JPS6318470B2

JPS6318470B2 -

Info

Publication number: JPS6318470B2
Application number: JP59248202A
Authority: JP
Inventors: Yutaka Sato; Junji Kobayashi; Naomi Shiotani
Original assignee: Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1984-11-26
Filing date: 1984-11-26
Publication date: 1988-04-19
Also published as: JPS61126029A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、新規なヒト肺癌組織の細胞から株化
されたヒトコロニー形成刺激因子（Human
Colonystimulating faotor；以下単に、ｈ−CSF
と略す）産生細胞株TLC−9Aに関する。更に本
発明においては細胞株TLC−9Aの大量培養によ
るｈ−CSFの工業的量産法を確立し、それによつ
て得られたｈ−CSFを医薬ならびに疾病の診断に
応用することを目的とした有用な技術分野に関す
るものである。

従来の技術ｈ−CSFは、骨髄系幹細胞に由来する白血球に
分類される顆粒球やマクロフアージ系幹細胞に作
用して成熟した白血球に分化させる体液性因子と
して知られている〔Journal of Immunological
Methods，42，253−284（1981）等〕。

またｈ−CSFは、骨髄系幹細胞を顆粒球やマク
ロフアージ等の白血球に分化誘導せしめる作用を
有することから、例えば癌患者等の白血球減少に
対する治療薬または種々の感染症の予防薬として
有用な生理活性物質である。さらにｈ−CSFは、
インビトロ生成量に起因するｈ−CSF増多症およ
び減少症の診断用試薬としても有用なものであ
る。

発明が解決しようとする問題点そのため、従来ではヒトの尿またはヒト胎盤の
培養上清を原料として採取していたが、原料に制
限があり、また常に一定のｈ−CSF活性を有する
標品を得ることが困難であつた。それ故ｈ−CSF
の有用性が期待されているにもかかわらず、純度
の高いｈ−CSFを大量に製造することが困難であ
り、未だに医薬品ならびに診断薬として実用化さ
れていない状況である。

問題点を解決するための手段本発明において、白血球の一つである顆粒球の
減少症の治療薬またはｈ−CSFの増多症および減
少症の診断用試薬としてｈ−CSFを大量に製造す
るためにヒト由来のCSF産生細胞について長期間
鋭意研究した結果、ヒト肺癌組織由来の細胞から
ｈ−CSF産生能を有する細胞を新たに単離して継
代培養を継続し、遂に、無限に継代培養し得る株
化細胞の樹立に成功した。この株化細胞はTLC
−9Aと命名され、現在までに68回の継代培養を
行つたが、細胞形態、細胞増殖性、ｈ−CSF生産
性、ポピユレイシヨン・ダブリング・タイム
（Population Doubing Time）等、継代培養間に
おいて変動が少なく、かなり安定したTLC−9A
の特徴的性質を維持する細胞株であることを認め
た。

本発明は、上記の知見に基づいて完成されたも
ので、下記の性質を有するヒト肺癌組織細胞由来
のヒト株化細胞TLC−9Aに関するものである。

形態：上皮細胞様、染色体数：高４倍体域である染色体数117本
のモーダル・ナンバー（modal No.）を示すこ
とを特徴とする染色体数の分布モード、継代培養：無限な継代培養、機能的特徴：コロニー形成刺激因子産生、細胞増殖性：単層シート状の増殖性を示し、
特にRPMI−1640＋５〜20％牛胎児血清含有培
地において増殖性良く、ポピユレイシヨン・ダ
ブリング・タイムは35±７時間である。

まず本発明のｈ−CSF産生細胞株TLC−9Aを
得るに当つて、外科的に摘出された肺癌の腫瘍組
織の１〜２ｇを細切し、これを10〜100mlトリス
緩衝生理食塩水（Tris Buffer Salne Solution；
以下、TBSと略す）にて洗浄する。次いでこれ
を細胞分散用酵素、例えば0.1〜0.25％のトリプ
シン、0.05％程度のコラゲナーゼ、500〜
1000U／mlのデイスパーゼ（合同酒精社製）、
25U／ml程度のナガーゼ（長瀬産業社製）の
TBS溶液10〜50mlを加えて37℃にて60〜120分間
撹拌して組織を分散せしめる。その後、培地を希
釈して酵素活性を停止せしめた後細胞を回収す
る。このようにして分離した細胞は、通常培地１
ml当り10⁴〜10⁶個の細胞数になるように調整して
用いられる。またこの際用いられる培地として
は、公知の種々の培地、例えばMEM培地、199
培地、ハム（Ham）Ｆ−10培地、ハム（Ham）
Ｆ−12培地、RPMI−1640培地、マツコイ（Mc
coy）5A培地、ウイリアムス（Willams）Ｅ培
地、ウエイマウスズ（Waymouth's）MB752／
１培地、またはこれらの改変培地、例えばイーグ
ル・MEM（Ｅ−MEM）、アルフアーMEM、ダ
ルベツコMEMなどに、好ましくは牛胎児血清を
10〜20％、さらに抗菌性物質、例えばペニシリン
Ｇ、硫酸ジヒドロストレプトマイシンを添加して
調整したものが挙げられる。これらの抗菌性物質
は、同様に継代培養、増殖培養時培地に添加する
ことが好ましい。このような培地を用いて細胞数
を調整した後、まず初代培養が行なわれるが、こ
の培養においては、簡便にはシヤーレまたはプラ
スチツクボトルの培養容器を用いて、37℃、５％
CO₂混合気相、湿度100％の条件下にて静置培養
する。次いでこれを継代培養するに当つて、まず
初期培養において細胞が増殖して飽和状態に達し
たことを確認後、洗浄して細胞を剥離し回収す
る。この際洗浄液としてはカルシウム、マグネシ
ウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水（以下、
PBS（−）と略す〕を用いればよく、また細胞剥
離の際はトリプシンまたはナガーゼ酵素液を用い
て剥離すればよい。このようにして得られた細胞
は、さらに細胞数を調整して前述の培地に加え、
これを37℃、５％CO₂混合気相、湿度100％の条
件下培養容器内で飽和増殖せしめる。次いでこの
飽和増殖時の３分の１量の細胞数を、新たな培地
に接種し、同一条件下にてくり返し（継代培養回
数50回以上）培養した。

このようにして継代培養を行なつた結果、限界
なく継代培養が可能な株化細胞が得られ、さらに
この細胞はｈ−CSFを産生する機能的特徴を有す
るもので、この細胞をｈ−CSF産生細胞株TLC
−9Aと命名した。

このｈ−CSF産生細胞として樹立したTLC−
9A株の細胞生物学的および機能的性質を挙げれ
ば、以下の通りである。

形態：培養細胞は密に接した多角形の細胞が単層
シート状に増殖して敷石状を呈し、典型的な
上皮細胞様配列を示した。

細胞増殖能：RPMI−1640＋10％牛胎児血清含有
培地を用い、35mmの口径からなる組織培養用
プラスチツクデイツシユ（コーニング社製）
に、３×10⁴生細胞／mlの細胞浮遊液を２ml
接種し、37℃培養温度、５％CO₂混合気相、
100％湿度の条件下で培養を行なつて増殖曲
線を求め、この増殖曲線より求めたポピユレ
イシヨン・ダブリング・タイムは35±７時間
であつた。本株は、公知のいずれの培地でも
培養可能であるが、RPMI−1640培地＋５〜
20％牛胎児血清含有培地においては、特に良
好に増殖する。

染色体数：染色体分析に基づく染色体数の分布モ
ードは、第１図に示す通りであつて、染色体
数117本をモーダル・ナンバーとする高４倍
体域にあり、さらに本株は個々の染色体の形
態を観察して解析した結果でも比較的安定し
た株化細胞であることが判断された。

継代培養：無限な継代培養が可能である。

機能的特徴：ｈ−CSFを産生する。細胞株TLC
−9Aは、公知のどの培地に培養してもｈ−
CSFを産生するが、特に、10％牛胎児血清添
加RPMI−1640培地を用いて培養した場合に
おいては、細胞の増殖とｈ−CSFの産生が良
好であつた。培養液中のｈ−CSF活性は細胞
数とともに上昇し、飽和増殖時に最大となり
１ml当りのｈ−CSF活性が約380単位に達し
た。

なおｈ−CSFのアツセイ方法としては、(a)マウ
ス骨髄細胞を用いたコロニー形成法、(b)ヒト臍帯
血細胞を用いたコロニー形成法が行なわれている
が、そのいずれのアツセイ方法を用いてもよく、
本発明においては両アツセイ方法の結果において
同様な値を示した。またそのアツセイ方法は、以
下の通りである。

ａマウス骨髄細胞を用いたコロニー形成法仁保の方法（「免疫実験操作法」、日本免疫学会
編、1974年、第927頁）に従いメチルセルローズ
を用いる下記の方法で行つた。

2.2％メチルセルローズ／α−MEM …1.6ml ウマ血清 …0.8ml マウス骨髄細胞懸濁液／α−MEM …0.8ml 被験サンプルまたはCSF標準液 …0.8ml メチルセルローズはDow社製、α−MEMは
Flow社製、ウマ血清はGIBCO社製
（＃28K8024）CSF標準液はGIBCO社製GCT−
CMを使用した。またマウス骨髄細胞は静岡実験
動物農業協同組合より購入した雄性７週令のICR
を使用し、大髄骨骨髄の単核球を分離し、α−
MEMに懸濁して５×10⁵／mlに調整した。

上記混合液を３枚の35mmの口径からなるプラス
チツクデツシユに１mlずつ分注し37℃、５％CO₂
混合気相下で７日間培養した後、20個以上の細胞
からなる細胞集団を１コロニーとみなして算出
し、上記条件で１コロニーを形成させるｈ−CSF
活性を１単位（Ｕ）とした。

ｈ−CSFの活性はいずれも３枚のデツシユの平
均値で算出した。

ヒト臍帯血細胞を用いたコロニー形成法仁保のマウス骨髄細胞コロニー形成法を少し変
更して下記の方法で行つた。

2.2％メチルセルローズ／α−MEM …1.6ml ウシ胎児血清（GIBCO社製） …0.8ml ヒト臍帯血有核細胞／α−MEM …0.8ml 被験サンプルまたはCSF標準液 …0.8ml ヒト臍帯血は帝王切開により人工的出産した新
生児臍帯より採血した。臍帯血有核細胞の分離は
５〜６mlのヒト臍帯血に等量のリン酸緩衝塩類溶
液（PBS（−））を添和して混和した後、その液
をフイコル−メトリゾエイト（Ficoll−
Metrizoate；，δ：1.077Nyegaard＆Co.）を入
れたポリカーボネート製遠心管中に静かに重層
し、20℃、400×ｇにて20分間遠心分離すること
により行つた。遠心分離により血漿層とFicoll−
Metrizoate層との間に分離された有核細胞をα
−MEM培地に懸濁し、90mm口径プラスチツクデ
イツシユに入れて37℃、５％CO₂混合気相下で30
分間静置して付着細胞を除去した後、細胞濃度を
１×10⁶／mlに調整した。上記混合液を３枚の35
mm口径からなるプラスチツクデイツシユに１mlず
つ分注し37℃、５％CO₂混合気相下で８日間培養
した後、20個以上の細胞からなる細胞集団をコロ
ニーとみなして算定し、上記条件で１コロニーを
形成させるｈ−CSF活性を１単位（Ｕ）と定義し
た。

さらに本発明における生細胞数の計測は、改良
型ノイバウエル（Neubauer）氏血球計算板を用
いて0.1％トリパンブルー染色により計算した。

また本発明のTLC−9A株の保存は、そのTLC
−9A株の培養物より酵素的に細胞を剥離させた
後10％ジメチルスルホキサイドまたは10％グリセ
リンを含有するRPMI−1640培地（10％牛胎児血
清含有）に懸濁して、−80〜−190℃にて凍結保存
すればよい。

実施例以下に本発明の実施例を詳細に説明する。

実施例１外科的に摘出された患者腫瘍肺組織２ｇを、鋭
利な手術用メスで２〜３mm立方角に細切した。

これを、20mlのTBSで２回洗浄した後、0.25％
トリプシン（DIFCO社製）TBS溶液20mlを加え
て37℃で90分間撹拌して組織を充分に分散せしめ
た。次いで、これに、牛胎児血清を含む培地で希
釈して酵素活性を停止せしめた後、150メツシユ
の篩を通して過し、その液を1000rpm、５分
間遠心分離して細胞成分を集めた。次いで分離し
た細胞をRPMI−1640培地＋15％牛胎児血清の培
地に懸濁させ単細胞浮遊液とした後、細胞数を計
測（改良型Neubauer氏血球計算板を用いる0.1％
トリパンブルー染色による生細胞数を計測した）
し、培地１ml当り細胞数が２×10⁵個になる様に
調整してこの懸濁液５mlを径６cmのシヤーレで37
℃、５％CO₂混合気相、湿度100％の条件下静置
培養した。培養した後、細胞が増殖した飽和状態
に達したことを検鏡により確認した。次いで培養
液を除去し、これをPBS（−）で洗浄後25U／ml
のナガーゼ（長瀬産業社製、100U／mg）のTBS
溶液（0.02％のEDTA・ジナトリウム塩含有）５
mlを加えて37℃、15分間処理して細胞を剥離せし
めた。次いで酵素液を遠心除去し、RPMI−1640
培地＋15％牛胎児血清の培養培地15mlを加えて充
分に細胞を分散させ、その５mlを新たな培養容器
に入れて37℃、５％CO₂混合気相、湿度100％の
条件下培養した。培養後、飽和増殖時の３分の１
量の細胞数を新たな培地に接種し、同一条件下68
回継代培養した。

このようにして継代された細胞株TLC−9Aの
細胞生物学的性質ならびに本株化細胞の特徴的諸
性質に関する安定性は、前述した通りである。

さらにこのヒト肺癌組織より株化樹立した
TLC−9A株の維持培養は、５〜20％好ましくは
10％牛胎児血清含有RPMI−1640培地を用い、１
×10⁵個／mlの細胞密度でコーニング社製No.25100
組織培養用フラスコに５ml量播種して37℃、５％
CO₂混合気相、湿度100％の培養条件で４〜５日
毎に継代を行なつた。

またTLC−9A株の増殖とｈ−CSF産生との相
関を求めるため、10％牛胎児血清含有RPMI−
1640培地を用いて35mmφの口径からなるプラスチ
ツクデイツシユに６×10⁴個の細胞を播種し、37
℃、５％CO₂混合気相、湿度100％のもとで培養
し、培養時、経時的に３枚のデイシユをサンプリ
ングして細胞数と培養液のｈ−CSF活性を測定し
た。その結果、第２図に示す通り、細胞は１日の
ラグ・タイムの後に増殖し、８日後にほぼ飽和に
近づき10日後には1.1×10⁶個に達した（第２図参
照）。またその際の培養液のCSF活性は細胞数の
増大とともに上昇し、飽和増殖時に最大となり１
ml当りのｈ−CSF活性は約380Uに達する（第３
図）ことが明らかとなつた。

なお牛胎児血清の代りに、仔牛血清、成牛血
清、ヒト血清や馬もしくはニワトリ由来の血清を
用いてもよい。

発明の効果本発明により、新規なｈ−CSF産生細胞株
TLC−9Aが得られたもので、株化細胞であるこ
とから均質なｈ−CSFの大量製造が可能となり、
白血球減少症の治療薬あるいはｈ−CSF増多症や
減少症の診断薬の分野に有用な物質を提供し得る
ものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のｈ−CSF産生細胞株TLC−
9Aの染色体分析に基づく染色体数の分布モード
を示し、第２図は本発明のｈ−CSF産生細胞株
TLC−9Aの増殖曲線を示し、第３図は経時的増
殖におけるｈ−CSF活性を示す。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の性質を有するヒト肺癌組織細胞由来の
ヒト株化細胞TLC−9A。形態：上皮細胞様、染色体数：高４倍体域である染色体数117本
のモーダル・ナンバーを示すことを特徴とする
染色体数の分布モード、継代培養：無限な継代培養、機能的特徴：コロニー形成刺激因子産生、細胞増殖性：単層シート状の増殖性を示し、
特にRPMI−1640＋５〜20％牛胎児血清含有培
地において増殖性良く、ポピユレイシヨン・ダ
ブリング・タイムは35±７時間である。