KR0142885B1 - 골수의 복제방법 및 시험에서의 다른 기관의 복제방법 그리고 이들의 용도 - Google Patents

골수의 복제방법 및 시험에서의 다른 기관의 복제방법 그리고 이들의 용도

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KR0142885B1
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Abstract

내용 없음

Description

골수의 복제방법 및 시험에서의 다른 기관의 복제방법 그리고 이들의 용도
제1도는 생장하는 골수기질 세포를 가진 메쉬워크를 나타내며 1.65 배율된 전자현미경 주사를 나타낸다.
*도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명
10:메쉬워크 12:날줄
13:씨줄 14:기질세포
골수의 이식방법은 공지되어 있다. 일반적으로, 골수이식은 건강한 골수세포를 파괴하고 이의 기능을 억제하는 암과 같은 질병으로 고통을 당하는 환자에 실시한다. 또한, 화학요법이나 방사선 치료와 같은 치료는 심지어 골수가 치료를 받고 있는 질병에 의해서 직접적인 영향을 받지않는 경우에서도 악영향을 미친다. 골수이식의 공지된 방법은 많은 불리한 점을 내포하고 있다. 골수이식 거부의 주요 요인중 한가지는 한사람으로부터 제거한 골수를 다른 사람에 이식할 때 발생되는 식접용편 대 숙주 반응이 된다. 골수이식의 실패의 또 다른 주요 원인은 골수 색전으로 발생되는 혈관 폐쇄질병이 된다. 현재에는 화학요법과 방사선 치료 그리고 이 골수의 재주사수혈을 조합시키기 전에 사람의 골수를 제거하고 저장하는 방법이 존재한다(예로서 자가이식). 그러나, 환자는 종종 심지어 골수를 처음으로 제거할 때 이미 질병이 있었던 관계로 인하여 식접용편이 발생한다 하더라도 이 질병의 재발 때문에 고통을 겪는다.
그러므로, 본 발명의 목적은 건강한 골수세포를 파괴하거나 또는 이들의 기능적 복제능력을 약화시키는 질병을 치료하는 방법을 제공하는 것이며, 이 방법은 현재의 골수이식 기술의 알려진 불리한 점들을 야기시키지 않는다.
본 발명의 또다른 목적은 골수이식에 의한 질병을 치료하는 방법을 제공하는 것인데 이 방법은 식접용편 대 숙주 반응을 일으키지 않는다.
본 발명의 또다른 목적은 골수이식에 의한 질병을 치료하는 방법을 제공하는 것인데, 이 방법은 골수섹전의 형성을 유발하지 않는다.
본 발명의 또다른 목적은 환자에서 골수를 흡입하고, 인공조건에서 골수세포를 복제하고 다음에 이렇게 복제된 골수세포를 환자속으로 다시 재주사 수혈시킴에 의하여 건강한 골수세포를 파괴하는 질병이나 상태를 치료하는 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 화학요법 및 또는 방사선 치료에 의해서 악영향을 받은 골수의 기능을 증대시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 골수에 전이되는 혈핵학적 악성 및 기타 신생물의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 아래의 상세설명을 참조하면 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 분명해질 것이다.
본 발명은 생장하는 골수기질 세포를 가진 메쉬워크(meshwork)를 나타내는 1.65 배율로된 전자현미경의 주사를 나타내는 아래의 도면을 참조하면 잘 이해될 것이다.
본 발명에 따라서, 골수가 파괴되었거나 또는 기능을 상실한 사람을 치료하는 방법을 제공한다. 본 방법은 아래의 단계를 포함한다:
Ⅰ. 공급자로부터 골수시료를 체취하고;다음에
Ⅱ. 이 골수 시료를 인공조건에서 복제하여 골수를 재집단하는 능력을 가지는 조혈성 간(幹)세포를 포함하는 복제된 골수를 생성하고, 이것의 일부는 나중에 사용하기 위하여 한냉 보관한다.
Ⅲ. 조혈성 간세포를 포함하는 복제된 골수를 인체에 주입하여 인체에서 조혈성을 복원한다.
본 발명에 따라서, 건강한 골수세포가 파괴되었거나 그 기능이 약화된 질병이나 상대를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 골수에 전이된 혈액학적 악성과 다른 신생물을 치료하는데 특별히 효과가 있다. 본 발명의 방법은 아래의 단계를 포함한다; 건강한 사람으로부터 소량의 골수를 흡입하고; 전술한 세포를 한냉보관하고; 인공조건에서 이 골수세포를 복제하여 자가의 재주입을 위해 충분한 수가 되게 골수의 수를 증가시키며, 이수는 환자에서 원래에 제거할때의 수보다 커야하며; 다음에 이 골수세포를 환자속으로 재주입한다.
본 발명의 구체예에 따라서 골수세포를 환자에게 흡입한 직후에 한냉 보관하거나 또는 동결하고 다음에 녹여서 복제한다. 본 발명의 또다른 구체예에 따라서, 동종의 골수이식을 한사람에서 골수를 흡입하고, 인공 조건에서 이 골수를 복제하고 그리고 이 복제된 골수세포를 또다른 사람에게 재주입하여 실시한다.
또한 본 발명의 인공조건 골수복제 시스템은 골수에 영향을 미치는 조건과 관련하여 환자를 감시하는 수단도 제공한다. 예를 들면, 본래의 악성의 재발이나 전이를 점검하기 위하여 소량의 골수시료를 치료받은 암환자에게서 흡입하고 본 발명의 인공조건 시스템에서 복제한다.
또한 이 인공조건 골수 복제시스템은 약품, 식품첨가제, 보건제품, 항-종양제, 및 발암물질의 세포독성 시험에 적용한다. 시험할 약제를 비율적인, 축소 투여량을 본 발명의 인공조건 골수 시스템에 첨가하고 각종 세포형태에 대한 그 영향을 기록하였다. 골수세포 이외의 세포형태를 필요에 따라서 특별한 약제를 시험하는데 대체한다.
본 발명은 또한 배양물에서 세포를 생장시키기 위한 3차원의 지지물을 기술한다. 이 지지물의 존재하에서의 세포의 생장은 단백질, 당단백질, 글리코사아미노글리칸, 세포기질 및 그 자체로서 또는 이러한 물질로서 지지물을 피복하여 지지하는 다른 물질을 첨가하여 증대시킬 수도 있다. 하나의 3차원의 지지물을 사용하면 증복층에서 세포를 생장시킬 수가 있어서, 본 발명의 3차원의 세포배양시스템을 형성시킨다. 이 3차원의 지지물을 골수, 피부, 간 그리고 많은 다른 세포 많은 형태 및 조직용의 3차원의 세포배양 시스템을 만드는데 사용할 수 있다.
본 발명중 하나의 구체예에서 이 3차원의 세포배양 시스템을 생체조직으로 옮길 수가 있다.
이 3차원의 지지물은 바람직하게는 메쉬의 형태로 된다. 제조한 지지물은 나중에 3차원의 생리학적 세포 배양 시스템에서 사용하기 위하여 보관할 수도 있다. 조혈성 골수세포를 생장시키기 위한 한 구체예에서, 이 메쉬는 기질의 골수세포가 소집합이 될 때까지 메쉬에서 기질 골수세포의 층을 생장시켜 제조한다.
첨부된 도면에 따르면, 본 발명의 유용한 메쉬위크(10)이 표현되어 있다. 이 메쉬워크(10)는 날줄(12)와 씨줄(13)을 포함한다.
도면에서 표현한 것 같이, 기질세포(14)는 실(12, 13)에서 생장하는 것을 볼 수 있다.
[골수이식용의 골수의 복제 및 한냉보관]
본 발명은 건강한 골수세포를 파괴하여 그 기능을 약화시키는 질병이나 상태를 치료하는 방법을 목적으로 한다. 이 방법은 골수에 전이되는 혈액학적 악성 및 기타 신생물의 치료에 특별한 효과가 있다.
본 발명의 방법은 또한 골수에 직접적으로 영향을 미치지 않는 질병에 소요되는 화학요법 및 또는 방사선치료에 의해서 골수가 악영향을 받은 환자를 치료하는데 효과가 있다. 본 발명의 방법은 또한 건강한 사람으로부터 골수세포를 떼어서 보관하고 다음에 복제하고 만일 골수를 직접적으로 파괴하는 질병이 발생하는가 또는 골수에 악영향을 미치는 치료를 받은 환자가 있을 때 골수세포를 재주입하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따라서, 소량(10-15㏄ 골수/말초의 혈액 현탁액)을 공급자의 장골능에서 흡입하였다. 이 방법은 만일: 1. 개체가 그의 골수를 한냉보관할때에 40대이고, 2. 환자가 질병이 없으면, 결과는 최적이 된다. 이 방법은 만일 물리적 또는 화학요법적 수단에 의한 악성세포를 추방이 배양전에 실시될 수 있으면 전이성 질병이나 혈액학적 악성이 있는 어떤 환자에게 유익한 것으로 입증이 될 수도 있다.
현재, 이러한 방법은 소수의 세포를 사용할 때 가장 효과가 있는데, 이 사실은 그 자체가 아래의 방법에 잘 부합될 수도 있다. 공급자로부터 골수에 흡입하는 방법은 본 기술분야에 잘 공지되어 있다. 공급자로부터 골수를 흡입하는 장치와 방법의 실시예는 미국특허 제4, 481, 946호 및 제4, 486, 188호에서 볼 수가 있다.
다음에 공급자에게 취한 골수를 복제하거나 또는 후일의 복제를 위하여 보관한다. 만일 골수를 보관해야 한다면, 골수를 컴퓨터가 부착된 한냉기술적 장치를 사용하여 증분식으로 동결할 수 있다. 새로운 골수/혈액 현탁액을 두균의 Nunc 튜브 속으로 같은 용적으로 분취하고 한냉저장 챔버가 유사한 온도(4℃)에 도달할때까지 분쇄한 얼음이든 비커속에 넣는다. 챔버속으로 피검물을 삽입하기 직전에, 무균의 기술을 사용하여 각 Nunc 튜브에 용액을 첨가하여서, 한냉보호제인 디메틸술폭시드와 글리세롤를 각각 7% 및 5%의 최종농도가 되게 한다. 동결프로그램은 이 피검물을 주입한 직후에 개시한다. CryoMed 모델번호 1010에서 동결프로그램 1번을 사용한다.
이 기술을 사용하여, 동결후에 80℃의 물중탕에서 녹인 세포의 생존율은 트리판청 공치술 방법을 통하여 90%를 초과한다. 또한, 원래의 집락을 형성하는 단위 배양물(CFU-C)에서 80%이상을 동결후에 회수할 수도 있다. 사전 계산한 온도 대 시간 커브에 따라서 골수와 생물학적 물질을 동결하는 시스템의 실시예는 미국특허 제4, 107, 937호 및 제4, 117, 881호에 계시되어 있다. 바람직하게는, 골수세포를 -196℃온도의 액체질소의 액체상태에서 저장하는데, 이 온도에서는 모든 세포의 신진대사 활성도가 중지된다.
녹인후에 골수세포를 개체속으로 재주입하거나 또는 복제하고 다음에 재주입한다.
본 발명의 방법은 골수이식을 필요로 하는 환자에 몇가지 잇점을 준다. 만일 환자가 그 자신의 세포를 받을 때에는, 이것을 자가의 이식이라 부른다. 이러한 이식은 거부의 가능성이 없다. 자가이식은 식접용편 대 숙주반응인 골수이식 거부의 주요 원인을 제거한다. 더욱이, 배양물속에서 생장할 때, 혈액학적 세포는 물리적 조작 및 또는 효소처리에 의해서 용이하게 분리된다. 이로서 골수색전에서 기인되는 혈관 폐쇄의 위험성을 감소시킨다. 또한, 본 발명의 방법으로 화학요법과 방사성으로된 신생종의 장해의 더욱 진취적인 치료가 가능케한다. 현재, 이러한 치료의 정도는 골수독성에 의해서 종종 제한을 받는다.
[인공조건에서의 골수 복제 시스템]
더욱이 본 발명은 생리학적 조건에 비교되는 시스템에서의 인공조건에서 골수세포를 복제하는 단계를 포함한다. 더욱이, 이 시스템에서 복제된 골수세포는 모든 세포형태가 원래의 골수 접종물에 존재한다고 가정할 때, 정상 골수에 존재하는 모든 세포를 포함한다.
공급자로부터 직접 수득한 것이든 또한 한냉 저장한 저장물에서 구한, 골수세포는 처음에 물리적 수단에 의해서 그들의 망상질로부터 분리한다. 다음에 이 골수를 정상골수의 기질 성분을 가진 공-배양물에서 생장시키며, 이것은 3차원의 지지물 위에 있는 섬유아세포, 대식세포, 망상세포 및 지방세포를 포함한다. 또한 비장의 및 또는 간장의(간의) 대식세포 배양물의 매체에서 또는 기질세포의 소단위에서 유도되는 인자를 이 배양물에 첨가할 수도 있다.
비록 골수세포가 홀로 배양될 때 생장을 제한될 수가 있다 하더라도, 이러한 배양물의 장기간 생장은 기질세포나 또는 이들의 분비되는 생성물이 존재할 때에만 가능하다. Long-Term Bone Marrow Culture, D.C Wright J.S Greenberger, eds., A.R. Liss, New York (1984) 참조.
본 발명은 내재적 또는 환경적으로-전달된 질병에 의해서 또는 이러한 질병의 호학요법 및 또는 방사선의 치료에 의해서 골수가 파괴되었을 때 골수를 재생시키는 능력을 갖춘 다중 잠재적인 조혈성 간세포의 중식을 최대화 하는 것을 목적으로 한다. 골수의 재생 활성도(MAR)를 가진 간세포는 장기간의 골수배양물에서 지속되고 복제되는 것으로 나타났다. 그러나, 간세포, 조혈성 생식세포, 조혈성 선구물질세포는 모두 본 발명의 시스템에서 복제하고 증식한다. 더욱이, 생리학적 방법으로 이 시스템에서 감별을 진행시킬 수 있다. 예를 들면, 적색의, 척수의, 임파의, 대식세포의 그리고 기핵세포의 집락을 본 발명에서 가르킨 것 같은 시스템을 사용하는 같은 배양시스템에서 계속적으로 일어날 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따라서 조혈성 간세포 생장을 아래와 같이 실시한다:
1. 기질의 지지물층의 형성
골수 현탁액을 20분간 3000 × g로 원심분리하고 대식세포, 섬유아세포, 지방세포, 단핵혈액세포, 망상세포, 대피세포 및 기타 잔유세포를 포함하는 세포의 백색기질을 제거한다. 이 세포를 Roswell Park Memorial Institute medium number 1640이라 칭하는 매체 또는 단순히 RPMI 1640이라 하는 매체에 현탁시킨다. 이 RPMI 1640은 GIBCO Incorporated of Grand Island, New York, USA에서 구입한다. 이 RPMI 1640을 10% 태아소의 혈청, 10% 말혈청, 히드로코티숀 헤미숙신산염 및 적절한 항체로서 보충하였다.
이러한 세포의 106를 패트리 접시에든, 미국 뉴욕의 Tetko Corp.에서 구입한 무균의 나일론 메쉬에 넣는다. 이 메쉬는 400㎛2의 채면적과 100㎛의 섬유직경을 가진다.
다음에 이 접종한 메쉬에 상처를 입히고 위에서 기술한 것 같은 매체 5㎖를 포함하는 배양 플라스크 속으로 넣는다. 이 메쉬를 배양 플라스크 속으로 풀고 플라스크의 바닥을 완전히 덮는다. 이 배양물을 상대습도가 90%과잉으로 된 50%의 CO2가든 대기중 기에서 37℃에서 생장시킨다. 주로 섬유아세포인 기질세포를 처음에 메쉬 개구부 속으로 생장을 시작하기 전에 나일론 섬유를 따라 생장시키고 이의 전부를 완전하게 에워싸게 한다. 이 과정은 대략 14 내지 18일이 소요된다. 기질세포의 소집합의 정도는 조혈성 세포의 접종 전에 도면의 그림에 보인 것과 일치해야 한다.
현탁된 기질세포는 골수세포에 관하여 앞에서 기술한 것과 같은 기술을 써서 한냉보존할 수 있다. 메쉬에 소-집합 세포를 한냉보존시키기 위하여, 나일론 메쉬를 감고 최종농도가 각각 5% 및 15%로된 한냉 보호제, 디메틸술폭시드와 글리세롤을 가진 RPMI 1640 메체를 포함하는 Nunc 튜브 속으로 삽입하였다. 메쉬에 기질세포를 동결하는 일은 +1℃에서 -40℃로 -1℃/분의 초기의 냉각속도로 실시하였다. -2 내지 -3℃/분의 냉각속도가 최적이며 이를 -84℃의 최종단계 온도에 도달할 때까지 사용한다. 대략 20-25%의 기질세포를 나일론 메쉬로부터 떼어낸다.
2. 조혈성 세포로서 접종
골수세포를 5-10% 태아소의 혈청과 5-10%말의 혈청, 비타민, 히드로코르티손, 글루타민 및 항체로서 보충되고 변경시킨 Fischer's 또는 McCoy's 5A 매체에 현탁시킨다. 이러한 세포는 새것일 수도 있고 또는 이미 한냉보관한 시료에서 꺼내어서 80℃의 고온수 중탕에 급히 녹힌 것일 수도 있다. 2 내지 5 × 106세포를 25㎟ 플라스틱 배양플라스크에든 소집합의 기질세포 메쉬워크에 접종시키고, 5% CO2가 든 대기공기에서 33 내지 34℃로 생장시킨다. 3일후에 배양온도를 35 내지 37℃로 올린다.
조혈성 세포는 소집합의 기질세포로 형성된 천연의 포켓속에서 생장하고 번식 세포는 세포의 접착층속에 남는다. 접착층은 메쉬에 직접 부착된 이러한 세포이거나 또는 그 자체가 메쉬에 직접 부착된 세포에 간접적으로 부착되어 연결된 것들이 된다. 4 내지 5일 후, 숙성된 입자세포, 단핵세포, 및 적색세포가 사이토스핀 제품에 의해서 관찰되는 것 같이 비-부착성 층에서 나타난다. 7 내지 10일후, 다수의 조혈성 집락이 메쉬의 간극속에서 관찰할 수가 있고 형태학적으로 CFU-C, 혼합된 집락 및 임파의 집락과 일치한다. 기핵세포의 생장은 제한되지만 또한 이 기질에서 관찰될 수 있다. 평균배양물은 주당 450 내지 950 CFU-C를 생성한다. 기질세포로 구성된 배양물과 같은 개체(자가의)에서 유도된 조혈성 세포는 주당 2배로 주입해야 한다. 다른 개인(동종의)에서 유도된 기질의 세포 메쉬워크에 접종된 환자의 골수로 구성된 배양물은 비-접착성층으로부터의 숙성 면역적임 세포가 적절하게 모집단이 해체된 것을 보장하기위하여 주당 3배로 주입해야 한다.
3. 인공조건에서의 골수 복제시스템의 변화
[골수 기질세포의 생장의 증대]
골수의 기질세포의 생장율을 제한하는 제1의 요인은 골수의 기질세포 사이에 포함된 섬유아세포의 비교적 낮은 유사분열 지수가 된다. 이러한 세포의 생장과 외측세포 기질 성분의 이들의 분해는 다음을 첨가하여 증대시킬 수도 있다:
1. 히드로코르티손 헤미숙신산염 및 또는 2. 높은 율의 세포분열을 가지는 배양된 인체 생장인자의 매체에서 유도된 자체-조절식 생장인자.
메쉬에서의 섬유 아세포의 부착과 생장은 또한 다음에 의해서 증대시킬 수 있다.: 1. 가용된 형태 I-IV 교원질로서 메쉬를 예비-피복하고, 또는 2. 태아 사람의 섬유 아세포 또는 어떤 교원질 형태를 합성시킬 능력에 의해서 부분직합된 성인의 섬유아세포(이후로는 생장증대 섬유아세포라 칭한다)에 의해서 분비된 교원질로 피복되거나 함침된 메쉬를 사용하는 일. 이런 관점에서, 생장을 증대시키는 섬유아세포는 집합에 이르면(태아 인체 섬유아세포에 대해서는 5 내지 7일간 그리고 성인섬유아세포에 대해서는 14 내지 18일간) 메쉬에서 약하게 트립신화하여 상승시키고 또한 1. 위에서 기술한 것 같이 기질의 골수세포로 접종하거나 또는 2. 장래에 사용하기 위하여 한냉보관할 수도 있다.
본 발명의 한구체예에서, 합성하는 교원질이고 다른 세포 외의 기질성분인 생장 증대 섬유아세포를 이들이 소집합에 이를때까지 매쉬에서 생장시킨다. 그리고 조혈성 및 기질의 두가지 모두의 골수세포의 혼합물을 소집합 생장 증대 섬유아세포 메쉬워크에 접종시킨다. 생장증대 섬유아세포를 생장시키고, 부분집합시키고, 그리고 한냉보관하는 방법은 아래와 같다:
a. 생장증대 섬유아세포의 배양 섬유아세포를 2-10% 태아소의 혈청 또는 2-10%의 말의 혈청으로 보충된 RPIM 1640에서 생장시키고 여기에 1㎍/㎖의 히드로코르티손 헤미숙신산염 및 2㎍/㎖의 겐타마이신, 페니실린, 스트렙토마이신 및 진균류영역을 첨가하였다. 배양물을 5% CO2를 포함하고 상대습도가 90% 이상인 실내공기에서 370℃로 생장시킨다.
b. 생장증대 섬유아세포의 부분집합, 골수 현탁액, 피포의 섬유 아세포의 연층에서 취한 5.0 × 106섬유아세포 또는 사체간에서 취한 섬유아세포를 미량적정웰(1㎟)에 바르고 집합이 되도록 생장시킨다. 이러한 세포는 Ca++이나 Mg++가 없는 Hank의 발란스된 염용액으로 4 내지 5회 반복 세척하여 배양웰에서 떼어낸다. 미량적정기판에 남아있는 기질은 각종 기질성분과 형광 이소티오시안산염-라벨이된 토끼의 항-쥐 임뮤노글로볼린G에 단클론의 항체를 이용하는 간접 면역형광으로 시험하여 존재하는교원질 형태를 확인한다. 현탁된 세포는 교원질 형태 I-IV, 엘라스틴, 트로포엘라스틴 및 섬유넥틱(fibronectin)에 대항하는 단클론의 항체로 처리하여 각 생성물을 합성시킬 수 있는 세포의 소모 집단을 단리한다. 이 세포는 단클론의 항체가 부착된 이러한 세포에 손상을 주거나 파괴하는 기니아돼지보체로 처리한다. 생존 가능한 세포는 위에서 기술한 것 같이 미량적정판에 다시 입히고 집합으로 생장시키고 그리고 리포트한다. 다음에 단리 기술의 효율은 단클론의 항체를 가진 이러한 세포에 의해서 분비된 기질을 시험하고 간접 면역 형광에 의해서 입증한다.
조혈성 세포의 최적 생장을 위하여는 이 기질이 교원질형태 Ⅲ, Ⅳ 및 Ⅰ을 대략 6:3:1의 비율로 포함해야 한다.
c. 생장증대 섬유아세포의 한냉보관 생장증대 섬유아세포는 기질의 세포에 대해서 위에서 기술한 것과 같은 기술을 사용하여 한냉보관할 수 있다. 기질의 세포와 같이 몇가지 생장증대 섬유아세포는 또한 동결중에 메쉬로부터 뗄 수 있다. 그러나 이 기질은 아직도 골수기질세포의 부착에 기여하므로 조혈성 세포생장에 이르는 기질의 형성에 소요하는 시간을 감소시킨다.
[단핵세포의 접종]
골수배양물의 장기간 생장을 증대시키기 위하여, 말초의 혈액 단핵세포를 Ficoll-hypague 또는 Percoll를 사용하여 헤파린화한 현탁액으로부터 제조한다. 말초의 혈액세포와 골수 조혈성 세포는 같은 개체(자가의)에서 취한다. 이런 것들은 정맥천자를 통해서 제거해야하고 골수피검물을 취할때에 한냉보관해야 한다. 또다른 말초혈액 세포를 만일 필요하면 배양과정중에 질병이 있는 환자로부터 획득할 수가 있었다. 그러나, 만일 전이성 질병의 의심이 나면, 시료를 처음에 앞에서 언급했듯이 편출한다. 5 × 105내지 106의 단핵세포(단세포 소모집단이 이 단계에서의 단핵세포층 내에서의 바람직한 세포형태가 된다)를 골수 조혈세포로 최초 접종한 후 4 내지 5일 그리고 그후에는 매 3주마다 메쉬워크에 접종시킨다. 이 과정으로 주당 기준으로 관찰할 때 10 내지 13%의 조혈성 향상을 가져온다.
[생식성 세포의 배양 및 보관의 영속성]
본인들의 경험에 의하면, 집합적인 기질 세포 배양물은 조혈에 도움이 되지 않거나 또는 기껏해야 조금 도움이 된다. 인체 조혈생식의 무한정 생장은 만일 이들에 필요한 기질에서 취한 생장조절 인자가 제공되어 있으면 가능하다.
예를 들면 최초의 골수시료는 대략 106조혈세포를 포함하는 다수의 분취량으로 분활한다. 이들의 각각을 소-집합의 기질세포 메쉬워크에 접종한다. 이 배양물을 각 주입후에 사이토스핀 제조물에서 볼 수 있는 것 간이 역층 현미경과 비-접착세포의 감별계수의 직접 관찰에 의해서 감시한다. 집단에 도달하기 전에, 배양물을 교원효소를 처리하고 대략 6-10분간 약하게 한의 음파파쇄 처리한다. 조혈성 세포와 기질세포는 밀도경사법으로 분리한다. 이 조혈성 세포는 적혈구 계산반을 사용하여 계수하고 대략 50%는 앞에서 기술한 방법을 한냉보온한다. 조혈성 세포의 나머지 50%는 대략 106의 세포를 포함하는 분취량으로 분활하고 소-집단 기질세포 배양물에 접종하여 평행으로 서로 엇갈리게 하고, 생장시킨다. 이것들이 집단에 도달하면, 같은 과정을 수행한다.
본 기술: 1. 소요의 생장인자를 생성하는 미량환경을 제공하여 조혈성 세포의 생장을 영속화하고, 그리고 2. 식접용편화에 적합한 수를 얻을 때까지 조혈성 번식물을 침전시킬 수도 있는 경우의 계속적 뱅크를 형성한다.
[세포생성물에 의한 조혈성 세포의 모듈화]
이 기술은 현재 별도의 배양물로서 인체골수의 각종 세포성분을 준-배양시키는 것으로 존재한다. 대식세포, 망상세포, 지질세포 및 섬유아세포는 별도록 생장시킬 수도 있고 이들의 분비물 활성도는 각종 제로 처리하여 변화시켰다.
[3차원의 메쉬워크에서의 장기간]
인체 골수배양물에서의 조혈작용도 또한 아래의 방법으로 배양물에서 생장시킬 때 골수외의 대식세포(Kupffer 세포)의 분비에 의해서 모듈화할 수도 있다. Kupffer 세포는 프로나제(Pronase) 소화후에 그들의 기관 기질로부터 분리한다. 간단히 말하면, 조직 피검물을 프로나제용액[0.2% 프로나제(Calbiochem)와 Gey의 발란스된 염용액(BBS)]에서 1시간동안 약하게 저으면서 배양한다. 이 용액의 PH는 1N NaOH로 7.3 내지 7.5로 유지한다. 디옥시리보핵산효소(0.5㎎)(Calbiochem)을 상기 과정중에 30분 간격으로 첨가하고, 수득되는 세포현탁액을 여과하고 350 × G로 10분간 원심분리한다. 이 펠릿을 Gey의 BBS에서 재현탁시키고 제방세포(대식세포 및 내피세포)는 Percoll(제약학적)경사를 사용하여 세포 부스러기와 숙성 혈액세포에서 분리한다.
수득되는 세포부분을 10% 태아의 소의 혈청을 첨가한 개조된 Dulbecco의 매체로 3 x 3분간 세척하고 3 내지 4 x 106의 세포를 포함하는 용적의 플라스틱 배양접시에 입힌다. 1일간 배양후에, 비-접착성 세포는 배양물 매체로 세척하여 제기하고 접착성 세포는 6%의 CO2를 포함하고 상대습도가 80%이상인 실내공기의 혼합가스에서 33℃로 유지한다. 이러한 세포의 생장 및 또는 분비활성도는 다음에 의해서 자극시킬 수 있다: 1. CO2: O2의 비율변화, 2. 라텍스 용구의한 배양물의 처리, 3. 실리카로 배양물의 처리, 4. 매체에 프로스타글라딘 E2, E1또는 E2α의 첨가, 5. 인터로이킨 1 또는 인터로이킨 2를 매체에 보충. 대식세포 분비생성물은 이러한 방법/약제에 모듈화할 수도 있다.
이러한 대식세포의 분비생성물로 조정한 매체를 인공조건에서 발생하는 것과 같은 방법으로 장기간 골수 배양 적혈구 조혈성/입자조혈성비율을 보충하는데 사용할 수도 있다.
본 발명의 이 방법은 골수이식을 필요로 하는 환자에게 여러 가지 잇점을 준다.
[환자의 상태를 감시하기 위한 인공조건에서의 골수복제시스템의 사용]
암환자나 다른 질병의 환자에서 환자의 골수를 흡입하고 이 시료를 시험하여 환자의 상태를 감시하는 것이 종종 효험이 있다. 이 방법에서, 전이나 재발은 이것을 임상적으로 명백해지기전에 검출할 수도 있다. 골수세포를 시험하여 검출할 수 있는 다른 상태의 환자도 또한 이 방법으로 감시할 수도 있다.
본 발명의 골수 복제시스템을 사용하여 흡입한 골수피검물에든 세포의 장기간 생장으로 염색체에 이상이 있는 클론의 전이성 세포 및 조혈성세포의 검출의 가능성을 향상시킨다. 이러한 세포는 새로이 흡입한(배양치않는) 골수의 통상적인 무늬에서의 검출을 모면한다.
[세포독성 시스템에서의 골수 복제시스템의 인공조건하의 사용]
제약제, 항-신생물제, 발암물제, 식품첨가제 및 골수에 있는 다른 물질의 골수에 대한 세포독성을 본 발명의 골수복제 시스템을 인공조건에서 사용하여 시험한다.
첫째로, 골수세포의 안정되고 생장하는 배양물(기질세포 및 조혈성세포의 둘 모두를 포함하는)을 형성시킨다. 다음에, 이 배양물을 시험약품의 농도 변화에 노출시킨다. 이 시험약품으로 뱅양한 후에, 배양물을 상 현미경으로 시험하여 최초의 형태학적 비정상이 발생할때의 시험약품의 농도인-최고의 내성 투여량(HTD)을 측정한다. 세포독성 시험은 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 잘 알려진 기술을 사용하며, 이 3차원의 시스템에서 세포 생존성을 확인하기 위하여 여러 가지 초생체의 염료를 사용하여 실시할 수가 있다. 이 HTD 측정으로 또다른 시험을 위한 농도범위를 제공한다.
일단 시험범위가 설정되면, 여러 가지 농도로된 시험약품을 본 기술분야의 통상의 지식을 가진자에게 잘알려진 방법으로 골수배양물을 구성하는 상이한 세포형태의 생존성, 생장 및 또는 형태학에 대한 이들의 영향을 시험할 수 있다.
본 발명에 계시된 것 같은 다른 3차원의 세포배양물을 세포독성 시험용으로 적용시킬 수도 있다.
[3차원의 세포배양 시스템의 형성]
본 발명의 3차원의 지지물 및 이의 3차원적 다중층 세포배양물 시스템용 프레임으로서의 용도를 개시한다. 이미 알려진 조직 배양시스템에서, 이 세포들은 단층으로 생장한다. 본 발명에 따른 3차원의 지지물에서 생장한 세포는 다중층으로 생장하여 세포기질을 형성한다. 이 3차원적 세포배양물 시스템은 앞에서 기술한 단일층 조직 배양시스템에서 보다 더큰 정도로 인공조건에서 발견되는 생리학적 상태로 근접한다. 본 발명의 한가지 구체예에서, 이 3차원의 세포배양 시스템은 살아있는 유기체가 그 속으로 옮긴다.
이 3차원의 지지물은 아래의 어떤 물질이 될 수도 있다.: 1. 세포가 그것에 부착되게 하고(또는 이것에 부착되도록 변화될 수 있다) 그리고 2. 세포가 단일층 이상의 층으로 생장되게 한다. 3차원의 지지물은 본 발명의 바람직한 구체예에서 하나의 메쉬가 된다.
3차원의 세포배양시스템은 골수, 피부, 간 및 그의 많은 다른 세포 형태 및 조직에 적용시킬 수 있다는 것을 정사할 수가 있다. 예를 들면, 3차원의 피부세포 배양시스템을 아래와 같이 제조한다:
1. 섬유아세포를 메쉬에 부착시키고 7-9일간 생장시켜 인공조건에서의 골수 복제시스템에 사용한 생장 향상 섬유아세포와 관련하여 위에서 기술한 것 같이 교원질형태 Ⅰ 및 Ⅲ을 석출시킨다.;
2. 흑혈구는 처리한 메쉬에 바르고 5일간 접종한다.
3. 케라티노사이드를 준집합 흑혈구에 접종한다.
비록 본 발명의 이들의 특이한 구체예를 참조하여 상세히 기술한다하더라도, 위에서 그리고 아래의 청구범위에서 기술한 것 같은 본 발명의 범위에서 이탈치않고도 변화를 할 수 있음을 알 수가 있다.

Claims (32)

  1. (a) 기질세포와 기질세포에서 자연적으로 분비되는 연결조직 단백질의 부착된 살아있는 기질조직과 기질세포에 의해 연결된 간질공간을 가진 삼차구조로 형성된 생체 경쟁성 있는 비생존 물질로 구성된 구조물로 싸여있는 시험관내에서 만들어진 살아있는 기질조직에다 유조직 세포를 접종시키고, (b)접종시킨 세포를 증식시키기 위해 영양배지에서 접종된 세포가 살아있는 기질조직을 배양시키는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 세포배양 방법.
  2. 제1항에 있어서, 기질세포가 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 배양방법.
  3. 제1항에 있어서, 기질세포가 섬유아세포, 내피세포, 혈관주세포, 대식세포, 단세포, 백혈구세포, 혈장세포, 유선세포 또는 지방세포로 복합된 것을 특징으로 하는 배양방법.
  4. 제1항에 있어서, 구조물이 생화학적으로 분해가능한 물질로 구성된 것을 특징으로 하는 배양방법.
  5. 제4항에 있어서, 생화학적으로 분해가능한 물질이 면, 폴리글리콜산, 고양이 장 봉합실, 셀룰로오즈, 젤라틴 또는 덱스트란으로 구성된 것을 특징으로 하는 배양방법.
  6. 제1항에 있어서, 구조물이 생화학적으로 분해되지 않는 물질로 구성된 것을 특징으로 하는 배양방법.
  7. 제6항에 있어서, 생화학적으로 분해되지 않는 물질이 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리카보네이트, 폴리테트라 폴로로에틸렌 또는 니트로셀룰로스 성분물인 것을 특징으로 하는 배양방법.
  8. 제4항에 있어서, 구조물이 콜라겐으로 전-피복처리된 것을 특징으로 하는 배양방법.
  9. 제1항에 있어서, 구조물이 망인 것을 특징으로 하는 배양방법.
  10. 제9항에 있어서, 구조물이 망인 것을 특징으로 하는 배양방법.
  11. (a) 기질세포와 기질세포에서 자연적으로 분비되는 연결조직 단배질 부착된 살아있는 기질조직과 기질세포에 의해 연결된 간질 공간을 가진 삼차구조로 형성된 생체 경쟁성 있는 비생존 물질로 구성된 구조물로 싸여있는 시험관내에서 만들어진 살아있는 기질조직에다 조혈세포를 접종시키고, (b) 접종시킨 세포를 증식시키기 위해 영양배지에서 접종된 세포가 살아있는 기질조직을 배양시키는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 세포배양 방법.
  12. (a) 기질세포와 기질세포에서 자연적으로 분리되는 연결조직 단백질이 부착된 살아있는 기질조직과 기질세포에 의해 연결된 간질공간을 가진 삼차구조로 형성된 생체 경쟁성 있는 비생존 물질로 구성된 구조물로 싸여 있는 시험관내에서 만들어진 살아있는 기질조직에다 흑혈구와 케라틴 세포를 접종시키고, (b) 접종시킨 세로를 증식시키기 위해 영양배지에서 접종된 세포가 살아있는 기질조직을 배양시키는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 세포배양방법.
  13. 제12항에 있어서, 기질조직은 기질세포가 서로 합류되어 구성된 것을 특징으로 하는 세포배양방법.
  14. (a) 기질세포와 기질세포에서 자연적으로 분비되는 연결조직 단백질이 부착된 살아있는 기질조직과 기질세포에 의해 연결된 간질공간을 가진 삼차구조로 형성된 생체 경쟁성 있는 비생존 물질로 구성된 구조물로 싸여있는 시험관내에서 만들어진 살아있는 기질조직에다 간세포를 접종시키고, (b) 접종시킨 세포를 증식시키기 위해 영양배지에서 접종된 세포가 살아있는 기질조직을 배양시키는 것으로 구성된 것을 특징으로 하는 세포배양방법.
  15. 기질세포와 기질세포에서 자연적으로 분비되는 연결조직 단백질이 부착된 살아있는 기질조직에 기질세포에 의해 연결된 간질공간을 가진 삼차 구조로 형성된 생체 경쟁성 있는 비생존 물질로 구성된 구조물로 싸여있는 것을 특징으로 하는 시험관에서 만들어진 살아있는 기질조직에 배양된 세포 실질조직용기에 시험물질을 첨가하여 만든 것을 특징으로 하는 세포시험기구.
  16. 제15항에 있어서, 기질세포가 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 세포시험기구.
  17. 제15항에 있어서, 기질세포가 섬유아세포, 내피세포, 혈관주세포, 대식세포, 단세포, 백혈구세포, 혈장세포, 유선세포 또는 지방세포로 복합된 것을 특징으로 하는 세포시험기구.
  18. 제15항에 있어서, 구조물이 생화학적으로 분해가능한 물질로 구성된 것을 특징으로 하는 세포시험기구.
  19. 제15항에 있어서, 생화학적으로 분해가능한 물질이 면, 폴리글리콜산, 고양이 장 봉합실, 셀룰로우스, 젤라틴 또는 덱스트란으로 구성된 것을 특징으로 하는 세포시험기구.
  20. 제15항에 있어서, 구조물이 생화학적으로 분해되지 않는 물질로 구성된 것을 특징으로 하는 세포시험기구.
  21. 제15항에 있어서, 생화학적으로 분해되지 않는 물질이 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐, 폴리카보네이트, 폴리테트라 플로로에틸렌 또는 니트로셀룰로스 성분물인 것을 특징으로 하는 세포시험기구.
  22. 제18항에 있어서, 구조물이 콜라겐으로 전-피복처리된 것을 특징으로 하는 세포시험기구.
  23. 제15항에 있어서, 구조물이 망인 것을 특징으로 하는 세포시험기구.
  24. 제22항에 있어서, 구조물이 망인 것을 특징으로 하는 세포시험기구.
  25. 제15항에 있어서, 용기가 멀티-웰 콘테이너인 것을 특징으로 하는 기구.
  26. 제22항에 있어서, 용기가 멀티-웰 콘테이너인 것을 특징으로 하는 기구.
  27. 제23항에 있어서, 용기가 멀티-웰 콘테이너인 것을 특징으로 하는 기구.
  28. 제24항에 있어서, 용기가 멀티-웰 콘테이너인 것을 특징으로 하는 기구.
  29. 제15항에 따르는 시험물질의 세포학적 효과 검사방법에 있어서, 조직실질세포가 조혈세포인 것을 특징으로 하는 기구.
  30. 제15항에 따르는 시험물질의 세포학적 효과 검사방법에 있어서, 조직실질세포가 흑혈구와 케라틴 세포인 것을 특징으로 하는 기구.
  31. 제15항에 따르는 시험물질의 세포학적 효과 검사방법에 있어서, 조직실질세포가 간세포인 것을 특징으로 하는 기구.
  32. 시험관내에서 살이 있는 기질조직을 만드는 방법에 있어서, 생체적응성이 있는 비-생존 3차구조물에 기질 조직을 배양하는 것으로 구성되고 이때, 기질 조직은 결합조직 단백질 분비하여 구조물에 부착되고 이를 에워싸서 3차원 구조물을 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1019870701161A 1986-04-18 1987-04-15 골수의 복제방법 및 시험에서의 다른 기관의 복제방법 그리고 이들의 용도 KR0142885B1 (ko)

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