CN1962855A - 一种构建干细胞体外增殖分化微环境的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及干细胞组织工程领域,具体地说是一种构建干细胞体外增殖分化微环境的方法,以海藻酸钠,聚赖氨酸为材料,制备APA微囊化ES细胞;将微囊化ES细胞加入到ES生长培养基中,置37℃,空气中含体积5%CO2的培养箱内培养,每2-3天定期更换培养基,即为干细胞体外增殖分化的微环境。本发明操作简单,既能实现ES细胞体外的高密度培养和规模化扩增,同时又能抑制或者延缓ES细胞走向分化,即最大限度的维持ES细胞未分化潜能的技术方法。本发明不但能实现干细胞在体外的规模化扩增,还可为干细胞与其它转基因细胞的共培养研究提供理想的试验模型,在基础发育生物学和下游的临床应用研究中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞组织工程领域,具体地说是一种构建干细胞体外增殖分化微环境的方法。
背景技术
胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)是一类源于囊胚时期内细胞团的特定细胞群,兼具有自我更新及全向分化的潜能,即在合适的体内或体外条件下,能够分化为内、中、外三个不同胚层的细胞。1981年,小鼠ES细胞的成功分离建系揭开了干细胞研究的序幕[文献1:Evans MJ,Kaufman MH.Establishment in culture of pluripotential cells from mouseembryos.Nature,1981;292(5819):154-156.]。继之,ESC定向诱导分化成为国内外共同关注的热点。目前有关ES细胞定向诱导分化的研究日趋深入:横向扩展至向神经元、心肌细胞、内皮细胞、造血细胞、肝前体细胞以及胰岛素分泌细胞等多种细胞的诱导分化,纵向已深入至基因调控、信号转导等方面的机制探讨。该领域成果不但为发育生物学提供了宝贵的体外研究模型,而且还可能为细胞治疗提供理想的种子细胞。尽管如此,若要将ES细胞真正应用于临床治疗,尚存在诸多不可回避的难题。包括:(一)如何实现ES细胞在体外培养扩增的同时仍维持其最佳的未分化状态即多向分化潜能?(二)如何标准化ES细胞定向诱导分化操作规则;如何提高定向分化率以及如何实现ES源目的细胞的分离纯化?可以说,上述两个方面的研究相辅相承,而前者又在很大程度上制约着后者的深入,因此问题(一)已成为干细胞相关研究中的重要瓶颈问题。
目前,在体外培养过程中维持ES细胞进行自我更新的途径包括[文献2:Smith AG,Heath JK,Donaldson DD,et al.Inhibition of pluripotentialembryonic stem cell differentiation by purified polypeptides.Nature,1988,336:688-690]:(1)添加细胞因子-LIF,即白血病抑制因子;(2)将具有分泌LIF功能的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为饲养层细胞,与ES细胞共同培养;(3)建立转染有未分化维持基因(Oct-3/4)的ES细胞株。但上述途径分别存在如下问题:(1)细胞因子LIF的商品价格昂贵,不但增加了ES细胞维持培养条件的苛刻性,而且也大大限制了ES细胞规模化扩增的广泛开展。(2)饲养层细胞的制备对取材来源要求较高(孕13.5天的孕鼠),操作复杂,且每次传代均需要经丝裂霉素预处理的饲养层细胞。(3)真核细胞转基因操作较为复杂,且外源基因的表达不稳定易于在增殖传代过程中发生丢失。因此,国内外学者仍在努力探索其他途径以期实现ES细胞在体外培养扩增的同时仍维持其最佳分化潜能[文献3:Magyar JP,NemirM,Ehler E,Suter N,Perriard JC,Eppenberger H.Mass production of embryoidbodies in microbeads.Ann N Y Acad Sci,2003,944:135-143]。2004年3月,《cell》曾发表文章:强调在干细胞的增殖与分化的动态调节过程中,所有外源性和内源性的影响因素共同构建了干细胞所处的微环境。微环境因素间复杂的相互作用在决定干细胞的命运方面起着重要作用[文献4:Fuchs E,Tumbar T,Guasch G.Socializing with the neighbors:stem cells and their niche.Cell,2004,116:769-778;文献5:Spradling A,Drummond-Barbosa D,Kai T.Stem cells find their niche.Nature,2001,414:98-104]。但近年相关报道多集中于成体干细胞的体内诱导分化方面,有关ES细胞的研究甚少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单的构建干细胞体外增殖分化微环境的方法,其既能实现ES细胞体外的高密度培养和规模化扩增,同时又能抑制或者延缓ES细胞走向自发性分化的实验方法。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:以海藻酸钠,聚赖氨酸为材料,将小鼠胚胎干细胞与少量饲养层细胞进行微囊化共培养,这样既能实现ES细胞体外的高密度培养和规模化扩增,同时又利用APA(alginate-poly-lysine-alginate,APA)微胶囊所特有的理化性质及其营造的特殊培养环境,最大限度的抑制或者延缓ES细胞走向分化。
一种构建干细胞体外增殖分化微环境的方法,以海藻酸钠,聚赖氨酸为材料,制备APA微囊化ES细胞;将微囊化ES细胞加入到ES生长培养基中,置37℃,空气中含体积5%CO2的培养箱内培养,每2-3天定期更换培养基;其以APA微胶囊内部的海藻酸钠凝胶作为干细胞生长的良好基质,促进ES细胞增殖。并利用APA微胶囊所提供的限制性生长空间,将与干细胞共培养的饲养层细胞共同包被入APA微囊。由此,在微囊微环境下,ES细胞与饲养层细胞呈三维直接接触,可能延迟ES细胞在体外的自发性分化进程,同时也可以实现采用规模化细胞培养系统进行干细胞的规模化扩增。
所述制备APA微囊化ES细胞的方法为静电液滴发生法,具体步骤如下,
①通过微胶囊制备仪,将均匀混合有ES细胞的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下滴入钙溶液中,得到海藻酸钙凝胶珠;
②将海藻酸钙凝胶珠与聚赖氨酸溶液反应成膜,形成非液化的海藻酸钠/聚赖氨酸微囊膜,反应成膜时间为8-15分钟,膜厚在5-50μm范围内;再与海藻酸钠溶液反应;最后用柠檬酸钠液化,于是便得到海藻酸钠/聚赖氨酸半透膜包封的内部为液态环境的APA微胶囊;
所述海藻酸钠的w/v浓度为1.5%-1.8%;钙溶液中钙离子浓度为0.05-0.3mol/L;聚赖氨酸浓度(W/V)为0.05-0.1%,海藻酸钙胶珠与聚赖氨酸溶液的体积比为1∶10;柠檬酸钠溶液浓度在0.01-0.10mol/L;ES细胞存活率>96%,ES细胞含量150-200 cells/个微胶囊,微胶囊粒径可在400-600μm精确可控。
微胶囊粒径是通过控制微胶囊制备仪的操作条件来调整的,其操作条件为:电压50-75V、频率120-140Hz、泵速5.08-15.9ml/h、针头孔径4#-7#。
所述干细胞(细胞类型)为多来源胚胎干细胞或各种成体干细胞。
所述培养的培养时间3-10天,培养基的种类根据所选定的ES细胞确定,例如:小鼠来源ES细胞采用H-DMEM培养基(含15%FCS+1%非必需氨基酸UAA+0.1mmol/L β-Me+103U/ml LIF),人源ES细胞采用KnockOutDMEM培养基(含20 KnockOut SR+1mmol/L glutamine+1%UAA+0.1mmol/Lβ-Me+103U/ml LIF+4ng/ml bFGF)。
本发明具有如下优点:
1.操作简单,实现ES细胞体外的高密度培养和规模化扩增。本发明基于APA微胶囊内部的海藻酸钠凝胶是动物细胞的良好生长基质,利用APA微胶囊所提供的特殊微环境,不但能够维持干细胞的生物活性,而且可促进ES细胞在微囊内显著增殖,本发明利用微囊化细胞培养的优势,将小鼠ES细胞进行APA微囊化培养并体外扩增,以获得足够数量的ES细胞进行相应的下游研究与应用;
2.抑制或者延缓ES细胞走向分化。本发明在微囊化制备的过程中,将与干细胞共培养的饲养层细胞共同包被,可以延缓或限制ES细胞在扩增过程中所发生的自发性分化。ES细胞与少量饲养层细胞在APA微囊所提供的特殊微环境内实现共培养,二者在三维空间内充分接触,由饲养层细胞分泌LIF因子既可直接作用于ES细胞,又可在局部实现浓度的暂态富集,加之APA微胶囊膜的控释性,上述因素均可加强饲养层对ES细胞的生物学作用,延长LIF对ES细胞的作用时间,最终达到抑制或减少小鼠ES细胞走向分化的目的;即APA微胶囊为ES细胞提供了一个限制性的生长空间和特殊的生长微环境,使该过程中ES细胞仍持续表达干细胞未分化标志蛋白及相关基因,表明微囊化ES在扩增过程中仍维持其未分化状态,或是ES细胞走向自发性分化的进程得以延缓。
3.实验操作温和、可控。本发明利用静电液滴法在生理条件下制备APA微囊化的小鼠胚胎干细胞,制备过程中对小鼠ES细胞的活性没有损害(对小鼠ES细胞活性没有影响);通过调整电压、频率、泵速及针头孔径,控制微囊直径大小在400-600μm之间,可以保证APA微囊内ES细胞的营养供应。
4.操作条件较为优化。①本发明采用的培养体系为具有良好生物相容性和培养基质作用的海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微胶囊,包括液化型与非液化型;通过比较不同微囊类型(包括液化型和非液化型)对ES细胞生长及代谢活性的影响,以筛选在体外培养的过程中更有利于ES细胞保持良好生长状态并显著增殖的微囊类型;
②本发明选择液化型APA微囊作为该发明的理想培养体系,检测微囊化ES细胞在体外培养的过程中,在不添力LIF因子的情况下,囊内ES细胞未分化状态的蛋白(阶段特异性抗原SSEA-1,碱性磷酸酶AP)及基因(Oct-4)的表达情况;
③明确微囊内ES细胞在体外长期培养过程中(近2-3周)持续保持其未分化潜能。
5.应用范围广。本发明方法可用于胚胎干细胞的体外规模化扩增;APA微囊膜具有免疫隔离效用,可应用于干细胞体内定位移植及相关的诱导分化研究,而无需应用价格昂贵的裸鼠;本发明培养体系可用于干细胞与其它细胞(包括基因工程化细胞)的共培养研究;本发明APA微囊化干细胞还为研究体内微环境对干细胞增殖及分化及相互作用的影响提供了理想的模型。
总之,本发明既能实现ES细胞体外的高密度培养和规模化扩增,同时又能抑制或者廷缓ES细胞走向分化,即在体外培养扩增过程中最大限度的维持ES细胞未分化潜能。在APA微囊化ES细胞的制备过程中,不需要去除饲养层细胞,使之以干细胞共培养于微囊内。由于具备上述优点,使得该实验方法在基础发育生物学和下游的临床应用研究中将发挥重要作用。
附图说明
图1为不同类型APA微囊内小鼠胚胎干细胞的体外生长曲线;APA微囊化ES细胞经过体外培养后,每个微囊内细胞可增殖至初始接种数量的数十至数百倍。比较非液化型,液化型APA微胶囊更适合ES细胞的生长增殖。
图2为APA微囊化小鼠胚胎干细胞体外培养2周(100×,OLYMPUS);APA微囊化ES细胞经过体外培养1.5-2周后,ES细胞增殖为细胞球,每个微囊内细胞数量约为初始接种密度的数十至数百倍(附图2);
图3为H&E染色显示APA微囊内小鼠胚胎干细胞的生长形态(200×);APA微囊化小鼠胚胎干细胞体外培养样品制备为石蜡切片,经H&E染色进行初步形态学观察,APA微囊内ES细胞增殖良好,中央未出现因养分传质障碍所导致的细胞坏死区;
图4为免疫组织化学技术检测体外培养的APA微囊化ES表达AP蛋白;APA微囊化小鼠胚胎干细胞体外培养3周,免疫组织化学检测AP表达阳性(200×,OLYMPUS),微囊化ES细胞经体外培养22天后,在不添力LIF因子的条件下,微囊内ES细胞仍能不同程度的表达标志性蛋白---AP蛋白;
图5为免疫荧光检测体外培养的APA微囊化ES细胞表达SSEA-1蛋白;
微囊化ES细胞经体外培养22天后,在不添加LIF因子的条件下,微囊内ES细胞仍能不同程度的表达标志性蛋白---SSEA-1,APA微囊化小鼠胚胎干细胞体外培养3周,免疫荧光检测SSEA-1表达阳性(Leica):红色为PI复染细胞核;
图6为RT-PCR方法检测转录因子Oct-4在体外培养的微囊化ES细胞中的表达情况;RT-PCR检测体外培养的APA微囊化ES细胞表达Oct-4基因,β-actin作为内参基因,Marker为DL2000;微囊化ES细胞经体外培养的第14和第22天,在不添力LIF因子的条件下,微囊内ES细胞仍能不同程度的表达标志性基因---Oct-4。
具体实施方式
试剂:海藻酸钠(Sigma),聚赖氨酸(Sigma),单克隆抗体SSEA-1(SantaCruz),碱性磷酸酶AP(Zhongshan),RI-PCR试剂盒(Takara);
ES细胞生长培养基:H-DMEM培养基(Gibico)+15%胎牛血清+1%非必需氨基酸+0.1mmol/Lβ-巯基乙醇(β-Me)+103U/ml LIF;
仪器:CO2细胞培养箱,相差显微镜,静电液滴发生器,酶标仪,紫外分光光度计,激光共聚焦显微镜,搅拌式生物反应器(B.Braun);
细胞模型:小鼠胚胎干细胞系ES-D3(北京大学医学部提供);
具体方法:
1.ES-D3细胞以生长培养基在体外进行维持培养。经0.25%胰蛋白酶消化并收集后,调整细胞密度4×106cells/ml。利用静电液滴发生法,在生理条件下制备出APA微囊化小鼠ES细胞,具体制备条件为:5#国产注射器针头,电压70V,频率120Hz,泵速8.9ml/h,pH6.0-7.4,20-37℃,1个大气压,无震荡及剪切。操作过程为:将ES细胞与1.5%(W/V)海藻酸钠溶液混合后,将该细胞悬液经注射器泵滴入100mmol/L Cacl2溶液中钙化20min,得到海藻酸钙凝胶珠。将海藻酸钠凝胶珠与0.05%(W/V)的聚赖氨酸(PLL)反应成膜12min,形成非液化的海藻酸钠/聚赖氨酸微囊膜,再与0.15%(W/V)海藻酸钠溶液反应3min,最后用55mmol/L柠檬酸钠液化5min,于是便得到海藻酸钠/聚赖氨酸半透膜包封的内部为液态环境的APA微胶囊。
2.将上述制备的微囊化ES细胞用培养基洗涤3次,然后按1∶10的体积比(微胶囊∶培养基)加入ES生长培养基(不含有LIF),置37℃,空气中含体积5%CO2的培养箱内培养,每2-3天定期更换培养基。体外培养试验分组:i)液化微囊组ii)非液化微囊组,对比不同微囊环境对干细胞生长的影响,筛选ES细胞生长的理想条件。
3.APA微囊化ES细胞在体外培养的过程中,定期观察细胞生长情况,并每隔24小时取样,利用MTT方法检测微囊内细胞的活性,绘制细胞活性曲线。
4.收集上述微囊化ES细胞的样品,PBS溶液清洗2遍,4%甲醛室温下固定。经梯度脱水,石蜡包埋,制备石蜡切片。经H&E染色进行初步形态学观察,明确ES细胞在APA微囊内增殖情况。
5.将上述制备的石蜡切片进行脱蜡处理,利用免疫组织化学和免疫荧光技术检测分别与抗小鼠单克隆抗体AP及SSEA-1孵育,检测其未分化标志蛋白的表达情况。
6.收集微囊化干细胞样品,机械法破碎微囊并分离细胞,Trizol裂解也提取细胞样品总RNA,利用RT-PCR方法检测样品内未分化基因Oct-4的表达情况。
7.将上述制备的微囊化ES细胞在搅拌式细胞培养反应器中扩增培养2周,计算机控制并实时监测细胞生长情况,计算细胞活性率。
实验结果:
①APA微囊化小鼠ES细胞是利用静电液滴发生器在生理条件下制备,制备过程中对ES细胞活性损害<4%;
②ES细胞含量150-200 cells/个微胶囊,微胶囊粒径可在400-600μm精确可控。
③APA微囊化ES细胞经过体外培养后,每个微囊内细胞可增殖至初始接种数量的数十至数百倍。比较非液化型,液化型APA微胶囊更适合ES细胞的生长增殖(附图1)。
④APA微囊化ES细胞经过体外培养1.5-2周后,ES细胞增殖为细胞球,每个微囊内细胞数量约为初始接种密度的数十至数百倍(附图2)。
⑤收集上述微囊化ES细胞的样品,制备为石蜡切片,经H&E染色进行初步形态学观察,APA微囊内ES细胞增殖良好(附图3)。
⑥利用免疫组织化学和免疫荧光技术检测其未分化标志蛋白的表达情况,结果表明:体外培养22天后,微囊内ES细胞仍能不同程度的表达SSEA-1,AP(附图4,附图5)。
⑦在APA微囊化ES细胞体外培养的过程中,通过机械法破囊收获囊内细胞标本,利用RT-PCR方法检测到未分化基因Oct-4的表达水平在整个培养扩增的过程中未发生显著下调(附图6)。
⑧微囊化ES细胞可以在细胞培养反应器内规模化培养,扩增,细胞生长状态理想。培养2周后,细胞存活率>85%。
⑨上述结果表明:小鼠ES细胞经APA微囊化培养后能够实现一定规模的体外扩增,而在该增殖过程中,ES细胞仍能维持其未分化状态,或者也可以说是ES细胞走向自发性分化的进程得以延缓。
Claims (5)
1.一种构建干细胞体外增殖分化微环境的方法,其特征在于:以海藻酸钠,聚赖氨酸为材料,制备APA微囊化ES细胞;将微囊化ES细胞加入到ES生长培养基中,置37℃,空气中含体积5%CO2的培养箱内培养,每2-3天定期更换培养基,即为干细胞体外增殖分化的微环境。
2.按照权利要求1所述构建干细胞体外增殖分化微环境的方法,其特征在于:
所述制备APA微囊化ES细胞的方法为静电液滴发生法,具体步骤如下,
①通过微胶囊制备仪,将均匀混合有ES细胞的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下滴入钙溶液中,得到海藻酸钙凝胶珠;
②将海藻酸钙凝胶珠与聚赖氨酸溶液反应成膜,形成非液化的海藻酸钠/聚赖氨酸微囊膜,反应成膜时间为8-15分钟,膜厚在5-50μm范围内;再与海藻酸钠溶液反应;最后用柠檬酸钠液化,于是便得到海藻酸钠/聚赖氨酸半透膜包封的内部为液态环境的APA微胶囊;
所述海藻酸钠的w/v浓度为1.5%-1.8%;钙溶液中钙离子浓度为0.05-0.3mol/L;聚赖氨酸的W/V浓度为0.05-0.1%,海藻酸钙胶珠与聚赖氨酸溶液的体积比为1∶10;柠檬酸钠溶液浓度在0.01-0.10mol/L;ES细胞存活率>96%,ES细胞含量150-200cells/个微胶囊,微胶囊粒径可在400-600μm精确可控。
3.按照权利要求1所述构建干细胞体外增殖分化微环境的方法,其特征在于:微胶囊粒径是通过控制微胶囊制备仪的操作条件来调整的,其操作条件为:电压50-75V、频率120-140Hz、泵速5.08-15.9ml/h、针头孔径4#-7#。
4.按照权利要求1所述构建干细胞体外增殖分化微环境的方法,其特征在于:所述干细胞为多来源胚胎干细胞或各种成体干细胞。
5.按照权利要求1所述构建干细胞体外增殖分化微环境的方法,其特征在于:所述培养的培养时间3-10天,培养基的种类根据所选定的ES细胞确定。
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---|---|---|---|
CNA2005100476894A CN1962855A (zh) | 2005-11-11 | 2005-11-11 | 一种构建干细胞体外增殖分化微环境的方法 |
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Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1962855A (zh) |
Cited By (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101381701B (zh) * | 2007-09-07 | 2011-04-06 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种体外扩增造血干细胞的方法 |
CN102101037A (zh) * | 2009-12-18 | 2011-06-22 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 海藻酸盐/ε-聚赖氨酸/海藻酸盐生物微胶囊的制备 |
US8202701B2 (en) | 2004-10-08 | 2012-06-19 | Georgia Tech Research Corporation | Microencapsulation of cells in hydrogels using electrostatic potentials |
CN102747029A (zh) * | 2012-07-30 | 2012-10-24 | 何伟 | 一种视网膜祖细胞培养方法及其培养基 |
CN103849593A (zh) * | 2012-12-06 | 2014-06-11 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种磁分离式细胞三维共培养方法 |
CN104450605A (zh) * | 2014-11-26 | 2015-03-25 | 荆东辉 | 一种液体微胶囊包埋、分化全能干细胞成心肌细胞的方法 |
CN106190961A (zh) * | 2016-07-27 | 2016-12-07 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | 诱导干细胞体外定向分化的方法 |
WO2018195400A1 (en) * | 2017-04-20 | 2018-10-25 | Victory Innovations Company | Electrostatic stem cell fluid delivery system |
CN108753692A (zh) * | 2018-05-03 | 2018-11-06 | 佛山科学技术学院 | 一种鸡胚原始生殖细胞的3d培养方法 |
US10322424B2 (en) | 2015-12-21 | 2019-06-18 | Victory Innovations Company | Electrostatic fluid delivery backpack system |
US10589298B2 (en) | 2014-09-04 | 2020-03-17 | Victory Innovations Company | Electrostatic fluid delivery system |
CN111621493A (zh) * | 2020-06-10 | 2020-09-04 | 航天中心医院 | 可裂解细胞微囊及其制备方法和细胞培养方法 |
CN112342190A (zh) * | 2019-07-22 | 2021-02-09 | 陈传果 | 一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用 |
CN113201525A (zh) * | 2021-04-12 | 2021-08-03 | 清华大学深圳国际研究生院 | 干细胞微球组及干细胞的体外扩增方法和应用 |
-
2005
- 2005-11-11 CN CNA2005100476894A patent/CN1962855A/zh active Pending
Cited By (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8202701B2 (en) | 2004-10-08 | 2012-06-19 | Georgia Tech Research Corporation | Microencapsulation of cells in hydrogels using electrostatic potentials |
CN101381701B (zh) * | 2007-09-07 | 2011-04-06 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种体外扩增造血干细胞的方法 |
CN102101037A (zh) * | 2009-12-18 | 2011-06-22 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 海藻酸盐/ε-聚赖氨酸/海藻酸盐生物微胶囊的制备 |
CN102101036A (zh) * | 2009-12-18 | 2011-06-22 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 海藻酸盐-ε-聚赖氨酸微胶囊及其制备和应用 |
CN102101037B (zh) * | 2009-12-18 | 2013-09-18 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 海藻酸盐/ε-聚赖氨酸/海藻酸盐生物微胶囊的制备 |
CN102747029A (zh) * | 2012-07-30 | 2012-10-24 | 何伟 | 一种视网膜祖细胞培养方法及其培养基 |
CN103849593A (zh) * | 2012-12-06 | 2014-06-11 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种磁分离式细胞三维共培养方法 |
CN103849593B (zh) * | 2012-12-06 | 2016-08-10 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种磁分离式细胞三维共培养方法 |
US10994291B2 (en) | 2014-09-04 | 2021-05-04 | Victory Innovations Company | Electrostatic fluid delivery system |
US11623231B2 (en) | 2014-09-04 | 2023-04-11 | Octet Medical, Inc. | Electrostatic fluid delivery system |
US10589298B2 (en) | 2014-09-04 | 2020-03-17 | Victory Innovations Company | Electrostatic fluid delivery system |
CN104450605A (zh) * | 2014-11-26 | 2015-03-25 | 荆东辉 | 一种液体微胶囊包埋、分化全能干细胞成心肌细胞的方法 |
US10322424B2 (en) | 2015-12-21 | 2019-06-18 | Victory Innovations Company | Electrostatic fluid delivery backpack system |
CN106190961A (zh) * | 2016-07-27 | 2016-12-07 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | 诱导干细胞体外定向分化的方法 |
WO2018195400A1 (en) * | 2017-04-20 | 2018-10-25 | Victory Innovations Company | Electrostatic stem cell fluid delivery system |
CN108753692B (zh) * | 2018-05-03 | 2021-09-28 | 佛山科学技术学院 | 一种鸡胚原始生殖细胞的3d培养方法 |
CN108753692A (zh) * | 2018-05-03 | 2018-11-06 | 佛山科学技术学院 | 一种鸡胚原始生殖细胞的3d培养方法 |
CN112342190A (zh) * | 2019-07-22 | 2021-02-09 | 陈传果 | 一种提高间充质干细胞外泌体产量的方法及其应用 |
CN111621493A (zh) * | 2020-06-10 | 2020-09-04 | 航天中心医院 | 可裂解细胞微囊及其制备方法和细胞培养方法 |
CN113201525A (zh) * | 2021-04-12 | 2021-08-03 | 清华大学深圳国际研究生院 | 干细胞微球组及干细胞的体外扩增方法和应用 |
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