JPH10114664A - 骨髄の複製方法 - Google Patents
骨髄の複製方法Info
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- JPH10114664A JPH10114664A JP9268792A JP26879297A JPH10114664A JP H10114664 A JPH10114664 A JP H10114664A JP 9268792 A JP9268792 A JP 9268792A JP 26879297 A JP26879297 A JP 26879297A JP H10114664 A JPH10114664 A JP H10114664A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 健康な骨髄細胞を破壊したりその機能を損
なう疾病や状態を治療するための方法を提供する。 【解決手段】(a) 移植すべき細胞型から得られた実質細
胞（例えば、造血細胞、皮膚細胞、肝細胞など）をin v
itroで培養して増殖させ；そして(b) 増殖した実質細胞
をin vivo 移植する；ことを含む、ヒト以外の哺乳動物
への細胞のin vivo 移植方法。
なう疾病や状態を治療するための方法を提供する。 【解決手段】(a) 移植すべき細胞型から得られた実質細
胞（例えば、造血細胞、皮膚細胞、肝細胞など）をin v
itroで培養して増殖させ；そして(b) 増殖した実質細胞
をin vivo 移植する；ことを含む、ヒト以外の哺乳動物
への細胞のin vivo 移植方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、骨髄の複製方法に
関する。
関する。
【０００２】
【従来の技術】骨髄移植に関しては幾つかの方法が知ら
れている。一般に骨髄の移植は健康な骨髄細胞を破壊し
たりその機能を衰えさせる癌のような病気に冒された患
者に対して施される。これに加えて治療中の病気が直接
骨髄に影響を与えていない場合でも化学療法や放射線療
法が副作用として骨髄に影響を与える。数々の損傷を受
けた骨髄に移植術を施す方法が知られている。骨髄移植
拒絶反応の主要原因のひとつに対宿主性移植片反応があ
る。これはある人から取り出した骨髄を別の人に移植し
た際に起こる。骨髄移植が失敗するもうひとつの重要な
原因に骨髄塞栓の形成による血管閉塞性疾患がある。組
み合わされた化学療法と放射線療法に先立ち人の骨髄を
取り出し貯蔵する方法及びその骨髄を再注入する方法が
現存する（すなわち、自己移植術）。しかし、この治療
をうけた患者は、たとえ組織の植え付けが成功した場合
でもしばしば病気が再発する。これは移植された骨髄が
最初に取り出される際すでに羅病していたことによる。
れている。一般に骨髄の移植は健康な骨髄細胞を破壊し
たりその機能を衰えさせる癌のような病気に冒された患
者に対して施される。これに加えて治療中の病気が直接
骨髄に影響を与えていない場合でも化学療法や放射線療
法が副作用として骨髄に影響を与える。数々の損傷を受
けた骨髄に移植術を施す方法が知られている。骨髄移植
拒絶反応の主要原因のひとつに対宿主性移植片反応があ
る。これはある人から取り出した骨髄を別の人に移植し
た際に起こる。骨髄移植が失敗するもうひとつの重要な
原因に骨髄塞栓の形成による血管閉塞性疾患がある。組
み合わされた化学療法と放射線療法に先立ち人の骨髄を
取り出し貯蔵する方法及びその骨髄を再注入する方法が
現存する（すなわち、自己移植術）。しかし、この治療
をうけた患者は、たとえ組織の植え付けが成功した場合
でもしばしば病気が再発する。これは移植された骨髄が
最初に取り出される際すでに羅病していたことによる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は健康な骨髄細胞を破壊したり、その機能や複製の能力
を損う疾病を治療するための方法で現行の骨髄移植技術
において知られている不都合な点を克服した方法を提供
することにある。本発明のもう一つの目的は、対宿主性
移植片反応が生じない骨髄移植術による疾病の治療法を
提供することにある。
は健康な骨髄細胞を破壊したり、その機能や複製の能力
を損う疾病を治療するための方法で現行の骨髄移植技術
において知られている不都合な点を克服した方法を提供
することにある。本発明のもう一つの目的は、対宿主性
移植片反応が生じない骨髄移植術による疾病の治療法を
提供することにある。
【０００４】さらにもう一つの本発明の目的は、骨髄塞
栓の形成をひき起こさない骨髄移植術により疾病を治療
する方法を提供することにある。本発明のさらにもう一
つの目的は、健康な骨髄細胞を破壊する疾病や状態を患
者から骨髄を吸い出し、試験管内で骨髄細胞を複製し、
その後複製された骨髄細胞を患者に再注入するという方
法により治療する方法を提供することにある。
栓の形成をひき起こさない骨髄移植術により疾病を治療
する方法を提供することにある。本発明のさらにもう一
つの目的は、健康な骨髄細胞を破壊する疾病や状態を患
者から骨髄を吸い出し、試験管内で骨髄細胞を複製し、
その後複製された骨髄細胞を患者に再注入するという方
法により治療する方法を提供することにある。
【０００５】本発明のさらに他の目的は、化学療法及び
放射線療法またはその一方により受けた副作用で損われ
た骨髄の機能を向上させる方法を提供することにある。
本発明のさらに別の目的は、血液学的悪性疾患及び骨髄
に転移するその他の新形成を治療する方法を提供するこ
とにある。本発明のさらに別の目的や有用性は、この技
術に熟練した人々にとって、以下に示す詳細な記述を参
照することにより明白であろう。
放射線療法またはその一方により受けた副作用で損われ
た骨髄の機能を向上させる方法を提供することにある。
本発明のさらに別の目的は、血液学的悪性疾患及び骨髄
に転移するその他の新形成を治療する方法を提供するこ
とにある。本発明のさらに別の目的や有用性は、この技
術に熟練した人々にとって、以下に示す詳細な記述を参
照することにより明白であろう。
【０００６】本発明は、以下に示す骨髄基質細胞が次々
に網目状に増殖している状態を示す1.65×1000倍拡大の
走査型電顕写真を参照することにより、より良く理解で
きるであろう。
に網目状に増殖している状態を示す1.65×1000倍拡大の
走査型電顕写真を参照することにより、より良く理解で
きるであろう。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明により骨髄が破壊
されているか或いはその機能が失われている患者を治療
するための方法が提供される。その方法は以下の段階か
ら成っている。 Ｉ．提供者から骨髄の試料を得ること、次に II．骨髄への再定着活性を持つ造血幹細胞を含む複製さ
れた骨髄を生産するために試験管内で骨髄細胞を複製
し、その一部を低温保存し後の使用に備えること、次に III．造血幹細胞を含む複製された骨髄を患者の造血を
回復させために患者に注入する。
されているか或いはその機能が失われている患者を治療
するための方法が提供される。その方法は以下の段階か
ら成っている。 Ｉ．提供者から骨髄の試料を得ること、次に II．骨髄への再定着活性を持つ造血幹細胞を含む複製さ
れた骨髄を生産するために試験管内で骨髄細胞を複製
し、その一部を低温保存し後の使用に備えること、次に III．造血幹細胞を含む複製された骨髄を患者の造血を
回復させために患者に注入する。
【０００８】本発明により、健康な骨髄細胞を破壊した
りその機能を損う疾病や状態を治療するための方法が提
供される。本発明の方法は、血液学的悪性疾患及び骨髄
に転移するその他の新形成の治療において、特に効果的
である。本発明の方法は次のような段階から成ってい
る。健康な患者から少量の骨髄を吸い出す。その細胞を
寒冷保存する。患者から取り出した元の数より多く自己
に再注入するのに十分なだけの数に骨髄細胞を増やすた
めに骨髄細胞を試験管内で複製する、そしてその骨髄細
胞を患者に再注入する。本発明の一つの具体例によれ
ば、骨髄細胞は患者から吸引後直ちに低温保存又は凍結
され、その後解凍されて複製される。本発明のもう一つ
の具体例によれば、ある人から骨髄を吸い出し、その骨
髄細胞を試験管内で複製し、その複製された骨髄細胞を
別の人に再注入するという同種間の骨髄移植が実施され
る。
りその機能を損う疾病や状態を治療するための方法が提
供される。本発明の方法は、血液学的悪性疾患及び骨髄
に転移するその他の新形成の治療において、特に効果的
である。本発明の方法は次のような段階から成ってい
る。健康な患者から少量の骨髄を吸い出す。その細胞を
寒冷保存する。患者から取り出した元の数より多く自己
に再注入するのに十分なだけの数に骨髄細胞を増やすた
めに骨髄細胞を試験管内で複製する、そしてその骨髄細
胞を患者に再注入する。本発明の一つの具体例によれ
ば、骨髄細胞は患者から吸引後直ちに低温保存又は凍結
され、その後解凍されて複製される。本発明のもう一つ
の具体例によれば、ある人から骨髄を吸い出し、その骨
髄細胞を試験管内で複製し、その複製された骨髄細胞を
別の人に再注入するという同種間の骨髄移植が実施され
る。
【０００９】本発明の試験管内における骨髄複製のシス
テムは骨髄に影響する種々の状態について患者をモニタ
ーする方法も提供する。例えば骨髄の少量の試料を治療
中の癌患者から吸い出し、本発明の試験管内のシステム
で複製させることにより元の悪性疾患の再発や移転がチ
ェックされる。試験管内の骨髄複製システムはまた薬
物、食品添加物、健康食品、抗新生物薬、及び癌原性物
質の細胞毒性試験にも適用できる。比例させて用量を減
じた試験物質を本発明の試験管内の骨髄システムに添加
し、さまざまな細胞種に対するその影響を観察する。骨
髄細胞以外の種々の細胞種についても特別な物質で必要
とあればテストする。
テムは骨髄に影響する種々の状態について患者をモニタ
ーする方法も提供する。例えば骨髄の少量の試料を治療
中の癌患者から吸い出し、本発明の試験管内のシステム
で複製させることにより元の悪性疾患の再発や移転がチ
ェックされる。試験管内の骨髄複製システムはまた薬
物、食品添加物、健康食品、抗新生物薬、及び癌原性物
質の細胞毒性試験にも適用できる。比例させて用量を減
じた試験物質を本発明の試験管内の骨髄システムに添加
し、さまざまな細胞種に対するその影響を観察する。骨
髄細胞以外の種々の細胞種についても特別な物質で必要
とあればテストする。
【００１０】本発明はまた、培地中で増殖する細胞のた
めの３次元の支持体についても述べる。この支持体の存
在下での細胞の増殖はタンパク質、糖タンパク質、グリ
コサミノグリカン、細胞間質、その他の物質を支持体自
体に加えるか、これらの物質で支持体を被覆することに
よりより強められる。３次元の支持体を使用することに
より細胞を多層に増殖させられ、従って本発明の細胞培
養系は３次元的となる。この３次元的な支持体は骨髄、
皮膚、肝及びその他多くの細胞種や組織に対し３次元的
細胞培養系を創り出すために利用できる。本発明の具体
化の一例として、３次元的細胞培養系を生きた生物上に
或いはその中に移すことができるかも知れない。
めの３次元の支持体についても述べる。この支持体の存
在下での細胞の増殖はタンパク質、糖タンパク質、グリ
コサミノグリカン、細胞間質、その他の物質を支持体自
体に加えるか、これらの物質で支持体を被覆することに
よりより強められる。３次元の支持体を使用することに
より細胞を多層に増殖させられ、従って本発明の細胞培
養系は３次元的となる。この３次元的な支持体は骨髄、
皮膚、肝及びその他多くの細胞種や組織に対し３次元的
細胞培養系を創り出すために利用できる。本発明の具体
化の一例として、３次元的細胞培養系を生きた生物上に
或いはその中に移すことができるかも知れない。
【００１１】３次元の支持体は網目構造の形成に好都合
である。調製された支持体は、３次元的な生理学的細胞
培養系でその後使用するために保存することができる。
造血機能のある骨髄細胞の増殖に関する具体化の一例中
としては間質骨髄細胞が群落（subconfluency)に達する
まで、間質骨髄細胞の層を網目の上に増殖させることに
より網目構造を調製する。
である。調製された支持体は、３次元的な生理学的細胞
培養系でその後使用するために保存することができる。
造血機能のある骨髄細胞の増殖に関する具体化の一例中
としては間質骨髄細胞が群落（subconfluency)に達する
まで、間質骨髄細胞の層を網目の上に増殖させることに
より網目構造を調製する。
【００１２】
【発明の実施の形態】骨髄移植術に使用するための骨髄の複製と低温保存法 本発明は、健康な骨髄細胞を破壊したり、その機能を損
う疾病又は状態を治療するための方法を見出すためにな
されている。本発明の方法は特に血液学的悪性疾患及び
骨髄に転移するその他の新形成の治療において有効であ
る。本発明の方法は、また直接骨髄には影響を与えない
疾病によって必要とされる化学療法及び放射線療法ある
いはその一方により骨髄に対し副作用を受けた患者を治
療する際にも有効である。本発明の方法は、さらに患者
が直接骨髄を破壊する病気或いはその治療によって骨髄
が有害な影響を受けるような病気になった際に、健康な
患者から骨髄を取り出し、保存し、その後その骨髄を複
製し、再注入する方法を提供している。
う疾病又は状態を治療するための方法を見出すためにな
されている。本発明の方法は特に血液学的悪性疾患及び
骨髄に転移するその他の新形成の治療において有効であ
る。本発明の方法は、また直接骨髄には影響を与えない
疾病によって必要とされる化学療法及び放射線療法ある
いはその一方により骨髄に対し副作用を受けた患者を治
療する際にも有効である。本発明の方法は、さらに患者
が直接骨髄を破壊する病気或いはその治療によって骨髄
が有害な影響を受けるような病気になった際に、健康な
患者から骨髄を取り出し、保存し、その後その骨髄を複
製し、再注入する方法を提供している。
【００１３】本発明の方法に従って少量（10−15cc骨髄
／末梢血液懸濁液）を、提供者の腸骨稜から吸い出す。
以下の条件が満たされる時に、本発明の方法の結果は最
善となる。すなわち、１．骨髄が低温保存される時点で
その人の年齢が40歳以下である。２．その患者が病気に
冒されていない。本発明の方法は、もし物理的方法或い
は化学療法によって培養に先立ち悪性の細胞を一掃する
事ができるならば、転移性の疾病や血液の悪性疾患を持
つ特定の患者には有益であることが示されるだろう。現
在は、これらの方法は少数の細胞を使用した際に最も効
果的であり、このことは以下に示す本発明の方法の目的
によくあっていると言えるかも知れない。提供者から骨
髄を吸い出す方法は技術的にはよく知られている。提供
者から骨髄を吸い出すための器具や方法はアメリカ合衆
国特許4,481,946 及び4,486,188に見出すことができ
る。
／末梢血液懸濁液）を、提供者の腸骨稜から吸い出す。
以下の条件が満たされる時に、本発明の方法の結果は最
善となる。すなわち、１．骨髄が低温保存される時点で
その人の年齢が40歳以下である。２．その患者が病気に
冒されていない。本発明の方法は、もし物理的方法或い
は化学療法によって培養に先立ち悪性の細胞を一掃する
事ができるならば、転移性の疾病や血液の悪性疾患を持
つ特定の患者には有益であることが示されるだろう。現
在は、これらの方法は少数の細胞を使用した際に最も効
果的であり、このことは以下に示す本発明の方法の目的
によくあっていると言えるかも知れない。提供者から骨
髄を吸い出す方法は技術的にはよく知られている。提供
者から骨髄を吸い出すための器具や方法はアメリカ合衆
国特許4,481,946 及び4,486,188に見出すことができ
る。
【００１４】提供者から取り出された骨髄は、その後複
製されるか或いは後日複製させるために保存される。も
し骨髄が保存される場合は、骨髄はコンピュータで制御
された低温技術を駆使した装置を用いて増進的に凍結す
る。血液懸濁液中の新鮮な骨髄を滅菌したナンク（Nun
c) 管中に等量ずつ分注し、低温保存チェンバ室が同じ
温度（４℃）になるまで砕いた氷のはいったビーカ中に
置く。チェンバに試料を挿入する直前に凍結保護剤であ
るジメチルスルホキシドとグリセロールをそれぞれ最終
濃度が７％と５％となるように無菌的にナンク（Nunc)
管に添加する。凍結プログラムは、試料が入手された直
後から開始する。クライオメド モデルナンバー（Cryo
Med Model Number) 1010コントローラの凍結プログラム
１番を使用する。
製されるか或いは後日複製させるために保存される。も
し骨髄が保存される場合は、骨髄はコンピュータで制御
された低温技術を駆使した装置を用いて増進的に凍結す
る。血液懸濁液中の新鮮な骨髄を滅菌したナンク（Nun
c) 管中に等量ずつ分注し、低温保存チェンバ室が同じ
温度（４℃）になるまで砕いた氷のはいったビーカ中に
置く。チェンバに試料を挿入する直前に凍結保護剤であ
るジメチルスルホキシドとグリセロールをそれぞれ最終
濃度が７％と５％となるように無菌的にナンク（Nunc)
管に添加する。凍結プログラムは、試料が入手された直
後から開始する。クライオメド モデルナンバー（Cryo
Med Model Number) 1010コントローラの凍結プログラム
１番を使用する。
【００１５】この技術を用いれば、凍結し80℃の水浴中
で急速解凍した後の細胞生存率はトリパンブルー排除法
で90％を越える。さらに、元のコロニー形成単位培養
（CFU-C)の80％以上が解凍後に回収される。あらかじめ
計算された温度と時間の曲線に従った骨髄と生物材料の
凍結システムの例は、アメリカ合衆国特許4,107,937 及
び4,117,881 に示されている。より好ましいのは骨髄細
胞を細胞の全ての代謝活性がなくなる-196℃の温度で液
体窒素中において液相のまま貯蔵する方法である。
で急速解凍した後の細胞生存率はトリパンブルー排除法
で90％を越える。さらに、元のコロニー形成単位培養
（CFU-C)の80％以上が解凍後に回収される。あらかじめ
計算された温度と時間の曲線に従った骨髄と生物材料の
凍結システムの例は、アメリカ合衆国特許4,107,937 及
び4,117,881 に示されている。より好ましいのは骨髄細
胞を細胞の全ての代謝活性がなくなる-196℃の温度で液
体窒素中において液相のまま貯蔵する方法である。
【００１６】解凍後、骨髄細胞は患者に再注入されるか
複製され、その後再注入される。本発明の方法は、骨髄
移植を必要としている患者にとって数々の利点がある。
もし患者が、自分自身の細胞を受け入れる場合はこれを
自己移植と呼ぶ。このような移植では、ほとんど拒絶の
可能性はない。自己移植は、骨髄移植の拒絶反応の主な
原因である移植片対宿主の反応がない。さらに、培地中
で増殖させた際、造血細胞を物理的操作及び酵素処理或
いはその一方により容易に分離できる。このことは、骨
髄塞栓に起因する血管閉塞性の疾病の危険性を減じてい
る。さらに本発明の方法は、化学療法剤や放射線を用い
て腫瘍性疾患に対して、より積極的な治療を行なうこと
を可能にしている。現在のところ、これらの治療法の大
部分は骨髄に対するその毒性により制限を受けている。試験管内における骨髄複製システム 本発明の方法は、さらに生理学的状態に匹敵する試験管
内の条件で骨髄を複製する段階を含んでいる。さらに、
このシステムで複製された骨髄細胞には元の接種材料と
なる骨髄にすべての種類の細胞が存在すると考えられる
場合、正常な骨髄に存在するすべての細胞が含まれる。
複製され、その後再注入される。本発明の方法は、骨髄
移植を必要としている患者にとって数々の利点がある。
もし患者が、自分自身の細胞を受け入れる場合はこれを
自己移植と呼ぶ。このような移植では、ほとんど拒絶の
可能性はない。自己移植は、骨髄移植の拒絶反応の主な
原因である移植片対宿主の反応がない。さらに、培地中
で増殖させた際、造血細胞を物理的操作及び酵素処理或
いはその一方により容易に分離できる。このことは、骨
髄塞栓に起因する血管閉塞性の疾病の危険性を減じてい
る。さらに本発明の方法は、化学療法剤や放射線を用い
て腫瘍性疾患に対して、より積極的な治療を行なうこと
を可能にしている。現在のところ、これらの治療法の大
部分は骨髄に対するその毒性により制限を受けている。試験管内における骨髄複製システム 本発明の方法は、さらに生理学的状態に匹敵する試験管
内の条件で骨髄を複製する段階を含んでいる。さらに、
このシステムで複製された骨髄細胞には元の接種材料と
なる骨髄にすべての種類の細胞が存在すると考えられる
場合、正常な骨髄に存在するすべての細胞が含まれる。
【００１７】骨髄細胞は、直接提供者から得られた場合
も或いは低温保存で貯蔵されたものから使用する場合で
も、いずれの場合においてもまず最初に物理的方法によ
り小網から分離される。次に骨髄細胞を３次元の支持体
上で線維芽細胞、大食細胞、細網細胞、及び脂肪細胞を
含む正常な骨髄の間質成分と共に培養し増殖させる。脾
及び肝、或いはその一方の大食細胞の培養液又は間質細
胞のサブセットから誘導した因子もこの培養中に加え
る。
も或いは低温保存で貯蔵されたものから使用する場合で
も、いずれの場合においてもまず最初に物理的方法によ
り小網から分離される。次に骨髄細胞を３次元の支持体
上で線維芽細胞、大食細胞、細網細胞、及び脂肪細胞を
含む正常な骨髄の間質成分と共に培養し増殖させる。脾
及び肝、或いはその一方の大食細胞の培養液又は間質細
胞のサブセットから誘導した因子もこの培養中に加え
る。
【００１８】骨髄細胞は、それだけで培養した際には増
殖に限界があるが、間質細胞或いはその分泌物が存在す
る場合に限って長期間これらの培養株を増殖させること
ができる。ロング−ターム ボーン マロー カルチュ
アー，デー・ジー・ライトアンド ジェー．エス．グリ
ーンバーガ，イーディーエス．，エー．アール．リイ
ス，ニューヨーク，（１９８４年）〔Long-Term Bone M
arrow Culture, D.G.Wright & J. S. Greenberger, ed
s., A. R. Liss, New York, (1984)〕を参照のこと。
殖に限界があるが、間質細胞或いはその分泌物が存在す
る場合に限って長期間これらの培養株を増殖させること
ができる。ロング−ターム ボーン マロー カルチュ
アー，デー・ジー・ライトアンド ジェー．エス．グリ
ーンバーガ，イーディーエス．，エー．アール．リイ
ス，ニューヨーク，（１９８４年）〔Long-Term Bone M
arrow Culture, D.G.Wright & J. S. Greenberger, ed
s., A. R. Liss, New York, (1984)〕を参照のこと。
【００１９】本発明は、多くの可能性を持った造血幹細
胞の増殖を最大にする方法を追求している。この造血幹
細胞は、骨髄細胞が内因性の病気或いは環境に媒介され
て引き起こされた病気によって破壊されたり、病気の治
療に用いられた化学療法及び放射線あるいはその一方に
よって破壊された際、骨髄に最定着する能力を持ってい
る。骨髄への再定着活性が（MRA)を持つ幹細胞は、長時
間を経た骨髄培養液中で生存し複製することが示されて
きている。しかし、幹細胞、ヘモ（hemo) 造血母細胞、
造血前駆細胞、これらすべてが本発明のシステム中で複
製し増殖する。さらに、このシステム中で生理学的に同
様な分化が進行する。例えば、赤血球、骨髄球、リンパ
球、大食細胞、巨核球のコロニーを、本発明により示さ
れたようにこのシステムを用いて同じ培養システム中で
連続的に発生させることができる。
胞の増殖を最大にする方法を追求している。この造血幹
細胞は、骨髄細胞が内因性の病気或いは環境に媒介され
て引き起こされた病気によって破壊されたり、病気の治
療に用いられた化学療法及び放射線あるいはその一方に
よって破壊された際、骨髄に最定着する能力を持ってい
る。骨髄への再定着活性が（MRA)を持つ幹細胞は、長時
間を経た骨髄培養液中で生存し複製することが示されて
きている。しかし、幹細胞、ヘモ（hemo) 造血母細胞、
造血前駆細胞、これらすべてが本発明のシステム中で複
製し増殖する。さらに、このシステム中で生理学的に同
様な分化が進行する。例えば、赤血球、骨髄球、リンパ
球、大食細胞、巨核球のコロニーを、本発明により示さ
れたようにこのシステムを用いて同じ培養システム中で
連続的に発生させることができる。
【００２０】本発明のひとつの好ましい具体化の例によ
れば造血幹細胞の増殖は以下のように達成される： １．間質支持層の定着 骨髄懸濁液を3000×ｇで20分間遠心し、大食細胞、線維
芽細胞、脂肪細胞、単核の血球、細網細胞、内皮細胞及
びその他内在する細胞を含む細胞の白い基底を取り除
く。細胞は、ロスウェル パーク メモリアル インス
チュート(RoswellPark Memorial Institute) 培地1640
番又は単に“RPMI1640”と呼ばれる培地に懸濁する。RP
MI 1640 はニューヨーク グランド アイランドにある
GIBCO 社より購入する。10％の牛胎仔血清、10％馬血
清、ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、及び適当な抗生物
質をこのRPMI 1640 に加える。
れば造血幹細胞の増殖は以下のように達成される： １．間質支持層の定着 骨髄懸濁液を3000×ｇで20分間遠心し、大食細胞、線維
芽細胞、脂肪細胞、単核の血球、細網細胞、内皮細胞及
びその他内在する細胞を含む細胞の白い基底を取り除
く。細胞は、ロスウェル パーク メモリアル インス
チュート(RoswellPark Memorial Institute) 培地1640
番又は単に“RPMI1640”と呼ばれる培地に懸濁する。RP
MI 1640 はニューヨーク グランド アイランドにある
GIBCO 社より購入する。10％の牛胎仔血清、10％馬血
清、ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、及び適当な抗生物
質をこのRPMI 1640 に加える。
【００２１】これらの細胞106 個を、アメリカ合衆国、
ニューヨークのテトコ（Tetko)社から購入した滅菌ナイ
ロンメッシュをペトリ皿に入れこの上に広げる。このメ
ッシュは、25mm2 のプラスチック製の培養フラスコの内
側の大きさに合わせてあらかじめ切っておく。このメッ
シュは、 400μm2 の篩面積を持っており繊維の直径は
100μm である。
ニューヨークのテトコ（Tetko)社から購入した滅菌ナイ
ロンメッシュをペトリ皿に入れこの上に広げる。このメ
ッシュは、25mm2 のプラスチック製の培養フラスコの内
側の大きさに合わせてあらかじめ切っておく。このメッ
シュは、 400μm2 の篩面積を持っており繊維の直径は
100μm である。
【００２２】接種されたメッシュは巻きつけ、上述した
培地が５ml入った培養フラスコに入れる。メッシュは、
培養フラスコの中で巻いたものを開きフラスコの底を完
全に覆う。培養細胞は、37℃で５％のCO2 を含む空気中
で90％以上の相対湿度を保って増殖させる。線維芽細胞
が大半を占める間質細胞が最初に増殖し、メッシュの開
口部へ増殖し始める前にナイロン繊維すべてを取り囲
む。この過程におよそ14〜18日かかる。間質細胞の亜集
密（subconfluency)の程度は、造血細胞の接種前には図
に示されたものと一致していなければならない。
培地が５ml入った培養フラスコに入れる。メッシュは、
培養フラスコの中で巻いたものを開きフラスコの底を完
全に覆う。培養細胞は、37℃で５％のCO2 を含む空気中
で90％以上の相対湿度を保って増殖させる。線維芽細胞
が大半を占める間質細胞が最初に増殖し、メッシュの開
口部へ増殖し始める前にナイロン繊維すべてを取り囲
む。この過程におよそ14〜18日かかる。間質細胞の亜集
密（subconfluency)の程度は、造血細胞の接種前には図
に示されたものと一致していなければならない。
【００２３】懸濁された間質細胞は骨髄細胞について先
に述べたのと同様の技術を用いて低温保存することがで
きる。このメッシュ上の亜集密的細胞の低温保存に際し
てはナイロンメッシュを巻き、凍結保護剤であるジメチ
ルスルホキシドとグリセロールをそれぞれ最終濃度が５
％と15％になるように加えたRPMI 1640 培地を含むナン
ク管に入れる。メッシュ上の間質細胞の凍結は＋１℃か
ら−40℃まで−１℃／分の初期冷却速度で行なう。−２
ないし−３℃／分の冷却速度で−84℃の最終温度まで達
成するのが最適である。間質細胞のおよそ20〜25％がナ
イロンメッシュから剥離する。 ２．造血細胞の接種 ５〜10％の牛胎仔血清、５〜10％の馬血清、ビタミン
類、ヒドロコルチゾン類、グルタミン、及び抗生物質を
補足した改良型フィッシャーズ（Fischer's)又はマッコ
イズ（McCoy's) 5A 培地に骨髄細胞を懸濁する。これら
の細胞は、採取直後のものか或いは80℃の湯浴中で急速
に解凍された低温保存されていた試料かである。２〜５
×106 個の細胞を25mm2 のプラスチック製の培養フラス
コ中にある亜集密的間質細胞の網目上に接種し、５％の
CO2 を含む空気中で33〜34℃で増殖する。これらの培養
における相対湿度は90％以上である。３日後に培養温度
を35〜37℃に上げる。
に述べたのと同様の技術を用いて低温保存することがで
きる。このメッシュ上の亜集密的細胞の低温保存に際し
てはナイロンメッシュを巻き、凍結保護剤であるジメチ
ルスルホキシドとグリセロールをそれぞれ最終濃度が５
％と15％になるように加えたRPMI 1640 培地を含むナン
ク管に入れる。メッシュ上の間質細胞の凍結は＋１℃か
ら−40℃まで−１℃／分の初期冷却速度で行なう。−２
ないし−３℃／分の冷却速度で−84℃の最終温度まで達
成するのが最適である。間質細胞のおよそ20〜25％がナ
イロンメッシュから剥離する。 ２．造血細胞の接種 ５〜10％の牛胎仔血清、５〜10％の馬血清、ビタミン
類、ヒドロコルチゾン類、グルタミン、及び抗生物質を
補足した改良型フィッシャーズ（Fischer's)又はマッコ
イズ（McCoy's) 5A 培地に骨髄細胞を懸濁する。これら
の細胞は、採取直後のものか或いは80℃の湯浴中で急速
に解凍された低温保存されていた試料かである。２〜５
×106 個の細胞を25mm2 のプラスチック製の培養フラス
コ中にある亜集密的間質細胞の網目上に接種し、５％の
CO2 を含む空気中で33〜34℃で増殖する。これらの培養
における相対湿度は90％以上である。３日後に培養温度
を35〜37℃に上げる。
【００２４】造血細胞は亜集密的間質細胞により形成さ
れたナチュラル ポケット(naturalpokets)中で増殖
し、前駆細胞は細胞の付着層中に残る。付着層はメッシ
ュに直接付着した細胞或いはメッシュに直接付着した細
胞に付着することにより間接的につながっている細胞か
ら成る。４〜５日後、成熟顆粒球、単核細胞、及び赤血
球がサイトスピン（cytospin) 標本により観察すると非
付着層に現われているのがわかる。７〜10日後、数多く
の造血細胞のコロニーがメッシュのすき間に観察され、
形態学的には CFU-C、混合コロニー、及びリンパ様コロ
ニーである。巨核球の増殖には限界があるがこの基質中
では十分観察されるであろう。好調な培養では一週間当
り 450〜950 CFU-C が生産されるであろう。
れたナチュラル ポケット(naturalpokets)中で増殖
し、前駆細胞は細胞の付着層中に残る。付着層はメッシ
ュに直接付着した細胞或いはメッシュに直接付着した細
胞に付着することにより間接的につながっている細胞か
ら成る。４〜５日後、成熟顆粒球、単核細胞、及び赤血
球がサイトスピン（cytospin) 標本により観察すると非
付着層に現われているのがわかる。７〜10日後、数多く
の造血細胞のコロニーがメッシュのすき間に観察され、
形態学的には CFU-C、混合コロニー、及びリンパ様コロ
ニーである。巨核球の増殖には限界があるがこの基質中
では十分観察されるであろう。好調な培養では一週間当
り 450〜950 CFU-C が生産されるであろう。
【００２５】同じ個体から取り出された（自己の）造血
細胞と間質細胞とから成る培養株には一週間に２回栄養
を与えなければならない。異なる個体から取り出した
（同種異系の）間質細胞の網目上に接種された患者の骨
髄から成る培養株には非付着層からの成熟免疫適格細胞
の十分な脱集団化を確実にするために一週間に３回栄養
を与えなければならない。 ３．試験管内での骨髄複製システムにおけるバリエーシ
ョン 骨髄間質細胞の増殖促進について、骨髄間質細胞の増殖
における一時速度制限因子は骨髄間質細胞の中に含まれ
ている線維芽細胞の相対的に低い分裂指数にある。これ
らの細胞の増殖と細胞外基質成分の沈着は、１．ヘミコ
ハク酸ヒドロコルチゾン及び／または２．速い細胞分裂
をする人胎児線維芽細胞の培養液から取り出された自己
制御増殖因子を加えることにより促進される。
細胞と間質細胞とから成る培養株には一週間に２回栄養
を与えなければならない。異なる個体から取り出した
（同種異系の）間質細胞の網目上に接種された患者の骨
髄から成る培養株には非付着層からの成熟免疫適格細胞
の十分な脱集団化を確実にするために一週間に３回栄養
を与えなければならない。 ３．試験管内での骨髄複製システムにおけるバリエーシ
ョン 骨髄間質細胞の増殖促進について、骨髄間質細胞の増殖
における一時速度制限因子は骨髄間質細胞の中に含まれ
ている線維芽細胞の相対的に低い分裂指数にある。これ
らの細胞の増殖と細胞外基質成分の沈着は、１．ヘミコ
ハク酸ヒドロコルチゾン及び／または２．速い細胞分裂
をする人胎児線維芽細胞の培養液から取り出された自己
制御増殖因子を加えることにより促進される。
【００２６】メッシュ上の線維芽細胞の付着と増殖は、
１．可溶化されたＩ−IV型のコラーゲンでメッシュをあ
らかじめ被覆するか、又は２．人胎児の線維芽細胞或い
はこの型のコラーゲンを合成する能力によりサブセット
された成人線維芽細胞（以下“増殖促進線維芽細胞と呼
ぶ）により分泌されたコラーゲンを被覆又は埋め込んだ
メッシュを使用することによっても促進できる。これに
ついては、増殖促進線維芽細胞は集密に達した時点（人
胎児線維芽細胞で５〜７日、成人線維芽細胞で14〜18
日）で穏やかなトリプシン処理によりメッシュより取り
除き、１．先に述べたように間質骨髄細胞に接種する
か、２．後の使用に備えて低温保存することもできる。
１．可溶化されたＩ−IV型のコラーゲンでメッシュをあ
らかじめ被覆するか、又は２．人胎児の線維芽細胞或い
はこの型のコラーゲンを合成する能力によりサブセット
された成人線維芽細胞（以下“増殖促進線維芽細胞と呼
ぶ）により分泌されたコラーゲンを被覆又は埋め込んだ
メッシュを使用することによっても促進できる。これに
ついては、増殖促進線維芽細胞は集密に達した時点（人
胎児線維芽細胞で５〜７日、成人線維芽細胞で14〜18
日）で穏やかなトリプシン処理によりメッシュより取り
除き、１．先に述べたように間質骨髄細胞に接種する
か、２．後の使用に備えて低温保存することもできる。
【００２７】本発明の一つの具体例では、コラーゲンや
その他の細胞外基質成分を合成している増殖促進線維芽
細胞を亜集密に達するまでメッシュ上で増殖させる。造
血細胞と間質骨髄細胞の両方の混合物を、次にこの亜集
密的増殖促進線維芽細胞の網目に接種する。増殖促進線
維芽細胞の増殖、サブセッティング、低温保存の方法は
以下に示すとおりである。
その他の細胞外基質成分を合成している増殖促進線維芽
細胞を亜集密に達するまでメッシュ上で増殖させる。造
血細胞と間質骨髄細胞の両方の混合物を、次にこの亜集
密的増殖促進線維芽細胞の網目に接種する。増殖促進線
維芽細胞の増殖、サブセッティング、低温保存の方法は
以下に示すとおりである。
【００２８】ａ．増殖促進線維芽細胞の培養 線維芽細胞は２〜10％牛胎仔血清又は２〜10％馬血清に
１μｇ／mlのヘミコハク酸ヒドロコルチゾンと２μｇ／
mlのゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン
及びフンギゾン（fungizone)をあらかじめ加え、これを
RPMI 1640 に添加してこの中で増殖させる。培養株は５
％のCO2 を含む空気中、37℃、相対湿度90％以上で増殖
させる。
１μｇ／mlのヘミコハク酸ヒドロコルチゾンと２μｇ／
mlのゲンタマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン
及びフンギゾン（fungizone)をあらかじめ加え、これを
RPMI 1640 に添加してこの中で増殖させる。培養株は５
％のCO2 を含む空気中、37℃、相対湿度90％以上で増殖
させる。
【００２９】ｂ．増殖促進線維芽細胞のサブセッティン
グ 骨髄懸濁液のバフィーコートから取り出した線維芽細
胞、死体の肝から取り出した線維芽細胞、又は皮膚の線
維芽細胞を5.０×106 個、マイクロタイターウェル（１
mm2 ) に入れ、集密化するまで増殖させる。これらの細
胞はCa++或いはMg++を含まないハンクの均衡塩類溶液で
通常４〜５回繰り返し洗うことにより培養ウェルより取
り出す。マイクロタイタープレート上に残った基質は、
存在するコラーゲンの種類を確認するために間接免疫蛍
光法により検査する。この方法では、さまざまな基質成
分に対するモノクローナル抗体とフルオレセインイソチ
オシアネートでラベルした兎の抗マウス免疫グロブリン
Ｇを用いる。懸濁された細胞は、各々の生成物を合成す
る能力のある細胞の亜集団を分離するためにコラーゲン
Ｉ−IV型、エスラチン、トロポエラスチン、及びフィブ
ロネクチンに対して作られたモノクローナル抗体で処理
する。この細胞を、モノクローナル抗体が付着したこれ
らの細胞を損傷するか破壊する働きのあるモルモットの
補体で処理する。生きている細胞は、先に述べたように
ミクロタイターウェルに再び入れ、集密化まで増殖させ
取り出す。分離技術の効率は、モノクローナル抗体と間
接免疫蛍光法によりこれらの細胞から分泌された基質を
調べることにより確かめられる。
グ 骨髄懸濁液のバフィーコートから取り出した線維芽細
胞、死体の肝から取り出した線維芽細胞、又は皮膚の線
維芽細胞を5.０×106 個、マイクロタイターウェル（１
mm2 ) に入れ、集密化するまで増殖させる。これらの細
胞はCa++或いはMg++を含まないハンクの均衡塩類溶液で
通常４〜５回繰り返し洗うことにより培養ウェルより取
り出す。マイクロタイタープレート上に残った基質は、
存在するコラーゲンの種類を確認するために間接免疫蛍
光法により検査する。この方法では、さまざまな基質成
分に対するモノクローナル抗体とフルオレセインイソチ
オシアネートでラベルした兎の抗マウス免疫グロブリン
Ｇを用いる。懸濁された細胞は、各々の生成物を合成す
る能力のある細胞の亜集団を分離するためにコラーゲン
Ｉ−IV型、エスラチン、トロポエラスチン、及びフィブ
ロネクチンに対して作られたモノクローナル抗体で処理
する。この細胞を、モノクローナル抗体が付着したこれ
らの細胞を損傷するか破壊する働きのあるモルモットの
補体で処理する。生きている細胞は、先に述べたように
ミクロタイターウェルに再び入れ、集密化まで増殖させ
取り出す。分離技術の効率は、モノクローナル抗体と間
接免疫蛍光法によりこれらの細胞から分泌された基質を
調べることにより確かめられる。
【００３０】造血細胞が最もよく増殖するためには、基
質にコラーゲンIII型、IV型及びＩ型がおよそ６：３：
１の割合で含まれている必要がある。 ｃ．増殖促進線維芽細胞の低温保存 増殖促進線維芽細胞は間質細胞について先に述べたのと
同じ技術を用いて低温保存することができる。間質細胞
と同様に、増殖促進線維芽細胞のいくらかも、また凍結
中にメッシュから剥離する。しかし、この基質は依然と
して骨髄間質細胞の付着に役立ち、造血細胞の増殖の助
けとなる基質の完成に必要となる時間を短縮させる。 （単核細胞の接種）骨髄細胞培養株の長期間の増殖を促
進するために末梢血液の単核細胞をフイコル−パイパク
（Ficoll-hypaque) 比重遠心法又はパーコール（Percol
l)勾配法によってヘパリンを加えた懸濁液より調製す
る。末梢血液細胞と骨髄造血細胞は同じ個体から取り出
す（自己由来）。これらの細胞は、静脈穿刺により採取
し骨髄の試料を取り出した時点で低温保存する。培養の
過程でさらに末梢血液細胞が必要な場合は羅病している
患者から採血してもよい。しかし転移性の疾病が疑われ
る場合には試料から悪性細胞を先に述べたように一掃す
る必要がある。５×105〜106 の単核細胞（この段階で
は単核細胞層の中でも単球の亜集団がより好ましい細胞
型である）を、骨髄造血細胞を最初に接種してから４〜
５日後の網目に接種する。この後、３週間ごとに単核細
胞を接種していく。この方法により、一週間ごとの観察
で、造血が10〜13％増強される。 （培養株の永続化と前駆細胞の預託）本発明者らの実験
では、集密的間質細胞培養株は全く、或いは最も良い状
態でも、ほとんど造血を助けない。間質由来の必要な増
殖／制御因子が与えられた場合は人の造血前駆細胞の無
期限の増殖が可能となる。
質にコラーゲンIII型、IV型及びＩ型がおよそ６：３：
１の割合で含まれている必要がある。 ｃ．増殖促進線維芽細胞の低温保存 増殖促進線維芽細胞は間質細胞について先に述べたのと
同じ技術を用いて低温保存することができる。間質細胞
と同様に、増殖促進線維芽細胞のいくらかも、また凍結
中にメッシュから剥離する。しかし、この基質は依然と
して骨髄間質細胞の付着に役立ち、造血細胞の増殖の助
けとなる基質の完成に必要となる時間を短縮させる。 （単核細胞の接種）骨髄細胞培養株の長期間の増殖を促
進するために末梢血液の単核細胞をフイコル−パイパク
（Ficoll-hypaque) 比重遠心法又はパーコール（Percol
l)勾配法によってヘパリンを加えた懸濁液より調製す
る。末梢血液細胞と骨髄造血細胞は同じ個体から取り出
す（自己由来）。これらの細胞は、静脈穿刺により採取
し骨髄の試料を取り出した時点で低温保存する。培養の
過程でさらに末梢血液細胞が必要な場合は羅病している
患者から採血してもよい。しかし転移性の疾病が疑われ
る場合には試料から悪性細胞を先に述べたように一掃す
る必要がある。５×105〜106 の単核細胞（この段階で
は単核細胞層の中でも単球の亜集団がより好ましい細胞
型である）を、骨髄造血細胞を最初に接種してから４〜
５日後の網目に接種する。この後、３週間ごとに単核細
胞を接種していく。この方法により、一週間ごとの観察
で、造血が10〜13％増強される。 （培養株の永続化と前駆細胞の預託）本発明者らの実験
では、集密的間質細胞培養株は全く、或いは最も良い状
態でも、ほとんど造血を助けない。間質由来の必要な増
殖／制御因子が与えられた場合は人の造血前駆細胞の無
期限の増殖が可能となる。
【００３１】例えば、最初の骨髄試料を、およそ106 個
の造血細胞を含むいくつかの試料に分割する。これらの
各々を、亜集密的間質細胞の網目上に接種する。この培
養株を倒立顕微鏡を用いて直接観察し、サイトスピン
（cytospin) 標本上に見られる非付着細胞の鑑別計数を
行なうことによりモニターする。集密に達する前に培養
株をコラゲナーゼで処理し、およそ６〜10分間穏やかに
超音波処理する。造血細胞及び間質細胞は密度勾配法で
分離する。造血細胞は血球計算板を用いて計算し、およ
そ50％を先に述べた方法で低温保存する。造血細胞の残
りの50％は、およそ106 個の細胞からなる試料に分割
し、平行して激しく揺らして増殖させてあった亜集密的
間質細胞培養株上へ接種する。これらが集密に達し始め
た時、同様の手順を実施する。
の造血細胞を含むいくつかの試料に分割する。これらの
各々を、亜集密的間質細胞の網目上に接種する。この培
養株を倒立顕微鏡を用いて直接観察し、サイトスピン
（cytospin) 標本上に見られる非付着細胞の鑑別計数を
行なうことによりモニターする。集密に達する前に培養
株をコラゲナーゼで処理し、およそ６〜10分間穏やかに
超音波処理する。造血細胞及び間質細胞は密度勾配法で
分離する。造血細胞は血球計算板を用いて計算し、およ
そ50％を先に述べた方法で低温保存する。造血細胞の残
りの50％は、およそ106 個の細胞からなる試料に分割
し、平行して激しく揺らして増殖させてあった亜集密的
間質細胞培養株上へ接種する。これらが集密に達し始め
た時、同様の手順を実施する。
【００３２】この技術は、１．必要とされる増殖因子を
生産する微細環境を提供することにより造血細胞の増殖
を永続化する、２．移植を実施するのに十分な数が達成
されるまで造血前駆細胞を預けておく永続的預託機関を
つくることにより達成される。 （細胞の生産物による造血細胞の増殖の調整）現在人の
骨髄をさまざまな細胞成分に分け、別々の培養株として
継代培養する技術が存在している。大食細胞、細網細
胞、脂肪細胞、及び線維芽細胞は別々に増殖させること
ができ、その分泌活性は、さまざまな試薬で処理するこ
とにより変化させられる。線維芽細胞の調整は先に記述
したとおりである。
生産する微細環境を提供することにより造血細胞の増殖
を永続化する、２．移植を実施するのに十分な数が達成
されるまで造血前駆細胞を預けておく永続的預託機関を
つくることにより達成される。 （細胞の生産物による造血細胞の増殖の調整）現在人の
骨髄をさまざまな細胞成分に分け、別々の培養株として
継代培養する技術が存在している。大食細胞、細網細
胞、脂肪細胞、及び線維芽細胞は別々に増殖させること
ができ、その分泌活性は、さまざまな試薬で処理するこ
とにより変化させられる。線維芽細胞の調整は先に記述
したとおりである。
【００３３】３次元の網目上の長期間の人骨髄培養株中
の造血もまた以下の様な培養法で増殖させた時、骨髄外
の大食細胞（Kupffer(クッパー）細胞）の分泌物により
調整できる。クッパー細胞はプロナーゼで分解後器官支
質から分離する。簡単に示すと、組織標本をプロナーゼ
［0.２％プロナーゼ溶液〔カルバイオケム（Calbioche
m) 〕及びゲイ（Gey)の均衡塩類溶液（BSS)］中で穏や
かに攪拌しながら１時間保温する。溶液のpHは１規定の
NaOHで7.３〜7.５に維持する。デオキシリボヌクレアー
ゼ（0.５mg）（カルバイオケム）を上記の過程を通して
30分おきに加え、得られた細胞懸濁液を濾過し、 350×
Ｇで10分間遠心分離処理する。ペレットはゲイズ（Gey'
s) BSSに再懸濁し、沿岸細胞（大食細胞及び内皮細胞）
を細胞破壊片及び成熟血液細胞からパーコール（Percol
l)〔ファーマシア（Pharmacia)〕勾配法を用いて分離す
る。この結果得られた細胞フラクションを３分間ずつ３
回、10％牛胎仔血清を添加し改良したダルベッコ（Dulb
ecco) 培地で洗い、３〜４×106 個の細胞を含む量をプ
ラスチック製の培養皿に入れる。
の造血もまた以下の様な培養法で増殖させた時、骨髄外
の大食細胞（Kupffer(クッパー）細胞）の分泌物により
調整できる。クッパー細胞はプロナーゼで分解後器官支
質から分離する。簡単に示すと、組織標本をプロナーゼ
［0.２％プロナーゼ溶液〔カルバイオケム（Calbioche
m) 〕及びゲイ（Gey)の均衡塩類溶液（BSS)］中で穏や
かに攪拌しながら１時間保温する。溶液のpHは１規定の
NaOHで7.３〜7.５に維持する。デオキシリボヌクレアー
ゼ（0.５mg）（カルバイオケム）を上記の過程を通して
30分おきに加え、得られた細胞懸濁液を濾過し、 350×
Ｇで10分間遠心分離処理する。ペレットはゲイズ（Gey'
s) BSSに再懸濁し、沿岸細胞（大食細胞及び内皮細胞）
を細胞破壊片及び成熟血液細胞からパーコール（Percol
l)〔ファーマシア（Pharmacia)〕勾配法を用いて分離す
る。この結果得られた細胞フラクションを３分間ずつ３
回、10％牛胎仔血清を添加し改良したダルベッコ（Dulb
ecco) 培地で洗い、３〜４×106 個の細胞を含む量をプ
ラスチック製の培養皿に入れる。
【００３４】１日間培養した後、培養液で洗うことによ
り非付着細胞を取り除き、付着細胞は33℃、室内の空気
に６％のCO2 を混ぜた中で、相対湿度を80％以上に維持
する。これらの細胞の増殖及び／又は分泌活性を以下の
条件により促進することができる。１．CO2 ： O2 の割
合を変化させる、２．培養株をラテックスビースで処理
する、３．培養株をシリカで処理する、４．プロスタグ
ランジン E2 、 E1 、又は F2αを培地に添加する、
５．培地にインターロイキン１又はインターロイキン２
を添加する。大食細胞分泌物は、これらの方法及び試薬
により調整できる。
り非付着細胞を取り除き、付着細胞は33℃、室内の空気
に６％のCO2 を混ぜた中で、相対湿度を80％以上に維持
する。これらの細胞の増殖及び／又は分泌活性を以下の
条件により促進することができる。１．CO2 ： O2 の割
合を変化させる、２．培養株をラテックスビースで処理
する、３．培養株をシリカで処理する、４．プロスタグ
ランジン E2 、 E1 、又は F2αを培地に添加する、
５．培地にインターロイキン１又はインターロイキン２
を添加する。大食細胞分泌物は、これらの方法及び試薬
により調整できる。
【００３５】これらの大食細胞の分泌物により調整され
た培地は、長期間の骨髄培養株の赤血球生成／顆粒球生
成の割合を生体内における状態と同じようにするために
使われる。本発明の方法は骨髄移植を必要とする患者に
対し幾つかの有益な点を持っている。患者の状態をモニターするための試験管内における骨髄
複製システムの使用 癌或いはその他の病気にかかっている患者において、患
者の状態を、骨髄の一部を吸い出しこれを検査してモニ
ターすることはしばしば有効な手段である。このように
して転移や再発を臨床上明らかになる以前に検知するこ
とができる。骨髄細胞を検査することにより検知できる
その他の状態にある患者も、またこの方法によりモニタ
ーできる。
た培地は、長期間の骨髄培養株の赤血球生成／顆粒球生
成の割合を生体内における状態と同じようにするために
使われる。本発明の方法は骨髄移植を必要とする患者に
対し幾つかの有益な点を持っている。患者の状態をモニターするための試験管内における骨髄
複製システムの使用 癌或いはその他の病気にかかっている患者において、患
者の状態を、骨髄の一部を吸い出しこれを検査してモニ
ターすることはしばしば有効な手段である。このように
して転移や再発を臨床上明らかになる以前に検知するこ
とができる。骨髄細胞を検査することにより検知できる
その他の状態にある患者も、またこの方法によりモニタ
ーできる。
【００３６】本発明の骨髄複数システムを使用して吸引
した骨髄の試料中での長期間の細胞の増殖は、クローン
の転移細胞及び染色体に異常を伴った造血細胞の検知の
可能性を高める。これらの細胞は、新しく吸引された
（培養されていない）骨髄の従来の塗抹標本では検知漏
れとなる。細胞毒性システムにおける試験管内骨髄複製システムの
使用 薬物、抗新生物薬、癌原性物質、食品添加物、及びその
他骨髄に関係する物質の骨髄に対する細胞毒性は、本発
明の試験管内骨髄複製システムを用いてテストされる。
した骨髄の試料中での長期間の細胞の増殖は、クローン
の転移細胞及び染色体に異常を伴った造血細胞の検知の
可能性を高める。これらの細胞は、新しく吸引された
（培養されていない）骨髄の従来の塗抹標本では検知漏
れとなる。細胞毒性システムにおける試験管内骨髄複製システムの
使用 薬物、抗新生物薬、癌原性物質、食品添加物、及びその
他骨髄に関係する物質の骨髄に対する細胞毒性は、本発
明の試験管内骨髄複製システムを用いてテストされる。
【００３７】まず最初に、骨髄細胞（間質細胞及び造血
細胞を含む）の増殖中の培養株を作る。その後、この培
養株をテストする物質のさまざまな濃度に曝す。テスト
物質と共に培養した後、培養株を位相差顕微鏡で検査す
ることにより最大耐量（HTD)〔形態学上の異常が最も早
く出現する際のテスト物質の濃度〕を決定する。細胞毒
性試験はこの３次元システムで細胞の生存能を調べるた
めのさまざまな超生体染色色素を用いてこうした技術に
習熟している人々にはすでに十分知られている技術を用
いて実施することができる。HTD 決定はさらに他の試験
のための濃度範囲を提供することとなる。
細胞を含む）の増殖中の培養株を作る。その後、この培
養株をテストする物質のさまざまな濃度に曝す。テスト
物質と共に培養した後、培養株を位相差顕微鏡で検査す
ることにより最大耐量（HTD)〔形態学上の異常が最も早
く出現する際のテスト物質の濃度〕を決定する。細胞毒
性試験はこの３次元システムで細胞の生存能を調べるた
めのさまざまな超生体染色色素を用いてこうした技術に
習熟している人々にはすでに十分知られている技術を用
いて実施することができる。HTD 決定はさらに他の試験
のための濃度範囲を提供することとなる。
【００３８】一度試験の範囲が確立されれば、テスト物
質のさまざまな濃度について骨髄培養株を構成するさま
ざまな細胞型の生存能力、増殖、及び／または形態に対
する影響をよく知られた方法で調べられることができ
る。本発明で示されたようなその他の３次元細胞培養シ
ステムを細胞毒性試験に使用することができる。３次元細胞培養シテテムの確立 本発明は３次元の支持体及びその３次元的、多重層細胞
培養システムのための枠構造としての利用を明らかにす
る。これまでに知られている組織培養システムにおいて
は、細胞は単層で増殖した。本発明に従い３次元の支持
体上で増殖した細胞は、細胞基質を形成しながら多重層
を成して増殖する。この３次元的細胞培養システムは、
これまでに記述されている単層の組織培養システムに比
べ、はるかに生体内で見られる生理学的状態に近い。本
発明の一つの具体例では３次元の細胞培養システムは生
きている生物上に或いはその中へ移すことができる。
質のさまざまな濃度について骨髄培養株を構成するさま
ざまな細胞型の生存能力、増殖、及び／または形態に対
する影響をよく知られた方法で調べられることができ
る。本発明で示されたようなその他の３次元細胞培養シ
ステムを細胞毒性試験に使用することができる。３次元細胞培養シテテムの確立 本発明は３次元の支持体及びその３次元的、多重層細胞
培養システムのための枠構造としての利用を明らかにす
る。これまでに知られている組織培養システムにおいて
は、細胞は単層で増殖した。本発明に従い３次元の支持
体上で増殖した細胞は、細胞基質を形成しながら多重層
を成して増殖する。この３次元的細胞培養システムは、
これまでに記述されている単層の組織培養システムに比
べ、はるかに生体内で見られる生理学的状態に近い。本
発明の一つの具体例では３次元の細胞培養システムは生
きている生物上に或いはその中へ移すことができる。
【００３９】この３次元の支持体は、以下の条件を満た
すどのような材料でもよい。１．細胞がそれに付着する
もの（或いは細胞がそれに付着するように装飾できるも
の）及び、２．細胞が２層以上増殖できるもの。この３
次元の支持体は本発明における好ましい具体例ではメッ
シュである。この３次元細胞培養システムは、骨髄、皮
膚、肝、及びその他多くの種類の細胞や組織に適用でき
るものと期待されている。例えば、３次元の皮膚細胞培
養システムは以下のように作られる。
すどのような材料でもよい。１．細胞がそれに付着する
もの（或いは細胞がそれに付着するように装飾できるも
の）及び、２．細胞が２層以上増殖できるもの。この３
次元の支持体は本発明における好ましい具体例ではメッ
シュである。この３次元細胞培養システムは、骨髄、皮
膚、肝、及びその他多くの種類の細胞や組織に適用でき
るものと期待されている。例えば、３次元の皮膚細胞培
養システムは以下のように作られる。
【００４０】１．線維芽細胞をメッシュに付着させ、７
〜９日間増殖させる。試験管内骨髄複製システムで使用
された増殖促進線維芽細胞に関して先に述べた様にコラ
ーゲンＩ型及びIII型を沈着する。 ２．メラノサイトを処理されたメッシュ上につけ５日間
増殖させる。 ３．ケラチン細胞を亜集密的メラノサイト上に接種す
る。
〜９日間増殖させる。試験管内骨髄複製システムで使用
された増殖促進線維芽細胞に関して先に述べた様にコラ
ーゲンＩ型及びIII型を沈着する。 ２．メラノサイトを処理されたメッシュ上につけ５日間
増殖させる。 ３．ケラチン細胞を亜集密的メラノサイト上に接種す
る。
【００４１】本発明を、それぞれについての具体例に言
及しながら詳細に説明してきたが、そのさまざまなバリ
エーションが、特許請求の範囲から逸脱することなく可
能であることが理解されるであろう。
及しながら詳細に説明してきたが、そのさまざまなバリ
エーションが、特許請求の範囲から逸脱することなく可
能であることが理解されるであろう。
【００４２】
【発明の効果】本発明により、健康な骨髄細胞を破壊し
たりその機能を損なう疾病の治療法が提供された。
たりその機能を損なう疾病の治療法が提供された。
【図１】図１は、本発明で有用である一つの網目構造10
を示す。この網目構造10は、縦糸12と横糸13を含んでい
る。図に示されているように、間質細胞14が12と13の糸
の上に増殖しているのがわかる。
を示す。この網目構造10は、縦糸12と横糸13を含んでい
る。図に示されているように、間質細胞14が12と13の糸
の上に増殖しているのがわかる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ノートン，ゲイル ケイ アメリカ合衆国 10598 ニューヨーク ヨークタウン ハイツ グイン ドライヴ アール ディー ２ ボックス ビー・ 339
Claims (18)
- 【請求項１】(a) 移植すべき細胞型から得られた実質細
胞をin vitroで培養して増殖させ；そして(b) 増殖した
実質細胞をin vivo 移植する；ことを含む、ヒト以外の
哺乳動物への細胞のin vivo 移植方法。 - 【請求項２】前記の培養が、 (a) 間質細胞によって橋かけされた隙間を有する３次元
構造に構成された生物適合性の非生存物質から成る枠構
造に付着しかつ実質的に該枠構造を覆っている間質細胞
と、該間質細胞により自然界で分泌される結合組織タン
パク質とを含むin vitroで作製された生存間質組織に実
質細胞を接種し；そして(b) 接種した生存間質組織を栄
養培地中でインキュベートして接種細胞を培養下で増殖
させる；ことを含む、請求項１記載の移植方法。 - 【請求項３】間質細胞が線維芽細胞である、請求項２記
載の方法。 - 【請求項４】間質細胞が線維芽細胞と内皮細胞、周皮細
胞、大食細胞、単核細胞、白血球、形質細胞、マスト細
胞または脂肪細胞との組合せである、請求項２記載の方
法。 - 【請求項５】枠構造が生物分解性の物質から構成されて
いる、請求項２記載の方法。 - 【請求項６】生物分解性の物質が綿、ポリグリコール
酸、腸線縫合糸、セルロース、ゼラチン、またはデキス
トランである、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】枠構造が非生物分解性物質から構成されて
いる、請求項２記載の方法。 - 【請求項８】非生物分解性物質がポリアミド、ポリエス
テル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレー
ト、ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオ
ロエチレン、またはニトロセルロース化合物である、請
求項７記載の方法。 - 【請求項９】枠構造がコラーゲンで予備被覆されてい
る、請求項５〜８のいずれか１つに記載の方法。 - 【請求項１０】枠構造がメッシュである、請求項２〜８
のいずれか１つに記載の方法。 - 【請求項１１】枠構造がメッシュである、請求項９記載
の方法。 - 【請求項１２】(a) 造血細胞をin vitroで培養して増殖
させ；そして(b) 増殖した造血細胞をin vivo 移植す
る；ことを含む、ヒト以外の哺乳動物への骨髄細胞のin
vivo 移植方法。 - 【請求項１３】前記の培養が、 (a) 間質細胞によって橋かけされた隙間を有する３次元
構造に構成された生物適合性の非生存物質から成る枠構
造に付着しかつ実質的に該枠構造を覆っている間質細胞
と、該間質細胞により自然界で分泌される結合組織タン
パク質とを含むin vitroで作製された生存間質組織に造
血細胞を接種し；そして(b) 接種した生存間質組織を栄
養培地中でインキュベートして接種細胞を培養下で増殖
させる；ことを含む、請求項１２記載の骨髄細胞の移植
方法。 - 【請求項１４】(a) メラノサイトおよびケラチノサイト
をin vitroで培養して増殖させ；そして(b) 増殖したメ
ラノサイトおよびケラチノサイトをin vivo 移植する；
ことを含む、ヒト以外の哺乳動物への皮膚細胞のin viv
o 移植方法。 - 【請求項１５】前記の培養が、 (a) 間質細胞によって橋かけされた隙間を有する３次元
構造に構成された生物適合性の非生存物質から成る枠構
造に付着しかつ実質的に該枠構造を覆っている間質細胞
と、該間質細胞により自然界で分泌される結合組織タン
パク質とを含むin vitroで作製された生存間質組織にメ
ラノサイトおよびケラチノサイトを接種し；そして(b)
接種した生存間質組織を栄養培地中でインキュベートし
て接種細胞を培養下で増殖させる；ことを含む、請求項
１４記載の皮膚細胞の移植方法。 - 【請求項１６】間質細胞が集密的である、請求項１５記
載の皮膚細胞の移植方法。 - 【請求項１７】(a) 肝細胞をin vitroで培養して増殖さ
せ；そして(b) 増殖した肝細胞をin vivo 移植する；こ
とを含む、ヒト以外の哺乳動物への肝臓細胞のin vivo
移植方法。 - 【請求項１８】前記の培養が、 (a) 間質細胞によって橋かけされた隙間を有する３次元
構造に構成された生物適合性の非生存物質から成る枠構
造に付着しかつ実質的に該枠構造を覆っている間質細胞
と、該間質細胞により自然界で分泌される結合組織タン
パク質とを含むin vitroで作製された生存間質組織に肝
細胞を接種し；そして(b) 接種した生存間質組織を栄養
培地中でインキュベートして接種細胞を培養下で増殖さ
せる；ことを含む、請求項１７記載の肝臓細胞の移植方
法。
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US85356986A | 1986-04-18 | 1986-04-18 | |
| US853569 | 1986-04-18 | ||
| US07/036,154 US4721096A (en) | 1986-04-18 | 1987-04-03 | Process for replicating bone marrow in vitro and using the same |
| US036154 | 1987-04-03 | ||
| US3811087A | 1987-04-14 | 1987-04-14 | |
| US038110 | 1987-04-14 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62502719A Division JP2857392B2 (ja) | 1986-04-18 | 1987-04-15 | 骨髄の複製方法およびその組織の試験管内複製法とその使用法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10114664A true JPH10114664A (ja) | 1998-05-06 |
| JP3032492B2 JP3032492B2 (ja) | 2000-04-17 |
Family
ID=27364979
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62502719A Expired - Lifetime JP2857392B2 (ja) | 1986-04-18 | 1987-04-15 | 骨髄の複製方法およびその組織の試験管内複製法とその使用法 |
| JP9268792A Expired - Fee Related JP3032492B2 (ja) | 1986-04-18 | 1997-10-01 | 骨髄の複製方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62502719A Expired - Lifetime JP2857392B2 (ja) | 1986-04-18 | 1987-04-15 | 骨髄の複製方法およびその組織の試験管内複製法とその使用法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0309456B1 (ja) |
| JP (2) | JP2857392B2 (ja) |
| KR (1) | KR0142885B1 (ja) |
| AT (1) | ATE127692T1 (ja) |
| AU (3) | AU615414B2 (ja) |
| BG (1) | BG51337A3 (ja) |
| BR (1) | BR8707673A (ja) |
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| DK (1) | DK665687A (ja) |
| FI (1) | FI100249B (ja) |
| HK (1) | HK1007684A1 (ja) |
| HU (1) | HU202578B (ja) |
| NO (1) | NO179181C (ja) |
| RO (1) | RO106655B1 (ja) |
| WO (1) | WO1987006120A1 (ja) |
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| JP2012506258A (ja) * | 2008-10-22 | 2012-03-15 | リジーンメッド インコーポレイテッド | 培養システム |
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| US5567612A (en) * | 1986-11-20 | 1996-10-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making |
| US5759830A (en) * | 1986-11-20 | 1998-06-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Three-dimensional fibrous scaffold containing attached cells for producing vascularized tissue in vivo |
| US5736372A (en) * | 1986-11-20 | 1998-04-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Biodegradable synthetic polymeric fibrous matrix containing chondrocyte for in vivo production of a cartilaginous structure |
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| US5709854A (en) | 1993-04-30 | 1998-01-20 | Massachusetts Institute Of Technology | Tissue formation by injecting a cell-polymeric solution that gels in vivo |
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1987
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