CN101381701B

CN101381701B - 一种体外扩增造血干细胞的方法

Info

Publication number: CN101381701B
Application number: CN2007100127638A
Authority: CN
Inventors: 马小军; 李双月; 王为; 于炜婷
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2007-09-07
Filing date: 2007-09-07
Publication date: 2011-04-06
Anticipated expiration: 2027-09-07
Also published as: CN101381701A

Abstract

本发明涉及一种体外扩增造血干细胞的方法，包括单个核细胞的分离；微囊化单个核细胞的制备和培养；造血干细胞的扩增。本发明不但能实现造血干细胞的有效扩增，还能进行规模化培养，从而推动了血液生物学和临床应用研究的发展。

Description

一种体外扩增造血干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种三维条件下扩增造血干细胞的技术方法，具体地说制备微囊化单个核细胞，利用微胶囊及微囊化材料自身的理化性质促进基质细胞生成，实现造血干细胞与同源基质细胞三维共培养，基质细胞同时分泌细胞外基质和细胞因子，在微胶囊内共同构成类造血微环境，在仅用少量细胞因子的情况下，抑制/延缓造血干细胞走向分化，并促进造血干细胞的有效扩增。

背景技术

造血干细胞在临床上有广泛的应用前景，它在血液系统疾病、实体瘤、免疫缺陷病、遗传性疾病、自身免疫性疾病等的支持治疗、免疫治疗、替代治疗及基因治疗中具有广泛的用途。但造血干细胞移植在实际应用中存在数量限制的问题，需要在控制分化的基础上进行规模化扩增。目前，模拟体内造血微环境被认为是体外扩增造血干细胞的最佳方法之一。

造血微环境是由基质细胞、基质细胞分泌的细胞外基质和细胞因子构成的三维空间。体外模拟造血微环境的方法包括：(1)在三维支架上培养造血细胞；(2)与基质细胞共培养；(3)添加造血细胞因子。但上述途径分别存在如下问题：(1)培养规模难以放大，不能满足临床使用要求；(2)异源性基质细胞及建系的基质细胞与造血干细胞共培养，可能存在免疫排斥问题，而同源基质细胞的制备过程繁琐，需要较长时间；(3)单用细胞因子不能维持体外长期造血，而且细胞因子用量大，费用昂贵，大大限制了造血干细胞的大规模扩增。因此，需要发展一种三维培养体系，不但能免除同源基质细胞的制备过程，而且仅需少量或者不需添加细胞因子就能扩增出大量造血干细胞。

基于造血干细胞的不对称分裂原则，起始培养细胞中尽可能多的保留造血干细胞是体外扩增的关键。而造血干细胞从单个核细胞中分离、纯化时不可避免的会发生部分丢失，且高度纯化的造血干细胞完全失去其他辅助细胞，不仅导致增殖能力的降低，移植物抗白血病及移植物抗宿主效应也会发生变化。所以，以单个核细胞为起始培养细胞是最佳的选择。

本专利提出：以海藻酸钠-聚赖氨酸(alinate-polylysine，AP)为复合材料、根据单个核细胞来源及初始单个核细胞中CD34⁺细胞数量确定制备工艺及材料选择，制备微囊化单个核细胞，并利用微胶囊膜对生物分子的选择性通透作用、海藻酸钠的理化性质和微胶囊内的渗透压胁迫等微环境，促进基质细胞生成，实现造血干细胞与同源基质细胞的三维共培养。由于微胶囊膜的截留特性，基质细胞分泌的细胞外基质将聚集在微胶囊内，细胞因子在微胶囊内也会实现暂态高浓度，这样就可以少用或不用细胞因子实现造血干细胞的有效扩增。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、成本低廉、可规模化的造血干细胞体外扩增方法，其将在血液生物学和临床应用研究中发挥重要作用。该方法可以利用微胶囊的特定理化性质模拟造血微环境，实现造血干细胞与多种细胞(如：基质细胞、转基因细胞)三维共培养，有效扩增造血干细胞。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为；

一种体外扩增造血干细胞的方法，以海藻酸钠、聚赖氨酸为复合材料，采用挤出/外部凝胶化法制备AP微囊化单个核细胞；将微囊化单个核细胞加入到扩增培养基中，置37℃、空气中含体积5％CO₂的培养箱中培养，每2-3天定期更换培养基，即为造血干细胞扩增体系。

具体为：

1)单个核细胞的分离：采用密度梯度离心法，用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心分离脐血或骨髓中的单个核细胞；其中含有占总细胞个数0.7-3.1％的CD34⁺细胞；

2)微囊化单个核细胞的制备：

A.将β-L-古洛糖醛酸重量含量30-40％、α-D-甘露糖醛酸重量含量为6 0-70％的海藻酸钠配制成1.0-3.0％w/v海藻酸钠溶液I；

将β-L-古洛糖醛酸重量含量60-70％、α-D-甘露糖醛酸重量含量为30-40％的海藻酸钠配制成0.8-2.5％w/v海藻酸钠溶液II；

将海藻酸钠溶液I和海藻酸钠溶液II按1∶5-5∶1体积比例混合，得海藻酸钠溶液III；

B.将单个核细胞重悬于海藻酸钠溶液III中，每ml溶液中含有细胞8×10⁵-2×10⁷个；

C.采用挤出/外部凝胶化法将海藻酸钠细胞悬液加入pH＝7.0-7.4质量浓度0.8-1.6％氯化钙的水溶液中，获得直径大小在300-500μm之间的海藻酸钙胶珠；

将海藻酸钙凝胶珠与聚赖氨酸溶液反应成膜，聚赖氨酸的分子量20-35Mw、w/v浓度为0.04-0.1％，聚赖氨酸溶液与海藻酸钙胶珠的体积比为8-14∶1，反应成膜时间为5-20min，膜厚在5-50μm范围内；得到非液化的微胶囊；

将50-100μM柠檬酸钠溶液按体积比8-14∶1加入非液化的微胶囊中，静置3-8分钟；得到海藻酸钠/聚赖氨酸半透膜包封的内部为液态环境的液化微胶囊；

3)将微胶囊按体积比1∶8-15置于扩增培养基中培养，单个核细胞能够在微胶囊内存活，并发生显著增殖；

扩增培养基为于IMDM培养液中添加：2-5ng/ml白介素-3，15-25ng/ml干细胞因子，5-10ng/ml人FLT-3配体，1.2-2.5ng/ml血小板生成因子，终体积浓度10％胎牛血清，pH＝7.0-7.2。

当所述挤出/外部凝胶化法为静电液滴发生法时，通过控制微胶囊制备仪的操作条件来调整微胶囊粒径，其操作条件为：电压40-85v、频率100-160Hz、泵速5-16ml/小时、针头孔径4-8#。

单个核细胞为人、鼠等多来源单个核细胞，如人脐血、人骨髓或鼠骨髓。

培养时间5-15天，扩增培养基的组成根据所选定的单个核细胞来源及初始单个核细胞中CD34⁺细胞数量确定。

为满足造血干细胞扩增对物质扩散和三维生长环境等的特殊要求，本专利提出以海藻酸钠、聚赖氨酸为材料，制备AP微胶囊，包括液化型与非液化型；并采用单个核细胞，包括人、鼠等细胞来源；

根据单个核细胞来源及初始单个核细胞中CD34⁺细胞数量采用海藻酸钠组合配置，按照海藻酸钠基质强度、与膜材料交联程度及物质传递等标准，确定海藻酸钠浓度、海藻酸钠β-L-古洛糖醛酸与α-D-甘露糖醛酸比例及聚赖氨酸的分子量和成膜时间，采用静电液滴发生法、气流喷射法等挤出/外部凝胶化方法对单个核细胞进行微囊化包封，制备微囊化单个核细胞并培养，以有效扩增造血干细胞。

经过培养，微胶囊内部分单个核细胞生成基质细胞，实现造血干细胞与同源基质细胞共培养，基质细胞同时分泌细胞因子和细胞外基质，在微胶囊内共同形成类造血微环境的三维结构，在仅用少量细胞因子的情况下，抑制/延缓造血干细胞走向分化，有效扩增造血干细胞，并可实现规模化培养；细胞存活率＞96％，细胞含量180-250 cells/个微胶囊，微胶囊粒径可在300-500μm精确可控；

与已有的造血干细胞扩增方法相比，本发明有其明显的优势：第一，微囊化细胞可以实现规模化制备和规模化培养，在培养规模上可以满足临床使用要求；第二，APA微胶囊及材料的特殊理化性质可以促进基质细胞生成，免除基质细胞繁琐的制备过程，实现造血干细胞与同源基质细胞微胶囊内的三维共培养；第三，在微胶囊的三维空间内，造血干细胞和基质细胞充分接触，基质细胞分泌的细胞因子和细胞外基质既可直接作用于造血干细胞，又可在局部实现暂态富集，加之微胶囊膜的控释性，大大增强了滋养成份在三维空间中对造血干细胞的生物学作用，从而大大减少细胞因子用量，降低成本。因此，在仅用少量或不用细胞因子的情况下，利用微胶囊包封、培养单个核细胞，在抑制或延缓造血干细胞走向分化的同时，可以实现造血干细胞有效和规模化扩增。

本发明具有操作方便、简单、细胞活性高、可规模化生产的优点。

附图说明

图1是本发明实施例的相差显微镜照片(bar＝100um)，可见AP微囊化单个核细胞经培养7天后可形成三维细胞聚集体；

图2为本发明实施例1的共聚焦显微镜照片；单个核细胞微囊化包封(day 0)和培养后(day 15)的死活染色照片(bar＝80μm)，可见微囊化包封及培养过程对细胞活性无影响(中间部位的绿色代表活细胞)；

图3为本发明实施例1的不同细胞载量的微囊化单个核细胞的增殖曲线A和代谢曲线B，可见随体外培养时间的延长，细胞逐渐增多，乳酸生成增多；

图4为本发明实施例1的微囊化单个核细胞HE染色照片(bar＝80μm)。可见微胶囊内的细胞聚集体结构松散，细胞外有明显(嗜酸红染)的细胞外基质；

图5为本发明实施例1微囊化单个核细胞CD45染色的免疫荧光共聚焦图片(bar＝100um)。A为CD45染色阳性细胞，B为同一部位的光镜照片，C为A和B的叠加。C图显示微胶囊内叠加部位(红染部位)为造血细胞，未叠加部位(非红染部位)为基质细胞。可见微胶囊内的细胞聚集体中，大部分为造血细胞，小部分为基质细胞(A和B叠加部位为造血细胞，未叠加部位为基质细胞)。

具体实施方式

实施例1

一种体外扩增造血干细胞的方法，

1)单个核细胞的分离：

人脐带血中的有核细胞的获取：将重量浓度0.125％的甲基纤维素溶液按4∶1的体积比加入人的脐带血中，室温静置，沉降红细胞；取上清液1500rpm/min离心，沉降物即有核细胞。

密度梯度离心，将密度为1.077/ml的Ficoll淋巴细胞分离液按1∶1的体积比加于有核细胞上，1500rpm/mim，30min，吸取中间层的单个核细胞；其中含有CD34⁺细胞的数量为细胞总个数的0.9％；PBS洗涤(1500rpm/min，5min)后调整细胞密度待用。

2)微囊化单个核细胞的制备：

A.将β-L-古洛糖醛酸重量含量31.2％、α-D-甘露糖醛酸重量含量为68.8％的海藻酸钠配制成1.5％w/v海藻酸钠溶液I；

将β-L-古洛糖醛酸重量含量66％、α-D-甘露糖醛酸重量含量为34％的海藻酸钠配制成0.9％w/v海藻酸钠溶液II；

将海藻酸钠溶液I和海藻酸钠溶液II按5∶1体积比例混合，得海藻酸钠溶液III；

B.将单个核细胞均匀重悬于海藻酸钠溶液III中，每ml溶液中细胞为6×10⁶个；

C.采用静电液滴发生法，操作条件为：电压45v、频率120Hz、泵速8ml/小时、针头孔径5#，将海藻酸钠细胞重悬液滴入pH＝7.0-7.4质量浓度1.1％氯化钙的水溶液中，静置20分钟得海藻酸钙胶珠，胶珠直径300-400μm精确可控；

将分子量35Mw、w/v浓度0.05％的聚赖氨酸按体积比10∶1加入海藻酸钙胶珠中，成膜时间为10min，膜厚约25μm；得到非液化的微胶囊；

将55μM柠檬酸钠溶液按体积比10∶1加入非液化的微胶囊中，静置5分钟；收集液化的微胶囊；

采用静电液滴法在生理条件下制备AP微囊化单个核细胞，制备过程对细胞活性没有损害，如图2；

3)将液化的微胶囊按体积比1∶10置于扩增培养基中，37℃扩增15天，单个核细胞能够在微胶囊内存活，并发生显著增殖，如图3；

在APA微胶囊内培养过程中，部分单个核细胞借助微胶囊及材料的特殊理化性质生成基质细胞，如图5，基质细胞分泌细胞外基质和细胞因子，共同在微胶囊内构建三维造血微环境，促进造血干细胞在体外的有效扩增。

扩增培养基为于IMDM培养液中添加：3ng/ml白介素-3，20ng/ml干细胞因子，8ng/ml人FLT-3配体，1.8ng/ml血小板生成因子，终体积浓度10％胎牛血清，pH＝7.0-7.2。

造血干细胞在微胶囊内重构的造血微环境中实现高效扩增，即：在添加少量细胞因子的情况下，APA微囊化单个核细胞在体外培养7天后，CD34+细胞及集落形成细胞(CFU-C)的扩增倍数分别可达13倍和9倍。

采用本发明可以实现造血干细胞在体外的有效扩增，批量获得干细胞，满足组织工程研究中对种子细胞的需求。利用AP微胶囊的特定微环境，干细胞可与多种细胞(包括转基因细胞)实现共培养。

实施例2

一种体外扩增造血干细胞的方法，

1)单个核细胞的分离：

密度梯度离心，将密度为1.077/ml的Ficoll淋巴细胞分离液按1.5∶1的体积比加于人骨髓液上，1500rpm/mim，30min，吸取中间层的单个核细胞；其中含有CD34⁺细胞的数量细胞总个数的1.9％；PBS洗涤(1500rpm/min，5min)后调整细胞密度待用；

2)微囊化单个核细胞的制备：

A.将β-L-古洛糖醛酸重量含量37％、α-D-甘露糖醛酸重量含量为63％的海藻酸钠配制成1.0％w/v海藻酸钠溶液I；

将β-L-古洛糖醛酸重量含量62％、α-D-甘露糖醛酸重量含量为38％的海藻酸钠配制成2.5％w/v海藻酸钠溶液II；

将海藻酸钠溶液I和海藻酸钠溶液II按1∶1体积比例混合，得海藻酸钠溶液III；

B.将单个核细胞重悬于海藻酸钠溶液III中，每ml溶液中细胞为3×10⁶个；

C.将重悬液滴入pH＝7.0-7.4质量浓度0.9％氯化钙的水溶液中，静置15分钟得海藻酸钙胶珠，控制胶珠直径大小在300-500μm之间；

将分子量30WM、质量浓度0.07％的聚赖氨酸溶液按体积比12∶1加入海藻酸钙胶珠中，成膜时间为12min，膜厚约40μm范围；得到非液化的微胶囊；

将80μM柠檬酸钠溶液按体积比10∶1加入非液化的微胶囊中，静置6分钟；收集液化的微胶囊；

3)将液化的微胶囊按体积比1∶10置于扩增培养基中，37℃扩增15天，单个核细胞能够在微胶囊内存活，并发生显著增殖。

造血干细胞在微胶囊内重构的造血微环境中实现高效扩增，即：在添加极少量细胞因子的情况下，AC微囊化单个核细胞在体外培养6天后，CD34⁺细胞及集落形成细胞(CFU-C)的扩增倍数分别可达16.47倍和12.3倍。

采用本发明可以实现造血干细胞在体外的规模化培养，批量获得干细胞，满足组织工程研究中对种子细胞的需求；利用AC微胶囊的特定微环境，干细胞可与多种细胞(包括基质细胞、转基因细胞)实现共培养。

Claims

1.一种体外扩增造血干细胞的方法，其特征在于：以海藻酸钠、聚赖氨酸为复合材料，采用挤出/外部凝胶化法制备AP微囊化单个核细胞；将微囊化单个核细胞加入到扩增培养基中，置37℃、空气中含体积5％CO₂的培养箱中培养，每2-3天定期更换培养基，即为造血干细胞扩增体系；

具体步骤如下，

1)单个核细胞的分离：用Ficoll淋巴细胞分离液密度梯度离心分离脐血或骨髓中的单个核细胞；

2)微囊化单个核细胞的制备：

A.将β-L-古洛糖醛酸重量含量30-40％、α-D-甘露糖醛酸重量含量为60-70％的海藻酸钠配制成1.0-3.0％w/v海藻酸钠溶液I；

将单个核细胞均匀重悬于海藻酸钠溶液III中，每ml溶液中含有细胞8×10⁵-2×10⁷个；

B.采用挤出/外部凝胶化法将海藻酸钠细胞重悬液加入pH＝7.0-7.4，质量浓度0.8-1.6％氯化钙的水溶液中，静置10-30分钟，获得直径大小在300-500μm之间的海藻酸钙凝胶珠；

将海藻酸钙凝胶珠与聚赖氨酸溶液反应成膜，海藻酸钙胶珠与聚赖氨酸溶液的体积比为1∶8-14，聚赖氨酸的分子量20-35WM、w/v浓度0.04-1.0％，反应成膜时间为5-20min，膜厚在5-50μm范围内，形成非液化的海藻酸钠/聚赖氨酸微胶囊；

将10-100μM柠檬酸钠溶液按体积比8-14∶1加入非液化的微胶囊中，静置3-8分钟，得到海藻酸钠/聚赖氨酸半透膜包封的内部为液态环境的液化微胶囊；

3)将液化的微胶囊按体积比1∶8-15置于扩增培养基中，扩增培养基为于IMDM培养液中添加：2-5ng/ml白介素-3，15-25ng/ml干细胞因子，5-10ng/ml人FLT-3配体，1.2-2.5ng/ml血小板生成因子，终体积浓度10％胎牛血清，pH＝7.0-7.4。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：当所述挤出/外部凝胶化法为静电液滴发生法时，通过控制微胶囊制备仪的操作条件来调整微胶囊粒径，其操作条件为：电压40-85v、频率100-160Hz、泵速5-16ml/小时、针头孔径4-8#。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述单个核细胞为人脐血、人骨髓或鼠骨髓中的单个核细胞。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养时间5-15天。