JPH01503195A - 骨髄の複製方法およびその組織の試験管内複製法とその使用法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　骨髄の複製方法およびその組織の試験管内複製法とその使用法 発明の詳細な説明 〔発明の利用分野〕 骨髄移植に関しては幾つかの方法が知られている。

一般に骨髄の移植は健康な骨髄細胞を破壊したりその機能を衰えさせる癌のよう な病気に冒された患者に対して施される。これに加えて治療中の病気が直接骨髄 に影響を与えていない場合でも化学療法や放射線療法が副作用として骨髄に影響 を与える。数々の損傷を受けた骨髄に移植術を施す方法が知られている。骨髄移 植拒絶反応の主要原因のひとつに対宿主性移植片反応がある。これはある人から 取り出した骨髄を別の人に移植した際に起こる。骨髄移植が失敗するもうひとつ の重要な原因に骨髄塞栓の形成による血管閉塞性疾患がある。組み合わされた化 学療法と放射線療法に先立ち人の骨髄を取り出し貯蔵する方法及びその骨髄を再 注入する方法が現存する（すなわち、自己移植術）。

しかし、この治療を受けた患者は、たとえ組織の植え付けが成功した場合でもし ばしば病気が再発する。これは移植された骨髄が最初に取り出される際すでに罹 病していたことによる。

〔発明の目的〕

従って、本発明の目的は健康な骨髄細胞を破壊したり、その機能や複製の能力を 損う疾病を治療するための方法で現行の骨髄移植技術において知られている不都 合な点を克服した方法を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、対宿主性移植片反応が生じない骨髄移植術による疾 病の治療法を提供することにある。

さらにもう一つの本発明の目的は、骨髄塞栓の形成をひき起こさない骨髄移植術 により疾病を治療する方法を提供することにある。

本発明のさらにもう一つの目的は、健康な骨髄細胞を破壊する疾病や状態を患者 から骨髄を吸い出し、試験管内で骨髄細胞を複製し、その後複製された骨髄細胞 を患者に再注入するという方法により治療する方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、化学療法及び放射線療法またはその一方により受け た副作用で損われた骨髄の機能を向上させる方法を提供することにある。一本発 明のさらに別の目的は、血液学的悪性疾患及び骨髄に転移するその他の新形成を 治療する方法を提供することにある。

本発明のさらに別の目的や有用性は、この技術に熟練した人々にとって、以下に 示す詳細な記述を参照することにより明白であろう。

本発明は、以下に示す骨髄基質細胞が次々に網目状に増殖している状態を示す１ ．６５　Ｘ　１０００倍拡大の走査型電顕写真を参照することにより、より良く 理解できるであろう。

〔発明の概要〕

本発明により骨髄が破壊されているか或いはその機能が失われている患者を治療 するための方法が提供される。その方法は以下の段階から成っている。

■、提供者から骨髄の試料を得ること１次に■、骨髄への再定着活性を持つ造血 幹細胞を含む複製された骨髄を生産するために試験管内で骨髄細胞を複製し、そ の一部を低温保存し後の使用に備えること、次に ■、造血幹細胞を含む複製された骨髄を患者の造血を回復させるために患者に注 入する。

本発明により、健康な骨髄細胞を破壊したりその機能を損う疾病や状態を治療す るための方法が提供される。本発明の方法は、血液学的悪性疾患及び骨髄に転移 するその他の新形成の治療において、特に効果的である。

本発明の方法は次のような段階から成っている。健康な患者から少量の骨髄を吸 い出す、その細胞を寒冷保存する、患者から取り出した元の数より多く自己に再 注入するのに十分なだけの数に骨髄細胞を増やすために骨髄細胞を試験管内で複 製する、そしてその骨髄細胞を患者に再注入する０本発明の一つの具体例によれ ば、骨髄細胞は患者から吸引後直ちに低温保存又は凍結され、その後解凍されて 複製される８本発明のもう一つの具体例によれば、ある人から骨髄を吸い出し、 その骨髄細胞を試験管内で複製し、その複製された骨髄細胞を別の人に再注入す るという同種間の骨髄移植が実施される。

本発明の試験管内における骨髄複製のシステムは骨髄に影響する種々の状態につ いて患者をモニターする方法も提供する。例えば骨髄の少量の試料を治療中の癌 患者から吸い出し１本発明の試験管内のシステムで複製させることにより元の悪 性疾患の再発や転移がチェックされる。

試験管内の骨髄複製システムはまた薬物、食品添加物、健康食品、抗新生物薬、 及び癌原性物質の細胞毒性試験にも適用できる。比例させて用量を減じた試験物 質を本発明の試験管内の骨髄システムに添加し、さまざまな細胞種に対するその 影響を観察する。骨髄細胞以外の種々の細胞種についても特別な物質で必要とあ ればテストする。

本発明はまた、培地中で増殖する細胞のための３次元の支持体についても述べる 。この支持体の存在下での細胞の増殖はタンパク質、糖タンパク質、グリコサミ ノグリカン、細胞間質、その他の物質を支持体自体に加えるか、これらの物質で 支持体を被覆することによりより強められる。３次元の支持体を使用することに より細胞を多層に増殖させられ、従って本発明の細胞培養系は３次元的となる。

この３次元的な支持体は骨髄、皮膚、肝及びその他多くの細胞種や組織に対し３ 次元的細胞培養系を創り出すために利用できる１本発明の具体化の一例として、 ３次元的細胞培養系を生きた生物上に或いはその中に移すことができるかも知れ ない。

３次元の支持体は網目構造の形成に好都合である。

調製された支持体は、３次元的な生理学的細胞培養系でその後使用するために保 存することができる。造血機能のある骨髄細胞の増殖に関する具体化の一例中と しては間質骨髄細胞が群落（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）に達するまで、間質 骨髄細胞の層を網目の上に増殖させることにより網目構造を調製する。

〔図面の簡単な説明〕 ここで、数個の図表のうち一つの図について言及する０本発明で有用である一つ の網目構造１０を示す、この網目構゛造１０は、縦糸１２と横糸１３を含んでい る１図に示されているように、間質細胞１４が１２と１３の糸の上に増殖してい るのがわかる。

〔発明の詳細な説明〕

骨　植術に　するための骨　の　製と低温保存法本発明は、健康な骨髄細胞を破 壊したり、その機能を損う疾病又は状態を治療するための方法を見出すためにな されている０本発明の方法は特に血液学的悪性疾患及び骨髄に転移するその他の 新形成の治療において有効である９本発明の方法は、また直接骨髄には影響を与 えない疾病によって必要とされる化学療法及び放射線療法あるいはその一方によ り骨髄に対し副作用を受けた患者を治療する際にも有効である０本発明の方法は 、さらに患者が直接骨髄を破壊する病気或いはその治療によって骨髄が有害な影 響を受けるような病気になった際に、健康な患者から骨髄を取り出し、保存し、 その後その骨髄を複製し、再注入する方法を提供している。

本発明の方法に従って少量（１０−１５ｃｃ骨髄／末梢血液懸濁液）を、提供者 の腸骨稜から吸い出す、以下の条件が満たされる時に、本発明の方法の結果は最 善となる。すなわち、１．骨髄が低温保存される時点でその人の年齢が４０歳以 下である。２．その患者が病気に冒されていない０本発明の方法は、もし物理的 方法或いは化学療法によって培養に先立ち悪性の細胞を一掃する事ができるなら ば、転移性の疾病や血液の悪性疾患を持つ特定の患者には有益であることが示さ れるだろう、現在は、これらの方法は少数の細胞を使用した際に最も効果的であ り、このことは以下に示す本発明の方法の目的によくあっていると言えるかも知 れない。

提供者から骨髄を吸い出す方法は技術的にはよく知られている。提供者から骨髄 を吸い出すための器具や方法はアメリカ合衆国特許４．４８１．９４６及び４． ４８６．１８８に見出すことができる。

提供者から取り出された骨髄は、その後複製されるか或いは後日複製させるため に保存される。もし骨髄が保存される場合は、骨髄はコンピュータで制御された 低温技術を駆使した装置を用いて増進的に凍結する。

血液懸濁液中の新鮮な骨髄を滅菌したナンク（Ｎｕｎｃ）管中に等量ずつ分注し 、低温保存チェンバ室が同じ温度（４℃）になるまで砕いた氷のはいったビーカ 中に置く。チェンバに試料を挿入する直前に凍結保護剤であるジメチルスルホキ シドとグリセロールをそれぞれ最終濃度が７％と５％となるように無菌的にナン ク（Ｎｕｎｃ）管に添加する。凍結プログラムは、試料が入手された直後から開 始する。クライオメト　モデルナンバー　（ＣｒｙｏＭｅｄ　Ｍｏｄｅｌ　Ｎｕ ｍｂｅｒ）　１０１０コントローラの凍結プログラム１番を使用する。

この技術を用いれば、凍結し８０℃の水浴中で急速解凍した後の細胞生存率はト リバンブルー排除法で９０％を越える。さらに、元のコロニー形成単位培養（Ｃ ＰＵ−Ｃ）の８０％以上が解凍後に回収される。あらかじめ計算された温度と時 間の曲線に従った骨髄と生物材料の凍結システムの例は、アメリカ合衆国特許４ ，１０７．９３７及び４．１１７．８８１に示されている。より好ましいのは骨 髄細胞を細胞の全ての代謝活性がなくなる一１９６℃の温度で液体窒素中におい て液相のまま貯蔵する方法である。

解凍後、骨髄細胞は患者に再注入されるか複製され、その後再注入される。

本発明の方法は、骨髄移植を必要としている患者にとって数々の利点がある。も し患者が、自分自身の細胞を受け入れる場合はこれを自己移植と呼ぶ、このよう な移植では、はとんど拒絶の可能性はない、自己移植は、骨髄移植の拒絶反応の 主な原因である移植片対宿主の反応がない、さらに、培地中で増殖させた際、° 　造血細胞を物理的操作及び酵素処理或いはその一方により容易に分離できる。

このことは、骨髄塞栓に起因する血管閉塞性の疾病の危険性を減じている。さら に本発明の方法は、化学療法剤や放射線を用いて腫瘍性疾患に対して、より積極 的な治療を行なうことを可能にしている。現在のところ、これらの治療法の大部 分は骨髄に対するその毒性により制限を受けている。

試験　における　システム 本発明の方法は、さらに生理学的状態に匹敵する試験管内の条件で骨髄を複製す る段階を含んでいる。さらに、このシステムで複製された骨髄細胞には元の接種 材料となる骨髄にすべての種類の細胞が存在すると考えられる場合、正常な骨髄 に存在するすべての細胞が含まれる。

骨髄細胞は、直接提供者から得られた場合も或いは低温保存で貯蔵されたものか ら使用する場合でも、いずれの場合においてもまず最初に物理的方法により小網 から分欝される。次に骨髄細胞を３次元の支持体上で線維芽細胞、大食細胞、細 網細胞、及び脂肪細胞を含む正常な骨髄の間質成分と供に培養し増殖させる。

牌及び肝、或いはその一方の大食細胞の培養液又は間質細胞のサブセットから誘 導した因子もこの培養中に加える。

骨髄細胞は、それだけで培養した際には増殖に限界があるが、間質細胞或いはそ の分泌物が存在する場合に限って長期間これらの培養株を増殖させることができ る。ロングーターム　ボーン　マロー　カルチュアー、デー・ジー・ライト　ア ンド　ジエー、ニス。グリーンバーガアイーディーニス０．ニー、アール。リイ ス、ニューヨーク、（１９８４年）　（Ｌｏｎｇ　−ＴｅｒｍＢｏｎｅ　Ｍａｒ ｒｏｗ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、Ｄ、Ｇ、　Ｗｒｉｇｈｔ　＆　Ｊ、　Ｓ、　Ｇｒｅｅ ｎｂｅｒｇｅｒ、　ａｄｓ、、　Ａ、　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　 （１９８４））　を参照のこと。

本発明は、多くの可能性を持った造血幹細胞の増殖を最大にする方法を追及して いる。この造血幹細胞は、骨髄細胞が内因性の病気或いは環境に媒介されて引き 起こされた病気によって破壊されたり、病気の治療に用いられた化学療法及び放 射線あるいはその一方によって破壊された際、骨髄に再定着する能力を持ってい る。骨髄への再定着活性（ＭＲＡ）を持つ幹細胞は、長時間を経た骨髄培養液中 で生存し複製することが示されてきている。しかし、幹細胞、ヘモ（ｈｅｍｏ） 造血母細胞、造血前駆細胞、これらすべてが本発明のシステム中で複製し増殖す る。さらに、このシステム中で生理学的に同様な分化が進行する０例えば、赤血 球、骨髄球、リンパ球、大食細胞、巨核球のコロニーを、本発明により示された ようにこのシステムを用いて同じ培養システム中で連続的に発生させることがで きる。

本発明のひとつの好ましい具体化の例によれば造血幹細胞の増殖は以下のように 達成される：１、濶ＪＬｕ持１ヱど１潰− 骨髄懸濁液と３０００Ｘｇで２０分間遠心し、大食細胞、線維細胞、脂肪細胞、 単核の血球、細網細胞、内皮細胞及びその他内在する細胞を含む細胞の白い基底 を取り除く０、脂肪は、ロスウェル　パーク　メモリアルインスチュート（Ｒｏ ｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ）培地１６４０ 番又は単に“ＲＰＭ１１６４０”と呼ばれる培地に懸濁する。　ＲＰＭＩ　１６ ４０はニューヨーク　グランドアイランド　にあるＧＩＢＣＯ社より購入する。

１０％の牛脂仔血清、１０％の馬血清、ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、及び適 当な抗生物質このＲＰＭＩ　１６４０に加える。

これらの細胞１０′個を、アメリカ合衆国、ニューヨークのテトロ（Ｔｅｔｋｏ ）社から購入した滅菌ナイロンメツシュをペトリ皿に入れこの上に広げる。この メツシュは、２５ＩＩＩＩ０２のプラスチック製の培養フラスコの内側の大きさ に合わせてあらかじめ切っておく。このメツシュは、４００μｍ２の部面積を持 っており繊維の直系は１００μ腸である。

接種されたメツシュは巻きつけ、上述した培地が５ｗｒＱ入った培養フラスコに 入れる。メツシュは、培養フラスコの中で巻いたものを開きフラスコの底を完全 に覆う、培養細胞は、３７℃で５％のＣＯ２を含む空気中で９０％以上の相対湿 度を保って増殖させる。ｖＡ維芽細胞が大半を占める間質細胞が最初に増殖し、 メツシュの開口部へ増殖し始める前にナイロン繊維すべてを取り囲む、この過程 におよそ１４−１８日かかる０間質細胞の群落（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ） の程度は、造血細胞の接種前には図に示されたものと一致していなければならな い。

懸濁された間質細胞は骨髄細胞について先に述べたのと同様の技術を用いて低温 保存することができる。

このメツシュ上に群落化した細胞の低温保存に際してはナイロンメツシュを巻き 、凍結保護剤であるジメチルスルホオキシドとグリセロールをそれぞれ最終濃度 が５％と１５％になるように加えたＲＰＭＩ　１６５０培地を含むナンク管に入 れる。メツシュ上の間質細胞の凍結は＋１℃から一４０℃まで１℃／分の初期冷 却速度で行なう、−２ないし一り℃／分の冷却速度で一８４℃の最終温度まで達 成するのが最適である０間質細胞のおよそ２０−２５％がナイロンメツシュから 剥離する。

２・盈血旦盗■遺１ ５〜１０％の牛脂仔血清、５〜１０％の馬血清、ビタミン類、ヒドロコルチゾン 類、グルタミン、及び抗生物質を補足した改良型フィツシャーズ（Ｆｉｓｃｈｅ ｒ’ｓ）又はマツコイズ（ＭｃＣｏｙ’ｓ）　５Ａ培地に骨髄細胞を懸濁する。

これらの細胞は、採取直後のものか或いは８０℃の湯浴中で急速に解凍された低 温保存されていた試料かである。２〜５Ｘ１０’個の細胞を２５ｍｍ”のプラス チック製の培養フラスコ中にある群落間質細胞の網目上に接種し、５％のＣＯ□ を含む空気中で３３〜３４℃で増殖する。これらの培養における相対湿度は９０ ％以上である。

３日後に培養温度を３５〜３７℃に上げる。

造血細胞は群落間質細胞により形成された　ナチュラル　ポケット（ｎａｔｕｒ ａｌ　ｐｏｃｋｅｔｓ）中で増殖し、母細胞は細胞の付着層中に残る。付着層は メツシュに直接付着した細胞或いはメツシュに直接付着した細胞に付着すること により間接的につながっている細胞から成る。４〜５日後、成熟顆粒球、単核細 胞、及び赤血球がチトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ　）標本により観察すると非付 着層に現われるいるのがわかる。７〜１０日後、数多くの造血細胞のコロニーが メツシュのすき間にａｍされ、形態学的にはＣＦＵ　−Ｃ１混合コロニー、及び リンパ様コロニーである。巨核球の増殖には限界があるがこの基質中では十分Ｉ ＩＩされるであろう。好調な培養では一週間当り４５０〜９５０　ＣＦＵ−Ｃが 生産されるであろう。

同じ個体から取り出された（自己の）造血細胞と間質細胞とから成る培養株には 一週間に２回栄養を与えなければならない、異なる個体から取り出した（異種異 系の）間質細胞の網目上に接種された患者の骨髄から成る培養株には非付着層か ら成熟した免疫適格細胞を十分に減らすことを確実にするために一週間に３回栄 養を与えなければならない。

骨髄間質細胞の増殖促進について、 骨髄間質細胞の増殖における一次速度制限因子は骨髄間質細胞の中に含まれてい る線維芽細胞の相対的に低い分裂指数にある。これらの細胞の増殖と細胞外基質 成分の沈着は、速い細胞分裂をする胎児児線維芽細胞の培養液から取り出された 、１．ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン及び、２．自己制御増殖因子或いはその一 方を加えることにより促進される。

メツシュ上の線維芽細胞の付着と増殖は、１．可溶化されたＩ−ＩＶ型のコラー ゲンでメツシュをあらかじめ被覆するか、又は２０人胎児の線維芽細胞或いはこ の型のコラーゲンを合成する能力があるかどうかであらかじめサブセットされた 成人線維芽細胞（以下“増殖促進線維非細胞と呼ぶ）により分泌されたコラーゲ ンで被覆又は埋め込んだメツシュを使用することによっても促進できる。これに ついては、増殖促進線維非細胞は群落に達した時点（胎児児線維芽細胞で５〜７ 日、成人線維芽細胞で１４〜１８日）で穏やかなトリプシン処理によりメツシュ より取り除き、１．先に述べたように間質骨髄細胞に接種するか、２．後の使用 に備えて低温保存することもできる。

本発明の一つの具体例では、コラーゲンやその他の細胞外基質成分を合成してい る増殖促進線維非細胞を群落に達するまでメツシュ上で増殖させる。造血細胞と 間質骨髄細胞の両方の混合物を、次にこの群落化増殖促進線維芽細胞の網目に接 種する。

増殖促進線維非細胞の増殖、サブセット、低温保存の方法は以下に示すとおりで ある。

ａ、増殖促進線維非細胞の培養 線維芽細胞は２〜１０％牛脂仔血清又は２−１０％馬血清に１μｇ／ｍＬのへミ コハク酸ヒドロコルチゾンと２μｇ７’＋Ｌのゲンタマイシン、ペニシリン、ス トレプトマイシン及びファンジゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）をあらかじめ加え、 これをＲＰＭＩ　１６５０に添加してこの中で増殖させる。培養株は５％の００ ２を含む空気中、３７℃、相対湿度９０％以上で増殖させる。

ｂ、増殖促進線維非細胞のサブセツティング骨髄懸濁液のバフィーコートから取 り出した線維芽細胞、死体の肝から取り出した線維芽細胞、又は皮膚の線維芽細 胞を５．ＯＸ　１０’個、マイクロタイターウェル（１■”　）に入れ１群落化 するまで増殖させる。これらの細胞は、Ｃａ　或いはＭｇ　を含まないハングの 均衡塩類溶液で通常４〜５回繰り返し洗うことにより培養ウェルより取り出す、 マイクロタイタープレート上に残った基質は、存在するコラーゲンの種類を確認 するために間接免疫蛍光法により検査する。この方法では、さまざまな基質成分 に対するモノクローナル抗体とフルオレセインイソチオシアン酸塩でラベルした 兎の抗マウス免疫グロブリンＧを用いる。

懸濁された細胞は、各々の生成物を合成する能力のある細胞の亜集団を分離する ためにコラーゲンＩ−ＩＶ型。

エラスチン、トロボエラスチン、及びフィブロネクチンに対して作られたモノク ローナル抗体で処理する。

この細胞を、モノクローナル抗体が付着したこれらの細胞を損傷するか破壊する 働きのあるモルモットの補体で処理する。生きている細胞は、先に述べたように ミクロタイターウェルに再び入れ、群落化まで増殖させ取り出す９分離技術の効 率は、モノクロナール抗体と間接免疫蛍光法によりこれらの細胞から分泌された 基質を調べることにより確かめられる。

造血細胞が最もよく増殖するためには、基質にコラーゲンｍ型、■型及びＩ型が およそ６：３：１の割合で含まれている必要がある。

Ｃ０増殖促進線維芽細胞の低温保存 増殖促進線維芽細胞は間質細胞について先に述べたのと同じ技術を用いて低温保 存することができる。間質細胞と同様に、増殖促進線維芽細胞のいくらかも、ま た凍結中にメツシュから剥離する。しかし、この基質は依然として骨髄間質細胞 の付着に役立ち、造血細胞の増殖の助けとなる基質の完成に必要となる時間を短 縮させる。

（単核細胞の接種） 骨髄細胞培養株の長期間の増殖を促進するために末梢血液の単核細胞をフィコル ーパイバク（Ｆｉｃｏｌｌ　−ｈｙｐａｑｕｅ）比重遠心法又はパーコール（Ｐ ｅｒｃｏｌｌ）勾配法によってヘパリンを加えた懸濁液より調整する。

末梢血液細胞と骨髄造血細胞は同じ個体から取り出す（自己由来）。これらの細 胞は、静脈穿刺により採取し骨髄の試料に取り出した時点で低温保存する。培養 の過程でさらに末梢血液細胞が必要な場合は罹病している患者から採血してもよ い。しかし転移性の疾病が疑われる場合には試料から悪性細胞を先に述べたよう に一掃する必要がある。５Ｘ１０’〜１０６の単核細胞（この段階では単核細胞 層の中でも単球の集団がより好ましい細胞種である）を、骨髄造血細胞を最初に 接種してから４〜５Ｂ後の網目に接種する。この後、３週間ごとに１核細胞を接 種していく。この方法により、−週間ごとの観察で、１０〜１３％造血機能が増 強される。

（培養株の永続化と母細胞の預託） 本発明者らの実験では、集合間質細胞培養株は全く、或いは最も良い状態でも、 はとんど造血を助けない。

骨髄から取り出された必要な増殖／制御因子が与えられた場合は人の造血母細胞 の増殖が不明確であるが可能となる。

例えば、最初の骨髄試料を、およそ１０ｔ′個の造血細胞を含むいくつかの試料 に分割する。これらの各々を、群落化した間質細胞の網目上に接種する。この培 養株を倒立顕微鏡を用いて直接観察し、チトスビン（ｃｙｔ。

５ｐｉｎ）　’ＩＡ本上に見られる非付着細胞の鑑別計数を行なうことによりモ ニターする。融合に達する前に培養株をコラゲナーゼで処理し、およそ６〜１０ 分間穏やかに超音波処理する。造血細胞及び間質細胞は密度勾配法で分離する。

造血細胞は血球計算板を用いて計算し。

およそ５０％を先に述べた方法で低温保存する。増血細胞の残りの５０％は、お よそ１０′個の細胞からなる試料に分割し、平行して時間をずらして増殖させて あった群落化間質細胞培養株上へ接種する。これらが群落に達し始めた時、同様 の手順を実施する。

この技術は、１．必要とされる増殖因子を生産する微細環境を提供することによ り造血細胞の増殖を永続化する、２．移植を実施するのに十分な数が達成される まで造血母細胞を預けておく永続的預託機関をつくることにより達成される。

（細胞の生産物による造血細胞の増殖の調整）現在人の骨髄をさまざまな細胞成 分に分け、別々の培養株として培養する技術が存在している。大食細胞、細網細 胞、脂肪細胞、及び線維芽細胞は別々に増殖させることができ、その分泌活性は 、さまざまな試薬で処理することにより変化させられる。線維芽細胞の調整は先 に記述したとおりである。

３次元の網目上の長期間の人骨髄培養株中の造血もまた以下の様な培養法で増殖 させた時、骨髄外の大食細胞（クップファー細胞）の分泌物により調整できる。

クップファー細胞はプロナーゼで分解後器官支質から分離する。簡単に示すと、 組織標本をプロナーゼ［０，２％プロナーゼ溶液〔カルバイオケム（Ｃａｌｂｉ ｏｃｈｅｍ）　］及びゲイ（Ｇｅｙ）の均衡塩類溶液（ＢＳＳ）コ中で穏やかに 撹拌しながら１時間保温する。溶液のｐＨは１規定のＮａＯＨで７．３〜７．５ に維持する。デオキシリボヌクレアーゼ（０，５＋ｎｇ）　（カルバイオケム） を上記の過程を通して３０分おきに加え、得られた細胞懸濁液を濾過し、３５０ ＸＧで１０分間遠心分離処理する。ペレットはゲイズ（Ｇｅｙ’ｓ）　ＢＳＳに 再懸濁し、沿岸細胞（大食細胞及び内皮細胞）を細胞破壊片及び成熟血液細胞か らパーコール（Ｐｅｒｃａｌｌ）　（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｅｉａ）〕勾 配法を用いて分離する。この結果得られた細胞フラクションを３分間ずつ３回、 １０％牛脂仔血清を添加し改良したダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　）培地で洗 い、３〜４Ｘ１０’個の細胞を含む量をプラスチック製の培養皿に入れる。

１日間培養した後、培養液で洗うことにより非付着細胞を取り除き、付着細胞は ３３℃５室内の空気に６％のＣＯ２を混ぜた中で、相対湿度を８０％以上に維持 する。

これらの細胞の増殖及び／又は分易活性を以下の条件により促進することができ る。　１．ＣＯ□：０□の割合を変化させる、２．培養株をラテックスビーズで 処理する、３、培養株をシリカで処理する。４．プロスタグランジンＥ、、Ｅ□ 、又はＦａを培地に添加する。５．培地にインク−ロイキン１又はインターロイ キン２を添加する。大食細胞分泌物は、これらの方法及び試薬により調整できる 。

これらの大食細胞の分泌物により調整された培地は、長期間の骨髄培養株に添加 され赤血球生成／顆粒球生成の割合を生体内における状態と同じようにするため に使われる。

本発明の方法は骨髄移植を必要とする患者に対し幾かの有益な点を持っている。

、者の゛　をモニターするための試験管　におけるシステムの 癌或いはその他の病気にかかっている患者において、患者の状態を、骨髄の一部 を吸い出しこれを検査してモニターすることはしばしば有効な手段である。この ようにして転移や再発を臨床上明らかになる以前に検知することができる。骨髄 細胞を検査することにより検知できるその他の状態にある患者も、またこの方法 によりモニターできる。

本発明の骨髄複製システムを使用して吸引した骨髄の試料中での長期間の細胞の 増殖は、クローンの転移細胞及び染色体に異常を伴った造血細胞の検知の可能性 を高める。これらの細胞は、新しく吸引された（培養されていない）骨髄の従来 の塗抹標本では検知漏れとなる。

細　毒性システムにおける試験管内骨　製システム夙吏凪 薬物、抗新生物薬、癌原性物質１食品添加物、及びその他骨髄に関係する物質の 骨髄に対する細胞毒性は、本発明の試験管内骨髄複製システムを用いてテストさ れる。

まず最初に、骨髄細胞（間質細胞及び造血細胞を含む）の増殖中の培養株を作る 。その後、この培養株をテストする物質のさまざまな濃度に曝す、テスト物質と 共に培養した後、培養株を位相差顕微鏡で検査することにより最大耐量（ＨＴＤ ）　Ｃ形態学上の異常が最も早く出現する際のテスト物質の濃度〕を決定する。

細胞毒性試験はこの３次元システムで細胞の活性を調べるためのさまざまな超生 体染色色素を用いてこうした技術に習熟している人々にはすでに十分知られてい る技術を用いて実施することができる。　ＨＴＤ決定はさらに他の試験のための 濃度範囲を提供することとなる。

一度試験の範囲が確立されれば、テスト物質のさまざまな濃度について骨髄培養 株を構成するさまざまな細胞種の生存能力、増殖、及び形態或いはその一方に対 する影響をよく知られた方法で調べることができる。

本発明で示されたようなその他の３次元細胞培養システムを細胞毒性試験に使用 することができる。

３−細　培　システムの　立 本発明は３次元の支持体及びその３次元的、多重層細胞培養システムのための枠 としての利用を明らかにする。これまでに知られている組織培養システムにおい ては、細胞は単層で増殖した０本発明に従い３次元の支持体上で増殖した細胞は 、細胞基質を形成しながら多重層を成して増殖する。この３次元的細胞培養シス テムは、これまでに記述されている単層の組織培養システムに比べ、はるかに生 体内で見られる生理学的状態に近い０本発明の一つの具体例では３次元の細胞培 養システムは生きている生物上に或いはその中へ移すことができる。

この３次元の支持体は、以下の条件を満たすどのような材料でもよい、１．細胞 がそれに付着するもの（或いは細胞がそれに付着するように装飾できるもの）及 び、２．細胞が一層以上増殖できるもの、この３次元の支持体は本発明における 好ましい具体例ではメツシュである。

この３次元細胞培養システムは、骨髄、皮膚、肝、及びその他多くの種類の細胞 や組織に適用できるものと期待されている１例えば、３次元の皮膚細胞培養シス テムは以下のように作られる。

１、線維芽細胞をメツシュに付着させ、７〜９日間増殖させる。試験管内骨髄複 製システムで使用された増殖促進線維芽細胞に関して先に述べた様にコラーゲン Ｉ型及び■型を沈着する。

２、メラノサイトを処理されたメツシュ上につけ５日間増殖させる。

３、ケラチン細胞をサブコンフリューエンド（５ｕｂｃｏｎｆｌｕａｎｔ）　し たメラノサイト上に接種する。

本発明は、それぞれについての具体例に言及しながら詳細に説明されているが、 そのさまざまなバリエーションは、上述のまたは以下の特許請求範囲のような本 発明の展望から離れることなく作られ、また作られ得ることが理解されるであろ う。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の７第１項）昭和６２年１２ 月１８日 特許庁長官　小　川　邦　夫　殿 １、国際出願番号　ＰＣＴ／ＵＳ　８７１０　Ｏ８６９３、特許出願人 住　所　アメリカ合衆国　９５８２５　カリフォルニアサクラメント　マーキュ リ−ウェイ　２０１３名　称　マロウーテク　インコーポレーテッドメ代表者　 コルスキー、ロジャー　４７ 国　籍　アメリカ合衆国 ４、代理人 住　所　東京都千代田区丸の内−丁目５番１号新丸ノ内ビルヂング３階４４区 ５、補正書の提出年月日　１９８７年（昭和６２年）９月８日６、添付書類の目 録 （１）補正書の写しく翻訳文）　１通 請求の範囲 １、骨髄が破壊されたかその機能が失われた患者を治療するための方法で以下の 段階から成るもの。

■、提供者から骨髄試料を得ること、 ■、骨髄複製活性を持つ造血幹細胞を含む複製された骨髄を生産するために試験 管内で骨髄の試料を複製すること、そして ■、患者の造血機能を回復するために患者に造血幹細胞を含む複製された骨髄を 注入すること。

２、請求の範囲１に従う患者を治療するための方法で。

骨髄を提供者から採取した直後に骨髄試料中の骨髄細胞を低温保存するか又は凍 結し、その後解凍し複製させるもの。

３、請求の範囲１に従う患者を治療するための方法で、複製された骨髄の一部を 低温保存するか凍結し、その後解凍し注入するもの。

４、請求の範囲１に従う患者を治療するための方法で、骨髄細胞を注入する前に 物理的或いは化学的方法で病気にかかっている細胞を骨髄細胞から取り除くもの 。

５、請求の範囲４に従う患者を治療するための方法で、病気にかかっている細胞 が悪性である場合のもの。

６、骨髄が破壊されているかその機能が失われている哺乳動物を治療するための 方法で以下の段階からなるもの。

■、治療される哺乳動物と同じ種の動物から骨髄の試料を得ること、 ■、骨髄複製活性を持った造血多能性細胞造血母細胞、及び造血前駆細胞を含む 造血幹細胞を含む複製された骨髄を注入すること。

７、請求の範囲６に従う哺乳動物を治療する方法で。

複製段階（ｎ）の間に造血幹細胞が生理学的に分化するもの。

８、請求の範囲７に従う哺乳動物を治療する方法で、赤血球、骨髄線、リンパ球 、大食細胞のコロニーを含む造血血液細胞のコロニーが複製段階（ｎ）の期間を 通じて連続的に発生すること。

９、請求の範囲８に従う哺乳動物を治療する方法で。

複製段階（ＩＩ）の期間巨核球のコロニーもまた連続的に発生し、成熟するもの 。

１０、請求の範囲６に従う哺乳動物を治療する方法で、骨髄試料中の骨髄細胞を 提供動物から採取した直後に低温保存するか凍結し、その後解凍して複製するも の。

１１、請求の範囲６に従う哺乳動物を治療するための方法で、複製された骨髄の 一部を低温保存又は凍結し。

その後解凍し複製するもの。

１２、請求の範囲６に従う哺乳動物を治療するための方法で骨髄を注入する前に 骨髄細胞から病気にかかっている細胞を物理的或いは化学的方法で取り除くもの 。

１３．請求の範囲１２に従う哺乳動物を治療するための方法で、この病気にかか っている細胞が悪性である場合のもの。

１４、骨髄が破壊されているか又はその機能が失われている哺乳動物を治療する ための方法で以下の段階からｔ゛るもの。

■、治療を受ける哺乳動物と同じ種の提供動物から骨髄の試料を得ること２ ■９元の骨髄試料に存在する全ての細胞種を含む複製された骨髄を生産するため に試験管内で骨髄試料を複製すること、そして ■、曙乳動物に造血機能を回復させるために元の骨髄に存在する全ての細胞種を 含む複製された骨髄を哺乳動物へ注入すること。

１５、請求の範囲１４に従う哺乳動物を治療するための方法で、細胞の種類が一 段階或いはそれ以上の分化をしている赤血球、骨髄味、リンパ球、及び大食細胞 であるもの。

１６、請求の範囲１５に従う方法で、この細胞の種類にさらに一段階或いはそれ 以上の分化をしている巨核球を含むもの。

１７、請求の範囲１４に従う哺乳動物を治療するための方法で提供動物から採取 した直後に骨髄試料中の骨髄細胞を低温保存するか又は凍結し、その後解凍して 複製するもの。

１８゜請求の範囲１４に従う哺乳動物を治療するための方法で、複製された骨髄 の一部を低温保存するか又は凍結し、その後解凍して注入するもの。

１９、請求の範囲１４に従う哺乳動物を治療するための方法で、骨髄を注入する 前に骨髄細胞中の病気にかかっている細胞を取り除くこと。

２０゜請求の範囲１９に従う哺乳動物を治療するための方法で、この病気にかか った細胞が悪性である場合のもの。

２１、請求の範囲１４に従う哺乳動物を治療するための方法で骨髄の試料が約１ Ｏ−１５ｃｃの末梢血液中の骨髄懸濁液であるもの。

２２、請求の範囲２１に従う哺乳動物を治療するための方法で１０−］、５ｃｃ の末梢血液中の骨髄懸濁液を造血機能を回復させるために治療を受ける哺乳動物 に注入するのに十分なだけの骨髄細胞に複製するもの。

２３、請求の範囲１４に従う哺乳動物を治療するための方法で、骨髄試料を提供 動物の腸骨稜から吸い出すもの。

２４、請求の範囲１４に従う哺乳動物を治療するための方法で、提供動物が４０ 歳以下のヒトである場合のもの。

２５、請求の範囲１４に従う哺乳動物を治療するための方法で提供動物が疾病に かかっていない場合のもの。

２６、請求の範囲１４に従う哺乳動物を治療するための方法で、試験管内で複製 された骨髄細胞を物理的操作及び／或いは酵素による処理で一種類ずつ分類する こと。

２７、請求の範囲１４に従う哺乳動物を治療するための方法で骨髄細胞を骨髄細 胞の付着と骨髄細胞の一層以上増殖を支える３次元の支持体上で試験管内で複製 するもの。

２８、請求の範囲２７に従う哺乳動物を治療するための方法で、３次元の支持体 がメツシュであるもの。

２９、請求の範囲２８に従う哺乳動物を治療する為の方法で、このメツシュがナ イロンメツシュであること。

３０、請求の範囲２９に従う哺乳動物を治療するための方法で、このナイロンメ ツシュに約４００μｍ２の篩面積があり繊維の直径が約１００μｍであるもの。

３１．請求の範囲２７に従う哺乳動物を治療するための方法で、この３次元の支 持体が群落（ｓｕｂｃｏｎｆｌυｅｎｃｙ）状態にまで増殖させた骨髄細胞の３ 次元的網目で被覆されているもの。

３２、請求の範囲３１に従う哺乳動物を治療するための方法で、この３次元の支 持体が約４００μｍ２の篩面積を持ち、繊維の直径が約１００μｍであるナイロ ンメツシュであること。

３３．１！乳動物の骨髄に影響を与える状態を検知する方法で以下の段階から成 るもの。

■、晴乳動物から骨髄の試料を採取すること、■、３次元の骨髄培養株を生産す るために試験管内で骨髄試料を複製すること、 ■、この３次元の骨髄培養株を検査すること、そして ■、異常細胞又は異常な細胞増殖を検知すること。

３４、請求の範囲３３に従う骨髄に影響を与える状態を検知するための方法で、 ３次元の骨髄培養株を、支持体に細胞が付着でき、一層以上の細胞の増殖が可能 な３次元的支持体で、群落まで増殖させた３次元の骨髄間質細胞で被覆された３ 次元的支持体のはいった培養液に骨髄試料を加えることにより生産するもの。

３５、請求の範囲３４に従う骨髄に影響を与える状態を検知する方法で、この３ 次元の支持体が約　４００μｌ１１２の篩面と約１００μｍの繊維直径を持つナ イロンメツシュであるもの。

３６、細胞培養の為の３次元的支持体で、この支持体が細胞の付着及び一層以上 の細胞の増殖を支えているもの。

３７、請求の範囲３６に従う３次元的支持体で、この３次元的支持体がメツシュ であるものや ３８、請求の範囲３７に従う３次元的支持体で、メツシュがナイロンメツシュで あるもの。

３９、請求の範囲３８に従う３次元的支持体で、このナイロンメツシュが約４０ ０μｍ２の篩面と１００μｍの繊維直径を持つもの。

４０、請求の範囲３６に従う３次元的支持体で、この支持体が細胞が支持体に付 着できる様に処理されたもの。

４１．３次元の細胞培養システムで以下から成るもの。

培養液中の３次元的支持体、及び少なくとも３次元的支持体上に２層以上の細胞 が増殖しており、その中の幾らかがこの３次元的支持体に付着しているもの。

４２、請求の範囲４１に従う３次元的細胞培養システムで、支持体がナイロンメ ツシュであるもの。

４３、請求の範囲４１に従う３次元的細胞培養システムで、このナイロンメツシ ュが約４００μ１１２の篩面と約１００μｍの繊維直径を持つもの。

４４、請求の範囲４１に従う３次元的細胞培養システムで、この３次元的支持体 上で増殖する細胞が骨髄、皮膚、或いは肝細胞であるもの。

４５、請求の範囲４４に従う３次元的細胞培養システムで、この支持体がナイロ ンメツシュであるもの。

４６、請求の範囲４５に従う３次元的細胞培養システムで、このナイロンメツシ ュが約４００μｍ２の篩面と約１００μ鳳の繊維直径を持つもの。

４７．３次元的骨髄細胞培養システムで以下から成るもの。

培養液中の３次元的支持体、 ３次元的支持体上に群落化するまで増殖した骨髄間質細胞の３次元的網目、そし て 骨髄間質細胞の３次元的網目上及びそのまわりに増殖する造血骨髄細胞コロニー 。

４８、請求の範囲４７に従う３次元的骨髄細胞培養システムで、この３次元的支 持体がナイロンメツシュであるもの。

４９、請求の範囲４８に従う３次元的骨髄細胞培養システムで、このナイロンメ ツシュが約４００μｌ１１２の篩面と約１００μｍの繊維直径を持つもの。

５０、請求の範囲４７に従う３次元的骨髄細胞培養システムで、この骨髄間質細 胞に線維芽細胞、大食細胞、顆粒細胞、及び脂肪細胞が含まれるもの。

５１、請求の範囲４７に従う３次元的骨髄細胞培養システムで、この培養液に牌 臓又は肝臓から得た骨髄外の大食細胞（クソプファー細胞）の培養液から分離し た因子を含むもの。

５２、請求の範囲４７に従う３次元的骨髄細胞培養システムで、この造血骨髄細 胞に赤血球、骨髄球、リンパ球、及び大食細胞のコロニーが含まれるもの。

５３、請求の範囲５２に従う３次元的骨髄細胞培養システムで、この骨髄細胞コ ロニーにさらに巨核球のコロニーが含まれること。

５４、骨髄細胞を複製するための方法で以下の段階から成るもの。

Ｉ８骨髄間質細胞を培養液中の３次元的支持体に接触すること、 ■、骨髄間質細胞の３次元的網目をこの３次元的支持体上で群落（ｓｕｂｃｏｎ ｆｌｕｅｎｃｙ）状態にまで増殖させること、 ■９群落化（ｓｕｂｅｏｎｆｌｕｅｎｔ）　した骨髄間質細胞の３次元的網目に 多能性、プロジエニター（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）及び／又は前駆幹細胞を含む 造血幹細胞を接種すること。

■、最初に接種した全種類の造血細胞を含む造血骨髄細胞コロニーを増殖させる こと。

５５、請求５４に従う骨髄細胞を複製する方法で、この３次元的支持体がナイロ ンメツシュであること。

５６、請求５５に従う骨髄細胞を複製するための方法で、このナイロンメツシュ が約４００μｍ２の篩面と約１００μｍの繊維直径を持つこと。

５７、請求５４に従う骨髄細胞を複製するための方法で、この骨髄間質細胞が線 維芽細胞、大食細胞、顆粒細胞。

及び脂肪細胞を含むこと。

５８、請求５４に従う骨髄細胞複製のための方法で、この培養液が牌又は肝の骨 髄外の大食細胞（クツプファー細胞）の培養液から分離した因子を含むこと。

５９、請求５４に従う骨髄細胞複製のための方法で、この骨髄細胞のコロニーに 赤血球、骨髄球、リンパ球、及び大食細胞のコロニーが含まれるもの。

６０、請求の範囲５４に従う骨髄細胞複製のための方法で、この骨髄細胞コロニ ーにさらに巨核球のコロニーも含まれるもの。

６１、請求の範囲５４に従う骨髄細胞複製のための方法で、３次元的支持体上の 間質細胞を造血幹細胞が接種される前に寒冷保存或いは凍結されその後解凍され るもの。

６２、請求の範囲５４に従う骨髄細胞複製のための方法で、この造血細胞を接種 後の最初の３日間は３３〜３４℃で増殖させるもの。

６３、請求の範囲５４に従う骨髄細胞複製のための方法で、間質細胞及び造血幹 細胞は同じ個体から取り出されたものであるもの。

６４、請求の範囲６３に従う骨髄細胞複製のための方法で。

造血骨髄細胞コロニーの増殖を維持するために培養液を増殖段階（ＩＶ）の間、 少なくとも一週間に２回交換するもの。

６５、請求の範囲５４に従う骨髄細胞複製のための方法で。

間質細胞と造血幹細胞が異った個体から取り出されたものであるもの。

６ｓ、　請求の範囲６５に従う骨髄細胞を複製するための方法で、造血骨髄細胞 のコロニーの増殖を維持するために培養液を増殖段階（■）の間少なくとも一週 間に３回交換するもの。

６７、請求の範囲５４に従う骨髄細胞複製のための方法で、この３次元的支持体 上に骨髄間質細胞を接種する前に、３次元的支持体を可溶化された！−４％’型 のコラーゲンで被覆するもの。

６８、請求の範囲５４に従う骨髄細胞複製のための方法で、この３次元的支持体 に骨髄間質細胞（］段階）を接種するに先立ち以下の数段階が加えられるもの。

（ａ）コラーゲン及びその他の細胞外基質成分或いはその一方を分泌する線維芽 細胞を３次元的支持体に接種すること、 （ｂ）コラーゲン及びその他の細胞外基質成分或いはその一方を分泌する線維芽 細胞をこの３次元的支持体上で増殖させること、そして （ｃ）コラーゲン及びその他の細胞外基質成分或いはその一方を分泌する線維芽 細胞を３次元的支持体から、この支持体を被覆した或いはこれを埋め込んだ分泌 されたコラーゲン及びその他の細胞外基質成分或いはその一方を遊離させる方法 により取り除くこと。

６９、請求の範囲６８に従う骨髄細胞を複製する方法で、（ａ）段階で接種され た線維芽細胞がそれぞれコラーゲン■型、ｎ′型及びｌ型を分泌し、その存在比 が約６：３：１である線維芽細胞の混合物であるもの。

７０、請求の範囲６８に従う骨髄細胞複製のための方法で、（ｅ）段階における 線維芽細胞の除去方法がトリプシン処理であるもの。

７１、請求の範囲６８に従う骨髄細胞複製のための方法で、コラーゲン及びその 他の細胞外基質成分或いはその一方を分泌する線維芽細胞を取り除いた後に、こ の３次元的支持体を寒冷保存或いは凍結し、その後造血幹細胞を接種する前に解 凍するもの。

７２、骨髄細胞複製のための方法で以下の段階から成るもの。

■、培養液中の３次元的支持体にコラーゲン及びその他の細胞外基質成分或いは その一方を分泌する線維芽細胞を接種すること、 ｎ、ｍ維芽細胞を群落まで増殖させること、■、この群落化した線維芽細胞に間 質及び造血細胞を含む骨髄試料を接種すること、 ■、最初に接種された全ての種類の造血細胞を含む造血骨髄細胞コロニーを増殖 させるもの。

７３、請求の範囲７２に従う骨髄細胞複製のための方法で、■段階で接種される 線維芽細胞はそれぞれコラーゲン■型、■型及びＩ型を分泌し、その存在比が約 ６＝３：１である線維芽細胞の混合物であるもの６７４、請求の範囲５４に従う 骨髄細胞複製のための方法で、最初の造血細胞の接種後４〜５日目に末梢血液の 単核細胞を加え、その後は３週間毎に加えるもの。

７５、請求の範囲７４に従う骨髄細胞複製のための方法で、この単核細胞が大部 分単球であるもの。

７６、請求の範囲７４に従う骨髄細胞複製のための方法で。

この単核細胞及び造血細胞が同じ個体から取り出されるもの。

７７、請求の範囲７４に従う骨髄細胞複製のための方法で、この単核細胞が添加 される前に物理的或いは化学的方法で病気にかかっている細胞が取り除かれてい るもの。

７８、請求の範囲７７に従う骨髄細胞複製のための方法で、この病気にかかって いる細胞が悪性であるもの。

７９、請求の範囲５４に従う骨髄細胞複製のための方法で、培養液が牌又は肝の 骨髄外大食細胞（クソブファー細胞）の分泌物により調整されているもの。

８０、請求の範囲７９に従う骨髄細胞複製のための方法で、骨髄外大食細胞は別 の培養液中で増殖させ、骨髄外大食細胞の別にされた培養株から得た分泌物を骨 髄の培養液に定期的に加えるもの。

８１、請求の範囲８０に従う骨髄細胞複製のための方法で、骨髄外大食細胞の別 にされた培養株の増殖及び分泌活性或いはその一方が骨髄外大食細胞が増殖する 場のＣＯ□二〇□比を変化させることにより刺激できるもの。

８２、請求の範囲８０に従う骨髄細胞複製のための方法で。

骨髄外大食細胞の別にされた培養株をラテックスサービスで処理するもの。

８３、請求の範囲８０に従う骨髄細胞複製のための方法で、骨髄外大食細胞の別 にされた培養株をシリカで処理するもの。

８４、請求の範囲８０に従う骨髄細胞複製のための方法で。

プロスタグランジンＦ２．Ｅ２又はＦ２ａを骨髄外大食細胞の別にされた培養株 に加えるもの。

８５゜請求の範囲８０に従う骨髄細胞を複製するための方法で骨髄外大食細胞の 別にされた培養株にインターロイキン１又はインターロイキン２を加えるもの。

８６、物質の細胞毒性を試験する方法で以下の段階から成るもの。

■、生きた細胞を含む３次元の細胞培養システムに試験する物質を加えること、 ■、この物質及び細胞培養システムを培養すること、そして ■、細胞に於ける細胞毒性の変化を観察すること。

８７、請求の範囲８６に従う物質の細胞毒性試験の方法で、その３次元の細胞培 養システムが骨髄細胞培養システムであるもの。

８８、請求の範囲８７に従う物質の細胞毒性試験の方法で。

その骨髄細胞培養システムが造血多能性細胞、造血母細胞及び前駆細胞を含むも の。

８９．　請求の範囲８６に従う物質の細胞毒性を試験する方法で、この３次元的 細胞培養システムが、細胞の付着と一層以上の細胞の増殖を支えている３次元的 支持体を含む培養液に生きた細胞を加えることにより作られるもの。

９０、請求の範囲８９に従う物質の細胞毒性を試験する方法で、この３次元的支 持体が約４００μ膓２の篩面と約１００μｍの繊維直径を持つナイロンメツシュ であるもの。

９１．３次元の皮膚細胞培養システムで以下から成るもの。

培養液中の３次元的支持体、 この３次元的支持体上に群落まで増殖したメラニン細胞の３次元的網目、及び このメラニン細胞の３次元的網目上及びその周囲に増殖しているケラチン細胞。

９２、請求の範囲９１に従う３次元的皮膚細胞培養システムで、この３次元的支 持体がメツシュであるもの。

９３、請求の範囲９２に従う３次元的皮膚細胞培養システムで、このメツシュが ナイロンメツシュであるもの。

９４、請求の範囲９３に従う３次元的皮膚細胞培養システムで、このナイロンメ ツシュが約４００μｍ２の篩面と約１００μｍの繊維直径をもつもの。

９５、皮膚細胞を？１１製する方法で以下の段階を含むもの。

■、培養液中の３次元的支持体にメラニン細胞を接種すること、 ■、メラニン細胞の３次元的網目をこの３次元的支持体上で群落まで増殖させる こと、 ■、メラニン細胞の群落化のための３次元的網目にケラチン細胞を接種すること 、 ■。ケラチン細胞を増殖させること。

９６、請求の範囲９５に従う皮膚細胞の複製のための方法で、この３次元的支持 体がメツシュであるもの。

９７、請求の範囲９６に従う皮膚細胞複製のための方法で。

このメツシュがナイロンメツシュであるもの。

９８、請求の範囲９７に従う皮膚細胞複製のための方法で、このナイロンメツシ ュが約４００μｍ２の篩面と約１００μ−の繊維直径を持つもの。

９９、請求の範囲９５に従う皮膚細胞複製のための方法で、この３次元的支持体 にメラニン細胞（１段階）を接種する前に以下の段階を加える事を含むもの。

（ａ）この３次元的支持体にコラーゲン及びその他の細胞外基質成分或いはその 一方を分泌する線維芽細胞を接種すること。

（ｂ）この３次元的支持体上で線維芽細胞が増殖すること、そして （ｃ）この３次元的支持体上に被覆された、或いはこれを埋め込んだ、分泌され たコラーゲンを遊離させる方法でこの３次元的支持体から線維芽細胞を除去する こと。

１００、請求の範囲９７に従う皮膚細胞を複製するための方法で（ａ）段階で接 種された線維芽細胞がＩ型とｍ型のコラーゲンを分泌する線維芽細胞の混合物で あるもの。

１０１、請求の範囲９７に従う皮膚細胞の複製のための方法で（Ｃ）段階で線維 芽細胞を除去する方法がトリプシン処理であるもの。

１０２、請求１００に従う皮膚細胞を複製するための方法で、この３次元的支持 体をコラーゲン分泌線維芽細胞を除去した後寒冷保存或いは凍結し、その後解凍 するもの。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．骨髄が破壊されたりその機能が失われている患者を治療するための方法であ って、以下の段階から成ることを特徴とする骨髄の複製方法。 １．提供者から骨髄の試料を得ること、ＩＩ．骨髄への再定着能を持つ造血幹細 胞を含む複製された骨髄を生産するために試験管内で骨髄の試料を複製すること 、次に ＩＩＩ．患者に造血援能を回復させるために、患者に造血幹細胞を含む複製され た骨髄を注入すること。
2. ２．特許請求範囲１に従う過程で、骨髄試料の骨髄細胞を患者から採取した直後 に低温保存するか凍結し、その後解凍して複製すること。
3. ３．特許請求範囲２に従う過程で、骨髄細胞を低温保存或いは凍結する前に悪性 細胞を物理的又は化学療法的方法で一掃すること。
4. ４．特許請求範囲１に従う過程で、複製された骨髄の一部を低温保存しその後注 入すること。
5. ５．患者の骨髄に影響する状態を検知する方法であって、以下の段階から成るこ とを特徴とする骨髄の状態の検知方法。 Ｉ．患者から骨髄の試料を得ること、 ＩＩ．３次元の骨髄培養株を生産するために試験管内で骨髄試料を複製すること 、 ＩＩＩ．３次元の骨髄培養株を検査すること、そしてＩＶ．異常細胞又は異常な 細胞増殖を検知すること。
6. ６．細胞がこれに付着でき、一層以上に増殖させることのできる細胞培養のため の３次元的支持体。
7. ７．特許請求範囲６に従う３次元的支持体でこの支持体がメッシュであること。
8. ８．特許請求範囲６に従う３次元的支持体でこの支持体を細胞がこの支持体に付 着できるように処理すること。
9. ９．３次元的支持体を用い、該３次元的支持体は、少なくとも２層の細胞が増殖 する３次元的支持体であって、細胞のいくつかがこの３次元的支持体に付着する ことを特徴とする３次元的細胞培養システム。
10. １０．特許請求範囲９に従う３次元的細胞培養システムで、ごの３次元的支持体 上で増殖している細胞が骨髄か皮膚か肝細胞であること。
11. １１．物質の細胞毒性を試験する方法であって、以下の段階から成ることを特徴 とする細胞毒性試験方法。 Ｉ．生きた細胞を含む３次元細胞培養システムに物質を加えること、 ＩＩ．物量と細胞培養システムを培養すること、そして ＩＩＩ．細胞における変化を観察すること。