JP3021379B2 - ランゲルハンス細胞を含有する皮膚等価物 - Google Patents

ランゲルハンス細胞を含有する皮膚等価物

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規の皮膚等価物
（skin equivalent）、その製造方法、該皮膚等価物に
含まれる表皮等価物（epidermis equivalent）、および
その調製方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】機械的領域および生理学的領域の双方に
おける皮膚の役割を十分に理解するために必要な研究を
行うことを可能にする再生（reconstructed）皮膚モデ
ルを開発する試みが数年にわたってなされている。
【０００３】しかして、多かれ少なかれヒトの皮膚に似
たモデルを開発することは可能である。例えば、欧州特
許第２８５４７１号、欧州特許第２８５４７４号、欧州
特許第４１８０３５号、国際特許公開第９０／０２７９
６号、国際特許公開第９１１６０１０号、欧州特許第１
９７０９０号、欧州特許第２０７５３号、仏国特許第２
６６５１７５号、仏国特許第２６８９９０４号の特許ま
たは特許出願の公報に記載されているモデルを挙げるこ
とができる。
【０００４】これらの公報に記載されている最も一般的
な再生皮膚モデルは、ヒトのケラチン細胞（ケラチン合
成細胞、ケラチノサイト）が支持体上に、多くの場合は
真皮等価物（dermis equivalent）上に付着させられ、
表皮等価物の形成に至る分化プログラムになるような条
件下で培養されてなる。
【０００５】しかしながら、天然のヒトの表皮は、主と
して、最も多いケラチン細胞、メラニン細胞（メラニン
形成細胞、メラノサイト）、ランゲルハンス細胞の３種
の細胞からなる。これらの細胞の各々は、皮膚が体にお
いて担う固有の役割に、それ自身の機能をもって寄与し
ている。ランゲルハンス細胞は、皮膚の免疫防御に関与
している。これらの細胞が、ホストの免疫防御におい
て、特に外部からの攻撃に対する最初の障壁として、本
質的な位置を占めていることは永く公知である。
【０００６】ランゲルハンス細胞は、ビルベック（Birb
ech）顆粒の存在と、ＣＤ１ａ抗原標識［ＣＤ１ａ−正
細胞（positive cell）］の発現により特徴付けられ
る、骨髄に由来する細胞である［ローデン（Rowden）
ら、ネイチャー（Nature） 268:247-248、1977］。それ
らは、皮膚に浸入してきた抗原、またはそれにより生じ
た新たな抗原に対して免疫応答を開始するという重要な
役割を担っている。アレルゲンと接触すると、ランゲル
ハンス細胞は神経節に移動し、そこで、Ｔ細胞特異反応
を引き起こす。このようにして、Ｔリンパ球を正確に機
能させるのに必須である抗原供与細胞に同化する。
【０００７】このように、ランゲルハンス細胞の主な機
能は、接触アレルゲン、腫瘍抗原および微生物を含む、
多種の抗原に対して誘発される皮膚の免疫応答において
敏感な信号を発することである。
【０００８】よって、これらの細胞は、おそらく、多く
の皮膚病に関与しているであろうと結論付けることがで
きる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】国際特許公開第９０／
０２７９６号公報においては、新鮮な皮膚のサンプルか
ら単離されたランゲルハンス細胞を、皮膚の３次元培養
システムにおいて、メラニン細胞およびケラチン細胞の
培養に添加することが提案されている。同じ公報には、
このような細胞の培養における成長は困難であることが
記載されている。実際、皮膚サンプルから精製されたラ
ンゲルハンス細胞が、ＣＤ１ａ−陽性細胞（positive c
ells）になる点まで分化サイクルが進行した前駆体から
誘導された細胞であり、これらの単離された細胞では分
化サイクルがもはや進行しない場合がしかりである。
【００１０】このような細胞の in vitro における培養
は、これらの細胞の増殖能力の欠如のため、生存状態を
維持することが中心である。実際、これらの細胞は、そ
の役割を果たさないまま停止して死ぬ。これらの細胞
が、再生皮膚モデルに導入された場合も同様である。よ
って、この公報において、ランゲルハンス細胞の導入が
示唆されていたとしても、ランゲルハンス細胞が生存し
ていないため、得られた再生皮膚モデルは満足のいくも
のではなかった。
【００１１】メラニン細胞は、表皮の基底層に位置す
る。それらは、メラニン形成部位であり、ケラチン細胞
に接触しているため、メラノソームの形態で新たに合成
された（neosynthesized）メラニンをケラチン細胞に移
行させ、皮膚に色を付与する。メラノソームに含有され
るメラニンの種類および量により皮膚の色が決定され
る。さらに、メラニンは、主に、太陽光線、特に紫外線
に対する保護のための効果的なバリアを構成する。メラ
ニン細胞を組み込んだ再生皮膚モデルは国際特許公開第
９３５１１６５号に記載されている。
【００１２】よって、従来技術において記載されている
再生皮膚モデルでは、皮膚の反応および／または役割を
研究するには不完全であった。実際、これらのモデルで
は、ランゲルハンス細胞、すなわち、皮膚の免疫防御に
必須の細胞がないので、 invitro での免疫学の研究に
は使用することはできなかった。さらに、ランゲルハン
ス細胞が構成する皮膚の必須成分の欠如により、これら
のモデルで行われる薬理学および／または毒理学の研究
では、相互作用の真実の一部のみしか反映することがで
きなかったと思われる。
【００１３】いわゆる敏感肌および／またはアレルギー
肌に関連した症状に至る自然現象、すなわちこのような
モデルにより更に理解することができる現象に関係な
く、一般に産業、特に化粧品産業では、その組成物中へ
新規の化合物をますます多く導入しつつある。産業が直
面する大きな問題の１つは、これらの化合物が皮膚と接
触して誘発するかもしれない有害な影響、特に、接触性
感作（contact sensitization）の評価である。
【００１４】倫理上の理由から、この評価を、ヒトまた
は動物で行うことはできないことは明らかである。
【００１５】よって、皮膚の防御メカニズムを把握する
ことにより、いわゆる敏感肌および／またはアレルギー
肌に関与した症状をよりよく理解することができ、産業
上使用できる可能性がある化合物の有害な影響の評価を
行うことができる in vitroのモデルの価値が理解でき
る。
【００１６】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
しかして、永年にわたり、再生皮膚の分野に興味を抱い
ていた本出願人は、再生皮膚モデルに、ランゲルハンス
細胞の事前に誘導させたまたは誘導させていない前駆体
を少なくとも導入することが可能であることを見いだし
た。
【００１７】よって、本発明の主題は、支持体上に表皮
等価物を有し、該表皮等価物が少なくともケラチン細胞
と、少なくともランゲルハンス細胞の誘導または非誘導
前駆体を含有することを特徴とする再生皮膚モデルにあ
る。
【００１８】この明細書中において、「ランゲルハンス
細胞の誘導前駆体」なる表現は、正常なものであろうと
病的なものであろうと、共培養（co-culture）に配され
る前に、ランゲルハンス細胞の特徴を付与することを意
図した少なくとも１つの処理を受けた任意の細胞を含む
ものであり、すなわち、この細胞によるＣＤ１ａ−陽性
の取得等を前もって判断しないＣＤ１ａ−正細胞を含む
ものである。
【００１９】正常な皮膚において、ランゲルハンス細胞
は、表皮の上基底部（suprabasal part）に位置してい
る。
【００２０】好ましくは、本発明の再生皮膚モデルは、
表皮等価物の上基底部に位置する、ランゲルハンス細胞
の誘導または非誘導前駆体を少なくとも有する。
【００２１】本発明の皮膚等価物が、それに導入されう
る、他の任意の種類の細胞を含有してもよいことは明ら
かに理解される。
【００２２】本出願人は、支持体上に表皮等価物を有
し、該表皮等価物が、少なくともケラチン細胞と、少な
くともランゲルハンス細胞の誘導または非誘導前駆体を
含有する皮膚等価物を調製する方法を確立することに成
功した。
【００２３】また、本発明の主題は、ケラチン細胞と、
少なくともランゲルハンス細胞の誘導または非誘導前駆
体を、支持体上で共培養することを特徴とする、上述し
た皮膚等価物の調製方法にある。
【００２４】理解の容易のために、「共培養」という用
語（またはこれに関連した用語）の使用は、再生皮膚モ
デルの形成を許容する支持体上で行われる細胞培養を指
すものと解すべきであり、必ずしも一以上の細胞種が存
在することを意味するものではない。「培養」および
「培養する」という用語は、この場合、従来の方法、例
えば、伝統的な細胞培養皿においてなされる細胞培養に
関するものとして解される。
【００２５】本発明で使用される支持体は、従来から知
られているものの何れであってもよい。例えば、支持体
としては、コラーゲン／繊維芽細胞混合格子（lattice
s）、予め表皮が除去された真皮、人工膜、例えば、ミ
リポア（Millipore）（商標）のフィルター、コラーゲ
ンをベースとした皮下代用物、プラスティックまたは細
胞の生存に適した他の任意の支持体を挙げることができ
る。
【００２６】好ましくは、支持体は、予め表皮が除去さ
れた真皮からなる。
【００２７】選択される支持体が何であれ、本発明で使
用される手順は、従来から知られている任意の手順であ
ってよい。
【００２８】好ましくは、本発明において、支持体が予
め表皮が除去された真皮である場合は、プルニエラス
（Prunieras）らのAnn. Chir. Plast., 1979, 24, No.
4, 357-362に記載されている手順が使用される。
【００２９】本発明において、少なくともケラチン細胞
と、少なくともランゲルハンス細胞の誘導または非誘導
前駆体を含有する表皮等価物を得るために、少なくとも
ケラチン細胞と、少なくともランゲルハンス細胞の誘導
または非誘導前駆体を、支持体上で、一緒に共培養す
る。
【００３０】本発明で使用されるケラチン細胞は、従来
より公知の任意の方法で調製されうる。例えば、正常ま
たは病的な皮膚のサンプルに由来する分離した表皮の培
養、または正常または病的な髪の濾胞の鞘（sheath）か
ら得られたケラチン細胞の培養を挙げることができる。
【００３１】好ましくは、本発明で使用されるケラチン
細胞は、レグニアー（Regnier）らの、マトリックス生
物学の開拓（Frontier of Matrix Biology）、第9巻、4-
35［カーガー（Karger）, バーゼル（Basel） 1981］に
記載されている方法で、正常または病的な皮膚のサンプ
ルに由来する分離した表皮から調製される。
【００３２】ランゲルハンス細胞の前駆体は、誘導によ
ってランゲルハンス細胞に分化可能な任意の幹細胞、す
なわち、ＣＤ１ａ−陽性細胞への分化が可能な任意の幹
細胞であってよい。好ましくは、これらの前駆体は、Ｃ
Ｄ３４+造血（haematopoietic）細胞［コウクス（Cau
x）ら、ネイチャー、第３６０巻、1992年11月、258］で
あってもよい。
【００３３】ランゲルハンス細胞の前駆体は、自然に生
存する組織から精製されたものであってよく、このよう
なものとしては、骨髄、末梢血液、臍帯血液を挙げるこ
とができる。
【００３４】好ましくは、末梢血液または臍帯血液から
調製されたランゲルハンス細胞の前駆体、さらに好まし
くは、臍帯血液から調製された前駆体が、本発明の方法
において使用される。
【００３５】任意の精製方法をこの目的のために使用す
ることができる。例えば、コウクスら、ネイチャー、第
３６０巻、1992年11月、258に記載されているものを挙
げることができる。
【００３６】本発明において、ランゲルハンス細胞の前
駆体の分化の誘導は、それらを共培養する前または後に
行ってよい。
【００３７】この誘導が、任意の公知の方法で行うこと
ができることは明らかである。このような方法として
は、例えば、シトキン、例えば、コロニー刺激因子（顆
粒球／マクロファージ−コロニー刺激因子、すなわちＧ
Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、幹細胞因
子（ＳＣＦ）、インターロイキン−３またはインターロ
イキン−４、またはそれらの混合物により分化を誘導す
ることが挙げられる。
【００３８】しかしながら、本出願人は、非常に驚くべ
きことに、ランゲルハンス細胞の前駆体の分化が、予め
ケラチン細胞が培養されていた培地でのこれらの前駆体
の培養、またはケラチン細胞の存在により、自発的に誘
導可能であることを見いだした。
【００３９】よって、ケラチン細胞の存在下では、ラン
ゲルハンス細胞の前駆体とケラチン細胞を同時に培養す
ることにより、培養中に誘導が生じるか、または支持
体、例えば、表皮がない真皮上で、ケラチン細胞とラン
ゲルハンス細胞の前駆体を共培養させることにより、共
培養中に誘導が生じる。
【００４０】本発明において、ランゲルハンス細胞の前
駆体の分化の誘導は、好ましくは、ケラチン細胞の存在
下、さらに好ましくは、支持体上でケラチン細胞とラン
ゲルハンス細胞の前駆体を共培養することにより行う。
【００４１】有利には、ランゲルハンス細胞の前駆体の
分化の誘導は、少なくとも２つのこれらの方法の組み合
わせ、例えば、ケラチン細胞および少なくとも１つのシ
トキンの存在下での培養、または、シトキン混合物、例
えば、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−αの組み合わせの存
在下における培養により行うことができる。
【００４２】誘導に使用されるシトキン濃度は、使用さ
れるシトキンの性質に依存することは明らかである。
【００４３】シトキンは、一般的に、１ｎｇ／ｍｌ〜４
００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、２．５ｎｇ／ｍｌ〜３０
０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。よって、例えば、ＧＭ
−ＣＳＦでは、濃度は、１００ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ
／ｍｌ、好ましくは２００ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍ
ｌであってよい。ＴＮＦ−αでは、濃度は、１ｎｇ／ｍ
ｌ〜７．５ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２．５〜５ｎｇ／ｍ
ｌであってよい。
【００４４】シトキンの混合物を使用する限りは、一つ
のシトキンの他のシトキンに対する割合は、使用される
シトキンの性質により変わる。例えば、ＧＭ−ＣＳＦ／
ＴＮＦ−αの混合物の場合、割合は、重量比で４００／
１〜１３／１、好ましくは１２０／１〜４０／１であ
る。
【００４５】共培養において、誘導前駆体の調製物をＣ
Ｄ１ａ−陽性細胞で富ませることは可能である。このた
め、ＣＤ１ａ−陽性細胞は、誘導前駆体の培養物から単
離される。
【００４６】本発明において、支持体上で共培養され
る、ランゲルハンス細胞の誘導または非誘導前駆体に対
するケラチン細胞の数の比は、共培養中の細胞の全数の
パーセンテージとして、９５／５〜２５／７５、好まし
くは７５／２５〜３５／６５、さらに好ましくは５０／
５０である。
【００４７】本発明の方法において、ランゲルハンス細
胞の誘導または非誘導前駆体は、表皮等価物の調製の任
意の段階で共培養される。
【００４８】有利には、本発明の方法は、ランゲルハン
ス細胞の誘導または非誘導前駆体が、表皮等価物での上
基底部局在化を許容するときにケラチン細胞と共培養に
配する工程を有する。
【００４９】好ましくは、ランゲルハンス細胞の誘導ま
たは非誘導前駆体は、表皮等価物の上基底層が形成され
始める瞬間から、分化したケラチン細胞が角質層の第１
層を形成し始める瞬間までの間で選択される時期に共培
養に配する。
【００５０】さらに好ましくは、ランゲルハンス細胞の
誘導または非誘導前駆体は、表皮等価物の上基底層が形
成され始める瞬間から、空気／液体の界面にさらされた
後のインキュベーションの２日目までの間で選択される
時期に共培養に配される（以下を参照）。
【００５１】本発明の方法で使用される栄養培地は、そ
の能力が、ケラチン細胞の分化および増殖を可能にする
任意の公知の栄養培地であってよい。例えば、ダルベッ
コの変性イーグル培地、または種々の所定カルシウム含
有量の培地、例えば、ボーイス エス．ティー（Boyce
S.T.）およびハム アール．ジー（Ham R.G.）（J. Tiss
ue. Cult. Meth., 1985, 9, 83-93）らにより記載され
ている培地を挙げることができる。
【００５２】有利には、本発明において、いくつかの栄
養培地の混合物、例えば、ダルベッコの変性イーグル培
地／ＨＡＭ Ｆ１２培地、またはレインワルド（Rheinwa
ld）およびグリーン（Green）培地（セル、1975、6、33
1-334）を使用することができる。
【００５３】皮膚等価物を調製するための手順におい
て、まず、３〜８日間のインキュベート時間で、栄養培
地中に、共培養物を浸漬する。この栄養培地は、例え
ば、ケラチン細胞の増殖が可能な培地である、レインワ
ルドまたはグリーンにより記載されている培地であって
よい。
【００５４】このインキュベート時間の終わりに、例え
ば、金属製のグリッド上に配することにより、共培養物
を空気／液体の界面に導く。好ましくは、液体は、レイ
ンワルドおよびグリーン培地に当初含有されている３つ
の成長因子、すなわち、表皮成長因子（ＥＧＦ）、イン
シュリン、およびヒドロコルチゾンが同じ濃度に保たれ
ているという差異以外は上述したものと同じ栄養培地か
らなる。
【００５５】ついで、皮膚等価物が、皮膚の特徴、すな
わち、従来よりの細胞層、すなわち、基底層、上基底
層、顆粒層および角質（corneal）層を有する真皮等価
物に支持される表皮等価物が得られるまで、インキュベ
ートし続ける。
【００５６】このように、インキュベートを５〜３０日
間続ける。
【００５７】このようにして製造された再生皮膚モデル
は、物理的に互いに分離可能な、表皮等価物と支持体の
２つの実体物からなる。
【００５８】表皮等価物は、支持体から分離させて使用
することができる。
【００５９】よって、本発明は、上述したように、少な
くともケラチン細胞と、少なくともランゲルハンス細胞
の誘導または非誘導前駆体を含有することを特徴とする
表皮等価物、および表皮等価物の調製方法に関する。
【００６０】好ましくは、本発明の表皮等価物は、上基
底部に位置する、少なくともランゲルハンス細胞の誘導
または非誘導前駆体を有する。
【００６１】もちろん、正常な皮膚と最もよく似ている
皮膚等価物は、正常な皮膚に存在する３種の必須細胞を
含有する皮膚等価物である。
【００６２】よって、有利には、本発明の再生皮膚モデ
ルは、メラニン細胞をさらに含有する。
【００６３】本発明は、有利には、ケラチン細胞、少な
くともランゲルハンス細胞、およびメラニン細胞の誘導
または非誘導前駆体を含有する表皮等価物に関する。
【００６４】本発明で使用されるメラニン細胞は、それ
らを含む任意の器官、例えば、正常な皮膚、または髪の
濾胞から精製することができる。
【００６５】好ましくは、正常な皮膚から精製されたメ
ラニン細胞が使用される。
【００６６】従来技術より公知の任意の精製方法を、こ
れらのメラニン細胞を調製するために使用することがで
きる。例えば、オルソン（Olsson）らの、Acta Derm. V
enereol., 1994, 74, 226-268に記載されている方法を
挙げることができる。
【００６７】正常な皮膚に存在する３種の細胞を含有す
る皮膚等価物を得るためには、支持体上で、ケラチン細
胞、ランゲルハンス細胞の誘導または非誘導前駆体、お
よびメラニン細胞を共培養する必要がある。
【００６８】よって、本発明の方法の他の特定の態様
は、支持体上で、ケラチン細胞、少なくともランゲルハ
ンス細胞の誘導または非誘導前駆体、およびメラニン細
胞を共培養することを特徴とするものである。
【００６９】３種の細胞を含有する皮膚等価物の場合、
その製造に使用される方法は、上述した２種の細胞を含
有する皮膚等価物の製法とは、どの点においても異なっ
ていない。
【００７０】例えば、支持体上で共培養されるランゲル
ハンス細胞および／または前駆体に対する混合物（メラ
ニン細胞＋ケラチン細胞）の比は、共培養中の全細胞数
のパーセンテージとして、９５／５〜２５／７５、好ま
しくは７５／２５〜３５／６５、さらに好ましくは５０
／５０である。
【００７１】ケラチン細胞とメラニン細胞との特定の比
は、従来技術（国際特許公開第９３５１１６５号）に記
載されているものであってよい。
【００７２】
【実施例】以下に実施例を例証するが、これらは本発明
を限定するものではない。
【００７３】ケラチン細胞、ランゲルハンス細胞、およ
びメラニン細胞を含有する表皮等価物の調製例：レグニ
アーらにより記載されている方法（マトリックス生物学
の開拓、第9巻、4-35、カーガー、バーゼル 1981）で予
め単離された正常なヒトのケラチン細胞、および、オル
ソンらにより記載されている方法（Acta Derm. Venereo
l., 1994, 74, 226-268）で予め単離されたヒトのメラ
ニン細胞の混合物を、１０対１の割合で調製した。プル
ニエラスらにより記載されている方法（Ann. Chir. Pla
st.,1979, 24, 第4号, 357-362）で、この混合物を、５
×１０5cell／cm2の量で、表皮が除去された真皮上に配
した。５μｇ／ｍｌのインシュリン、および１．８×１
０-4Ｍのアデニン、２×１０-9Ｍのトリヨードチロニ
ン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、１０-6Ｍのイソ
プロテレノール、４００ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾ
ン、１０ｎｇ／ｍｌの表皮成長因子（ＥＧＦ）、１０％
のウシ胎児血清を含有する、３対１の割合の、ダルベッ
コの変性イーグル培地およびＨＡＭ Ｆ１２培地からな
る培地（レインワルドおよびグリーン、セル、1975、
6、331-334）中で培養した。このようにして、６日間、
培養物を浸漬し続けた。ついで、培養物を空気／液体の
界面に配した。該液体は、イソプロテレノール、トラン
スフェリン、トリヨードチロニン、およびアデニンが除
去されている以外は、上述したものと同様の培地からな
る。
【００７４】同時に、ＣＤ３４+細胞を臍帯血液から単
離し、コウクスらにより記載されている方法（ネイチャ
ー、第３６０巻、1992年11月、258-260頁）で、２００
ｎｇ／ｍｌの濃度のコロニー刺激因子（顆粒球／マクロ
ファージ−コロニー刺激因子、すなわちＧＭ−ＣＳ
Ｆ）、および２．５ｎｇ／ｍｌの濃度の腫瘍壊死因子
（ＴＮＦ−α）の存在下にて、６日間培養した。空気／
液体の界面に、ケラチン細胞／メラニン細胞混合物を通
過させて２日後、予め準備しておいた５×１０5のＣＤ
３４+細胞を再生された表皮上に配した。ついで、組織
学的に満足のいく表皮等価物、換言すれば、従来の細胞
層、すなわち、基底層、上基底層、顆粒層および角質層
を有する表皮等価物が得られるまで、培養を続けた。
【００７５】ランゲルハンス細胞の前駆体を予め誘導し
ない、ケラチン細胞およびランゲルハンス細胞を含有す
る表皮等価物の調製：レグニアーらにより記載されてい
る方法（マトリックス生物学の開拓、第9巻、4-35、カー
ガー、バセル 1981）で予め単離された正常なヒトのケ
ラチン細胞、およびコウクスらにより記載されている方
法（ネイチャー、第３６０巻、1992年11月、258-260
頁）で臍帯血液から単離されたＣＤ３４+細胞の混合物
を、１対１の割合で調製した。この混合物を、プルニエ
ラスらにより記載されている方法（Ann. Chir. Plast.,
1979, 24, 第4号, 357-362）で、表皮が除去された真皮
上に、各々の種類ごとに、５×１０5cell／cm2の量で配
した。５μｇ／ｍｌのインシュリン、および１．８×１
０-4Ｍのアデニン、２×１０-9Ｍのトリヨードチロニ
ン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、１０-6Ｍのイソ
プロテレノール、４００ｎｇ／ｍｌのヒドロコルチゾ
ン、１０ｎｇ／ｍｌの表皮成長因子（ＥＧＦ）、１０％
のウシ胎児血清を含有する、３対１の容量比の、ダルベ
ッコの変性イーグル培地およびＨＡＭ Ｆ１２の混合物
からなる培地（レインワルドおよびグリーン、セル、19
75、6、331-334）中で共培養した。このようにして、６
日間、培養物を浸漬し続けた。ついで、培養物を空気／
液体の界面に配した。該液体は、イソプロテレノール、
トランスフェリン、トリヨードチロニン、およびアデニ
ンが除去されている以外は、上述したものと同様の培地
からなる。
【００７６】ついで、組織学的に満足のいく表皮等価
物、換言すれば、従来の細胞層、すなわち、基底層、上
基底層、顆粒層および角質層を有する表皮等価物が得ら
れるまで、共培養を続けた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マリー−ジャンヌ・スタキュー フランス・69150・デシーヌ・アヴェニ ュ・ジャン・ジョーレ・284 (56)参考文献 国際公開90／2796（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61L 27/00 A61F 2/10 C12N 5/00

Claims (35)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 支持体上に表皮等価物を含有し、該表皮
    等価物が少なくともケラチン細胞と、少なくともランゲ
    ルハンス細胞の誘導または非誘導前駆体を含有すること
    を特徴とする皮膚等価物。
  2. 【請求項２】 支持体が、コラーゲン／繊維芽細胞混合
    物格子、予め表皮が除去された真皮、人工膜、コラーゲ
    ンをベースとした皮下代用物、プラスティック、または
    細胞の生存に適した支持体から選択されることを特徴と
    する請求項１に記載の皮膚等価物。
  3. 【請求項３】 支持体が、予め表皮が除去された真皮か
    らなることを特徴とする請求項２に記載の皮膚等価物。
  4. 【請求項４】 メラニン細胞をさらに含有することを特
    徴とする請求項１ないし３のいずれか１項に記載の皮膚
    等価物。
  5. 【請求項５】 ランゲルハンス細胞の誘導または非誘導
    前駆体が、表皮等価物の上基底部に局在していることを
    特徴とする請求項１ないし４のいずれか１項に記載の皮
    膚等価物。
  6. 【請求項６】 ケラチン細胞と、少なくともランゲルハ
    ンス細胞の誘導または非誘導前駆体とを支持体上で共培
    養させることを特徴とする皮膚等価物の調製方法。
  7. 【請求項７】 支持体上で共培養される、ランゲルハン
    ス細胞の誘導または非誘導前駆体に対するケラチン細胞
    の数の比が、共培養中の全細胞数のパーセンテージで、
    ９５／５〜２５／７５であることを特徴とする請求項６
    に記載の方法。
  8. 【請求項８】 支持体上で共培養される、ランゲルハン
    ス細胞の誘導または非誘導前駆体に対するケラチン細胞
    の数の比が、共培養中の全細胞数のパーセンテージで、
    ７５／２５〜３５／６５であることを特徴とする請求項
    ７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 支持体上で共培養される、ランゲルハン
    ス細胞の誘導または非誘導前駆体に対するケラチン細胞
    の数の比が、共培養中の全細胞数のパーセンテージで、
    ５０／５０であることを特徴とする請求項８に記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】 ケラチン細胞が、正常または病的な皮
    膚のサンプルに由来する分離した表皮の培養、または正
    常または病的な髪の濾胞の鞘から得られたケラチン細胞
    の培養により得られたものであることを特徴とする請求
    項６ないし９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 ケラチン細胞が、正常または病的な皮
    膚のサンプルから得られたものであることを特徴とする
    請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 ランゲルハンス細胞の前駆体が、骨
    髄、末梢血液、または臍帯血液から精製されたものであ
    ることを特徴とする請求項６ないし１１のいずれか１項
    に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 ランゲルハンス細胞の前駆体が、臍帯
    血液から精製されたものであることを特徴とする請求項
    １２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 ランゲルハンス細胞の前駆体が、ＣＤ
    ３４+造血細胞であることを特徴とする請求項６ないし
    １３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 ランゲルハンス細胞の前駆体の分化
    が、それらを共培養する前または後に誘導されることを
    特徴とする請求項６ないし１４のいずれか１項に記載の
    方法。
  16. 【請求項１６】 ランゲルハンス細胞の前駆体の分化
    が、それらの共培養後に誘導されることを特徴とする請
    求項１５に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ランゲルハンス細胞の前駆体の分化
    が、ケラチン細胞の存在下での培養、ケラチン細胞が予
    め培養された培地中での培養、コロニー刺激因子、腫瘍
    壊死因子、幹細胞因子、インターロイキン−３またはイ
    ンターロイキン−４から選択されるシトキンの存在下で
    の培養から選択される方法で誘導されることを特徴とす
    る請求項１５または１６に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 分化が、ケラチン細胞の存在下での培
    養、ケラチン細胞が予め培養された培地中での培養、コ
    ロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、幹細胞因子、インター
    ロイキン−３またはインターロイキン−４から選択され
    るシトキンの存在下での培養から選択される方法の少な
    くとも２つの組み合わせにより誘導されることを特徴と
    する請求項１７に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 分化が、ケラチン細胞および少なくと
    も１つのシトキンの存在下での培養、またはシトキン混
    合物の存在下での培養により誘導されることを特徴とす
    る請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 分化が、コロニー刺激因子と腫瘍壊死
    因子の混合物により誘導されることを特徴とする請求項
    １９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 シトキンが、１ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎ
    ｇ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする請求項６な
    いし２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 シトキンが、２．５ｎｇ／ｍｌ〜３０
    ０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在することを特徴とする請求項
    ２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 コロニー性刺激因子の濃度が、１００
    ｎｇ／ｍｌ〜４００ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする
    請求項６ないし２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 コロニー性刺激因子の濃度が、２００
    ｎｇ／ｍｌ〜３００ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする
    請求項２３に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 腫瘍壊死因子の濃度が、１ｎｇ／ｍｌ
    〜７．５ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項６な
    いし２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 腫瘍壊死因子の濃度が、２．５ｎｇ／
    ｍｌ〜５ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項２５
    に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 コロニー性刺激因子／腫瘍壊死因子の
    混合物の場合、該混合物の割合が、重量比で４００／１
    〜１３／１であることを特徴とする請求項２０に記載の
    方法。
  28. 【請求項２８】 コロニー性刺激因子／腫瘍壊死因子の
    混合物の重量比が、１２０／１〜４０／１であることを
    特徴とする請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 ランゲルハンス細胞の誘導または非誘
    導前駆体が、表皮等価物の上基底部に局在化するとき
    に、ケラチン細胞とともに共培養に配することを特徴と
    する請求項６ないし２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 ランゲルハンス細胞の誘導または非誘
    導前駆体が、表皮等価物の上基底層が形成され始める瞬
    間から、分化したケラチン細胞が角質層の第１層を形成
    し始める瞬間までの間で選択される時期に培養に配され
    ることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 ランゲルハンス細胞の誘導または非誘
    導前駆体が、表皮等価物の上基底層が形成され始める瞬
    間から、空気／液体の界面を通過した後で培養の２日目
    との間で選択される時期に共培養に配されることを特徴
    とする請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 メラニン細胞を、さらに共培養するこ
    とを特徴とする請求項６ないし３１のいずれか１項に記
    載の方法。
  33. 【請求項３３】 少なくともケラチン細胞と、ランゲル
    ハンス細胞の誘導または非誘導前駆体を含有することを
    特徴とする表皮等価物。
  34. 【請求項３４】 メラニン細胞を、さらに含有すること
    を特徴とする請求項３３に記載の表皮等価物。
  35. 【請求項３５】 ランゲルハンス細胞の誘導または非誘
    導前駆体が、上基底部に局在化していることを特徴とす
    る請求項３３または３４に記載の表皮等価物。
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