CN107407685A - 快速精确分配、可视化和分析单个细胞的方法 - Google Patents

快速精确分配、可视化和分析单个细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供了用于分配和可视化单个细胞的方法、装置、组件和系统。例如，本文提供了用于将分配体积分配到多孔装置的多个孔中，以及通过细胞标记物确定多个孔中的每个孔中存在的细胞数量的系统和方法，其中分配体积中平均存在预定数量的细胞(例如，1‑20个)。对于被识别为具有少于预定细胞数量的孔可以多次重复这样的分配和细胞检测，以便增加多孔装置中含有所需数量(例如，单个细胞)的孔的数量。

Description

快速精确分配、可视化和分析单个细胞的方法
本申请要求于2015年2月20日提交的美国临时申请第62/118,965号、2015年4月15日提交的美国临时申请第62/147,756号以及2015年10月5日提交的美国临时申请第62/237,307号的优先权，其全部内容通过引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开提供了用于分配和可视化单个细胞的方法、装置、组件和系统。例如，本文提供了用于将分配体积分配到多孔装置的多个孔中，以及通过细胞标记物确定多个孔中的每个孔中存在的细胞数量的系统和方法，其中分配体积中平均存在预定数量的细胞(例如，1-20个)。对于被识别为具有少于预定数量的细胞的孔可以多次重复这样的分配和细胞检测，以便增加多孔装置中含有所需数量(例如，单个细胞)的细胞的孔的数量。
背景技术
遗传学家正在努力表征复杂的疾病，如癌症、自身免疫疾病和神经障碍，但发现驱动这些疾病的潜在机制是难以捉摸的。体细胞突变，其是一生中积累在细胞中的自发变异，是驱动疾病发病和复发的主要因素。随着细胞积累新的突变，它们形成与正常细胞共存的多克隆细胞群。测序大部分细胞群会掩盖这些独特且稀有的细胞类型的潜在异质性，使得难以将其与正常的种系突变区分开来。揭示这些差异和可视化克隆构型的最好方法是对群中的单个细胞进行测序。虽然单细胞测序可以帮助发现复杂疾病的机制，但传统方法是昂贵的、劳动密集型的，并且需要大量的样品输入。需要的是分离单个细胞的方法，例如，适用于使用多孔装置的分离单个细胞的方法。
发明内容
本公开提供了用于分配和可视化单个细胞的方法、装置、组件和系统。例如，本文提供了用于将分配体积分配到多孔装置的多个孔中，以及通过细胞标记物确定多个孔中的每个孔中存在的细胞数量的系统和方法，其中分配体积中平均存在预定数量的细胞(例如，1至20个)。对于被识别为具有少于预定数量的细胞的孔可以多次重复这样的分配和细胞检测，以便增加多孔装置中含有所需数量的细胞(例如，单个细胞)的孔的数量。在某些实施方案中，在具有单个细胞的孔中进行单细胞分析(例如，测序)。
本公开的实施方案提供快速选择、分配以及可视化和分析单个细胞的方法，包括：a)使用泊松分布稀释并以每孔单个细胞的浓度将细胞分配到微流体装置的多个孔中；和b)使用显微镜和快速显微镜图像分析软件使所述孔可视化，以检测、可视化和选择含有单个细胞的那些孔。在一些实施方案中，该方法还包括以下步骤：进行额外的分配循环(例如，重复一次或多次)将含有细胞的溶液分配到被明确识别为细胞计数为0或具有多于1个细胞的各个孔中。在其他实施方案中，图像分析和芯片映射位置(chip mapped positions)(例如，通过分配图文件(dispense map file))指导选择用以添加试剂和材料的孔，以允许进行进一步的生物化学或生物物理学和/或基于细胞活力的研究。
另外的实施方案提供一种系统，包括：a)微流体装置；以及b)显微镜组件，其包括显微镜和计算机软件以及配置为执行快速显微镜图像分析软件以检测、可视化和选择包含单个细胞的孔的计算机处理器。在某些实施方案中，该系统还包括分配图文件。
在某些实施方案中，该方法还包括c)将第一试剂分配到所选定的包含定义数量的细胞的孔(例如，在特定的孔中有且仅有一个细胞的孔)中的至少一个孔(例如，1...5...10...500...5000...10,000；多孔芯片中的全部或大部分孔)中。在一些实施方案中，第一试剂选自：细胞培养组分、细胞健康测定试剂、细胞分化试剂、药物、WTA、WGA、核酸、邻位连接技术(proximity ligation assay，PLA)试剂、细胞表面标志物、标记的抗体、未标记的抗体、与抗体检测相关的检测试剂、纳米材料、用于裂解细胞的试剂、用于检测和/或解析核酸或脂质或碳水化合物或蛋白质细胞组分的试剂。在具体实施方案中，每孔的定义细胞数量为1或2，或者大于1的任何数，或者0。
在某些实施方案中，本文提供的方法包括：a)将分配体积的细胞悬液分配到多孔装置的多个孔的每个孔中，其中细胞悬液包含细胞，所述细胞以一定浓度存在于细胞悬液中，使得分配体积中平均存在X个细胞(例如，0.1至100个细胞)，并且其中使用液体分配系统进行分配；b)在分配之前和/或之后用第一可检测标记物标记至少一部分细胞；和c)确定多个孔的至少一些孔中每孔存在的细胞的数量(例如，通过可视化染色的细胞，或测序方法)。
在一些实施方案中，X是1至100个细胞(例如，1...5...10...15...20...30...40...50...60...70...80...90...或100个细胞)。在某些实施方案中，X是1。在另外的实施方案中，多个孔的至少一个孔中的细胞数量确定为0(例如，至少20％的孔结果为分配有液体，但没有细胞)。在其他实施方案中，多个孔的至少一个孔中的细胞数量是0至40。在另外的实施方案中，该方法还包括：d)将分配体积的细胞悬液分配到确定为具有少于X个细胞的至少一些孔中。
在其他实施方案中，该方法还包括：e)将近似等于分配体积但不含细胞的第一附加体积分配到确定为具有X个细胞或多于X个细胞的至少一些孔中(例如，使得分配到芯片上所有孔中的液体的体积保持不变)。在其他实施方案中，该方法还包括：e)确定先前确定为具有少于X个细胞的每个孔中存在的细胞数量。在另外的实施方案中，该方法还包括：f)将分配体积的细胞悬液分配到确定为具有少于X个细胞的孔中。在其他实施方案中，该方法还包括：g)将等于(或大约等于)分配体积但不含细胞的第二附加体积分配到确定为具有X个细胞或多于X个细胞的至少一些孔中。
在一些实施方案中，该方法还包括：在分配和/或确定步骤之前和/或之后，用第二可检测标记物标记至少一部分细胞。在另外的实施方案中，该方法还包括：确定多个孔的哪些孔(如果有的话)含有具有第二标记物的细胞。在另外的实施方案中，确定包括使多个孔的至少一些孔的每个孔中的第一可检测标记物可视化。在一些实施方案中，确定包括使用图像捕获系统捕获多个孔的至少一些孔的第一图像，其中第一图像指示存在于第一图像中的每个孔中的细胞数量。在另外的实施方案中，图像捕获系统包括与放大镜连接的照相机。在其他实施方案中，图像捕获系统还包括计算机，其中计算机包括计算机处理器、计算机存储器和图像分析软件。在另外的实施方案中，图像分析软件被配置为分析第一图像并产生：i)哪些孔含有少于X个细胞的第一列表；ii)哪些孔含有X个细胞的第二列表；和iii)哪些孔含有多于X个细胞的第三列表。在另外的实施方案中，图像分析软件对液体分配系统产生指令，以将分配体积分配到第一列表的每个孔中。在另外的实施方案中，该方法还包括：d)基于第一图像，将分配体积分配到具有少于X个细胞的至少一些孔中。在其他实施方案中，该方法还包括：e)在分配之前捕获具有少于X个细胞的至少一些孔的第二图像，其中第二图像通过第一可检测标记物指示在分配之前存在于具有少于X个细胞的每个孔中的细胞数量。
在其他实施方案中，液体分配系统包括：i)多个流体分配通道，ii)含有细胞悬液的源容器；以及iii)附接到流体分配通道的自动运动部件，其中自动运动部件在源容器和多孔装置之间是可移动的。在其他实施方案中，液体分配系统是自动化的并且被配置为接收来自图像分析软件的指令。在一些实施方案中，第一可检测标记物包括细胞染色剂(cellstain)。在某些实施方案中，第一可检测标记物选自：细胞培养组分、细胞健康测定试剂、细胞分化试剂、药物、WTA、WGA、核酸、邻位连接技术(PLA)试剂、细胞表面标记物、标记的抗体、未标记的抗体、与抗体检测相关的检测试剂、纳米材料、用于裂解细胞的试剂、用于检测和/或解析核酸或脂质或碳水化合物或蛋白质细胞组分的试剂。在具体实施方案中，细胞是上皮细胞、器官细胞、皮肤细胞、细菌细胞、人类细胞、循环癌细胞、干细胞、造血干细胞或任何其他类型的细胞。
在某些实施方案中，该方法还包括：d)在确定为具有X个细胞的至少一个孔中进行生物反应。在其他实施方案中，该方法还包括：d)在至少10％的确定为具有X个细胞的孔中进行生物反应。在另外的实施方案中，生物反应包括测序反应。在另外的实施方案中，测序反应采用核酸条形码序列。在另外的实施方案中，多孔装置包括至少30个孔(例如，30...75...150...400...1000...4,000...10,000...20,000...或30个孔)。在其他实施方案中，多孔装置包括至少1000个孔。在具体实施方案中，多孔装置包括多孔芯片(例如，具有纳米孔或微孔)。在其他实施方案中，第二可检测标记物对循环癌细胞和/或癌干细胞和/或对于期望检测的任何其他类型的靶细胞是特异性的。在另外的实施方案中，第二可检测标记物包含抗体，其缀合物或抗体的抗原结合部分。
在某些实施方案中，从肿瘤或正常组织中纯化细胞悬液中的细胞。在其他实施方案中，分配体积为5至9000nl(例如，5...25...100...500..1000...4000...9000nl)。在另外的实施方案中，在分配之前标记细胞。在另外的实施方案中，在分配之后标记细胞。
在某些实施方案中，本文提供了系统和试剂盒，其包括：a)包含多个孔的多孔装置；b)液体分配系统，其被配置为将分配体积分配到多个孔的每个孔中；和c)细胞悬液，其包含细胞，所述细胞以一定浓度存在于细胞悬液中使得分配体积中平均存在X个细胞(例如，0.1至100个细胞)。
在其他实施方案中，X为1至20个细胞(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10...15...或20个细胞)。在另外的实施方式中，X是1。在具体实施方案中，液体分配系统被配置为以自动或半自动的方式将分配体积分配到多个孔的每个孔中。在其他实施方案中，该系统还包括：d)图像捕获系统，其捕获多个孔中的至少一些孔的第一图像，并且确定第一图像中每个孔中存在的细胞的数量。在其他实施方案中，图像捕获系统包括与放大镜连接的照相机。在另外的实施方案中，图像捕获系统还包括计算机，其中该计算机包括计算机处理器、计算机存储器和图像分析软件。在另外的实施方案中，图像分析软件被配置为分析第一图像并产生：i)哪些孔含有少于X个细胞的第一列表；和/或ii)哪些孔含有X个细胞的第二列表；和/或iii)哪些孔含有多于X个细胞的第三列表。在一些实施方案中，图像分析软件被配置为对液体分配系统生成指令以将分配体积分配到第一列表的每个孔中。在其他实施方案中，液体分配系统包括：i)多个流体分配通道，ii)含有细胞悬液的源容器；以及iii)附接到流体分配通道的自动运动部件，其中自动运动部件在源容器和多孔装置之间是可移动的。在另外的实施方案中，该系统还包括能够标记细胞悬液中的细胞的第一可检测标记物和/或第二可检测标记物(例如，一种标记物标记所有细胞，另一种标记物标记感兴趣的细胞，例如干细胞或循环肿瘤细胞)。在其他实施方案中，用第一可检测标记物和/或第二可检测标记物标记细胞悬液中的细胞。在某些实施方案中，第一可检测标记物包含细胞染色剂。在一些实施方案中，第一可检测标记物选自：细胞培养组分、细胞健康测定试剂、细胞分化试剂、药物、WTA、WGA、核酸、邻位连接技术(PLA)试剂、细胞表面标记物、标记的抗体、未标记的抗体、与抗体检测相关的检测试剂、纳米材料、用于裂解细胞的试剂、用于检测和/或解析核酸或脂质或碳水化合物或蛋白质细胞组分的试剂。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括：a)将分配体积的细胞悬液分配到多孔装置的多个孔的每个孔中，其中细胞悬液包含细胞，所述细胞以一定浓度存在于细胞悬液使得分配体积中平均存在一个细胞，并且其中用液体分配系统进行分配；b)在分配之前和/或之后用第一可检测标记物标记细胞；以及c)确定多个孔的至少一些孔的每个孔中是否存在0个、1个或多个(例如，2个、3个、4个或更多个)细胞(例如，用显微镜可视化；产生数字图像；或生成计算机数据；从而指示每个孔中的细胞的数量)。在某些实施方案中，该方法还包括：d)生成报告(例如，计算机代码、计算机文件、书面报告或电子报告)，其指示多个孔的至少一些孔的每个孔中是否存在0个、1个或多个细胞。
在具体实施方案中，该方法还包括：d)将分配体积的细胞悬液分配到确定为具有0个细胞的至少一个孔中。在其他实施方案中，该方法还包括：d)将分配体积的细胞悬液分配到至少50％(例如，50％...67％...75％...85％...95％...或100％)的确定为具有0个细胞的孔中。在其他实施方案中，该方法还包括：e)确定在先前确定为具有0个细胞的每个孔中是否存在0个、1个或多个细胞。在另外的实施方案中，该方法还包括：f)将分配体积的细胞悬液分配到两次均确定为具有0个细胞的孔中。在其他实施方案中，该方法还包括：g)确定存在于所述多孔装置中的所述全部多个孔的至少50％(例如，至少50％...55％...60％...65％...75％...80％...85％...或90％)的孔具有单个细胞。
在一些实施方案中，确定包括使多个孔中的至少一些孔中每孔中的可检测标记物可视化。在其他实施方案中，确定包括使用图像捕获系统捕获多个孔的至少一些孔的第一图像，其中第一图像指示第一图像的每个孔中是否存在0个、1个或多个细胞。在其他实施方案中，图像捕获系统包括与放大镜连接的照相机。在另外的实施方案中，图像捕获系统还包括计算机，其中计算机包括计算机处理器、计算机存储器和图像分析软件。在另外的实施方案中，图像分析软件被配置为分析第一图像并产生：i)哪些孔含有0个细胞的第一列表和/或ii)哪些孔含有1个细胞的第二列表。在另外的实施方案中，图像分析软件对液体分配系统产生指令，以将分配体积分配到第一列表的每个孔中。在一些实施方案中，该方法还包括d)基于第一图像将分配体积分配到具有0个细胞的至少一些孔中。在另外的实施方案中，该方法还包括：e)在分配之前捕获具有0个细胞的至少一些孔的第二图像，其中第二图像通过第一可检测标记物指示在分配之前具有0个细胞的每个孔中是否存在0个、1个或多个细胞。在某些实施方案中，该方法还包括在确定步骤之前离心多孔装置(例如，以在每个孔底部收集细胞)。
在某些实施方案中，液体分配系统包括：i)多个流体分配通道，ii)含有细胞悬液的源容器；以及iii)附接到流体分配通道的自动运动部件，其中自动运动部件在源容器和多孔装置之间是可移动的。在其他实施方案中，液体分配系统是自动化的并且被配置为接收来自计算机(例如，来自图像分析软件)的指令。在其他实施方案中，第一可检测标记物物包含细胞染色剂(例如，Hoechst染色剂)。在其他实施方案中，第一可检测标记物选自：细胞培养组分、细胞健康测定试剂、细胞分化试剂、药物、WTA、WGA、核酸、邻位连接技术(PLA)试剂、细胞表面标记物、标记的抗体、未标记的抗体、与抗体检测相关的检测试剂、纳米材料、用于裂解细胞的试剂、用于检测和/或解析核酸或脂质或碳水化合物或蛋白质细胞组分的试剂。在某些实施方案中，第一可检测标记物对循环癌细胞和/或干细胞和/或癌干细胞是特异性的(例如，对CD44、CD133、ALDH1等是特异性的)。
在一些实施方案中，细胞是循环癌细胞。在其他实施方案中，细胞是干细胞。在另外的实施方案中，细胞是癌干细胞(例如，乳腺CSC、卵巢CSC、结肠CSC、前列腺CSC、胰腺CSC等)。在另外的实施方案中，该方法还包括：d)在确定为具有一个细胞的至少一个孔中进行生物反应。在其他实施方案中，该方法还包括：d)在至少50％(例如，至少50％...70％...90％...或100％)的确定为具有一个细胞的孔中进行生物反应。在一些实施方案中，生物反应包括测序反应，和/或PCR反应，和/或细胞裂解反应。在具体实施方案中，测序反应采用核酸条形码序列。
在某些实施方案中，多孔装置包括至少50个孔(例如，50...100...150...400...689...900...或更多个孔)。在另外的实施方案中，多孔装置包括至少1000个孔(例如，1000...1500...2500...5000...5184...10,000...20,000...或更多个孔)。在其他实施方案中，多孔装置包括多孔芯片。
在具体实施方案中，该方法还包括在步骤a)的分配之前和/或之后用第二可检测标记物标记至少一些细胞。在某些实施方案中，第二可检测标记物对循环癌细胞和/或癌干细胞是特异性的。在其他实施方案中，第二可检测标记物包含抗体或抗体的抗原结合部分。在一些实施方案中，从肿瘤组织纯化细胞悬液中的细胞。在其他实施方案中，分配体积为25至500nl或500nl至1μl。在另外的实施方案中，在分配之前标记细胞。在另外的实施方案中，在分配之后标记细胞。
在一些实施方案中，本文提供的系统包括以下的至少两种：a)包括多个孔的多孔装置；b)液体分配系统，其被配置为将分配体积分配到多个孔的每个孔中；和c)选自以下的至少一种组分：i)细胞悬液，其含有细胞，所述细胞以一定浓度存在于细胞悬液中使得分配体积中平均存在X个细胞，ii)分配图文件，其向液体分配系统提供指令以将液体分配到含有X个细胞的多孔装置的细胞中。
在某些实施方案中，液体分配系统被配置为以自动或半自动的方式将分配体积分配到多个孔的每个孔中(例如参见图14至图16)。
在某些实施方案中，该系统还包括：d)图像捕获系统，其被配置为捕获多个孔的至少一些孔的第一图像并且确定第一图像的每个孔中是否存在0个、1个或多个细胞。在其他实施方案中，图像捕获系统包括与放大镜连接的照相机(例如，与显微镜光学器件连接的CCD照相机)。在其他实施方案中，图像捕获系统还包括计算机，其中计算机包括计算机处理器、计算机存储器和图像分析软件。在一些实施方案中，图像分析软件被配置为分析第一图像(以及第二图像、第三图像、第四图像等)并且生成：i)哪些孔含有0个细胞的第一列表和/或ii)哪些孔含有1个细胞的第二列表。在某些实施方案中，图像分析软件被配置为对液体分配系统产生指令以将分配体积分配到第一列表的每个孔中。
在具体实施方案中，液体分配系统包括：i)多个流体分配通道，ii)含有细胞悬液的源容器；以及iii)附接到流体分配通道的自动运动(例如，臂)部件，其中自动运动部件在源容器和多孔装置之间是可移动的。
在一些实施方案中，该系统还包含能够标记细胞悬液中的细胞的第一可检测标记物和/或第二可检测标记物。在其他实施方案中，用第一可检测标记物和/或第二可检测标记物标记细胞悬液中的细胞。在具体实施方案中，可检测标记物包括细胞染色剂。在一些实施方案中，第一可检测标记物选自：细胞培养组分、细胞健康测定试剂、细胞分化试剂、药物、WTA、WGA、核酸、邻位连接技术(PLA)试剂、细胞表面标记物、标记的抗体、未标记的抗体、与抗体检测相关的检测试剂、纳米材料、用于裂解细胞的试剂、用于检测和/或解析核酸或脂质或碳水化合物或蛋白质细胞组分的试剂。
在某些实施方案中，多孔装置包括至少50个孔。在其他实施方案中，多孔装置包括至少1000个孔。在另外的实施方案中，多孔装置包括多孔芯片。在其他实施方案中，该系统还包括对循环癌细胞和/或癌干细胞特异性的第二可检测标记物。在其他实施方案中，第二可检测标记物包括抗体或抗体的抗原结合部分。在某些实施方案中，从肿瘤组织纯化细胞悬液中的细胞。在其他实施方案中，分配体积为25至500nl，或50nl至1μl。
附图说明
图1：使用MSND将细胞转移到芯片、通过显微镜可视化并使用WafergenCelldetector软件选择细胞的工艺流程的流程图。
图2：分别示出了可视化的350nL深孔芯片中贴壁(adherent)(胰蛋白酶消化的)神经元细胞U87MG和悬浮淋巴细胞U937的4x物镜显微镜视野。作为芯片孔内的亮点，单个细胞很容易被识别。
图3：条形图示出使用深孔Wafergen芯片进行的芯片上分配实验的相对细胞计数。细胞计数等于0、等于1和大于1的相对百分比显示为输入(用Hoechst 33342染色的U937培养细胞)的增加的相对浓度的函数(与表1中的理论百分比相比)。在使用UV激发成像后，通过手动计数分析每个浓度的输入细胞的7个视野(FOV，通常每FOV有36个孔)。对于图表中输入细胞的每个相对浓度，“细胞计数＝0”、“细胞计数＝1”和“细胞计数>1”分别显示为黑色、深灰色和浅灰色。
图4：示出了在仅使用一次泊松分布分配步骤的情况下，将细胞分配于5,184孔芯片规格(72×72规格)中的理想化泊松分布的理论曲线拟合。在第一次分配后，每孔中含有单个细胞的理论孔的数量显示为第一λ(平均)值的函数。该初始分配的数据点在该图以及后续图5至图9的图中显示为黑色菱形。
图5：示出了在使用两次分配步骤的情况下，将细胞分配于5,184孔芯片规格(72×72规格)中的理想化泊松分布的理论曲线拟合。在此确定了在第一次分配之后被预测为包含零个细胞的剩余孔的数量，并进行第二次MSND泊松分布分配(递归泊松分布；RPD)。在第二次分配之后，每孔中含有单个细胞的理论孔的数量显示为第一λ(平均)值的函数。该两次分配方式的数据点在该图以及后续的图6至图9的图中显示为黑色圆圈。
图6：示出了在使用两次分配步骤的情况下，将细胞分配于5,184孔芯片规格(72×72规格)中的理想化泊松分布的理论曲线拟合。在此确定了在第一次分配之后被预测为包含零个细胞的剩余孔的数量，并进行第二次MSND泊松分布分配(RPD)。在第二次分配之后，每孔中含有单个细胞的理论孔的数量显示为第二λ(平均)值的函数。
图7：示出了在使用三次分配步骤的情况下，将细胞分配于5,184孔芯片规格(72×72规格)中的理想化泊松分布的理论曲线拟合。在此确定了在第二次分配之后被预测为包含零个细胞的剩余孔的数量并进行第三次MSND泊松分布分配(RPD)。在第三次分配之后，每孔中含有单个细胞的理论孔的数量显示为第一λ(平均)值的函数。该三次分配方式的数据点在该图以及后续图8至图9的图中显示为黑色圆圈。
图8：示出了在使用三次分配步骤的情况下，将细胞分配于5,184孔芯片规格(72×72规格)中的理想化泊松分布的理论曲线拟合。在此确定了在第二次分配之后被预测为包含零个细胞的剩余孔的数量并进行第三次MSND泊松分布分配(RPD)。在第三次分配之后，每孔中含有单个细胞的理论孔的数量显示为第二λ(平均)值的函数。
图9：示出了在使用三次分配步骤的情况下，将细胞分配于5,184孔芯片规格(72×72规格)中的理想化泊松分布的理论曲线。在此确定了在第二次分配之后被预测为包含零个细胞的剩余孔的数量并进行第三次MSND泊松分布分配(RPD)。在第三次分配之后，每孔中含有单个细胞的理论孔的数量显示为第三λ(平均)值的函数。
图10：对将细胞分配于5,184孔规格(72×72规格)中的理论叠代泊松分布进行数据建模。使用利用K折(K-fold)验证方法的神经网络模型拟合(JMP第11版软件)进行建模，其中折叠数设置为5，隐藏节点设置为3。将对两次分配中等于1的细胞计数(即，具有单个细胞的孔)的总和的响应限制(response limit)设置为最大化(Maximize)，将预测分析器(Prediction Profiler)设置为最大化可取性(Maximize Desirability)。预测分析器中在两个x轴上的灰色排字示出了在总计两次(一次是工程化的)分配之后，为实现所示出的最大数量(以单个细胞的y轴上的灰色排字显示)的每次叠代的最佳预测λ值。两次分配各自的最佳预测λ值对应于图5和图6中的那些。
图11：对将细胞分配于5,184孔规格(72×72规格)中的理论叠代泊松分布进行数据建模。使用利用K折验证方法的神经网络模型拟合(JMP第11版软件)来进行建模，其中折叠数设置为10，隐藏节点设置为6。将对三次分配中等于1的细胞计数(即，具有单个细胞的孔)的总和的响应限制设置为最大化(Maximize)，将预测分析器(Prediction Profiler)设置为最大化可取性(Maximize Desirability)。预测分析器中在三个x轴上的灰色排字示出了在总计三次(两次是工程化的)分配之后，为实现所示出的最大数量(以单个细胞的y轴上的灰色排字显示)的每次分配叠代的最佳预测λ值。三次分配各自的最佳预测λ值对应于图7、图8和图9中的那些。
图12：示出了150nL芯片中可视化的显示5184个孔中的36个孔的4x物镜显微镜视野。SK-BR-3细胞用Hoechst 33342染料和靶向HER2/neu抗原的APC-缀合的单克隆抗体进行双重染色。所有的SK-BR-3细胞用Hoechst 33342超活(supravital)染料染色(左图)。相邻的右图示出了相同的36孔的FOV，其中用对该细胞表面抗原有特异性的抗体处理SK-BR-3(HER2/neu/ERBB2阳性)细胞。图12中的两幅图的比较结果表明Hoechst信号与从Cy5滤波器组获得的缀合抗体产生的信号明显重叠。
图13：示出了150nL芯片中可视化的显示5184个孔中的36个孔的4x物镜显微镜视野。SK-BR-3细胞用Hoechst 33342染料和靶向小鼠IgG2B-APC的阴性对照Ab进行双重染色。所有的SK-BR-3细胞用Hoechst 33342超活染料染色(左图)。相邻的右图示出了相同的36孔的FOV，其中用对该细胞表面抗原无特异性的抗体处理SK-BR-3(HER2/neu/ERBB2阳性)细胞。图13中的两幅图的比较结果表明Hoechst信号与从Cy5滤波器组获得的阴性对照抗体产生的信号不重叠。
图14示出了封闭在罩中的示例性自动液体分配系统(70)。
图15示出了移除罩后的示例性自动液体分配系统(70)。
图16示出了示例性自动液体分配系统的近视图，包括：流体运动组件(10)，其包括多个流体通道(40)；以384个单独的样品源隔室示出的源容器(20)和用于将源容器(20)固定到位的第一固定组件(50)；以及多孔测试装置(30)，其可以是WAFERGEN 5184纳米孔芯片，并且其通过第二固定组件(60)来固定到位。
图17：示出了单一物种样品(U 87-MG-RFP和NIH 3T3)以及实施例2所述的混合物种样品的非同源基因组区域经比对的基因组读数(read)的图。偏离轴聚集的数据点表示每孔细胞类型多于一种的孔群。
图18A-E：示出了CellSelect软件的示例性输出结果。在图18A中，在行/列位置18/21示出孔。示出了获自该孔的结果及其相关图像，并将该孔作为包含在分配文件或分配图中的候选者。该孔包含单个活细胞(由箭头指示)，这表明存在满足合适的图像分析阈值和/或用户偏好的对象。在单个孔的Hoechst荧光图像(右上图)中，碘化丙啶通道(右下图)中没有明显的相应信号。图18B示出了由于导致对象被标记为潜在的细胞多重态(cellmultiplet)、细胞簇(cell cluster)的分析而未被选择为包含在分配图中的候选者的孔的实例。图18C表示排除含有多于1个细胞的孔或在碘化丙啶通道中通过信号检测进行排除。图18D示出了由于包含三个细胞而被软件排除的孔的实例。图18E示出了通过孔选择软件产生的分配图。分配图用于对分配装置进行编程以选择性地将试剂递送到合适的孔。
图19示出了包含基准孔的6×6阵列的图像。这些基准孔(在此实例中为5个)含有荧光染料(用红色箭头突出显示)，其允许用户在采集信息期间确保芯片的正确定向，并且还用于推断阵列孔位置。
具体实施方式
本公开提供了用于分配和可视化单个细胞的方法、装置、组件和系统。例如，本文提供了用于将分配体积分配到多孔装置的多个孔中，以及通过细胞标记物确定多个孔中的每个孔中存在的细胞的数量的系统和方法，其中，分配体积中平均存在预定数量的细胞(例如，1至20个)。对于被识别为具有少于预订数量的细胞的孔，可以多次重复进行这样的分配和细胞检测，以便增加多孔装置中含有所需数量的细胞(例如，单个细胞)的孔的数量。在某些实施方案中，在具有单个细胞的孔中进行单细胞分析(例如，测序)。
细胞异质性通常是生物组织和细胞的一般特征。遗传学家正在努力表征复杂的疾病，所述复杂的疾病包括癌症、自身免疫疾病和神经障碍。然而，确定驱动这些疾病的潜在机制仍然是难以捉摸的。随着细胞积累新的突变，它们可能形成与正常细胞共存的多克隆细胞群。因此，测序大部分细胞群会掩盖这些独特且稀有的细胞类型的潜在异质性，使得难以“在干草堆中找到针”。揭示群体内差异/细胞间差异的一种替代方法是评估从群体中选择的个体细胞的核酸序列。人们已经使用单细胞分析来定义具有不同DNA和RNA表达谱的亚群。总之，人们普遍认为，单细胞分析可能揭示以前的复杂疾病“隐藏的”机制。
单细胞领域的核心要求是清楚且明确地检测被评估的样品只含有单个细胞。传统的单个细胞分离方法包括：FACS检测仪器(Becton Dickinson)、微流体捕获(Fluidigm)、有限分散或广泛分散的细胞稀释法，这些方法都太贵，是劳动密集型的，是需要大量样品输入的方法，并且不容易规模化以满足在标准分子生物学工作流程中对更多细胞的需求。另一方面，细胞的随机沉积可能是不可预测的/随机分布的，从而使得难以预测细胞分布。
替代方法是将细胞分配到反应室中，使得在许多这样的分配中的平均值可实现分配单个细胞。这种现象的统计描述称为泊松分布。理论上，每孔分配单个细胞(n＝正好1个细胞，而不是0、2、3、4、5、6个细胞等)受到θ理论最大值的约束，该最大值＝36.8％的孔正好包含1个细胞。然而，可以利用泊松分布来将输入细胞浓度改变为非常宽的占用率范围。存在优化每孔所需数量的细胞(即1个细胞/孔)的权衡(tradeoff)。更具体地说，为获得所需比例(10:1的比例，其中λ接近0.185)的含有单个细胞的孔进行的优化可能使不具有任何细胞的孔的百分比令人不满意(>82％)。最近已经报道了一种类似的方法，试图利用尺寸分离方法来明确地以每孔1个细胞为目标。然而，在这种情况下，可能由于采用的细胞捕获装置的物理限制，仅有10％的孔包含单个细胞。然而，这种方法是复杂的，并且需要专门的试剂。在这种情况下，可能由于该系统的物理限制，只有10％的孔包含单个细胞。最重要的是，这种装置的尺寸限制组件(size constriction component)不能排除每个孔中只包含一个细胞的可能性。
用于选择单个细胞的、基于乳液的方法包括将细胞置于油包水乳液中。这样的系统提供了隔绝交叉污染的优点。然而，这些油分离的隔室难以操作。此外，这种乳液通常需要取决于标准未选择的泊松统计量的涡旋以实现克隆性。然而，这些方法得到仅有一小部分被占据的隔室和大量未被占据的隔室。因此，在微流体系统中产生乳液，这增加了成本，并且具有显著的缺点：一旦形成乳液，就难以以受控的方式在孔中交换其他材料。此外，使用不容易普遍化的条件随意地进行乳液PCR。
没有昂贵且复杂的设备就难以分离单个细胞。此外，这样的系统通常不能捕获多于384个单个细胞。因此，本文提供了与显微镜结合以可视化微流体芯片(例如由Wafergen，Freemont，CA出售的那些)中的细胞的统计学方法。在研发本公开的实施方案期间所进行的工作采用泊松分布来分配细胞，并且解决了与泊松分布有关的问题。简而言之，对于分配单个细胞，泊松分布在统计学上是受限的(表1)，因为微芯片会具有太多个含有零个细胞的孔(芯片容量的利用非常不足)或具有过多的含有两个或更多个细胞的孔(破坏和扰乱“单细胞”分析)。
表1在不同的λ值下，细胞计数(N＝0，n＝1，n>1)的泊松分布百分比
λ:在一段连续的时间或距离内出现次数的平均数
本公开克服了技术的统计限制，例如(a)只有一次分配机会可用，和/或(b)不能目视确认哪些孔实际上含有单个细胞。在一些实施方案中，以99％(或更高)的置信度确定所提交的用于下游基因组分析或其他分析的样品有且仅有一个细胞。在某些实施方案中，本公开提供了一种简单的、稳健的、可商业应用的方法，其以叠代的方式采用泊松统计、自动液体处理和基于显微镜的图像分析(例如，与软件组合)，从而快速且准确地识别多孔装置的孔中的单个细胞(例如，5,184孔规格中，每个芯片具有>2,000个或更多个单个细胞)。这种方法可根据需要扩大至更大的数量。解决这个问题有很大的商业和科学价值并最终具有医疗价值。
本公开描述了微流体(例如，WaferGen SmartChip)技术用于分离和处理单个细胞以用于DNA、RNA和/或其他应用的用途。利用泊松统计稀释细胞，使得每分配体积平均分配1个细胞。在某些实施方案中，使用显微镜(例如，放大光学器件)来可视化每个孔并且直接知晓该孔是否包含单个细胞。在某些实施方案中，将多样品分配器(例如，如图14至图16所示)编程为执行各种系列的生物化学步骤，包括裂解、DNA或RNA扩增，以及在仅具有单个细胞的孔中对样品特异性地进行条形编码。可以执行的分析的实例包括WGA、PCR或下一代测序。
在某些实施方案中，当孔被识别为已经接收零个细胞时，可以采用第二(和第三)可选的递归泊松分布(RPD)步骤来避开泊松分布的统计限制，从而将芯片上单个细胞的占用率从理论最大值37％提高到>50％。本公开中的RPD是指叠代循环的以下步骤：(a)将含细胞的溶液分配到芯片中的反应容器(孔、室等)中，(b)可视化芯片上各个孔中的细胞，(c)通过软件辅助的显微镜确定芯片上各个孔中的细胞计数(等于零、等于1、大于1)，以及(d)进行额外的分配循环将含细胞的溶液分配到在上一轮中被明确识别为细胞计数为零的各个孔中。RPD的目的是使含有单个细胞(或一些其他所需数量的细胞)的被占据的反应容器(孔、室等)的数量最大化，超过单次分配的泊松分布的理论限制。本公开不对叠代循环的次数进行限制。
总之，这种方法的实用性、直观性和稳健性表示它可用于多种情形，例如，要对单个细胞核酸进行商业相关的研发、筛选、化合物分析和/或诊断的情形。
在一些实施方案中，本公开描述了分离单个细胞并将其转移到微流体的单个孔(例如，Wafergen的SmartChip孔)中的方法。例如，首先用常用的超活染料Hoechst 33342对细胞进行染色，该染料与DNA结合时发出强烈的蓝色荧光。对细胞进行计数，将细胞稀释至每分配体积含有1个细胞，添加到源容器(例如384孔板)中，并使用自动微液体分配器(例如，Wafergen Multiple Sample Nano Dispenser，MSND)直接分配到深孔芯片中。将多孔芯片离心以在每个孔底部收集细胞。然后通过自动显微镜和图像分析使每个孔可视化，以明确确认每个孔中是否分配有0、1、2、3或4个细胞。该质量控制步骤既重要又独特，因为它快速且明确地识别了芯片上每个孔中的孔内容物。该示例性过程在图1中示出。
图2示出了在深孔中可视化的贴壁(胰蛋白酶消化的)神经元细胞U87-MG(面板1)和悬浮淋巴细胞U937(面板2)的4x物镜显微镜视图。图2示出了该系统分配贴壁培养细胞或悬浮培养细胞的能力。该过程耗时约10分钟将细胞分配到5184孔芯片中，耗时3分钟进行显微镜成像。经分配的细胞可以例如直接使用或在-80℃下冷冻直到方便进行下游分析。如图1所述制备在该芯片中可视化的细胞。
在研发本公开实施方案期间进行的工作中，通常观察到，5184孔芯片(用不同浓度的细胞接种n＝5个芯片)的14％至29％具有单个细胞。这些单个细胞占用率换算为在单个5184孔芯片中有725至1451个单细胞。这些占用率比单个细胞市场领导者(Fluidigm)单个细胞96细胞回收率高7至15倍。进行实验，其中在四倍相对浓度范围内对输入细胞进行滴定，以便在使用MSND进行单次分配后评估“芯片上”的细胞计数分布曲线(图3；表2)。
表2
输入细胞的相对浓度 细胞计数＝0 细胞计数＝1 细胞计数>1
1 1.0 90.1％ 9.1％ 0.8％
2 2.5 51.2％ 28.6％ 20.2％
3 3.0 35.5％ 29.8％ 34.7％
4 3.5 33.1％ 29.5％ 37.5％
5 4.0 19.1％ 34.7％ 46.2％
在这项研究中，对于在表观最大值下的细胞浓度(例如，对于输入细胞的相对浓度＝3.0)，单个细胞计数为29.8％。总体而言，在经检测的输入细胞浓度范围内的细胞计数(例如，等于零、等于1、大于1)的相对分布充分反映了泊松分布(参见表1)。
在某些实施方案中，本公开的方法和系统具有如下优点：可相对直观地进行并且使用最少训练而具有高度稳健性。相对于当前单细胞分离方法，本公开提供了许多优点：消除了对复杂且昂贵的低通量微流体系统(例如，Fluidigm C1芯片)的需要以及消除了对细胞进行的过度物理操作(FACS)。它具有开放系统的优点，使得可以在这些孔中进行各种生物化学和分子生物学方案。乳液PCR不是必需的。此外，与需要最少培训或设备的其他系统相比，它明显可以分离更多的单个细胞。在某些实施方案中，预期执行一个或多个递归泊松分布步骤以规避泊松分布的统计限制(表1)，将单个细胞占用率提高至例如大于50％(例如，大于50％...60％...75％...85％...或更高)。
使用统计软件包对将单次分配步骤(图4)的单细胞占用率提高至超过泊松分布的统计限制的理论依据进行建模。本公开的一个方面是利用递归泊松分配“RPD”来确定哪些微孔含有零个细胞的能力，并且特异性地执行随后的分配将含细胞的溶液分配到这些孔中，以进行第二次、第三次等叠代。
在某些实施方案中，采用自动化系统和方法来确定多孔测试装置的哪些孔含有所需数量的经分配的细胞(例如，每孔1个细胞)。在特定实施方案中，采用用于自动成像和自动化孔选择的软件来确定哪些孔含有所需数量的细胞。就这方面而言，可以生成分配图(例如，如图18e所示)，以显示哪些孔含有所需数量的细胞，因此这样的细胞可以被进一步地分配试剂并用于进一步的分析。
参考图18和图19，使用Wafergen 5184孔芯片和Hoechst 33342型和碘化丙啶荧光的一个示例性实施方案如下所示。一旦细胞已经通过分配装置(例如，Wafergen的多样品纳米分配器)沉积(例如，使用本文所述的泊松分配)到多孔测试装置(例如，具有5185个孔的芯片)中，使用机械化平台如机械化显微镜载片台对每个孔采集图像。在一些实施方案中，图像采集在2个波长下收集，通常与Hoechst 33342和碘化丙啶荧光的结果一致。每个图像可以由5184个孔芯片阵列中的6×6孔阵列组成。在每个检测波长下对5184孔的整个阵列进行成像，产生144个显微镜图像文件，如果在2个波长下检测，则共计288个图像。孔选择软件，如Wafergen的CellSelect软件，允许打开与给定芯片阵列(例如，SmartChip阵列)相关的全部图像组。图像分析包括4个主要步骤：1)通过对准基准孔在图像采集期间确认芯片的适当定位(见图19)，2)评估288个图像文件的每个文件中每个孔的位置，3)识别每个图像文件中每个孔内的潜在细胞，和4)呈现分析结果得到用芯片孔、条形码序列、检测波长和感兴趣的其他参数注释的、用户友好的输出。
通过分析位于每个芯片的已知孔位置(基准孔)中的分配的染料(例如荧光染料)来确认孔位置的评估和定向(参见图19)。基准孔可以以非对称的方式位于芯片阵列的角部，以在图像采集期间确认正确的芯片定向。类似地，可以基于基准孔之间的已知距离和对芯片阵列上阵列结构的尺寸了解来推断非基准孔的孔位置。
一旦确定了孔位置，就执行图像分析来识别每个孔内对象的数量，该对象数量满足自动化或用户定义的图像分析的阈值，该阈值定义细胞的存在或不存在。这些参数可以包括但不限于对象和背景荧光强度，尺寸和圆度。此外，对于每个对象，可以组合来自多个波长的结果以评估诸如细胞活力的参数。图像分析结果随后用阵列位置(行位置和列位置)进行总结，并与任何给定阵列位置的条形码和图像分析值相关联，从而允许在孔水平上的用户评价。
重要的是，孔选择软件(例如，Wafergen的CellSelect软件)会产生一个报告，该报告示出孔是否是候选单个细胞孔还是其他用户定义的孔，以接收后续试剂的分配。然后使用这些孔构建后续生物化学步骤中使用的分配图或文件或筛选文件(filter file)。
CellSelect软件的示例性输出如图18a至图18d所示。在图18a中，孔以行/列位置18/21示出。该孔的结果及与其相关的图像被示出，并识别该孔为包含在分配文件或分配图中的候选者。该孔包含单个活细胞(由箭头指示)，表明存在满足合适图像分析阈值和/或用户偏好的对象。在单个孔的Hoechst荧光图像(右上图)中，在碘化丙啶通道中没有明显的相应信号(右下图)。图18b示出了由于导致将对象标记为潜在细胞多重态、细胞簇的分析而未被选择为包含在分配图中的候选者的孔的实例。图18c表示排除含有多于1个细胞的孔或通过碘化钠通道中的信号检测进行排除。图18d示出了由于包含三个细胞而被软件排除的孔的实例。
完成对所有成像孔的分析后，可以创建试剂分配图(又称为“分配或筛选文件”)。可以在CellSelect软件(或其他孔选择软件)中完全自动化或者是用户编辑孔选择和后续的分配文件映射，以根据用户要求包括或排除孔。该分配图用于对诸如Wafergen的MSND的分配组件进行编程，以选择性地将试剂递送到适当的孔以进行进一步处理，例如逆转录。图18e示出了由CellSelect软件生成的典型的样品分配图，其定位了在标准WaferGen72x72芯片阵列中沉积的单个细胞。通常，每个分配和分析事件都会生成唯一的分配图，该分配图用唯一的芯片ID进行注释。图18e提供了突出显示被选择用于试剂分配以进行进一步上游处理的特定孔的分配图的示意图。
本公开不受所采用的细胞的类型的限制。在某些实施方案中，使用癌细胞、循环癌细胞、干细胞和癌干细胞。大多数癌症死亡似乎是由远处器官的循环肿瘤细胞的转移扩散和生长引起的。循环肿瘤细胞(CTC)、CTC簇(两个或更多个单独的CTC结合在一起)和癌症干细胞(CSC)最初可以是局部性的、潜伏且全身性的或者是辅助治疗后被耗尽的。因此，CTC和相关的干细胞经常在正常非癌细胞的大背景下以低数量存在。对于在大的“噪声”背景下检测所需的癌细胞信号，这些细胞的低频率会产生复杂的“在干草堆中找到针”的分析问题。检测癌细胞特异性细胞表面标志物和对这些细胞的分析与理解转移扩散的生物学密切相关。本文提供的方法和系统允许分离和分析这些重要的癌细胞。
基于抗原性/表型的细胞表面或细胞内标志物的存在，可以最初从细胞或组织环境或群体中富集或耗尽单细胞、多细胞和细胞簇，所述抗原性/表型的细胞表面或细胞内标志物包括但不限于：蛋白质，脂质，这些部分的碳水化合物(即糖基化)翻译后修饰，核酸及其修饰，或这些部分的不同组合。使用本文所述的方法和系统，在单细胞(包括癌细胞)中检测细胞表面标志物并将这些细胞转移到微流体装置(例如，Wafergen的SmartChip孔)的独立的各个孔中。在其他实施方案中，经标记的细胞可以直接分配到孔中，并通过使用各种广泛使用的荧光滤波器的标准或自动显微镜检查直接检测芯片中的抗原部分。
富集和可视化循环肿瘤细胞(CTC)的方法是本领域已知的，并且可以用于产生(并随后可视化)本文所述的方法和系统中使用的初始细胞悬液。例如，Krebs et al.Nat RevClin Oncol(自然评论临床肿瘤学).2014Mar；11(3):129-44的表1(其通过引用的方式的方式并入本文，具体参见表1)。可用于富集和可视化CTC的标志物的实例包括但不限于：CD45、EpCAM、MUC1和HER2。可以使用针对这样的标志物的抗体来标记和可视化这些细胞。可以使用任何类型的合适方法来分离和富集CTC，例如流式细胞术、柱结合等。
本公开不受所采用的多孔测试装置的类型(例如，板或芯片)的限制。通常，这样的装置具有容纳液体或者尺寸被设计成容纳液体的多个孔(例如，液体被捕获在孔中，使得单靠重力不能使液体流出孔)。一个示例性芯片是WAFERGEN的5184孔SMARTCHIP。其他示例性芯片提供于第8,252,581号、第7,833,709号和第7,547,556号美国专利中，它们的全部均通过引用的方式整体并入本文，包括例如用于教导本文使用的芯片、孔、热循环条件及相关试剂。其他示例性芯片包括在QUANTSTUDIO实时PCR系统(Applied Biosystems)中使用的OPENARRAY板。另一个示例性的多孔装置是96孔板或384孔板。
多孔装置的总尺寸可以变化，例如厚度从几微米到几厘米，宽度或长度从几毫米到50厘米。通常，整个装置的尺寸的宽度和/或长度为约10mm至约200mm，厚度为约1mm至约10mm。在一些实施方案中，芯片的宽度为约40mm，长度为40mm，厚度为3mm。
多孔装置上的孔(例如，纳米孔)的总数可以根据其中要使用的主体芯片的具体应用而变化。芯片表面上的孔的密度可以根据具体应用而变化。孔的密度以及孔的尺寸和体积可以根据所期望的应用和诸如使用本公开的方法的机体的种类等因素而变化。
本公开不受多孔装置中孔的数量或多孔源装置中孔的数量的限制。可以将大量的孔并入装置中。在各种实施方案中，装置上的孔的总数为约100至约200,000，或约5000至约10,000。在其他实施方案中，该装置包括较小的芯片，每个芯片包括约5,000至约20,000个孔。例如，方形芯片可以包括125×125个纳米孔，纳米孔的直径为0.1mm。
可以以任何方便的尺寸、形状或体积制造多孔装置中的孔(例如，纳米孔)。该孔的长度可以为约100μm至约1mm，宽度为约100μm至约1mm，深度为约100μm至约1mm。在各种实施方案中，每个纳米孔的纵横比(深度与宽度之比)为约1至约4。在一个实施方案中，每个纳米孔的纵横比约为2。横截面可以为圆形、椭圆形(elliptical)、卵形(oval)、圆锥形、矩形、三角形、多面形或任何其他形状。孔在任何给定深度处的横截面的尺寸和形状也可以变化。
在某些实施方案中，孔的体积为约0.1nl至约1μl。纳米孔的体积通常小于1μl、优选小于500nl。体积可以小于200nl，或小于100nl。在一个实施方案中，纳米孔的体积为约100nl。如果需要，可以制造纳米孔以提高表面积与体积之比，从而促进通过该单元的热传递，这可以减少热循环的斜坡时间。每个孔(例如，纳米孔)的腔可以采取多种构造。例如，孔内的腔可以被线性壁或弯曲壁隔开，以形成单独但相邻的隔室，或者被圆形壁隔开以形成内部的和外部的环形隔室。
如果需要的话，可以用材料涂覆具有高内表面与体积之比的孔，以降低其中所含的反应物与孔的内表面相互作用的可能性。如果试剂易于与内表面相互作用或附着在内表面上(这是不期望的)，则涂层是特别有用的。根据反应物的性质，可以选择疏水性涂层或亲水性涂层。各种合适的涂层材料在本领域中是可获得的。一些材料可以共价附着在表面上，而另一些则可以通过非共价相互作用附着在表面上。涂层材料的非限制性实例包括硅烷化试剂如二甲基氯硅烷、二甲基二氯硅烷、六甲基二硅氮烷或三甲基氯硅烷、聚马来酰亚胺；和硅化试剂如硅氧化物、AQUASIL和SURFASIL。其他合适的涂层材料是封阻剂例如氨基酸，或聚合物，包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮、聚腺苷酸和聚马来酰亚胺。某些涂层材料可通过加热、辐射和化学反应与表面交联。本领域技术人员会知晓用于涂覆多孔装置的纳米孔的其他合适的方法，或者能够确定这样的方法，而无需过多的实验。
示例性的多孔装置(例如，芯片)的厚度可以是约0.625mm，孔的尺寸是长度和宽度均为约0.25mm(250μm)。纳米孔的深度可以是约0.525mm(525μm)，芯片在给定的孔下方约0.1mm。纳米孔开口可以包括任何形状，例如圆形、正方形、矩形或任何其他所需的几何形状。举例来说，纳米孔的直径或宽度可以为约100μm至约1mm，间距(pitch)或长度为约150μm至约1mm以及深度为约10μm至约1mm。每个孔的腔可以采取多种构造。例如，纳米孔的腔可以被线性壁或弯曲壁隔开以形成的独立但相邻的隔室。
多孔装置的孔(例如，纳米孔)可以使用例如公知的光刻技术形成。可以使用湿法KOH蚀刻技术、各向异性干法蚀刻技术、机械钻孔、注射成型和/或热成型(例如，热压花)来形成纳米孔。
包含在多孔装置的液体内的试剂取决于被置于每个孔中的单个细胞要进行的反应。在一个实施方案中，孔包含用于进行核酸扩增反应的试剂。试剂可以是用于免疫测定、核酸检测测定(包括但不限于核酸扩增)的试剂。在芯片单元中，试剂可以是干燥状态或液体状态。在一个实施方案中，孔含有至少一种以下试剂：探针、聚合酶和dNTP。在另一个实施方案中，孔含有包含探针、引物和聚合酶的溶液。在各种实施方案中，每个孔包含(1)用于所述标准基因组内的多核苷酸靶标的引物，和(2)与所述引物相关的探针，如果所述引物与所述靶标结合，则所述探针就发射浓度依赖性信号。在各种实施方案中，每个孔包含用于基因组内的多核苷酸靶标的引物和与引物相关的探针，如果引物与靶结合，则探针发射浓度依赖性信号。在另一个实施方案中，芯片的至少一个孔含有包含正向PCR引物、反向PCR引物和至少一种FAM标记的MGB淬灭PCR探针的溶液。在一个实施方案中，将引物对分配到孔中，然后干燥，例如通过冷冻进行干燥。随后，用户可以选择性地分配，例如纳米分配样品、探针和/或聚合酶。
在本公开的其他实施方案中，孔可以含有干燥形式的任何上述溶液。在该实施方案中，该干燥形式可以涂覆到孔中或被引导到孔的底部。在进行分析之前，用户可以将水和被捕获的细胞的混合物添加到每个孔中。在该实施方案中，包含被全部弄干的反应混合物的芯片可以用衬垫密封，储存或运输到另一地方。
每个孔有单个细胞的多孔装置可用于基因分型、基因表达或通过PCR进行的其他DNA测定。在板中进行的测定不限于DNA测定，例如TAQMA、TAQMAN Gold、SYBR金和SYBR绿，并且还包括其他测定，如受体结合、酶和其他高通量筛选测定。
在一些实施方案中，对细胞(例如，在裂解和/或其他处理步骤之后)进行扩增和/或测序分析。进行一个或多个扩增反应可以包含一个或多个基于PCR的扩增反应、基于非PCR的扩增反应或其组合。核酸扩增技术的说明性的非限制性实例包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、巢式PCR、线性扩增、多重置换扩增(MDA)、实时SDA、滚环扩增、双循环扩增(circle-to-circle amplification)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域普通技术人员将认识到某些扩增技术(例如，PCR)要求在扩增前将RNA逆转录为DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。
通常称为PCR的聚合酶链式反应(第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号和第4,965,188号美国专利，它们各自通过引用的方式整体并入本文)，使用多个以下循环：变性、将引物对退火至相反链以及引物延伸，以允许靶核酸拷贝数的指数增加。在称为RT-PCR的变形方法中，使用逆转录酶(RT)从RNA制备互补DNA(cDNA)，然后通过PCR扩增cDNA以产生DNA的多个拷贝。对于PCR的其他各种前突变，参见例如第4,683,195号、第4,683,202号和第4,800,159号美国专利；Mullis et al.,Meth.Enzymol(酶学方法).155:335(1987)；以及Murakawa et al.,DNA 7:287(1988)，它们各自通过引用的方式整体并入本文。
通常称为TMA的转录介导的扩增(第5,480,784号和第5,399,491号美国专利，其各自通过引用的方式整体并入本文)，在基本恒定的温度、离子强度和pH条件下自动催化合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自动催化产生额外的拷贝。参见例如第5,399,491号和第5,824,518号美国专利，它们各自通过引用的方式整体并入本文。在第20060046265号美国公开(其通过引用的方式整体并入本文)所描述的变型中，TMA可选地包括使用封阻部分、封端部分和其他修饰部分以提高TMA工艺的灵敏度和精度。
通常称为LCR的连接酶链式反应(Weiss,R.,Science 254:1292(1991)，其通过引用的方式整体并入本文)使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。在热变性、杂交和连接的重复循环中，通过DNA连接酶共价连接DNA寡核苷酸以产生可检测的双链连接的寡核苷酸产物。
通常称为SDA的链置换扩增(Walker,G.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:392-396(1992)；第5,270,184号和第5,455,166号美国专利，它们各自通过引用的方式整体并入本文)利用以下循环：将引物序列对退火至靶序列的相反链；在dNTPαS的存在下进行引物延伸以产生双半硫代磷酸化(hemi-phosphorothioated)引物延伸产物；在半修饰的限制性内切核酸酶识别位点由内切核酸酶介导产生缺口；以及从缺口的3’端开始由聚合酶介导的引物延伸以置换现有的链并产生用于下一轮引物退火、产生缺口和链置换的链，导致产物几何扩增。嗜热SDA(tSDA)以基本相同的方法在较高温度下使用嗜热内切核酸酶和聚合酶(第0 684 315号欧洲专利)。
其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增(第5,130,238号美国专利，其通过引用的方式整体并入本文)；使用通常称为Qβ复制酶的RNA复制酶扩增探针分子本身的方法(Lizardi et al.,BioTechnol.6:1197(1988)，其通过引用的方式整体并入本文)；基于转录的扩增方法(Kwoh et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173(1989))；和自持续的序列复制(Guatelli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874(1990)，它们各自通过引用的方式整体并入本文)。对于已知扩增方法的进一步讨论，参见Persing,David H.,“In Vitro Nucleic Acid Amplification Techniques(体外核酸扩增技术)”in Diagnostic Medical Microbiology:Principles and Applications(Persinget al.,Eds.),pp.51-87(American Society for Microbiology,Washington,DC(1993))。
在一些实施方案中，利用核酸测序方法(例如，用于检测扩增的核酸)。在一些实施方案中，本文提供的技术可用于第二代(又称下一代或下代)、第三代(又称下下一代)或第四代(又称N3-Gen)测序技术，包括但不限于，焦磷酸测序、连接测序、单分子测序、合成测序(SBS)、半导体测序、大规模平行克隆、大规模平行单分子SBS、大规模平行单分子实时技术、大规模平行单分子实时纳米孔技术等。Morozova和Marra在Genomics(基因组学),92:255(2008)中提供了对一些这样的技术的综述，其通过引用的方式整体并入本文。本领域普通技术人员将认识到，因为RNA在细胞中较不稳定，并且更容易遭受核酸酶攻击，所以通常在测序前用实验将RNA逆转录为DNA。
许多DNA测序技术是合适的，包括基于荧光的测序方法(参见例如Birren et al.,Genome Analysis:Analyzing DNA,1,Cold Spring Harbor,N.Y.，其通过引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，该技术可用于本领域所理解的自动测序技术。在一些实施方案中，本发明的技术可用于分段扩增子的平行测序(Kevin McKernan等人的PCT公开第WO2006084132号，其通过引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，该技术可用于通过平行寡核苷酸延伸进行DNA测序(参见，例如，Macevicz等人的第5,750,341号美国专利；以及Macevicz等人的第6,306,597号美国专利，两者均通过引用的方式整体并入文本)。可使用本发明技术的测序技术的其他实例包括Church polony技术(Mitra et al.,2003,Analytical Biochemistry 320,55-65；Shendure et al.,2005Science 309,1728-1732；第6,432,360号美国专利、第6,485,944号美国专利、第6,511,803号美国专利；它们通过引用的方式整体并入本文)、454铬尖晶石焦磷酸测序技术(Margulies et al.,2005Nature437,376-380；US 20050130173；它们通过引用的方式整体并入本文)、Solexa单碱基添加技术(Bennett et al.,2005,Pharmacogenomics,6,373-382；U.S.Pat.No.6,787,308；第6,833,246号美国专利；它们通过引用的方式整体并入本文)、Lynx大规模平行测序技术(Brenner et al.(2000).Nat.Biotechnol.18:630-634；第5,695,934号美国专利；第5,714,330号美国专利；它们通过引用的方式整体并入本文)，以及Adessi PCR克隆技术(Adessi et al.(2000).Nucleic Acid Res.28,E87；WO 00018957；它们通过引用的方式整体并入文本)。
下一代测序(NGS)方法具有大规模平行、高通量策略这些共同特征，其目标是与较老的测序方法相比降低成本(参见，例如Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean et al.,Nature Rev.Microbiol.,7:287-296；各自通过引用的方式整体并入本文)。NGS方法可以大致分为通常使用模板扩增的方法和不使用模板扩增的方法。需要扩增的方法包括由Roche商业化为454技术平台的焦磷酸测序，(例如，GS 20和GSFLX)、Life Technologies/Ion Torrent(生命技术/离子激流)、由Illumina商业化的Solexa平台、GnuBio和由Applied Biosystems(美国应用生物系统公司)商业化的支持的寡核苷酸结合和检测(Supported Oligonucleotide Ligation and Detection,SOLiD)平台。也称为单分子测序的非扩增方法的实例为由Helicos BioSciences(螺旋生物科学)商业化的HeliScope平台和由VisiGen，Oxford Nanopore Technologies Ltd.(威斯康辛州牛津纳波尔科技有限公司)和Pacific Biosciences(太平洋生物科学)分别开发的新兴平台。
在焦磷酸测序中(Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean et al.,Nature Rev.Microbiol.,7:287-296；第6,210,891号美国专利；第6,258,568号美国专利；其各自通过引用的方式整体并入本文)，将模板DNA片段化，进行末端修复，连接到衔接子，并通过用携带与衔接子互补的寡核苷酸的珠粒(bead)捕获单个模板分子来进行原位克隆扩增。具有单一模板类型的每个珠粒被分至油包水型微囊泡中，并且使用称为乳液PCR的技术对模板进行克隆扩增。在扩增后，乳液被破坏，珠粒被置于皮量滴定板(picotitre plate)的单独的孔中，皮量滴定板在测序反应期间作为流动池起作用。在测序酶和发光报告物如萤光素酶的存在下，在流动池中有序地反复引入四种dNTP试剂中的每一种。如果在测序引物的3’端添加适当的dNTP，则所得的ATP的产物会导致孔内的突然发光，这可使用CCD相机记录下来。可以实现大于或等于400个碱基的读取长度，并且可以得到106个序列读段，得到多达5亿个碱基对(Mb)的序列。
在Solexa/Illumina平台(Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean et al.,Nature Rev.Microbiol.,7:287-296；第6,833,246号美国专利；第7,115,400号美国专利；第6,969,488号美国专利；它们各自通过引用的方式整体并入本文)中，测序数据以较短长度的读段的形式产生。在该方法中，对单链片段化的DNA进行末端修复以产生5’-磷酸化的平端，随后由Klenow介导将单个A碱基添加到片段的3’端。添加A有利于添加T-突出端衔接子寡核苷酸，其随后用于捕获在散布有寡核苷酸锚(oligonucleotideanchor)的流动池表面上的模板-衔接子分子。该锚被用作PCR引物，但是由于模板的长度以及其对邻近其他附近的锚寡核苷酸的接近度，通过PCR的延伸导致分子“拱起(archingover)”，从而与相邻的锚寡核苷酸杂交以在流动池表面上形成桥结构。将DNA的这些环变性和切割。然后用可逆染料终止剂对正向链进行测序。通过检测掺入后的荧光来确定掺入的核苷酸的序列，在dNTP添加的下一次循环之前，去除每种荧光剂(fluor)和封阻剂(block)。序列读段长度为36个核苷酸至超过250个核苷酸，每次分析运行的总输出超过10亿个核苷酸对。
使用SOLiD技术测序核酸分子(Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean et al.,Nature Rev.Microbiol.,7:287-296；第5,912,148号美国专利；第6,130,073号美国专利；它们各自通过引用的方式整体并入本文)还包括使模板片段化、连接至寡核苷酸衔接子、附着至珠粒以及通过乳液PCR进行克隆扩增。然后，将带有模板的珠粒固定在玻璃流动池的衍生化表面上，退火与衔接子寡核苷酸互补的引物。然而，该引物不是用于3'延伸，而是用于提供用于与询问探针连接的5’磷酸基团，该询问探针包含两个探针特有的碱基，接着是6个简并碱基(degenerate base)和四种荧光标记物中的一种。在SOLiD系统中，询问探针在每个探针的3’端具有两个碱基的16种可能的组合，并且在5’末端有四种荧光标记物中的一种。荧光颜色以及每个探针的身份对应于特定的颜色-空间编码方案。在多轮(通常为7轮)的探针退火、连接和荧光检测之后进行变性，然后使用相对于初始引物有一个碱基的偏差的引物进行第二轮测序。以这种方式，可以在计算上重新构建模板序列，并且模板碱基被询问两次，导致精度提高。序列读段长度平均为35个核苷酸，每次测序运行的总输出超过40亿个碱基。
在某些实施方案中，该技术可用于纳米孔测序(参见例如Astier et al.,J.Am.Chem.Soc.2006Feb 8；128(5):1705–10，其通过引用的方式并入本文)。纳米孔测序背后的理论与将纳米孔浸入导电流体并在其上施加电位(电压)时发生什么样的事件有关。在这些条件下，可以观察到由于离子通过纳米孔传导而导致的微小电流，并且电流的量对纳米孔的尺寸非常敏感。随着核酸的每个碱基通过纳米孔，这导致通过纳米孔的电流的量级发生变化，对于四种碱基中的每一种，电流的量级是不同的，从而允许确定DNA分子的序列。
在某些实施方案中，该技术可用于Helicos BioSciences的HeliScope(Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean et al.,NatureRev.Microbiol.,7:287-296；第7,169,560号美国专利；第7,282,337号美国专利；第7,482,120号美国专利；第7,501,245号美国专利；第6,818,395号美国专利；第6,911,345号美国专利；第7,501,245号美国专利；它们各自通过引用的方式整体并入本文)。将模板DNA片段化并在3'端进行聚腺苷酸化，最终的腺苷带有荧光标记物。将变性的聚腺苷酸化模板片段连接到流动池表面上的聚(dT)寡核苷酸。被捕获的模板分子的初始物理位置由CCD相机记录，然后将标记切割并洗去。通过加入聚合酶并连续加入荧光标记的dNTP试剂来实现测序。掺入事件产生对应于dNTP的荧光信号，并且在每轮dNTP添加之前由CCD相机捕获信号。序列读段的长度为25至50个核苷酸，每次分析运行总输出超过10亿个核苷酸对。
离子激流(Ion Torrent)技术是基于检测在DNA聚合期间释放的氢离子的DNA测序方法(参见，例如，Science 327(5970):1190(2010)；第20090026082号、第20090127589号、第20100301398号、第20100197507号、第20100188073号和第20100137143号美国专利申请公开；通过引用整体并入本文用于所有目的)。微孔包含待测序的模板DNA链。微孔层下面是高灵敏度的ISFET离子传感器。所有层都包含在CMOS半导体芯片中，类似于电子工业中使用的那些。当将dNTP掺入正在生长的互补链中时，释放一个氢离子，这触发了高灵敏度的离子传感器。如果模板序列中存在均聚物重复，则在单次循环中掺入多个dNTP分子。这产生了相应数量的释放氢和比例更高的电子信号。该技术与其他测序技术的不同在于不使用修饰的核苷酸或光学元件。对于50个碱基的读段，离子激流测序仪的单碱基准确度为～99.6％，每次运行产生～100Mb至100Gb。读段长度为100至300个碱基对。长度为5个重复的均聚物重复的准确度为～98％。离子半导体测序的优点是测序速度快以及前期成本和运行成本低。
该技术用于由Stratos Genomics有限公司开发的另一种核酸测序方法，并且涉及使用Xpandomers。该测序过程通常包括提供通过模板指导的合成产生的子链。子链通常包括以对应于全部或部分的靶核酸的连续核苷酸序列的顺序偶联的多个亚单位，其中各个亚单位包含系链(tether)、至少一个探针或核碱基残基，以及至少一个选择性切割的键。切割一个或多个选择性切割的键以产生比子链的多个亚单位的长度长的Xpandomer。Xpandomer通常以对应于全部或部分靶核酸的连续核苷酸序列的顺序包含系链和用于分析遗传信息的报告元件(reporter element)。然后检测Xpandomer的报告元件。关于基于Xpandomer的方法的其他细节描述于例如2008年6月19日提交的标题为“High Throughput NucleicAcid Sequencing by Expansion(通过扩增进行高通量核酸测序)”的第20090035777号美国专利公开中，其全部内容并入本文。
其他单分子测序方法包括使用VisiGen平台通过合成进行的实时测序(Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641–58,2009；第7,329,492号美国专利；第11/671956号美国专利申请；第11/781166号美国专利申请；它们各自通过引用的方式整体并入本文)，其中使用荧光修饰的聚合酶和荧光受体分子对固定化的带有引物的DNA模板进行链延伸，在核苷酸添加后得到可检测的荧光共振能量转移(FRET)。
用于任何合适类型的测定的试剂可以添加到多孔芯片的孔中(例如，使用多孔分配器，例如来自WAFERGEN BIOSYSTEMS的多孔分配器)。在将细胞(例如，单个细胞)加入到孔中之前或之后，可以将这样的试剂加入到孔中。在某些实施方案中，将蛋白质检测测定(例如，基于抗体的测定)组分加入到孔中。在其他实施方案中，将SNP检测测定组分加入到孔中。在其他实施方案中，将核酸测序测定组分加入到孔中。在某些实施方案中，使用核酸序列测定组分，该组分采用条形码标记单个mRNA分子和/或标记细胞/孔源(例如，如果在测序分析之前汇集孔)和/或标记特定的多孔芯片(例如，如果在进行测序之前汇集来自两个或更多个多孔芯片的孔)。这样的条形码方法和试剂的实例可见于第2007/0020640号美国专利公开、第2012/0010091号专利公开、第8,835,358号美国专利、第8,481,292号美国专利、Qiu等人(Plant.Physiol.,133,475-481,2003)、Parameswaran等人(Nucleic AcidsRes.2007Oct；35(19):e130)、Craig等人参考文献(Nat.Methods,2008,October,5(10):887-893)、Bontoux等人(Lab Chip,2008,8:443-450)、Esumi等人(Neuro.Res.,2008,60:439-451)、Hug等人，(J.Theor.,Biol.,2003,221:615-624)、Sutcliffe等人(PNAS,97(5):1976-1981；2000)、Hollas和Schuler(Lecture Notes in Computer Science Volume2812,2003,pp 55-62)以及WO201420127；所有这些通过引用的方式整体并入本文，包括关于与核酸的条形码和测序相关的反应条件和试剂的内容。
在某些实施方案中，采用WO2014201272的条形码标记和测序方法(“SCRB-seq”方法)。将SCRB-seq方法所必需的试剂(例如，对于小体积所必需的修饰)加入到多孔芯片的孔中(例如，孔中的单个细胞已经被裂解)。简而言之，SCRB-seq方法在多孔板中从单个细胞扩增初始mRNA样品(如上所述)，其中每个孔具有单个细胞。初始cDNA合成使用具有以下的第一引物：i)用于细胞/孔鉴定的N6或N11，ii)用于特定分子鉴定的N10，iii)结合mRNA的多聚T延伸(poly T stretch)，以及iv)产生其中第二模板-切换引物将杂交的区域的区域。第二引物是具有多聚G 3'端的模板切换引物，该切换引物的5'端具有异碱基(iso-bases)。cDNA扩增后，合并标记的cDNA单个细胞/孔样品。然后用两种不同的引物进行全长cDNA合成，纯化全长cDNA。接下来，使用i7引物(添加12种i7标签中的一种来识别特定多孔板)和P5NEXTPT5来添加用于NEXTERA测序的P5标签(P7标签添加到NEXTERA的另一端)从而制备NEXTERA测序文库。将文库在凝胶上纯化，然后进行NEXTERA测序。作为非限制性的实例，使用十二种i7板标签和384个细胞/孔特异性条形码使得能够一次完成总共4,608个单个细胞转录。该方法允许定量单个细胞中的mRNA转录物，并且允许用户对转录分子/细胞的绝对数量进行计数，从而从归一化除去任何变量。
在其他实施方案中，通过组合单次或多次添加用于检测和/或解析核酸或脂质或碳水化合物或蛋白质细胞组分试剂的试剂来动态和/或静态地选择芯片内图像或芯片映射的孔以用于进一步分析。
实施例
实施例1在多孔芯片中分离单个癌细胞
图12和图13分别示出了使用细胞表面标志物的实例，包括Wafergen芯片中的单个细胞和多个细胞的阳性和阴性对照抗体(Ab)染色、分配和成像。图12和图13示出了从约30,000个人乳腺癌SK-BR-3细胞(一种永生化培养细胞系，从文献中已知其是HER2/neu/ERBB2强阳性的)开始，将细胞从组织培养瓶中的经胰蛋白酶消化释放，重悬、染色和成像后孔水平上的36孔视野图(FOV)。
将SK-BR-3细胞洗涤并收集到1ml的1×PBS(无Mg++，无Ca++，pH 7.4；37℃)中。将一半体积的上述悬浮液与10μL针对细胞表面抗原ERBB2(HER2/neu)的合适缀合单克隆抗体(小鼠抗人ERBB2(HER2)-APC；R&D Systems；FAB1129A)孵育。将剩余一半体积的悬浮液与用于免疫染色的合适的阴性对照抗体(即，缀合的、同种型匹配的对照抗体(小鼠IgG2B-APC；R&D Systems；IC0041A))平行孵育。
简而言之，在37℃下进行缀合抗体孵育1小时。随后，加入体积为4.5mL预热的1×PBS(37℃)，并将细胞在室温下以200×g离心5分钟。将成片状沉淀的细胞重新悬浮在200μL预热的1×PBS(37℃)中，然后在37℃下在1×Hoechst 33342超活染料中染色～20分钟。将每个悬浮液的80微升等分试样分配到384孔板的合适的接收孔中。使用Wafergen MSND(多样品纳米分配器；参见第14/738,183号美国申请，其通过引用的方式整体并入本文)从384孔接受板中吸出细胞(参见例如图1至图3)。计算每个50nL分配体积，以向72×72孔Wafergen Smartchip的每个单独的孔平均输送约1个经抗体和Hoechst染色的细胞。分配后，芯片用Wafergen芯片覆盖膜密封，并在37℃下以300×g离心，收集在WafergenSmartchip孔底部的细胞。使用自动显微镜载片台和4×物镜进行标准显微镜图像采集。获得了共计144张Hoechst 33342图像和相应的144张APC-Cy5图像(对于Hoescht和Cy5，分别为约200mS或500mS曝光)，并保存为来自5184孔芯片的TIFF文件。144张图像中的每一张代表了5184孔Wafergen SmartChip阵列中的36个单独的孔。芯片分配和图像采集过程如图1所示。
显示芯片上36个单独的孔的视野(FOV)示出了一批SK-BR-3细胞，这些SK-BR-3细胞用Hoechst 33342染料和靶向HER2/neu抗原的APC缀合的单克隆抗体双重染色。预期使用Hoechst 33342超活染料对所有SK-BR-3细胞进行染色(图12，左图)。相邻图像示出了相同的36孔FOV，其中SK-BR-3(HER2/neu/ERBB2阳性)细胞用对该细胞表面抗原有特异性的抗体处理(图12，右图)。单个细胞作为芯片孔内的亮点很容易被识别。图12中两张图像的比较结果表明Hoechst信号(使用DAPI滤波器组获得)与缀合抗体产生的信号(从Cy5滤波器组获得)明显重叠。
显示同一5184孔芯片不同区域的36个单独的孔的第二视野示出了被Hoechst33342染料和APC-缀合的阴性对照单克隆抗体小鼠IgG2B-APC双重染色的一批SK-BR-3细胞(图13)。Hoechst染色的细胞(图13，左图)与阴性对照抗体染色的细胞(图13，右图)的比较结果并没有表明Hoechst信号与阴性对照抗体产生的信号重叠。
图12中的图像数据表明使用阳性对照抗体提供了多孔芯片中(例如，Wafergen多孔芯片)单个细胞和多个细胞的细胞抗原特异性抗体染色。在从同一芯片拍摄的图13中，非特异性抗体不产生与Hoechst染色信号重叠的离散点状信号。综合来讲，本实施例结合图12和图13中的结果证明了可用于分配并随后检测单个或多个癌细胞中的细胞表面表位特异性免疫染色的示例性系统和方法。
实施例2从不同细胞的混合物中分离单个细胞
在该实施例中，检测了三个样品。两个样品由单一物种组成：人U87-MG-(红色荧光蛋白阳性)细胞或小鼠NIH/3T3细胞。第三个样品由各单一物种样品的混合物组成。对细胞进行染色并使用MSND(多样品纳米分配器；Wafergen有限公司)分配细胞从而在WaferGenSMARTCHIP阵列的孔中允许细胞计数的泊松分布。随后将该阵列成像，选择含有单个细胞的孔和含有其他分析物的孔，以加工成第一链cDNA和第二链cDNA。使用先前所描述的方法从芯片中提取cDNA。将cDNA在芯片外进行PCR扩增，得到适用于NGS扩增和读取的DNA扩增子“文库”。然后能够将来自样品文库的序列读段映射到特定样品(即物种基因组)，从而首先确认该细胞和RT缓冲液选择过程能够选择特定的孔，其次确认来自混合细胞样品的选定孔产生了仅映射到一种物种的序列读段。实际上，后者可用于计算系统的单个细胞占用率和分配能力。
简单来讲，将人U87-MG-RFP细胞和小鼠NIH 3T3细胞分别在1×PBS中洗涤，计数并用Hoechst 33342和碘化丙啶染色。对于细胞混合物，将各细胞系的等分试样以1:1的比例混合。分别用来自K562细胞(12pg)的RNA和1x PBS作为阳性过程对照和阴性过程对照。
将样品和对照加载至384孔源板中，以使用多样品纳米分配器(MSND)分配到SmartChip阵列上。SmartChip阵列的每个孔都包含预先印好的、标识“条形码”引物的样品，其中这些引物上的3’oligodT序列用于退火至核酸序列的多聚腺苷酸化延伸。条形码作为裂解后从每个细胞捕获的mRNA分子的分子地址。在对照和样品分配之后，将阵列印迹，密封并在22℃下以300×g离心5分钟。然后将阵列成像。成像后，将阵列置于冷冻器(-80℃)中以等待细胞和样品选择以及随后的试剂添加。使用CellSelect(TM)图像分析软件基于Hoechst33342信号选择含单个细胞的孔和含其他分析物的孔。
共识别出1,268个含“单个细胞”的孔。在这1,268个孔中，来自每种单一物种细胞的90个孔，来自混合细胞样品的382个孔以及4个阳性对照孔和4个阴性对照孔，也被选择用于进行处理。一旦孔选择完成，映射这些孔以接收RT试剂。简言之，将阵列从冷冻器中取出，在室温下解冻10分钟，并在4℃下以3,220×g离心3分钟。将阵列放置在热循环仪中，在核酸温度变性(72℃下3分钟)以及在组合的离心/温度步骤(4℃，3,220×g离心3分钟)期间退火之后，允许每个孔中的具有条形码的oligodT引物退火至核酸(主要是mRNA)中的多聚腺苷酸化延伸。将阵列转移到MSND进行RT分配。使用由分析软件产生的分配图，将50nL含有MMLVRT和第二链合成“模板切换寡核苷酸”的RT混合物添加到选定的孔中。将阵列在4℃下以3,220×g离心3分钟，以使阵列内容物停留在每个孔中，并在42℃下孵育90分钟。在翻转芯片并置于提取装置中(如第2014/0130885号美国专利公开，申请号14/075,631中所述，其通过引用的方式整体并入本文)之后，通过第二次离心(如上所述)收集合并的(具有条形码的)样品cDNA产物。提取后，在芯片外进行单引物PCR。使用基于转座酶的方法将扩增子片段化。富集代表mRNA的3’端的序列的扩增子(Soumillion et.al.,http://其后为dx.doi.org/ 10.1101/003236 2014；还参见WO 2014/201273；它们均通过引用的方式并入本文)，并使用HiSeq 2500以快速运行模式对其进行测序。
测序后，将来自单一物种样品以及人细胞和小鼠细胞的混合物的读段分别与人基因组和小鼠基因组比对。与两个基因组均比对上的读段被鉴定为同源基因组区域的比对，并从分析中排除。鉴定了仅与每个条形码的单个基因组比对上的读段。主要与一个基因组比对上的条形码被鉴定为来自该基因组。在从混合细胞样品得到的382个孔中，来自138个和234个含单个细胞的孔的读段分别明确比对上人和小鼠基因组。五个孔条形码对各基因组的比对少于25,000(低比对读段)，并被排除不用于进一步分析。使用来自混合细胞样品的382个孔中产生映射到两种物种的测序读段的5个孔来计算该系统的多个细胞占用率和分配能力。简而言之，1.3％的条形码显示与两个基因组几乎相同数量的比对数。综上所述，该系统的单个细胞占用率和分配能力为98.7％，即如图17所示，～99％的孔是含单个细胞的孔。
本申请中提及的所有出版物和专利通过引用的方式并入本文。在不背离本公开的范围和精神的情况下，对本公开所述的方法和组合的各种修改和变化对于本领域技术人员而言将是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本公开，但是应当理解，所要求保护的公开内容不应被不适当地限于这些具体实施方案。实际上，用于实施本发明的对本发明所描述的模式进行的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内，所述各种修改对于相关领域技术人员而言是显而易见的。

Claims (21)

1.一种方法，包括：
a)将分配体积的细胞悬液分配到多孔装置的多个孔中的每个孔中，
其中所述细胞悬液包含细胞，所述细胞以一定浓度存在于所述细胞悬液中使得所述分配体积中平均存在X个细胞，和
其中用液体分配系统进行所述分配；
b)在所述分配之前和/或之后用第一可检测标记物标记至少一部分的所述细胞；以及
c)确定所述多个孔的至少一些孔中每孔中存在的细胞数量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中X是1至20个细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中X是1。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个孔的至少一个孔中的细胞数量确定为0。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个孔的至少一个孔中的细胞数量是0至40。
6.根据权利要求1所述的方法，还包括：d)将分配体积的所述细胞悬液分配到确定为具有少于X个细胞的至少一些所述孔中。
7.根据权利要求6所述的方法，还包括：e)将等于所述分配体积但不含细胞的第一附加体积分配到确定为具有X个细胞或多于X个细胞的至少一些所述孔中。
8.根据权利要求6所述的方法，还包括：e)确定先前确定为具有少于X个细胞的每个孔中存在的细胞数量。
9.根据权利要求8所述的方法，还包括：f)将分配体积的所述细胞悬液分配到确定为具有少于X个细胞的孔中。
10.根据权利要求9所述的方法，还包括：g)将等于所述分配体积但不含细胞的第二附加体积分配到确定为具有X个细胞或多于X个细胞的至少一些所述孔中。
11.根据权利要求1所述的方法，还包括：在所述分配和/或确定步骤之前和/或之后用第二可检测标记物标记至少一部分的所述细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，还包括：确定所述多个孔中哪些孔，如果有的话，含有具有所述第二标记物的细胞。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述确定包括使所述多个孔的至少一些孔的每个孔中的所述第一可检测标记物可视化。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述确定包括使用图像捕获系统捕获所述多个孔的至少一些孔的第一图像，其中所述第一图像指示存在于所述第一图像中的每个孔中的细胞数量。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述图像捕获系统包括与放大镜连接的照相机。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述图像捕获系统还包括计算机，其中所述计算机包括计算机处理器、计算机存储器和图像分析软件。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述图像分析软件被配置为分析所述第一图像并产生：i)哪些孔含有少于X个细胞的第一列表；ii)哪些孔含有X个细胞的第二列表；和iii)哪些孔含有多于X个细胞的第三列表。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述图像分析软件产生用于所述液体分配系统的指令，以将分配体积分配到所述第一列表的每个孔中。
19.根据权利要求17所述的方法，还包括：d)基于所述第一图像，将分配体积分配到具有少于X个细胞的至少一些所述孔中。
20.根据权利要求19所述的方法，还包括：e)在所述分配之前，捕获具有少于X个细胞的至少一些所述孔的第二图像，其中所述第二图像通过所述第一可检测标记物指示在所述分配之前存在于具有少于X个细胞的每个所述孔中的细胞数量。
21.一种系统，包括：
a)包括多个孔的多孔装置；
b)液体分配系统，其被配置为将分配体积分配到所述多个孔的每个孔中；以及
c)选自以下的至少一种组分：
i)细胞悬液，包含细胞，所述细胞以一定浓度存在于所述细胞悬液中使得所述分配体积中平均存在X个细胞，
ii)分配图文件，其向所述液体分配系统提供指令以将液体分配到含有X个细胞的所述多孔装置的细胞中。
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