CN101570740B - 一种新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar及应用 - Google Patents
一种新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar及其应用。所述的新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：C200927。其可以用于高效瞬时转染外源基因，并能以细胞团形式生长，本发明所提供的细胞亚群具有悬浮适应生长的特点，同时又具有贴壁生长特性。可以克服目前哺乳动物工程贴壁细胞培养生产药物时基因表达产物周期短，产率低，而悬浮细胞进行外源基因瞬时转染效率低的缺点。依据本发明，可用于建立贴壁转染-悬浮培养方式生产药物蛋白的新型规模化瞬时高效转染系统和比较经济的以细胞团为生长方式的无载体固定化培养生产模式。
Description
技术领域
本发明涉及一种哺乳动物工程细胞悬浮适应-可贴壁性细胞亚群；特别是一种新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar及应用，可以适用于规模化瞬时转染和无载体化细胞团培养生产重组腺病毒载体和重组蛋白。
背景技术
目前常用的工程细胞如HEK293、CHO、BHK等，在悬浮培养时一般均会发生凋亡或者周期抑制。工程上常采用悬浮适应方法进行贴壁细胞的悬浮驯化，以获得适应大规模悬浮培养的适应性细胞，因为只有悬浮培养方法更有利于工业规模化培养。动物工程细胞的悬浮适应过程一般经过长达数月乃至成年的反复贴壁和悬浮培养循环才能获得一种悬浮培养特性不太稳定的悬浮适应的细胞亚群，因为在实验室我们常会观察到悬浮细胞悬浮特性退化而导致重新贴壁培养的现象。分析悬浮适应方法的具体过程可以看出，这种方式是以是否具有悬浮特性作为标准筛选细胞群的，没有考虑到此筛选方法是否有利于高效外源蛋白表达细胞亚群的获得，在此过程中，有可能把具有高活性表达外源蛋白的细胞克隆丢掉；另外，这种方法获得悬浮适应细胞亚群一般耗时、耗力，而且即使获得带有外源表达特性的细胞株，也难于对其进行进一步的遗传改造或基因转染，因为在悬浮条件下进行基因操作的效率都很低，比如目前适应于药物开发前期需要的大规模瞬时转染在悬浮条件下转染效率非常不理想。
人胚肾293细胞系是用于制备重组腺病毒载体和重组蛋白的主要生产工程细胞。利用HEK293细胞悬浮培养时具有成团的培养特性，可以采用沉降或过滤的技术手段，使HEK293细胞团截留在搅拌培养体系中，起到类似于微载体和/或多孔微载体固定化培养的目的，并结合动物细胞培养过程的动态检测和优化控制，实现HEK293细胞的高密度长期培养及其表达产品的高效生产。悬浮细胞团中的细胞间所形成紧密的相互联系和相互作用有利于细胞表型的表达和维持，这一理论推断在一些研究中已经得到证实。利用HEK293细胞建立大规模瞬时转染生产药物蛋白生产模式，有可能建立高效的大规模瞬时转染工艺。但据Sabine Geisse报道，虽然理论上利用PEI(聚乙烯亚胺)转染细胞可以达到83％的转染效率，但由于目前商业上使用的无血清培养基中含有转染抑制剂而导致这样的转染效率难以达到。在商业培养基配方还属于专利保护范围的情况下，有必要发展形成一种更好的瞬时转染策略。基于贴壁培养条件 下细胞转染效率高和悬浮条件下蛋白生产有优势的特点，我们尝试建立一种先行在贴壁培养下进行转染，然后在悬浮条件下以无载体固定化培养方式进行规模化生产蛋白药物的策略。而这一策略的关键是要克服贴壁依赖性动物工程细胞在胞外基质剥夺时要发生失巢凋亡的特性，比如HEK293、CHO等。
研究表明，哺乳动物细胞系实质上是由一群对失巢敏感程度不同的多个细胞亚群组成的细胞群。动物工程细胞的悬浮驯化过程其实就是将亲本细胞群在反复的贴壁和悬浮培养过程中逐渐分群的过程；在此过程中，失巢敏感细胞由于发生失巢凋亡而逐渐被筛掉，而具有失巢凋亡抗性的细胞亚群会在此培养过程中逐渐被富集，最终形成一群具有失巢凋亡抗性适应悬浮培养的细胞亚群，即形成悬浮适应细胞亚群。然而，工程贴壁细胞在经过悬浮适应驯化以后，细胞在贴壁条件下培养的贴壁性能会有所下降，即使在贴壁条件下培养很长时间也很难重新贴壁。在利用动物哺乳细胞大规模瞬时转染方法生产蛋白药物时，目前多采用悬浮培养的细胞进行大规模瞬时转染，但由于在转染过程中细胞处于悬浮状态导致和转染物质的接触几率很小，从而使得转染和蛋白生产效率很低，严重影响此生产方式的进一步的规模化和生产化。如果在转染过程中使用的工程细胞既能以悬浮细胞团的形式生长，又具有在贴壁条件下重新贴壁的性能，那么我们就可以利用此细胞先在贴壁条件下进行高效率瞬时转染，继而在悬浮培养条件下培养生产蛋白药物；而且，在工程上细胞以细胞团为生命存活形式是一种典型的细胞自固定化方式，有利于细胞抵御不良环境影响，还有利于细胞活性的保持和外源蛋白的表达。正是基于以上假设，本发明参照肿瘤细胞在侵袭转移过程中侵袭转移能力即失巢凋亡抗性获得的生命历程，在体外通过贴壁和悬浮培养的反复筛选，获得了具有失巢凋亡抗性(即悬浮适应)培养特性，又具有在贴壁培养条件下重新贴壁性能的特殊细胞亚群。
我们选择以HEK293细胞作为本发明的哺乳工程细胞生产细胞群，因为此细胞即是大规模生产重组腺病毒载体和重组蛋白中常用的细胞株，又是近年来进行大规模瞬时转染法生产药物蛋白的最常用细胞株。
发明内容
本发明的目的是为了克服目前哺乳动物工程细胞生产蛋白药物中面临的具体问题，而提供一种具有悬浮适应培养特性又具有贴壁性生长特性的人胚肾293细胞亚群。此亚群的获得和使用有助于建立一种新型动物工程细胞瞬时转染工艺，解决一般利用悬浮适应细胞进行大规模瞬时转染生产药物蛋白过程中转染和蛋白生产效率低的问题。
本发明提供一种设计合理、操作简单，应用于规模化瞬时转染和细胞团培养的哺乳动物工程细胞-人胚肾293细胞亚群。一种新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar， 由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：C200927。
新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar的制备方法，在反复悬浮-贴壁的体外循环培养过程中选择细胞亚群时，选择能够以悬浮适应性细胞团生长，并能够在贴壁条件下生长的细胞亚群为目标亚群。
新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar作为贴壁-悬浮培养的分阶段培养的应用。
新型哺乳动物工程细胞亚群HEK293a作为无载体固定化培养的应用。
新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar作为高效建立转染基因稳定性细胞系的悬浮培养适应细胞群的应用。
新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar作为建立大规模高效瞬时基因转染生产药物蛋白的生产系统的应用
新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar用于建立高效瞬时基因转染系统生产药物蛋白的步骤为：在细胞贴壁培养状态下进行基因瞬时转染，在细胞悬浮培养状态下进行外源基因的稳定高效表达。
本发明的新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar的建立和获得，在生物工程上有非常重要的优点和意义，一、由于人胚肾293细胞HEK293ar细胞亚群具有失巢凋亡抗性，因此可以直接被用来建立悬浮细胞培养体系，而省去一般工程细胞在建立悬浮培养操作单元时要经过长时间悬浮适应的漫长过程；二、由于此细胞亚群是以细胞间建立多重细胞间连接而形成细胞团为生命的存活方式，此有助于细胞存活和蛋白的高效表达；三、目前，规模化瞬时转染法生产蛋白已经成为一种生产应急药物蛋白和工具蛋白的生产方式，但由于商用细胞培养基中存在的抑制转染效率成分，导致利用悬浮细胞转染效率低下，本发明所获得的悬浮适应人胚肾293细胞HEK293ar细胞亚群由于还具有在贴壁条件下重新贴壁的特点，因此可以利用此细胞亚群建立新型的瞬时转染生产系统以生产急需的药物蛋白和工具蛋白；四、有利于快速建立稳定转染的工程细胞系，因为，此细胞亚群可以直接被用来建立悬浮细胞培养体系，减少在悬浮适应培养过程中由于细胞发生失巢凋亡所导致的高表达蛋白特性细胞亚群的丢失。
本发明获得悬浮适应可贴壁性细胞亚群的最大特点在于：在一般悬浮适应驯化步骤中，选择的细胞群是仅仅能够适应悬浮培养特性的细胞亚群，而本发明选择的细胞亚群是可贴壁的悬浮适应亚群。
本发明提供的人胚肾293细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar是一种能够用作制备重组腺病毒载体和重组蛋白的通用生产细胞，可以通过已知抗体或蛋白基因转染所述的人胚肾293细胞HEK293ar细胞亚群，能够产生以前特征鉴定的抗体或者蛋白药物。因为，本细胞亚群的获得是基于常用哺乳动物工程细胞人胚肾293细胞的自然选育而得，没有破坏原工程细胞的基本生产特性。
附图说明
图1为流式细胞仪测定HEK293和人胚肾293细胞HEK293ar细胞亚群在失巢培养条件下细胞周期运行和凋亡发生实验结果图。
图2为流式细胞仪测定人胚肾293细胞HEK293ar细胞亚群失巢凋亡抗性稳定性实验结果图。
图3为HEK293和人胚肾293细胞HEK293ar细胞亚群瞬时转染生产蛋白对比实验结果图。
图4为人胚肾293细胞HEK293ar细胞亚群无载体固定化培养实验结果图。
保葳证明：请求保藏的培养物名称：人胚肾293细胞HEK293ar，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO：C200927。保藏日期：2009年4月16日。
具体实施方式
一种用于高效瞬时转染外源基因和无载体化培养的细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar的获得和用途。
1、细胞培养：将人胚肾293亲本细胞以6×105细胞/瓶的密度接种到含有胎牛血清的DMEM1640(Dulbecco’s modified Eagle’s medium1640，美国生命技术公司)培养基中，37℃，5％CO2孵育至细胞在培养瓶中长满。
2、细胞失巢培养：在超净台中用预先灭菌的含有1.5％的琼脂液在培养瓶中铺上薄薄一层，放置晾干；用胰酶消化液消化上述步骤1培养的细胞，800rpm离心5min收集细胞；分别用含有Methocel(甲基纤维素，美国sigma公司)0.5、0.75、1.0、1.5％的DMEM1640将上述收集的细胞制成细胞悬浮液，置于铺有琼脂的培养瓶中在37℃，5％CO2孵育培养。
3、在细胞失巢培养条件下培养细胞48hr后，在倒置显微镜下观察含有不同Methocel浓度的细胞培养瓶中的细胞分散情况。选择细胞呈现单个、均匀分散、悬浮分布的培养液中的Methocel浓度为失巢条件培养的Methocel最佳添加浓度。实验表明，添加0.75％的浓度可以使得HEK293细胞在失巢培养条件时呈现单个、均匀分散、悬浮分布。以下制备步骤中Methocel的添加浓度确定为0.75％。
4、悬浮-贴壁循环培养：在上述优选的HEK293细胞失巢培养条件下，37℃，5％CO2孵育培养HEK293细胞2天，将细胞悬液转移到没有用琼脂铺底的培养瓶中正常贴壁培养。在倒置显微镜下观察有细胞贴壁生长时，倒掉上层培养基，补加含有胎牛血清的新鲜DMEM1640培养基，继续培养至细胞在瓶中长满；再用胰酶消化液消化贴壁细胞，800rpm离心5min收集细胞，在细胞失巢培养条件下培养细胞一定时间，再转移到没有用琼脂铺底的培养瓶中正常贴壁培养细胞，至细胞长满；再一次在失巢培养条件下培养细胞，离心收集细胞贴壁培养。如此经过多次悬浮-贴壁循环培养，最终获得的细胞亚群即为具有失巢凋亡抗性，又具有在贴壁条件下重新贴壁性能的细胞亚群，命名为人胚肾293细胞HEK293ar细胞亚群。
5、将上述第4步骤所选的细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar和亲本细胞HEK293分别置于失巢模型培养基下培养24hr，用碘化丙啶(Propidium iodide，PI)进行细胞DNA染色，流式细胞仪测定细胞周期和亚二倍体峰值的变化。人胚肾293细胞HEK293ar细胞亚群的G2-M期细胞大约占40％，S期细胞比例为37.68％，而亲本细胞HEK293的G2-M期细胞比例为0，细胞S期比例高达56.22％；而且，人胚肾293细胞HEK293ar亚群在失巢培养条件下，亚二倍体峰仅为7.6％，亲本细胞高达35.59％，说明人胚肾293细胞HEK293ar细胞具有失巢凋亡抗性，在失巢培养条件下周期运行正常，没有发生细胞周期阻滞现象(结果见说明书附图1)。
6、将上述目标细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar在上述步骤所建立的失巢培养条件下长时间培养，培养过程中注意更换新鲜培养基。分别在培养过程的第1天、10天、30天取样，采用上述第五步骤的方法检测细胞周期和亚二倍体峰变化情况，发现取自不同时间的细胞在失巢条件下细胞周期运行正常，没有发生周期阻滞现象，反映细胞增殖的G2-M比例维持在40％左右，而各个时间点取样细胞亚二倍体峰的比例变化很少，维持在7-15％左右(结果见说明书附图2)，说明此亚群细胞在失巢条件下具有稳定的失巢凋亡抗性。将取样细胞分别置于贴壁条件下37℃，5％CO2孵育培养，观察到各个时间点取样细胞均能以正常贴壁培养方式生长。
7、经过上述多步骤获得一种稳定的悬浮适应-可贴壁性细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar，并于中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC-C200927。
8、以悬浮适应-可贴壁性细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar为生产细胞建立新型瞬时转染系统
分别将编码绿色荧光蛋白的EGFP/N1质粒瞬时转染进HEK293和人胚肾293细胞HEK293ar细胞，在荧光显微镜下检测其转染率基本在65％左右，然后将两种细胞亚群用消化液消化，转移到悬浮培养体系中继续培养，分别按时测定细胞活性和细胞分泌EGFP蛋白量的变化。实验发现，HEK293在检测的3天内，细胞活性从95％逐步下降到8％，而EGFP相对分泌量(relative light unit，RLU)从第一天的1625下降到600左右，而人胚肾293细胞HEK293ar细胞群在此时间内，细胞活性一直维持在95-89％，EGFP分泌量一直维持在1600的高水平(结果见说明书附图3)。EGFP荧光定量以下述方法进行：离心收集细胞，按1∶2的比例加入含1％TritonX-100的PBS，低温裂解后1hr采用荧光微孔读板仪进行荧光测量，设置激发波长在485nm，发射波长在520nm测定RLU。荧光强度可在37℃或者常温(22℃左右)下进行测量。细胞活性以相对活细胞数计算。此结果说明以本发明提供的人胚肾293细胞HEK293ar细胞比一般工业用的HEK293细胞更适宜于建立一种先贴壁转染后以悬浮培养生产蛋白的瞬时转染工艺。
9、人胚肾293细胞HEK293ar亚群用于细胞无载体固定化培养实验
将一定量贴壁培养的人胚肾293细胞HEK293ar细胞接种到摇瓶中以悬浮方式培养，观察细胞培养状况。研究发现，人胚肾293细胞HEK293ar细胞在悬浮条件下培养6-10hr后开始形成细胞团，后以细胞团方式生长，细胞活性可以维持在80-87％。而且，细胞可以维持近似对数期的生长速度，比生长速率达到0.05-0.06hr-1，这种利用人胚肾293细胞HEK293ar细胞悬浮培养成团的培养特性建立细胞团悬浮培养模式，可以采用沉降或过滤的技术手段，使人胚肾293细胞HEK293ar细胞团截留在搅拌培养体系中，起到类似于微载体或多孔微载体固定化培养的目的，从而达到无载体固定化培养细胞的目的(结果见说明书附图4)。
10、人胚肾293细胞HEK293ar亚群用于高效建立基因转染稳定细胞系的悬浮培养适应细胞
由于人胚肾293细胞HEK293ar亚群具有在失巢条件或悬浮条件下抵御失巢凋亡的抗性，因此，在获得适应工业化生产用的悬浮培养适应细胞系时具有独特优势。和一般失巢凋亡敏感细胞相比，人胚肾293细胞HEK293ar细胞亚群在贴壁条件下获得稳定基因转染细胞系后，由于人胚肾293细胞HEK293ar细胞亚群具有抗失巢凋亡特性从而可以减少在获得悬浮适应细胞系过程中发生的高效表达基因细胞亚群的丢失现象，从而快速建立基因转染稳定细胞的悬浮培养适应细胞，而一般失巢敏感细胞在悬浮适应过程中会发生凋亡而可能丢失高效表达基因的细胞亚群，并且需要更长的时间才能获得悬浮培养适应的细胞亚群。
Claims (6)
1.一种新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC N0：C200927。
2.权利要求1所述的新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar的制备方法，特征在于：在反复悬浮-贴壁的体外循环培养过程中选择细胞亚群时，选择能够以悬浮适应性细胞团生长，并能够在贴壁条件下生长的细胞亚群为目标亚群。
3.权利要求1所述新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar在贴壁-悬浮培养的分阶段培养中的应用。
4.权利要求1所述的新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar在无载体固定化培养中的应用。
5.权利要求1所述的新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar在建立大规模高效瞬时基因转染生产药物蛋白的生产系统中的应用。
6.如权利要求5所述的新型哺乳动物工程细胞亚群人胚肾293细胞HEK293ar在建立大规模高效瞬时基因转染生产药物蛋白的生产系统中的应用，其特征在于：用于建立高效瞬时基因转染系统生产药物蛋白的步骤为：在细胞贴壁培养状态下进行基因瞬时转染，在细胞悬浮培养状态下进行外源基因的稳定高效表达。
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