001进行通信的远程服务器上的附加存储单元。
计算机系统1001可以通过网络1030与一个或多个远程计算机系统进行通信。例如，计算机系统1001可以与用户的远程计算机系统进行通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(便携式个人计算机)、平板或平板个人计算机(例如，iPad、Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如，iPhone、支持Android的设备、)或个人数字助理。用户可以经由网络1030访问计算机系统1001。
本文所述的方法以及用于操作检测池、检测器和系统的任何其他组件(例如，泵)的指令可以通过存储在计算机系统1001的电子存储位置如存储器1010或电子存储单元1015上的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现。机器可执行或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用过程中，该代码可由处理器1005执行。在一些实施方案中，可以从存储单元1015检索该代码并将其存储在存储器1010中，以备处理器1005存取。在一些情况下，可以不包括电子存储单元1015，而将机器可执行指令存储在存储器1010上。该代码可以被预编译和配置为与具有适于执行该代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行过程中编译。该代码可以以编程语言提供，可以选择该编程语言以使该代码能够以预编译或编译的方式执行。
本文提供的系统和方法的方面，如计算机系统1001，可以体现在编程中。所述技术的各个方面可以被认为是通常以机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式的“产品”或“制品”，所述可执行代码和/或相关数据在一种类型的机器可读介质中携带或体现。机器可执行代码可以存储在电子存储单元如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪速存储器)或硬盘上。“存储”型介质可以包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器或其相关的模块，如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以在软件编程的任何时间提供非暂时性存储。有时可以通过因特网或各种其他电信网络来传送软件的全部或部分。例如，这样的通信可以使软件能够从一个计算机或处理器加载到另一个，例如从管理服务器或主机计算机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可承载软件元素的另一种类型的介质包括光波、电波和电磁波，如跨过在本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆路网络以及沿着各种空中链路使用的。携带这类波的物理元件如有线或无线链路、光学链路等也可以被认为是承载该软件的介质。如本文所用，除非限于非暂时性、有形“存储”介质，否则术语如计算机或机器“可读介质”是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，机器可读介质如计算机可执行代码可以采用许多形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，如任何计算机中的任何存储设备等，如可用于实现附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括在计算机系统内构成总线的导线。载波传输介质可以采用电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间生成的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、具有孔洞图案的任何其他物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或筒匣、载波传输数据或指令、传输这类载波的电缆或链路，或计算机可从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的许多种可以参与将一个或多个顺序的一个或多个指令携带到处理器以供执行。
本公开内容的附加方面提供了试剂盒，其可包含颗粒组、引物、其他试剂(例如，扩增核酸分子所需的一种或多种试剂)，以及适合于扩增核酸分子、进行引物延伸反应、测定靶核酸分子和/或生成(并且在一些情况下检测)核酸复合体的说明书。一方面，本公开内容提供了用于测定在具有或怀疑具有靶核酸链的样品中靶核酸链的存在或不存在的试剂盒。该试剂盒可包含第一颗粒、第二颗粒以及关于使用该第一和第二颗粒经由引物延伸反应鉴定样品中靶核酸链的存在或不存在的说明书。第一颗粒可包含第一引物，该第一引物具有与靶核酸链的一部分显示出序列同源性的第一核酸序列。第二颗粒可包含第二引物，该第二引物具有与靶核酸链的互补核酸链的一部分显示出序列同源性的第二核酸序列。此外，该第一核酸序列可不同于该第二核酸序列。
在一些实施方案中，第一颗粒和/或第二颗粒可被包含在容器中。第一和/或第二颗粒可被包含在任何合适类型的容器中，其包括本文别处所述的容器的示例类型。此外，第一颗粒和/或第二颗粒可以是任何合适类型的颗粒(包括本文别处所述的颗粒的示例类型)，可包含任何合适类型的材料(包括本文别处所述的颗粒材料的示例类型)，和/或可以具有任何合适的颗粒大小(包括本文别处所述的示例颗粒大小)。在一些实施方案中，第一颗粒和第二颗粒包含相同的材料。在一些实施方案中，第一颗粒和第二颗粒可包含不同的材料。
在一些实施方案中，所述试剂盒可进一步包含适合于生成油包水乳液或水包油乳液的一种或多种试剂。这类试剂的非限制性实例包括水性介质(例如，水、缓冲液等)、油(例如，矿物油)和表面活性剂(例如，ABIL EM90(来自Evonik Industries))、ABIL WE 90(来自Evonik Industries)、Triton-X100、吐温80、司盘(Span)80)。在一些实施方案中，该试剂盒可进一步包含可允许鉴定靶核酸链和/或扩增的靶核酸链的可检测物质(例如，光学响应性物质)。在一些实施方案中，该试剂盒可进一步包含被包括在反应混合物中的一种或多种试剂，如进行引物延伸反应所需的试剂(例如，聚合酶、核苷酸(例如，dNTP)、其他的酶、缓冲液、辅因子等)。
实施例
实施例1：聚合物颗粒的制备
本文提供了生成聚合物颗粒的实例方法，所述聚合物颗粒如本文别处所述可用来扩增核酸分子和/或生成核酸复合体。
制备含8％丙烯酰胺和5％双丙烯酰胺的水溶液并用氮气(N2)脱气10分钟。单独地，制备在矿物油中含有10％表面活性剂Abil We 90(来自Evonik Industries)的油溶液并在高真空下脱气10分钟。随后将200μL的该水溶液与10μL的6％过硫酸铵(NH4)2S2O8和20μL的丙烯酰胺修饰的寡核苷酸(例如，DNA寡核苷酸)或acrydite修饰的寡核苷酸混合，以生成经修饰的水溶液。单独地，将400μL的该油溶液与4μL的四甲基乙二胺(TEMED)混合，以生成经修饰的油溶液。
随后将经修饰的水溶液和经修饰的油溶液混合在一起，并立即在约2500rpm下涡旋2分钟以乳化该混合物。随后使乳化的混合物在环境温度下静置约三小时，使得在该溶液中生成颗粒。
接着，将10mL的乙醇添加至该乳液中，并将颗粒涡旋且随后在5000rpm下离心6分钟(min)。离心后，经由例如移液从该混合物中移除上清液。随后重复另外两轮以下步骤：用10mL乙醇洗涤所述颗粒，然后涡旋并在5000rpm下离心6min。随后用两轮10mL水来洗涤颗粒，然后涡旋并在5000rpm下离心6min。随后将洗涤的珠粒悬浮于20mL水中，并使较大的颗粒通过重力沉降到该混合物的底部。较小的颗粒保持在该混合物的顶部。随后可移取该溶液的顶部的较小颗粒，用水稀释，并通过选择具有所需颗粒大小的颗粒的过滤器或膜予以过滤。所选择的颗粒随后可通过SYBR绿染色进行定量。
虽然本文已显示并描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员显而易见的是，此类实施方案仅通过举例的方式来提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员将会想到许多变化、改变和替换。应当理解，本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。旨在由以下权利要求来限定本发明的范围，以及旨在由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (131)

1.用于核酸扩增的颗粒组，其包含：
第一颗粒，其包含具有5’端和3’端的第一引物，其中所述第一引物经由所述第一引物的所述5’端与所述第一颗粒连接，并且其中所述第一引物在靶核酸链的5’端显示出与所述靶核酸链的序列同源性；和
第二颗粒，其包含具有5’端和3’端的第二引物，其中所述第二引物经由所述第二引物的所述5’端与所述第二颗粒连接，并且其中所述第二引物在所述靶核酸链的互补核酸链的5’端显示出与所述互补核酸链的序列同源性，
其中所述第一引物与之显示出同源性的所述靶核酸链上的序列不同于所述第二引物与之显示出同源性的所述互补核酸链上的序列。
2.根据权利要求1所述的颗粒组，其中所述第一颗粒和/或所述第二颗粒包含在分区中。
3.根据权利要求2所述的颗粒组，其中所述分区为乳液中的小滴。
4.根据权利要求2所述的颗粒组，其中所述分区为孔。
5.根据权利要求4所述的颗粒组，其中所述孔在孔阵列中。
6.根据权利要求2所述的颗粒组，其中所述分区为容器。
7.根据权利要求1所述的颗粒组，其中所述第一引物的所述3’端适合于在引物延伸反应中延伸以形成所述靶核酸链或其一部分的拷贝。
8.根据权利要求1所述的颗粒组，其中所述第二引物的所述3’端适合于在引物延伸反应中延伸以形成所述互补核酸链或其一部分。
9.根据权利要求1所述的颗粒组，其中所述第一颗粒包含至少两个所述第一引物。
10.根据权利要求1所述的颗粒组，其中所述第二颗粒包含至少两个所述第二引物。
11.根据权利要求1所述的颗粒组，其进一步包含含有所述第一引物和/或第二引物的第三颗粒。
12.根据权利要求1所述的颗粒组，其中所述第一和/或第二颗粒选自固体颗粒、多孔颗粒、纳米颗粒、珠粒、微粒、金属颗粒、磁性颗粒、半导体颗粒、聚合物颗粒和核酸颗粒。
13.根据权利要求1所述的颗粒组，其中所述第一或第二引物与所述第一和第二颗粒中相应的一个直接连接。
14.根据权利要求1所述的颗粒组，其中所述第一或第二引物通过至少一个连接体与所述第一和第二颗粒中相应的一个连接。
15.根据权利要求14所述的颗粒组，其中所述至少一个连接体选自核酸、磷酸部分、氨基酸、肽、烃链、聚乙二醇(PEG)、多糖及其组合。
16.根据权利要求1所述的颗粒组，其中所述第一和/或第二颗粒包含选自金、银、铜、铂、钯、金属氧化物、聚合物、碳及其组合的材料。
17.用于核酸扩增的颗粒组，其包含：
第一颗粒，其包含具有5’端和3’端的第一引物，其中所述第一引物经由所述第一引物的所述5’端与所述第一颗粒连接，并且其中所述第一引物在靶核酸链的5’端显示出与所述靶核酸链的序列同源性；和
第二颗粒，其包含具有5’端和3’端的第二引物，其中所述第二引物经由所述第二引物的所述5’端与所述第二颗粒连接，并且其中所述第二引物在所述靶核酸链的互补核酸链的5’端显示出与所述互补核酸链的序列同源性，
其中所述第一引物与之显示出同源性的所述靶核酸链的序列与所述第二引物与之显示出互补性的所述靶核酸链的序列相隔至少约10个核苷酸。
18.根据权利要求17所述的颗粒组，其中所述第一引物与之显示出同源性的所述靶核酸链上的所述序列与所述第二引物与之显示出互补性的所述靶核酸链上的所述序列相隔至少约25个核苷酸。
19.根据权利要求17所述的颗粒组，其中所述第一引物与之显示出同源性的所述靶核酸链上的所述序列与所述第二引物与之显示出互补性的所述靶核酸链上的所述序列相隔至少约50个核苷酸。
20.根据权利要求17所述的颗粒组，其中所述第一引物与之显示出同源性的所述靶核酸链上的所述序列与所述第二引物与之显示出互补性的所述靶核酸链上的所述序列相隔至少约100个核苷酸。
21.根据权利要求17所述的颗粒组，其中所述第一颗粒和/或所述第二颗粒被包含在分区中。
22.根据权利要求21所述的颗粒组，其中所述分区为乳液中的小滴。
23.根据权利要求21所述的颗粒组，其中所述分区为孔。
24.根据权利要求23所述的颗粒组，其中所述孔在孔阵列中。
25.根据权利要求21所述的颗粒组，其中所述分区为容器。
26.根据权利要求17所述的颗粒组，其中所述第一颗粒包含至少两个所述第一引物。
27.根据权利要求17所述的颗粒组，其中所述第二颗粒包含至少两个所述第二引物。
28.根据权利要求17所述的颗粒组，其中所述第一和/或第二颗粒选自固体颗粒、多孔颗粒、纳米颗粒、珠粒、微粒、金属颗粒、磁性颗粒、半导体颗粒、聚合物颗粒和核酸颗粒。
29.根据权利要求17所述的颗粒组，其中所述第一和/或第二颗粒包含选自金、银、铜、铂、钯、金属氧化物、聚合物、碳及其组合的材料。
30.一种分离的核酸复合体，其包含具有至少第一链和至少部分互补于所述第一链的第二链的双链核酸分子，其中所述第一链在所述第一链的5’端与第一颗粒偶联，并且其中所述第二链在所述第二链的5’端与单独的第二颗粒偶联。
31.根据权利要求30所述的分离的核酸复合体，其中所述双链核酸分子包含第一端序列和第二端序列，其中所述第一端序列经由与所述第一颗粒连接的第一捕获序列而与所述第一颗粒复合，其中所述第二端序列经由与所述第二颗粒连接的第二捕获序列而与所述第二颗粒复合，其中所述第一捕获序列至少部分互补于所述第一端序列且所述第二捕获序列至少部分互补于所述第二端序列。
32.根据权利要求31所述的分离的核酸复合体，其中所述第一捕获序列在所述第一捕获序列的3’端与所述第一颗粒连接。
33.根据权利要求31所述的分离的核酸复合体，其中所述第二捕获序列在所述第二捕获序列的3’端与所述第二颗粒连接。
34.根据权利要求30所述的分离的核酸复合体，其中所述第一链在所述第一链的所述5’端与所述第一颗粒共价连接。
35.根据权利要求30所述的分离的核酸复合体，其中所述第二链在所述第二链的所述5’端与所述第二颗粒共价连接。
36.根据权利要求30所述的分离的核酸复合体，其中所述核酸复合体未固定于支持物上。
37.根据权利要求30所述的分离的核酸复合体，其进一步包含至少三个颗粒，所述颗粒中的每一个通过与所述双链核酸分子基本相同的附加的双链核酸分子而与另一颗粒连接。
38.根据权利要求30所述的分离的核酸复合体，其进一步包含至少五个颗粒，所述颗粒中的每一个通过与所述双链核酸分子基本相同的附加的双链核酸分子而与另一颗粒连接。
39.根据权利要求30所述的分离的核酸复合体，其进一步包含至少十个颗粒，所述颗粒中的每一个通过与所述双链核酸分子基本相同的附加的双链核酸分子而与另一颗粒连接。
40.根据权利要求30所述的分离的核酸复合体，其中所述第一颗粒和所述第二颗粒包含约0.5纳米(nm)至约100纳米的尺寸。
41.根据权利要求30所述的分离的核酸复合体，其中所述第一颗粒和所述第二颗粒包含约1nm至约20nm的尺寸。
42.根据权利要求30所述的分离的核酸复合体，其中所述核酸复合体包含在分区中。
43.根据权利要求42所述的分离的核酸复合体，其中所述分区为乳液中的小滴。
44.根据权利要求42所述的分离的核酸复合体，其中所述分区为孔。
45.根据权利要求44所述的分离的核酸复合体，其中所述孔在孔阵列中。
46.根据权利要求42所述的分离的核酸复合体，其中所述分区为容器。
47.根据权利要求30所述的分离的核酸复合体，其中所述第一和/或第二颗粒选自固体颗粒、多孔颗粒、纳米颗粒、珠粒、微粒、金属颗粒、磁性颗粒、半导体颗粒、聚合物颗粒和核酸颗粒。
48.根据权利要求30所述的分离的核酸复合体，其中所述第一和/或第二颗粒包含选自金、银、铜、铂、钯、金属氧化物、聚合物、碳及其组合的材料。
49.一种用于测定在具有或怀疑具有靶核酸链的样品中存在或不存在所述靶核酸链的试剂盒，其包含：
第一颗粒和第二颗粒，其中所述第一颗粒包含具有与靶核酸链的一部分显示出序列同源性的第一核酸序列的第一引物，其中所述第二颗粒包含具有与所述靶核酸链的互补核酸链的一部分显示出序列同源性的第二核酸序列的第二引物，其中所述第一核酸序列不同于所述第二核酸序列；
关于使用所述第一和第二颗粒经由引物延伸反应来鉴定样品中所述靶核酸链的存在或不存在的说明书。
50.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述第一和第二颗粒包含在容器中。
51.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述第一和/或第二颗粒选自固体颗粒、多孔颗粒、纳米颗粒、珠粒、微粒、金属颗粒、磁性颗粒、半导体颗粒、聚合物颗粒和核酸颗粒。
52.根据权利要求49所述的试剂盒，其中所述第一和/或第二颗粒包含选自金、银、铜、铂、钯、金属氧化物、聚合物、碳及其组合的材料。
53.根据权利要求49所述的试剂盒，其进一步包含适合于生成油包水乳液的一种或多种试剂。
54.根据权利要求53所述的试剂盒，其中所述适合于生成油包水乳液的一种或多种试剂选自缓冲液、油和表面活性剂。
55.根据权利要求49所述的试剂盒，其进一步包含允许鉴定所述靶核酸链的可检测物质。
56.根据权利要求55所述的试剂盒，其中所述可检测物质为光学响应性物质。
57.根据权利要求49所述的试剂盒，其进一步包含进行所述引物延伸反应所需的试剂。
58.根据权利要求57所述的试剂盒，其中所述试剂包含聚合酶和核苷酸。
59.一种用于测定在具有或怀疑具有靶核酸分子的样品中所述靶核酸分子的存在与否的方法，该方法包括：
在产生与至少第一颗粒和第二颗粒连接的扩增的靶核酸分子的条件下使所述样品在反应混合物中经历核酸扩增反应，该扩增的靶核酸分子包含所述靶核酸分子的序列的至少一部分，其中所述反应混合物包含：
(a)具有带有5’端和3’端的第一引物的所述第一颗粒，其中所述第一引物经由所述第一引物的所述5’端与所述第一颗粒连接，并且其中所述第一引物在所述靶核酸分子的链的5’端显示出与所述靶核酸分子的所述链的序列同源性；和
(b)具有带有5’端和3’端的第二引物的所述第二颗粒，其中所述第二引物经由所述第二引物的所述5’端与所述第二颗粒连接，其中所述第二引物在所述靶核酸分子链的互补链的5’端显示出与所述互补链的序列同源性，其中所述第一引物与之显示出同源性的所述靶核酸分子的所述链上的序列不同于所述第二引物与之显示出同源性的所述互补链的序列；并且
其中所述第一引物和所述第二引物适合于在引物延伸反应中延伸以形成所述靶核酸分子或其一部分的拷贝。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含聚合酶。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述聚合酶在引物延伸反应中延伸所述第一引物的所述3’端以形成所述靶核酸的所述链或其一部分的拷贝。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述聚合酶在引物延伸反应中延伸所述第二引物的所述3’端以形成所述互补链或其一部分。
63.根据权利要求59所述的方法，其进一步包括检测与所述第一颗粒和第二颗粒连接的所述扩增的靶核酸分子。
64.根据权利要求63所述的方法，其中光学地、电学地、物理地、光谱学地、电化学地或静电学地检测所述扩增的靶核酸分子。
65.根据权利要求63所述的方法，其中检测到多个扩增的靶核酸分子。
66.根据权利要求59所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含光学响应性物质。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述光学响应性物质为染料或荧光蛋白。
68.根据权利要求59所述的方法，其中所述反应混合物包含在分区中。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述分区为乳液中的小滴。
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述分区为孔阵列中的孔。
71.根据权利要求59所述的方法，其中所述靶核酸分子为单链的。
72.根据权利要求59所述的方法，其中所述靶核酸分子为双链的。
73.一种用于生成包含靶核酸分子的核酸复合体的方法，其包括：
在产生所述核酸复合体的条件下在反应混合物中用正向引物和反向引物扩增所述靶核酸分子，其中所述核酸复合体包含：
扩增的靶核酸分子，其中所述扩增的靶核酸分子包含第一链和至少部分互补于所述第一链的第二链，其中所述第一链在所述第一链的5’端与第一颗粒偶联，并且其中所述第二链在所述第二链的5’端与第二颗粒偶联。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述正向引物与所述第一颗粒连接且所述反向引物与所述第二颗粒连接。
75.根据权利要求73所述的方法，其中所述反应混合物包含所述第一颗粒和所述第二颗粒。
76.根据权利要求75所述的方法，其进一步包括采用在其上连接有所述正向引物或所述反向引物的第三颗粒来扩增所述靶核酸分子以产生所述核酸复合体，所述核酸复合体进一步包含经由附加的扩增的靶核酸分子与所述第一颗粒和/或所述第二颗粒偶联的所述第三颗粒。
77.根据权利要求73所述的方法，其进一步包括检测所述核酸复合体。
78.根据权利要求77所述的方法，其中光学地、光谱学地、物理地、电学地、电化学地或静电学地检测所述核酸复合体。
79.根据权利要求77所述的方法，其中所述第一颗粒和所述第二颗粒是金属颗粒，并且其中所述检测通过目视检查来实现。
80.根据权利要求73所述的方法，其进一步包括通过对所述核酸复合体进行离心、磁分离、沉降、过滤、色谱法、毛细管作用或亲和捕获来分离所述核酸复合体。
81.根据权利要求80所述的方法，其进一步包括通过将所述核酸复合体亲和捕获于支持物之上来分离所述核酸复合体。
82.根据权利要求73所述的方法，其中所述反应混合物包含在分区中。
83.根据权利要求82所述的方法，其进一步包括将所述核酸复合体从所述分区释放并检测所述释放的核酸复合体。
84.根据权利要求82所述的方法，其中所述分区为乳液中的小滴或孔。
85.根据权利要求77所述的方法，其进一步包括借助于光学响应性物质来检测所述核酸复合体。
86.一种用于鉴定样品中靶核酸分子的存在或不存在的方法，其包括：
a)提供怀疑含有所述靶核酸分子的溶液，其中所述靶核酸分子包含与第一颗粒连接的第一核酸链和与第二颗粒连接的第二核酸链，其中所述第二链经由序列互补性与所述第一链杂交以产生核酸复合体；和
b)检测指示在所述溶液中存在或不存在所述核酸复合体的信号，从而鉴定所述靶核酸分子的存在与否。
87.根据权利要求86所述的方法，其中在a)中向检测器提供所述溶液，并且其中在b)中所述检测器检测指示在所述溶液中所述核酸复合体的所述存在或不存在的所述信号。
88.根据权利要求86所述的方法，其中所述信号指示所述复合体的光学性质、物理性质、电性质、静电性质或电化学性质。
89.根据权利要求86所述的方法，其中所述第一颗粒和所述第二颗粒是金属颗粒，并且其中所述信号通过目视检查来检测。
90.根据权利要求86所述的方法，其中所述信号由光学响应性物质的活动生成。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述光学响应性物质为染料或荧光蛋白。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述染料选自SYBR绿I、SYBR绿II、SYBR金、溴化乙锭、亚甲蓝、Pyronin Y、DAPI、吖啶橙、Blue View或藻红蛋白。
93.根据权利要求86所述的方法，其中所述溶液包含在分区内。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述分区为孔阵列中的孔。
95.根据权利要求93所述的方法，其中所述分区为乳液中的小滴。
96.根据权利要求86所述的方法，其中所述溶液包含多个含有两个或更多个颗粒的核酸复合体。
97.根据权利要求86所述的方法，其中所述核酸复合体未附着于支持物上。
98.一种用于分析溶液的内含物的系统，其包含：
a)适合于包含或引导含有核酸复合体的溶液的检测池，该核酸复合体包含与至少第一颗粒和第二颗粒连接的双链核酸分子，其中所述双链核酸分子包含第一单链核酸分子和与所述第一单链核酸分子的至少一部分互补的第二单链核酸分子；
b)检测器，它与所述检测池连接并检测指示在所述溶液中存在或不存在核酸复合体的信号；以及
c)计算机处理器，它与所述检测器连接且被编程为i)接收来自所述检测器的信号，该信号指示存在或不存在所述核酸复合体，和(ii)根据所检测到的信号确定在所述溶液中存在或不存在所述核酸复合体。
99.根据权利要求98所述的系统，其中所述检测池包含容器或孔阵列。
100.根据权利要求98所述的系统，其中所述检测池包含支持物。
101.根据权利要求98所述的系统，其中所述检测池包含流体流动路径。
102.根据权利要求101所述的系统，其中所述流体流动路径为微流体通道。
103.根据权利要求98所述的系统，其中所述检测器选自光学检测器、光谱检测器和电化学检测器。
104.根据权利要求98所述的系统，其中所述检测池进一步包含所述溶液。
105.根据权利要求98所述的系统，其中所述溶液包含在分区内。
106.根据权利要求105所述的系统，其中所述分区为孔阵列中的孔。
107.根据权利要求105所述的系统，其中所述分区为乳液中的小滴。
108.根据权利要求105所述的系统，其中所述核酸复合体包含多个与超过两个颗粒连接的双链核酸分子。
109.一种用于测定样品中靶核酸序列的存在或不存在的方法，其包括：
a)接受测定所述样品中所述靶核酸序列的存在或不存在的请求；
b)通过检测包含与至少第一颗粒和第二颗粒连接的双链核酸分子的至少一个核酸复合体来测定所述样品中所述靶核酸的存在或不存在，其中所述双链核酸分子包含第一单链核酸分子和互补于所述第一单链核酸分子的第二单链核酸分子，并且其中所述第一单链核酸分子和所述第二单链核酸分子中的至少一个包含所述靶核酸序列；以及
c)生成指示在所述样品中存在或不存在所述靶核酸序列的报告。
110.根据权利要求109所述的方法，其中在b)中所述测定包括检测指示存在或不存在所述核酸复合体的信号。
111.根据权利要求110所述的方法，其中所述信号指示所述核酸复合体的光学性质、物理性质、电性质、光谱性质、静电性质或电化学性质。
112.根据权利要求110所述的方法，其中所述信号由光学响应性物质的活动生成。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述光学响应性物质为染料。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述染料选自SYBR绿I、SYBR绿II、SYBR金、溴化乙锭、亚甲蓝、Pyronin Y、DAPI、吖啶橙、Blue View或藻红蛋白。
115.根据权利要求109所述的方法，其中在分区中检测到所述核酸复合体。
116.根据权利要求115所述的方法，其中所述分区为孔阵列中的孔。
117.根据权利要求115所述的方法，其中所述分区为乳液中的小滴。
118.根据权利要求109所述的方法，其中所述核酸复合体包含多个与超过两个颗粒连接的双链核酸分子。
119.根据权利要求109所述的方法，其中所述报告为电子报告。
120.根据权利要求109所述的方法，其进一步包括将所述报告呈现在电子设备的电子显示器的用户界面上。
121.根据权利要求1-29中任一项所述的颗粒组，其中所述第一颗粒和/或所述第二颗粒具有约0.5nm至约100nm的尺寸。
122.根据权利要求1-29中任一项所述的颗粒组，其中所述第一颗粒和/或所述第二颗粒具有约1nm至约20nm的尺寸。
123.一种用于生成包含靶核酸分子的核酸复合体的方法，其包括：
在反应混合物中用正向引物和反向引物扩增所述靶核酸分子以产生扩增的靶核酸分子，其中所述正向引物和所述反向引物各自包含：
(i)能够在引物延伸反应中延伸的3’端，和
(ii)发夹结构，并且
其中所述扩增的靶核酸分子包含在所述扩增的靶核酸分子的一端含有第一突出端序列的第一链，以及在所述扩增的靶核酸分子的另一端含有第二突出端序列的第二链；以及
使所述扩增的靶核酸分子与第一颗粒和第二颗粒接触以产生核酸复合体，其中所述核酸复合体包含所述扩增的靶核酸分子，所述扩增的靶核酸分子：
(i)经由所述第一突出端序列与连接至所述第一颗粒的第一捕获序列之间的序列互补性而与所述第一颗粒复合，以及
(ii)经由所述第二突出端序列与连接至所述第二颗粒的第二捕获序列之间的序列互补性而与所述第二颗粒复合。
124.根据权利要求123所述的方法，其中所述正向引物和所述反向引物进一步包含不能经由引物延伸反应拷贝的间隔区。
125.根据权利要求124所述的方法，其中所述间隔区选自C3间隔区、脱碱基位点、碳质连接体、聚乙二醇(PEG)及其组合。
126.根据权利要求123所述的方法，其进一步包括将所述第一链与所述第二捕获序列连接。
127.根据权利要求123所述的方法，其进一步包括将所述第二链与所述第一捕获序列连接。
128.一种用于核酸扩增的方法，其包括：
a)将(i)与第一颗粒连接的正向引物与核酸链退火，以及将(ii)与第二颗粒连接的反向引物与所述核酸链的互补链退火；
b)以模板指导的方式延伸所述正向引物和所述反向引物以产生与所述第一颗粒连接的第一双链核酸分子和与所述第二颗粒连接的第二双链核酸分子；
c)使所述第一双链核酸分子和所述第二双链核酸分子变性以生成与所述第一颗粒连接的第一单链分子和与所述第二颗粒连接的第二单链分子；以及
d)通过将所述正向引物与所述第二单链分子退火和将所述反向引物与所述第一单链分子退火来重复(a)-(b)以产生包含扩增的双链核酸分子的核酸复合体，其中所述扩增的双链核酸分子在一端与所述第一颗粒连接且在其另一端与所述第二颗粒连接。
129.根据权利要求128所述的方法，其中(a)-(d)在分区中进行。
130.根据权利要求128所述的方法，其进一步包括采用在其上连接有所述正向引物或所述反向引物的第三颗粒来扩增所述核酸链以产生所述核酸复合体，所述核酸复合体进一步包含经由附加的扩增双链核酸分子而与所述第一颗粒和/或所述第二颗粒偶联的所述第三颗粒。
131.根据权利要求128所述的方法，其进一步包括光学地、光谱学地、物理地、电学地、电化学地或静电学地检测所述核酸复合体。
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