CN111826285B - 一种单细胞克隆培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种单细胞克隆培养容器，它是底表面带有纤连蛋白印迹块阵列的细胞培养容器；所述底表面未覆盖纤连蛋白的区域被封闭剂封闭；单个所述印迹块的面积为225～625μm2。本发明还公开了一种单细胞克隆的培养方法，它是将细胞接种于前述培养容器进行培养。本发明的单克隆培养方法，具有很高的通量，可单次培养上千个单细胞克隆团，还能克服传统的极限稀释法带来的单克隆不纯、单克隆无法正常生长的问题。另外，本发明可应用于基因编辑、肿瘤克隆培养、单细胞测序样品制备等等诸多领域，应用前景广阔。

Description

一种单细胞克隆培养方法
技术领域
本发明属于单细胞克隆培养方法领域。
背景技术
单细胞克隆，是将一个细胞进行培养，使其分裂形成的细胞群。由于这群细胞来源于共同祖先细胞，其基因型相同，生理状态一致性高，在生物学、医学研究中应用广泛，例如：基因编辑细胞筛选、肿瘤克隆、单细胞测序样品制备、杂交瘤制备等等。
公布号为CN 108130314 A的专利申请文件，公开了一种单克隆培养方法，主要包括：(1)先在预冷96孔板中加入凝血酶；(2)再将目的细胞用培养基稀释，加入纤维蛋白原、T7缓冲液和培养基，得混合体系；(3)再将步骤(2)的混合体系均匀铺满步骤(1)的96孔板，保证每个孔内为单个细胞；(4)培养。该方法又称“极限稀释法”，获得的单克隆往往混有其他细胞，无法真正获得由一个细胞分化而来的细胞群。另外，即使通过极限稀释法或者流式细胞术将一个细胞分置到一个孔中进行培养，不仅耗时耗力，费用高，由于缺乏细胞外基质和细胞之间的旁分泌调节，单个细胞往往不能正常分裂增殖，而无法获得单细胞克隆。
公布号为CN106939318A的专利申请文件，公开了一种贴壁生长细胞的单细胞克隆分离方法，它是先使用染料对细胞进行着色，再用低浓度胰酶局部消化贴壁细胞，得到脱落下来的细胞小团。该方法简单方便，但理论上得到的细胞不是纯净的单细胞克隆，容易被周围细胞所污染。
公布号为CN103923876A的专利申请文件公开了一种单细胞克隆培养方法，包括：步骤1，制备培养液微滴；步骤2，准备显微操作系统；步骤3，筛选单克隆细胞；步骤4，利用步骤2所述的显微操作系统将操作针内的目标细胞以每个液滴放一枚细胞逐一放入步骤1的培养液微滴内，然后进行细胞培养；步骤5，将步骤4培养的细胞在培养2天后进行半量换液；步骤6，扩大培养，获得单细胞克隆。该方法能得到较纯净的单克隆细胞，但是需要借助昂贵的显微操作系统，对操作人员的经验要求较高，且无法克服单个细胞无法正常生长的问题。
现有技术的方法还普遍存在通量低的问题，即单次培养获得的单克隆很少。
发明内容
本发明的目的是提供一种单细胞克隆培养方法。
本发明的技术方案包括：
一种单细胞克隆培养容器，它是底表面带有纤连蛋白印迹块阵列的细胞培养容器；
所述底表面未覆盖纤连蛋白的区域被封闭剂封闭；封闭剂即是阻止细胞贴壁的物质；
单个所述印迹块的面积为225～625μm2。
如前述的培养容器，所述容器为培养皿、培养盒、培养板或培养瓶。
如前述的培养容器，所述封闭剂为Pluronic F-127。
如前述的培养容器，每个所述印迹块的面积大小为225～400μm2。
一种单细胞克隆培养方法，它是将细胞接种于前述培养容器进行培养。
如前述的方法，它还包括：接种1～3h后，在显微镜下破坏粘连了2个以上细胞的印迹块。
如前述的方法，平均每1000个印迹块对应接种细胞数为500～5000。
如前述的方法，它还包括：待细胞长出肉眼可见的细胞球后，取出细胞球，扩大培养。
前述的方法在基因编辑细胞筛选、肿瘤克隆培养、单细胞测序样品制备或单克隆杂交瘤制备中的应用。
本发明具有如下有益效果：
1)效率高。本发明的单克隆培养方法，一次可得到上千单细胞克隆团，通量高。
2)纯度高。本发明的单克隆培养方法，其印迹块的面积低于96孔板，很难粘连2个以上细胞；即使粘连2个以上细胞，也可直接在显微镜下将对应印迹块使用移液枪枪头破坏掉。
3)单细胞克隆生长良好。本发明相比极限稀释法，无需用固体壁垒(例如96孔板的孔壁)分隔细胞，培养环境中不乏细胞外基质和细胞之间的旁分泌调节，细胞能够正常生长、增殖。
本发明的单细胞克隆可应用于基因编辑、肿瘤克隆培养、单细胞测序样品制备、杂交瘤培养等涉及单细胞克隆的诸多领域，应用前景广阔。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：本发明单细胞克隆培养原理示意图。
图2：实施例1单细胞克隆培养过程监测图；A：微阵列视野图；B：细胞种植后12h；C：细胞种植24h；D：细胞种植48h；E、F：细胞种植96h；G：经吹打分离得到的一个单细胞克隆球；标尺＝100μm。
图3：使用本发明方法培养高分化脂肪肉瘤细胞株93t449细胞得到的细胞团。
具体实施方式
实施例1单克隆培养方法
本发明具体包括如下步骤(图1为主要步骤的示意图)：
(1)使用激光蚀刻特定图案硅片为模板，倒模获得聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)印章，制备出具有外凸矩形微阵列(单个矩形面积225μm2)的PDMS印章。
(2)将200μl浓度为100μg/ml的纤连蛋白(fibronectin，FN)溶液涂布于印章表面，本实施例还加在印章表面额外添加了绿色荧光素Flourescein isothiocyanate isomer I用于指示印章，室温孵育20分钟后洗去多余的溶液。
(3)37℃孵箱中干燥8-15分钟，然后将装20-30ml水的50ml离心管倒置压在印章上，给予一定压力，使外凸矩形微阵列印压于细胞非贴附培养皿内底表面，待印迹形成后移去印章。本例中，印迹块分布密度为2500个/cm2。
(4)图案干燥后，加入体积分数1％Pluronic F-127室温孵育2小时，封闭剩余培养皿内底表面的空间。制作好的微阵列培养皿在使用前，先用PBS清洗3次，保证培养皿基底不能完全干燥，然后再接种细胞。
(5)将1×104细胞接种于培养容器中，在接种入细胞1-3小时后，通过换液就可以把没有贴壁的细胞去掉。在这个方法种主要就是通过印迹块的大小，保证每个印迹块只有一个细胞可以贴上。如果偶尔有一个印迹块上贴上了两个细胞，可以在显微镜下，用移液枪的枪尖把它破坏掉。
(6)种植第五天开始细胞球经过摇晃或移液枪轻轻吹打后自动成球脱落；将脱落的细胞球进行稀释，肉眼即可看见悬浮的细胞球；将单个细胞球吸出进行扩增培养，即快速获得单细胞克隆。
培养基底表面微阵列显微视野如图2A所示。由图2B可见在固定位置上清晰可见单个细胞以及分裂增殖了的细胞正贴壁生长。在24h至48h内(图2C、D)，细胞开始由贴壁状态转为成三维球状生长，渐渐成约50μm的细胞球。在96h以后细胞球几乎不再继续增长，保持在约100μm的大小，个别细胞球开始松动，欲脱离原有位置(图2E、F)。图2G为经吹打分离得到的一个单细胞克隆球。
本发明的单克隆培养方法，应用方式广泛，例如：
1.本发明的单细胞克隆培养方法可用于基因编辑单克隆制备。
在一种优选的实施方式中，将携带sgRNA的载体转入Cas9稳定表达的猪髋动脉内皮细胞(PIEC)中，即可使用本发明的单细胞克隆培养方法进行培养，扩增得到单细胞克隆后，可通过酶切(例如T7核酸内切酶I)或测序，对基因编辑效果进行鉴定。由于本发明单次可获得上千单克隆，其通量远高于传统的96孔板，使用本发明进行基因编辑效果鉴定或基因编辑细胞筛选，效率将大大提高。
2.本发明的单细胞克隆培养方法还可用于肿瘤克隆培养。
由于细胞的异质性，细胞对群体依赖性和增殖能力有所差异，贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。为了提高克隆形成效率，可使用本发明的单细胞克隆培养方法筛选得到异质性低、增殖能力强的肿瘤克隆，可用于肿瘤相关机制研究或药物筛选。图3即为使用实施例1的方法培养高分化脂肪肉瘤细胞株93t449细胞得到的细胞团。
3.本发明的单细胞克隆培养方法还可用于单细胞测序样品制备。
目前单细胞测序技术的细胞样品制备方法，主要包括：①极限稀释法；②流式细胞分选；③激光显微切割；④显微操作法；⑤微流控技术。这些技术中，有限稀释法和纤维操作法的操作难度高，且通量低；流式细胞分选、激光纤维切割和微流控技术成本较高。
而使用本发明的方法，例如实施例1的步骤(1)～(5)，可以一次性分离500～10000个单细胞。操作简单，获得单细胞快，成本低。
4.本发明的单细胞克隆培养方法还可以用于制备单克隆杂交瘤。
杂交瘤，即癌细胞和B淋巴细胞的融合细胞，既能无限增殖，又能产生B淋巴细胞的抗体，是单克隆抗体的主要生产工具。
一种抗原往往有多个决定簇，一个动物体在受到抗原刺激后产生的体液免疫应答实质是众多B细胞群的抗体分泌，而针对目标抗原表位的B细胞只占极少部分。由于细胞融合是一个随机的过程，在已经融合的细胞中有相当比例的无关细胞的融合体，需经筛选去除，主要包括如下步骤：
1)极限稀释法得到单克隆；
2)通过ELISA法选出抗体高分泌性的单克隆细胞；
3)再通过特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株。
而本发明的单克隆培养方法可以替代上述步骤1)中的极限稀释法，实现更高单克隆培养效率。
综上，本发明的单细胞克隆培养方法，具有很高的通量，可单次培养上千个单细胞克隆团，进而可扩增得到大量单细胞克隆；还能克服传统的极限稀释法带来的单细胞克隆不纯、单克隆无法正常生长的问题。本发明的单细胞克隆可应用于基因编辑、肿瘤克隆培养、单细胞测序样品制备、单克隆杂交瘤制备等等诸多领域，应用前景广阔。

Claims (6)

1.一种单细胞克隆培养方法，其特征在于：它是将细胞接种于单细胞克隆培养容器进行培养；所述单细胞克隆培养容器是底表面带有纤连蛋白印迹块阵列的细胞培养容器；所述底表面未覆盖纤连蛋白的区域被封闭剂封闭；所述封闭剂为Pluronic F-127；单个所述印迹块的面积为225~625μm2；所述单细胞克隆培养方法还包括接种1~3h后，在显微镜下破坏粘连了2个以上细胞的印迹块。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述容器为培养皿、培养盒、培养板或培养瓶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：每个所述印迹块的面积大小为225~400μm2。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，平均每1000个印迹块对应接种细胞数为500~5000。
5.如权利要求1~4任一所述的方法，其特征在于，它还包括：
待细胞长出肉眼可见的细胞球后，取出细胞球，扩大培养。
6.权利要求1~5任一所述的方法在基因编辑细胞筛选、肿瘤克隆培养、单细胞测序样品制备或单克隆杂交瘤制备中的应用。
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