PT87136B

PT87136B - Processo para a replicacao de medula ossea

Info

Publication number: PT87136B
Application number: PT8713688A
Authority: PT
Inventors: Brian A Naughton; Gail K Naughton
Original assignee: Marrow Tech Inc
Priority date: 1987-04-03
Filing date: 1988-03-30
Publication date: 1992-11-30
Also published as: PT87136A; IL85957A0; GR1003185B; IL85957A; GR880100216A; ES2009894A6

Description

MEMORIA descritiva

Conhecem-se processos para o transplante de medula óssea. Geralmente, realizam-se os transplantes de medula óssea em pacientes que sofrem de uma doença, tal como cancro, que destrói as células de medula óssea saudáveis ou deprimem a sua capacidade funcional. Além disso, tratamentos tais como quimioterapia ou terapia por radiação, afectam adversamente a medula-óssea mesmo em casos em que a medula óssea não foi directamente afectada pela doença a ser tratada. Os métodos de transplante de medula óssea conhecidos apresentam várias desvantagens.

Uma causa principal de rejeição de transplantes de medula óssea é a reacção enxerto versus hospedeiro que ocorre quando a medu la óssea retirada de uma pessoa é transplantada noutra pessoa. Outra causa principal do insucesso de transplante de medula óssea é a doença obstrutiva dos vasos resultante da formação de êmbolos da medula. Existem actualmente procedimentos para a remoção e armazenamento da medula de uma pessoa antes da qui mioterapia e radiação combinadas seguida de re-infusão dessa medula (i.e. transplante autólogo). No entanto, o paciente sçi fre frequentemente de recorrência da doença, mesmo que o enxer. to ocorra, uma vez que a medula já estava doente quando foi re. movida.

Em consequência, é um objecto do presente invento propor, cionar um processo para o tratamento de doenças que destroem células de medula óssea saudáveis ou deprimem a sua capacidade funcional ou replicativa, processo este que não apresenta as desvantagens conhecidas das técnicas de transplante de medula óssea actuais.

Outro objecto do presente invento, é proporcionar um processo para o tratamento de doenças por transplante de medula óssea, processo que não produz uma reacção enxerto versus hospedeiro.

Ainda um processo outro objecto do presente para o tratamento de doenças, por invento é proporcionar transplante de medula óssea, que não provoca a formação de êmbolos da medula.

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presente invento, é proporcionar doenças ou situações que destroem

Ainda outro objecto do um meio para o tratamento de células de medula óssea saudáveis por aspiração de medula óssea de um paciente, replicação das células de vitro, das no e em seguida re-infusão das células de paciente.

Ainda outro objecto do presente invento medula óssea in medula replicaé proporcionar ,

um processo para aumentar a capacidade funcional de uma medula óssea que foi afectada adversamente por quimioterapia e/ou terapia por radiação,

Ainda outro objectivo do presente invento é proporcionar para o tratamento de neoplasias malignas hematolóum processo gicas e de outras neoplasias que metastizam na medula óssea

Objectos e vantagens adicionais do presente invento tornar-se-ão evidentes para os entendidos na arte, com referência à descrição detalhada que se segue.

invento pode ser melhor compreendido com referência à Figura única que mostra uma fotomicrografia electrónica com uma ampliação de 1,65 células do estroma de mil vezes, mostrando um reticulado com medula óssea crescendo nela.

SUMARIO

DO

INVENTO presente invento proporciona-se um prode uma pessoa cuja medula óssea foi des0 processo comDe acordo com o cesso para tratamento truída ou perdeu a sua capacidade funcional, preende os seguintes passos:

I.

obtenção de uma amostra de medula dor; e em seguida óssea de um dali replicação da amostra de medula ósse _in ra produzir uma medula óssea replicada contendo hemocitoblastos hematopoiéticos com actividade re populadora da medula, uma porção da qual pode ser crioconservada para uso posterior?

vitro pae em seguida

III infusão da medula óssea replicada contendo hemocitoblastos hematopoiéticos na pessoa para restabele

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-4cer a hematopoiése na pessoa.

De acordo com o presente invento, proporciona-se um processo para o tratamento de doenças ou de situações que destrui, ram células de medula óssea saudável ou deprimiram a sua capacidade funcional. D processo do presente invento é especialmente eficaz no tratamento de doenças malignas hematológicas e de outras neoplasias que mestatizam na medula óssea.

processo do presente invento compreende os seguintes passos: aspiração de uma pequena quantidade de medula óssea de um paciente saudável; crioconservação das referidas células; replicação das células de medula óssea in vitro para aumentar o número de células de medula óssea até um número suficiente para re-infusão autóloga, o qual é superior ao número originalmente removido do paciente; e em seguida re-infusão das células de medula óssea no paciente. De acordo com uma concretização do presente invento, as células de medula óssea são crioconservadas ou congeladas imediatamente após a aspiração do paciente e são subsequentemente descongeladas e replica, das. De acordo com outra concretização do presente invento, é efectuado um transplante de medula óssea alogénico aspirando medula óssea de um indíviduo, replicando as células de medula óssea in vitro e em seguida re-infundindo as células de medula óssea replicadas noutro indivíduo.

sistema de replicação de medula óssea in vitro do presente invento proporciona também um meio para monitorizar um paciente em relação àquelas situações que afectam a medula óssea. Por exemplo, uma pequena amostra de medula óssea é aspirada de um doente canceroso tratado e replicada no sistema in vitro do presente invento, de forma a verificar se existe recorrência ou metastáses da doença maligna original.

sistema de replicação de medula óssea in vitro é também adaptável a testes de citotoxicidade de produtos farmacêuticos, aditivos alimentares, produtos sanitários, agentes anti -neoplásicos e carcinogénios. Adiciona-se ao sistema de medula óssea in vitro, do invento, uma dose decrescente, proporcio nal, do agente a ser testado e aplica-se em vários tipos de cjé

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-5lulas identificados. Os tipos de células diferentes das células de medula óssea são substituídos para testar um agente pajç ticular, quando necessário.

invento descreve também um suporte tridimensional para o crescimento de células em cultura. 0 crescimento de células em presença deste suporte pode ser aumentado adicionando proteínas, glicoproteínas, glicosaminoglicanos, uma matriz celular e outros materiais ao próprio suporte ou revestindo o suporte com estes materiais. A utilização de um suporte tridimensional permite que as células cresçam em várias camadas, criando assim o sistema de cultura de células tridimensional do presente invento. 0 suporte tridimensional pode ser usado para criar sistemas de cultura de células, tridimensionais, para células de medula óssea, pele, fígado e muitos outros tipos de células e tecidos. Numa concretização deste invento o sistema de cultura de células tridimensional pode ser transferido para dentro de um organismo vivo ou sobre ele.

suporte tridimensional está de preferência sob a forma de uma rede. Os suportes preparados podem ser conservados para uso posterior num sistema de cultura de células, tridimensional, fisiológico, Numa concretização para células de medula óssea hematopoiéticas em crescimento, a rede é preparada fa zendo crescer uma camada de células de estroma de medula sobre a rede até que as células do estroma de medula atinjam a sub-confluência.

BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO

Com referência agora à figura única dos desenhos mostra-se um reticulado 10 útil no presente invento. 0 reticulado 10 contém fios de urdidura 12 e fios de trama 13. Como mostra do na figura, as células do estroma 14 podem ser vistas crescer nos fios 12, 13.

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-6DESCRIÇAO DETALHADA DO INVENTO

Replicação e crioconservação de medula óssea para utilização em transplantes de medula óssea presente invento refere-se a um processo para o tratamento de doenças e situações que destroem células de medula ós. sea saudável ou deprimem a sua capacidade funcional. D proces. so é eficaz especialmente no tratamento de doenças malignas he matologicas e de outras neoplasias que metastizam na medula óssea. 0 processo deste invento é também eficaz no tratamento de pacientes cuja medula óssea foi adversamente afectada por quimioterapia e/ou terapia por radiação exigida por uma doença que não afecta directamente a medula óssea sente invento proporciona ainda um meio para remover e conservar células de medula óssea de um paciente saudável e em segui replicar e re-infundir as células de medula óssea, quer o desenvolva uma doença que destrua directamente a medu. ou quer o tratamento afecte adversamente a medula.

processo do pre da, paciente la óssea acordo com o processo do presente invento, uma pequena quantidade (10-15 cc) de medula óssea/sangue periférico, através da cristã ilíaca de um dador. Os resultados

1. o indivíduo tem menos de 40 na altura em que a sua medula é crioconservada. Este procedimento pode mostrar-se

De aspira-se do processo são óptimos se:

anos de idade

2. o paciente é saudável benéfico para certos pacientes com doenças metastãtica ou doenças malignas hematológicas se □u quimioterapêuticos puder ser Presentemente estes métodos pequenos números de células, um procedimento.

aspirar medula e métodos para são mo levar ao seguinte técnica métodos para pios de dispositivos dador podem ser encontrados na Patente e 4 486 188.

a limpeza por meios físicos realizada antes da cultura, muito eficazes quando se usam facto que pode bem por si mesda

ExemSão bem conhecidos óssea de um dador, aspirar medula óssea de um dos E.U. n3. 4 481 946

A medula óssea removida do dador é em seguida replicada ou conservada para replicação numa altura posterior . Se a me67 564

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-Ίdula óssea é para ser conservada, a medula óssea pode ser congelada gradualmente usando equipamento criotecnológico computa dorizado. Uma suspensão de medula óssea/sangue em alíquotas é colocada, em volumes iguais, em tubos Nunc este^eis e posta num copo com gela esmagado até a câmara de crioconservação ser levada a uma temperatura similar (45C). Imediatamente antes da inserção da amostra na câmara, adiciona-se uma solução a cada tubo Nunc, usando uma técnica estéril, de modo que os crioprotectores, o dimetilsulfóxido e o glicerol, estejam presentes em concentraçães finais de 7% e 5%, respectivamente. 0 progra ma de congelação é iniciado imediatamente após a introdução da amostra. Utiliza-se o programa de congelação número 1 controlja dor CryoMed modelo número 101D.

Usando esta técnica a viabilidade celular apús congelameri to e rápido descongelamento num banho de água a 8090 ultrapassa os 90%, pelo método da exclusão com azul tripano. Além disto mais de 80% da cultura da unidade formadora de colónia, original (CFU-C) pode ser recuperada após congelamento. Exemplos de sistemas para congelamento de medula óssea e de substâncias biológicas, de acordo com uma curva de tempo e de temperatura pré-calculadas estão divulgados nas patentes dos E.U. n9.

107 937 e 4 117 881. De preferência as células de medula ós. sea são armazenadas na fase líquida do azoto líquido, a uma temperatura de -1969C, à qual toda a actividade metabólica celular cessa,

Após descongelamento as células de medula óssea são re-infundidas num indivíduo ou são replicadas e em seguida re-infundidas.

processo do presente invento tem várias vantagens para um paciente em necessidade de um transplante de medula óssea. Se o paciente recebe as suas próprias células, chamanos ao transplante um transplante autólogo. Tal transplante tem poucas probabilidades de rejeição. Os transplantes autólogos eli minam a causa principal de rejeição de transplantes de medula óssea, isto é, de reacção enxerto versus hospedeiro. Além dis to, quando crescidas em cultura, as células hematopoiéticas p_o

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-8dem ser facilmente separadas por manipulação física e/ou trata mento enzimático. Isto diminui o risco de doença vaso-oclusiva resultante de êmbolos da medula. Adicionalmente o processo do presente invento permite um tratamento mais agressivo das desordens neoplásicas com agentes quimioterapêuticos e radiação. Presentemente, a extensão destes tratamentos é frequente mente limitada pela toxicidade para a medula óssea.

Sistema de replicação da medula óssea in vitro processo do presente invento compreende ainda o passo de replicação de células de medula óssea in vitro, num sistema comparável às condiçães fisiológicas. Além disso as células de medula óssea replicadas neste sistema incluem todas as céljj las presentes na medula óssea normal, assumindo que todos os tipos de células estavam presentes no inóculo de medula óssea original.

As células de medula óssea, quer obtidas directamente do dador quer recuperadas do armazenamento crioconservador, são primeiro separadas do seu retículo por meios físicos. As célu. las de medula óssea crescem então em co-culturas com componentes do estroma da medula, normal, que incluem fibroblastos, ma crófagos, células reticulares e adipócitos, num suporte tridimensional. Podem adicionar-se também à cultura factores prove. nientes do meio de cultura de macrófagos esplénicos e/ou hepáticos (fígado), ou de sub-CDnjuntos de células do estroma.

Embora as células de medula óssea sejam passíveis de crescimento limitado quando cultivadas sozinhas o crescimento, a longo prazo, destas culturas é possível apenas se estiverem presentes as células do estroma ou os seus produtos secretários. Ver Long-Term Bone Marrou/ Culture, D.G. Wright & 3.S. Gre enberger, eds., A.R. Liss, Neuj York, (1984).

presente invento procura maximizar a proliferação de hemocitoblastos hematopoiéticos polipotenciais que têm a capacidade de repopular a medula óssea quando a medula óssea foi destruída por doença intrínseca ou mediada, pelo meio ou por tratamento de tal doença por quimioterapia e/ou radiação. Os

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-9hemocitoblastos, que tem actividade repopuladora da medula óssea (MRA) mostraram persistir e replicar em culturas de medula óssea a longo prazo. No entanto os hemocitoblastos, as células progenitoras hematopoiéticas e células precursoras hematopoiéticas, replicaram e proliferaram todas, no sistema do presente invento. Além disto, a diferenciação pode ocorrer neste sistema de um modo fisiológico. Por exemplo as colónias eritroide, mieloide, linfoide, manofágica e megacariocíticas podem desenvolver-se continuamente no mesmo sistema de cultura usando os sistemas como concebidos no presente invento.

De acordo com uma concretização preferida, o crescimento dos hemocitoblastos hematopoiéticos é realizado do seguinte mo do:

1, Estabelecimento da camada de suporte de estrpma

Centrifugam-se, a 3000 χ g, suspensões de medula, durante 20 minutos e a base branca das células, contendo macrófagos, fibroblastos, adipócitos, células sanguíneas mononucleares, cé lulas reticulares, células endoteliais e outras células residentes, é removida. As células são suspensas num meio chamado meio número 1640 do Rostuell Park Memorial Institute óu simples, mente RPMI 1640. 0 RPMI 1640 é comprado à GIBCO Incorporated de Grand Island, Neui York, USA. 0 RPMI 1640 é suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 10% de soro de cavalo, he misuccinato de hidrocortisona e antibióticos apropriados.

10^ destas células são colocadas numa rede de nilão este rilizada da Tetko Corp., de Neu» York, Netu York, EUA, numa placa de Petri. Esta rede foi pré-cortada para corresponder às dimensões interiores de um frasco de cultura, em plástico, de 25 mm . A rede tem uma área de crivagem de 400^_/Um e um diâme tro de fibra de lOOy^m.

A rede inoculada é em seguida enrolada e colocada dentro do frasco de cultura contendo 5 ml do meio anteriormente descrito. A rede desenrola-se dentro do tubo de cultura e cobre completamente o fundo do tubo. As culturas crescem a 375C em ar ambiente com CC^ a 5% e a uma humidade relativa de mais de

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-1090%. As células do estroma, que são predominantemente fibroblastos, crescem primeiro ao longo das fibras de nilão e rode_i am-nas completamente, antes do início do crescimento nos espaços da rede. Este processo demora 14 a 18 dias, aproximadameji te. 0 grau de sub-confluência das células de estroma deve estar de acordo com o que se pode ver na figura, antes da inoculação das células hematopoiéticas.

As células do estroma podem ser crioconservadas pela mesma técnica que a descrita anteriormente para as células de medula óssea. Para crioconservação das células sub-confluentes na re de, a rede de nilão deve ser enrolada e inserida no tubo Nunc contendo meio RPMI 1640 com os crioprotectores dimetilsulfóxido e glicerol a concentrações finais de 5% e 15%, respectivamente. 0 congelamento das células do estroma na rede pode ser feito com taxas de arrefecimento inicial de -isc/minuto, desde +1QC até -4020. Uma taxa de arrefecimento de -2 a -32C/minuto, que é óptima, é utilizada até se atingir a temperatura final de -8420. Aproximadamente 20-25% das células do estroma separar-se-ão da rede de nilão.

2. Inoculação com células hematopoiéticas

Suspendem-se células de medula óssea num meio de Fischer modificado ou de McCoy 5A suplementado com 5-10% de soro fetal de bovino e 5-10% de soro de cavalo, vitaminas, hidrocortisona, glutamina e antibióticos. Estas células podem ser frescas ou derivadas de uma amostra anteriormente crioconservada, que foi rapidamente descongelada num banho de água quente, a 8090. 2 a 5 x 10^ células são inoculadas em reticulados de células do estroma sub-confluentes, em frascos de cultura, em plástico, com 25 mm e crescem a 33 - 3420 em ar ambiente com 5% de C0₂· A humidade relativa destas culturas tem de ser superior a 90%. Três dias depois a temperatura da cultura é aumentada para 35- 3720.

As células hematopoiéticas crescem nas bolsas naturais formadas pelas células do estroma sub-confluentes, permanecendo as células progenitoras na camada de células aderente. As

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células aderentes são aquelas células fixadas directamente à rede ou aquelas ligadas indirectamente por fixação a células que estão directamente fixadas à rede. Após 4 a 5 dias aparecem na camada não-aderente granulócitos, células mononucleares e eritrócitos, maduros, como observado através de preparação com citospin (cytospin). 7 a 10 dias depois podem-se observar numerosas colónias hematopoie^icas nos interstícios da rede, as quais são morfologicamente consistentes com CFU-C, colónias mistas e colónias linfoides. 0 crescimento megacariocitico é limitado mas pode também ser observado nesta matriz. Uma cultura média produzirá 450 a 950 CFU-C por semana.

As culturas constituídas por células do estroma e células hematopoíeticas derivadas do mesmo indivíduo (autólogas) têm de ser alimentadas duas vezes por semana. As culturas constituídas por medula óssea de um paciente que foi inoculada no reticulado de células do estroma derivadas de outro indivíduo(s) (alogénicas) devem ser alimentadas três vezes por semana para assegurar despopulação adequada de células imunocompetentes ma duras da camada não aderente.

3. Variações no sistema de replicação da medula óssea in vitro

Promoção do crescimento de células de medula óssea factor limitador da taxa primária do crescimento de cé lulas de medula óssea é o índice mitótico relativamente baixo dos fibroblastos, incluídos entre as células de estroma de me dula óssea. 0 crescimento destas células e a sua deposição em componentes da matriz extracelular pode ser promovida adicionando: 1. hemisuccinato de hidrocortisona e/ou 2. factores de crescimento auto-reguláveis, derivados do meio de fibrq blastos fetais humanos, cultivados, que têm uma elevada taxa de divisão celular.

A fixação e crescimento de fibroblastos sobre a rede podem também ser promovidos por: 1. pré-revestimento da rede com colagénio tipo I-IV solubilizado ou 2. uso de uma rede que é revestida ou embebida com colagénio ‘segregado por fibroblastos fetais humanos ou por fibroblastos de adulto (em segui

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-12da referidos como fibroblastos promotores do crescimento) que tenham sido separados pela sua capacidade para sintetizar certos tipos de colagénio. Com este fim, os fribroblastos promotores do crescimento são destacados da rede por tripsinização suave, após se ter atingido a confluência (5 a 7 dias para os fibroblastos fetais humanos e 14 a 18 dias para os fibroblastos de adulto, respectivamente, e podem ser também 1. inoculados com células do estroma de medula óssea como previamente descrito ou 2, crioconservados para uso futuro.

Numa concretização do invento, os fibroblastos promotores do crescimento, que sintetizam colagénio e outros componeri tes da matriz extracelular, crescem sobre a rede até terem atin gido a subconfluência. Uma mistura de células de medula óssea hematopoiéticas e do estroma são em seguida inoculadas no reti culado de fibroblastos promotores do crescimento, sub-conflue£ tes.

Os métodos de crescimento, separação e crioconservação dos fibroblastos promotores do crescimento são os seguintes:

a. Cultura dos fibroblastos promotores do crescimento

Os fibroblastos crescem em RPMI 1640 suplementado com

2-10% de soro fetal de bovino ou 2-10% de soro de cavalo ao qual se adicionaram 1 y*g/ml de hemisuccinato de hidrocortisona e 2 yUg/ml de gentamicina, penicilina, estreptomicina e fungiz£ na. As culturas crescem em ar ambiente com 5% de ^a 3790, com uma humidade relativa superior a 90%.

b. Separação dos fibroblastos promotores do crescimento Colocam-se 5,0 x 10^ fibroblastos derivados do revestimento leucocítico de uma suspensão de medula óssea, fibroblastos dérmicos ou fibroblastos derivados de fígados de cadáveres, em depósitos de microtitulação (1 mm ) e deixam-se crescer até confluência. Estas células são retiradas dos depósitos de cul tura por lavagens repetidas, habitualmente quatro ou cinco vezes com solução salina equilibrada de Hank, sem Ca⁺⁺ ou Mg⁺⁺. A matriz que fica nas placas de microtitulação é examinada por imunofluorescência indirecta utilizando anticorpos monoclonais

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-13para os vários componentes da matriz e imunoglobulina G anti-rato de coelho, marcada com isotiocianato de fluoresceína, para confirmar os tipos de colagénio presentes. As células suspensas são tratadas com anticorpos monoclonais dirigidos contra os tipos I—IV do colagénio, elastina, tropoelastina e fibronectina para isolar sub-populações de células capazes de sintetizar cada produto. As células são tratadas com complemento de cobaia que danificará ou destruirá as células às quais os anticorpos monoclonais estão fixados. As células viáveis são re-colocadas em depósitos de microtitulação, como previamente descrito, são crescidas até confluência e retiradas. A eficácia da técnica de isolamento é em seguida verificada por exame da matriz segregada pelas células com anticorpos monoclonais e imunofluDrescência indirecta.

Para um crescimento óptimo das células hematopoiéticas, a matriz deverá conter colagénio dos tipos III, IV e I numa ra zão aproximada de 6:3:1.

c. Crioconservação de fibroblastos promotores de crescimento

Os fibroblastos promotores do crescimento podem ser crio conservados utilizando as mesmas técnicas que as previamente descritas para as células do estroma. Tal como as células do estroma, alguns dos fibroblastos promotores do crescimento tam bém se separarão da rede durante o congelamento. Esta matriz, no entanto, contribuirá ainda para a fixação das células de me dula óssea e em consequência diminuirá o tempo necessário para o estabelecimento de uma matriz conducente ao crescimento de células hematopoiéticas.

Inoculação com células mononucleares

Para promover o crescimento a longo prazo de culturas de medula óssea, preparam-se células mononucleares do sangue per_i férico a partir de uma suspensão heparinizada usando Ficoll-hy paque ou Percoll. As células de sangue periférico e células hematopoiéticas de medula óssea são derivadas de um mesmo indi. víduo (autólogas). Estas devem ser removidas por meio de veno punctura e crioconservadas na altura em/â^U^mostra de medula

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-14óssea é tirada. Células de sangue periférico adicionais podem ser pesquisadas no paciente doente se necessárias durante o procedimento de cultura. No entanto se se suspeita de doença metastática, a amostra tem que ser primeiro submetida a lim-

nucleares (a subpopulação de monficitos é o tipo de células pre ferido na camada de células mononucleares, para este passo) são inoculadas nos reticulados 4 a 5 dias após a inoculação inicial com células hematopoiéticas de medula óssea e todas as terceiras semanas seguintes. Este procedimento promove a hema topoiése em 10% a 13%, como observado, numa base semanal.

Perpetuação da cultura e formação de bancos de células progenitoras

Na nossa experiência as culturas de células de estroma, confluentes, não assegurarão a hematopoiése ou no melhor dos casos fá-lo-ão em pequeno grau. 0 crescimento indefinido dos progenitores hematopoiéticos humanos é possível se eles forem providos com os necessários factores de crescimento derivados do estroma/factores reguladores.

Por exemplo, a amostra de medula inicial é dividida em várias alíquotas contendo aproximadamente 10⁸ células hemato poiéticas. Cada uma delas é inoculada num reticulado de células do estroma, sub-confluentes. As culturas são controladas por observação directa com um microscópio de fase inversa e por contagens diferenciais das células não aderentes como obser. vado na preparação de citospin após cada alimentação. Antes de atingir a confluência as culturas são tratadas com colagená se e submetidas a ultrasonicação suave durante, aproximadamente, 6-10 minutos. As células hematopoiéticas e as células do estroma são separadas por métodos de gradientes de densidade. As células hematopoiéticas são contadas usando um hemacitómetro e aproximadamente 50% são crioconservadas usando os métodos descritos anteriormente. 0s outros 50% de células hematopoiéticas são divididos em alíquotas consistindo em aproximada mente 10⁸ células e são inoculadas em culturas de células de estroma sub-confluentes que tinham sido arrastadas e crescidas

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-15Bm paralelo. Quando estas começam a atingir a confluência , realiza-se o mesmo procedimento.

Esta técnica: 1. perpetua o crescimento de células hema topoiéticas ao proporcionar um micro-ambiente que produz os factores de crescimento necessários e 2. forma um banco contí nuo em que os progenitores hematopoiéticos podem ser depositados até que se consigam os números adequados para enxerto.

Modulação do crescimento de células hematopoiéticas com produtos celulares

Presentemente, existe tecnologia para sub-cultivar os vã rios componentes celulares de medula óssea humana, como culturas separadas. Macrofagos, células reticulares, adipocitos e fibroblastos podem crescer separadamente e a sua actividade secretória ser modificada por tratamento com vários agentes. A modulação da actividade dos fibroblastos já foi anteriormente descrita.

A hematopoiese em culturas de medula humana a longo prazo, sobre o reticulado tridimensional pode também ser modulada pelas secreçães de macrofagos extramedulares (células de Kupffer) quando crescidos em cultura, do seguinte modo. As células de Kupffer são separadas do seu estroma depois de digestão com pronase. Resumidamente, incubam-se amostras de tecido durante 1 hora em solução de pronase (pronase a 2% (Calbiochem) e solução salina equilibrada de Geys (BSS)) agitando suavemente. 0 pH da solução é mantido entre 7,3 a 7,5 com NaOH 1N. Adicio na-se desoxiribonuclease (0,5 mg) (Calbiochem) a intervalos de 30 minutos, durante o procedimento anterior e a suspensão celu lar resultante é filtrada e centrifugada a 350 χ g durante 10 minutos. A pelota é ressuspensa em BSS de Geys e as células da periferia (macro'fagos e células endoteliais) são separadas dos detritos celulares e das células sanguíneas maduras usando um gradiente de Percoll (Pharmacia). A fracção celular resultante é lavada 3x3 minutos com meio de Dulbecco modificado, enriquecido com 10% de soro fetal de bovino e colocado em placas de cultura de plástico, num volume que contenha 3 a 4 x 10^ células.

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-16Apás incubação durante 1 dia as células não aderentes são removidas, por lavagem, com o meio de cultura e as células aderentes são mantidas a 339C numa mistura gasosa consistindo em ar ambiente com 6% de C0_2> a mais de 80% de humidade relativa. 0 crescimento e/ou actividade secretéria destas células podem ser estimulados por: 1. variação da razão C0₂ í 0₂,

2. tratamento das culturas com esferas de látex, 3. tratamento das culturas com sílica, 4. adição de prostaglandina E₂, E^ ou ^{a0 me}·*·⁰» suplementando o meio com interleucina ou interleucina 2. Os produtos secretários dos macro^agos podem ser modulados por estes procedimentos/agentes, meio condicionado com os produtos secretários destes macrófagos pode ser usado para suplementar a proporção eritropoiética/granulopoiética da cultura de medula ássea a longo pra zo, de uma maneira muito semelhante à que ocorre in vivo.

processo do presente invento tem várias vantagens para um paciente em necessidade de um transplante de medula ássea.

Utilização do sistema de replicação de medula ássea in vitro para controlar a situação de um paciente

Num paciente com cancro ou com outras doenças, é muitas vezes eficaz controlar a situação do paciente, aspirando uma porção de medula ássea do paciente e examinando a amostra. Deste modo pode detectar-se uma metástase ou recaída antes dela ser clinicamente evidente. Pacientes com outras situações que são detectáveis por exame de células de medula ássea, podem também ser controlados desta maneira. 0 crescimento a lo£ go prazo de células numa amostra de medula ássea aspirada usajn do o sistema de replicação de medula ássea do presente invento, aumenta a probabilidade da detecção de células metastáticas cio nais e de células hematopoiéticas com anormalidades cromossámi. cas. Estas células podem escapar à detecção num esfregaço cori vencional de medula ássea aspirada recentemente (não cultivado).

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-17Utilização do sistema de replicação de medula óssea _in vitro num sistema de citotoxicidade

A citotoxicidade para a medula óssea de medicamentos, agentes anti-neoplasicos, carcinogéneos, aditivos alimentares e outras substâncias, é testada por utilização do sistema de replicação de medula óssea in vitro do presente invento.

Em primeiro lugar estabelecem-se culturas de crescimento, estáveis, de células de medula óssea (incluindo células do estroma e hematopoiéticos). Em seguida as culturas são expostas a concentrações variadas do agente a testar. Após incubação com os agentes a testar a cultura é examinada por microsco pia de fase para determinar a dose mais elevada tolerada (HTD) - a concentração de agents a testar à qual as primeiras anorma lidades morfológicas aparecem. 0 teste da citotoxicidade pode ser realizado usando uma variedade de corantes supravitais para avaliar a viabilidade celular neste sistema tridimensional usando técnicas bem conhecidas pelos peritos da técnica. A d.e terminação da HTD proporciona uma gama de concentrações para testes posteriores.

Uma vez estabelecida uma gama de teste, concentrações va riáveis do agente de teste podem ser examinadas em relação ao seu efeito sobre viabilidade, crescimento θ/dlí morfologia dos diferentes tipos de células constituindo a cultura de medula óssea, por meios bem conhecidos dos peritos da técnica. Podem -se adoptar para uso no teste da citotoxicidade outros sistemas de cultura de células tridimensionais como divulgado no presente invento.

Estabelecimento de um sistema de cultura de células tridimensional presente invento divulga um suporte tridimensional e o seu uso como estrutura para um sistema de cultura de células em várias camadas, tridimensional. Nos sistemas de cultura de tecidos anteriormente conhecidos, as células cresciam numa monocamada. As células crescem num suporte tridimensional de acordo com o presente invento em camadas múltiplas formando

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-18uma matriz celular. Este sistema de cultura de células tridimensional aproxima-se das condições fisiológicas encontradas in vivo num grau superior ao dos sistemas de cultura de tecidos em monocamada previamente descritos. Numa concretização deste invento, o sistema de cultura de células pode ser trans ferido sobre, ou para dentro de, um organismo vivo.

suporte tridimensional pode ser de qualquer material que: 1. permita que as células se fixem a ele (ou que possa ser modificado para permitir que as células se fixem a ele) e,

2. permita que as células cresçam em mais de uma camada. 0 sjj porte tridimensional é uma rede, numa concretização preferida do presente invento.

Contempla-se que o sistema de cultura de células tridimensional é aplicável à medula óssea, pele, fígado e a muitos outros tipos de células e tecidos. Por exemplo, um sistema de cultura tridimensional de células da pele é produzido do seguinte modo:

1. Deixa-se que os fibroblastos se fixem a uma rede e crescam durante 7-9 dias, depositando colagénio dos tipos I e III, como descrito anteriormente -em relação ao fibroblasto promotor de crescimento usado nos sistemas de replicação de medula óssea in vitro;

2. Colocam-se melano'citos sobre a rede tratada e deixam -se crescer durante cinco dias;

3. Inoculam-se queratinócitos nos melanócitos subconflu entes.

Embora o invento esteja descrito em detalhe com referência às suas concretizações específicas, compreender-se-á que se podem fazer variações sem afastamento do escopo do invento como descrito anteriormente e como reivindicado a seguir.

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Claims

1 - Processo de preparação de um tecido do estroma, vivo, in vitro. caracterizado por compreender ligar e envolver substancialmente com células do estroma e com proteínas do tecido conjuntivo naturalmente segregadas pelas células do estroma uma estrutura composta por um material não vivo, biocompatível, constituído numa estrutura tridimensional possuindo espaços intersticiais unidos em ponte pelas células do estroma.

2 - Processo de preparação de um tecido do estroma, vivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as células do estroma serem fibroblastos.

3 - Processo de preparação de um tecido do estroma, vivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as células do estroma serem uma combinação de fibroblastos e células endoteliais, pericitos, macrófagos, monócitos, mastócitos e adipócitos.

4 - Processo de preparação de um tecido do estroma, vivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a estrutura ser composta por um material biodegradável.

5 - Processo de preparação de um tecido do estroma, vivo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o material biodegradável compreender algodão, poli(ácido glicólico), suturas de catgut, celulose, gelatina ou dextrana.

6 - Processo de preparação de um tecido do estroma, vivo, de acordo com a reivindicação 1,. caracterizado por a estrutura ser composta de material não biodegradável.

7 - Processo de preparação de um tecido do estroma, vivo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o material não biodegradável ser uma poliamida, um poliéster, um poliestireno, um polipropileno, um poliacrilato, um polivinilo, um policarbonato, um politetrafluoroetileno ou um composto de nitrocelulose.

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8 - Processo de preparação de um tecido do estroma, vivo, de acordo com a reivindicação 4, 5, 6 ou 7, caracterizado por a estrutura ser pré-revestida com colagéneo.

9 - Processo de preparação de um tecido do estroma, vivo, de acordo com a reivindicação 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado por a estrutura ser uma rede.

10 - Processo de preparação de um tecido do estroma, vivo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a estrutura ser uma rede.

11 - Processo de cultura de células in vitro caracterizado por compreender:

(a) a inoculação de células parenquimatosas num tecido do estroma, vivo, preparado in vitro, compreendendo células do estroma e proteínas do tecido conjuntivo naturalmente segregadas pelas células do estroma ligadas e envolvendo substancialmente uma estrutura composta por um material não vivo, biocompatível, constituído numa estrutura tridimensional possuindo espaços intersticiais unidos em ponte pelas células do estroma; e (b) a incubação do tecido do estroma, vivo, inoculado, num meio nutriente de modo que as células inoculadas proliferem em cultura.

12 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por as células do estroma serem fibroblastos.

13 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por as células do estroma serem uma combinação de fibroblastos e células endoteliais, pericitos, macrófagos, monócitos, mastócitos e adipócitos.

14 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a estrutura ser composta por um material biodegradável.

15 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracteri67 564

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16 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a estrutura ser composta de material não biodegradável.

17 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o material não biodegradável ser uma poliamida, um poliéster, um poliestireno, um polipropileno, um poliacrilato, um polivinilo, um policarbonato, um politetrafluoroetileno ou um composto de nitrocelulose.

18 - Processo de acordo com a reivindicação 14, 15, 16 ou 17, caracterizado por a estrutura ser pré-revestida com colagéneo.

19 - Processo de acordo com a reivindicação 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17, caracterizado por a estrutura ser uma rede.

20 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a estrutura ser uma rede.

21 - Processo de cultura de células da medula óssea in vitro caracterizado por compreender:

(a) a inoculação de células hematopoiéticas num tecido do estroma, vivo, preparado in vitro, compreendendo células do estroma e proteínas do tecido conjuntivo naturalmente segregadas pelas células do estroma ligadas e envolvendo substancialmente uma estrutura composta por um material não vivo, biocompatível, constituído numa estrutura tridimensional possuindo espaços intersticiais unidos em ponte pelas células do estroma; e (b) a incubação do tecido do estroma, vivo, inoculado, num meio nutriente de modo que as células inoculadas proliferem em cultura.

22 - Processo de cultura de células da pele in vitro caracterizado por compreender:

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-22— (a) a inoculação de melanócitos e queratinócitos num tecido do estroma, vivo, preparado in vitro, compreendendo células do estroma e proteínas do tecido conjuntivo naturalmente segregadas pelas células do estroma ligadas e envolvendo substancialmente uma estrutura composta por um material não vivo, biocompatível, constituído numa estrutura tridimensional possuindo espaços intersticiais unidos em ponte pelas células do estroma; e (b) a incubação do tecido do estroma, vivo, inoculado, num meio nutriente de modo que as células inoculadas proliferem em cultura.

23 - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o tecido do estroma, vivo, compreender células do estroma confluentes.

24 - Processo de cultura de células do fígado in vitro caracterizado por compreender:

(a) a inoculação de hepatócitos num tecido do estroma, vivo, preparado in vitro, compreendendo células do estroma e proteínas do tecido conjuntivo naturalmente segregadas pelas células do estroma ligadas e envolvendo substancialmente uma estrutura composta por um material não vivo, biocompatível, constituído numa estrutura tridimensional possuindo espaços intersticiais unidos em ponte pelas células do estroma; e (b) a incubação do tecido do estroma, vivo, inoculado, num meio nutriente de modo que as células inoculadas proliferem em cultura.

25 - Processo de teste do efeito citológico de uma substância de teste caracterizado por compreender:

(a) a exposição de uma cultura de células tridimensional, colocada num recipiente, a uma substância de teste, na qual a cultura de células tridimensional compreende células parenquimatosas cultivadas num tecido do estroma, vivo, preparado in vitro, o qual compreende células do estroma e proteínas do tecido conjuntivo

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6261-006-118 naturalmente segregadas pelas células do estroma ligadas e envolvendo substancialmente uma estrutura composta por um material não vivo, biocompatível, constituído numa estrutura tridimensional possuindo espaços intersticiais unidos em ponte pelas células do estroma; e (b) a determinação do efeito da substância de teste, pela medição de uma alteração na cultura de células tridimensional.

26 - Processo de acordo com a reivindicação 25, para testar a citotoxicidade de uma substância de teste, caracterizado por o efeito da substância de teste ser determinado medindo o número de células danificadas ou mortas na cultura de células tridimensional, na qual o número de células danificadas ou mortas está correlacionado com a citotoxicidade da substância de teste.

27 - Processo de acordo com a reivindicação 25, para testar a actividade de crescimento/regulação de uma substância de teste, caracterizado por o efeito da substância de teste ser determinado analisando o conteúdo celular de uma cultura de células tridimensional, na qual um aumento no número de células ou no tipo de células está correlacionado com a actividade de crescimento/regulação da substância de teste.

28 - Processo de acordo com a reivindicação 25, para testar a actividade metabólica de uma substância de teste, caracterizado por o efeito da substância de teste ser determinado medindo um metabolito produzido pela cultura de células tridimensional, na qual um aumento ou diminuição na quantidade de metabolito produzido está correlacionado com a actividade da substância de teste.

29 - Processo de acordo com a reivindicação 25, para testar o efeito alergénico de uma substância de teste, caracterizado por as culturas de células tridimensionais conterem mastócitos, e o efeito da substância de teste ser determinado medindo a libertação de um mediador vasoactivo pelas mastócitos, no qual a libertação do mediador vasoactivo está correlacionado com o

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6261-006-118 efeito alergénico da substância de teste.

30 - Processo de teste do efeito citológico de uma substância de teste de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por as células do estroma serem fibroblastos.

31 - Processo de teste do efeito citológico de uma substância de teste de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por as células do estroma serem uma combinação de fibroblastos e células endoteliais, pericitos, macrófagos, monócitos, leucócitos, células plasmáticas, mastócitos ou adipócitos.

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32 - Processo de teste do efeito citológico de uma substância de teste de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a estrutura ser composta por um material biodegradável.

33 - Processo de teste do efeito citológico de uma substância de teste de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o material biodegradável ser algodão, poli(ácido glicólico), suturas de catgut, celulose, gelatina ou dextrana.

34 - Processo de teste do efeito citológico de uma substância de teste de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a estrutura ser composta de materiais não biodegradáveis.

35 - Processo de teste do efeito citológico de uma substância de teste de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por o material não biodegradável ser uma poliamida, um poliéster, um poliestireno, um polipropileno, um poliacrilato, um polivinilo, um policarbonato, um politetrafluoroetileno ou um composto de nitrocelulose.

36 - Processo de teste do efeito citológico de uma substância de teste de acordo com a reivindicação 32, 33, 34 ou 35, caracterizado por a estrutura ser pré-revestida com colagéneo.

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37 - Processo de teste do efeito citológico de uma substância de teste de acordo com a reivindicação 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35, caracterizado por a estrutura ser uma rede.

38 - Processo de teste do efeito citológico de uma substância de teste de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por a estrutura ser uma rede.

39 - Processo de teste do efeito citológico de uma substância de teste de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por as células parenquimatosas serem células hematopoiéticas.

40 - Processo de teste do efeito citológico de uma substância de teste de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por as células parenquimatosas serem melanócitos e queratinócitos.

41 - Processo de teste do efeito citológico de uma substância de teste de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por as células parenquimatosas serem hepatócitos.

42 - Processo de teste do efeito de uma droga, caracterizado por compreender:

(a) a exposição de uma cultura de células tridimensional à droga, na qual a cultura de células tridimensional compreende células parenquimatosas cultivadas num tecido do estroma, vivo, preparado in vitro, o qual compreende células do estroma e proteínas do tecido conjuntivo naturalmente segregadas pelas células do estroma ligadas e envolvendo substancialmente uma estrutura composta por um material não vivo, biocompatível, constituído numa estrutura tridimensional possuindo espaços intersticiais unidos em ponte pelas células do estroma; e (b) a determinação do efeito da droga sobre as células em cultura.

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45 - Processo de teste do efeito citológico de uma substância de teste de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por o recipiente ser um recipiente com múltiplos poços.

46 - Processo de teste do efeito de uma droga, caracterizado por compreender:

47 - Processo de teste do efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por as células do estroma serem fibroblastos.

48 - Processo de teste do efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por as células do estroma serem uma combinação de fibroblastos e células endoteliais, pericitos, macrófagos, monócitos, leucócitos, células plasmáticas, mastócitos ou adipócitos.

49 - Processo de teste do efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por a estrutura ser composta por um material biodegradável.

50 - Processo de teste do efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 49, caracterizado por o material biodegradável ser algodão, poli(ácido glicólico), suturas de catgut, celulose, gelatina ou dextrana.

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51 - Processo de teste do efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por a estrutura ser composta de materiais não biodegradáveis.

52 - Processo de teste do efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por o material não biodegradável ser uma poliamida, um poliéster, um poliestireno, um polipropileno, um poliacrilato, um polivinilo, um policarbonato, um politetrafluoroetileno ou um composto de nitrocelulose.

53 - Processo de teste do efeito de uma droga de acordo com P a reivindicação 49, 50, 51 ou 52, caracterizado por a estrutura ser pré-revestida com colagéneo.

54 - Processo de acordo com a reivindicação 46, 47, 48, 49, 50, 51 ou 52, caracterizado por a estrutura ser uma rede.

55 - Processo de acordo com a reivindicação 53, caracterizado por a estrutura ser uma rede.

56 - Processo de teste do efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por as células parenquimatosas serem células hematopoiéticas.

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57 - Processo de teste do efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por as células parenquimatosas serem melanócitos e queratinócitos.

58 - Processo de teste do efeito de uma droga de acordo com a reivindicação 46, caracterizado por as células parenquimatosas serem hepatócitos.

59 - Processo para diagnosticar ou controlar uma doença maligna num paciente caracterizado por compreender:

(a) a obtenção de uma amostra de células do paciente;

(b) a inoculação de células da amostra num tecido do estroma, vivo, preparado in vitro. compreendendo células

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6261-006-118 do estroma e proteínas do tecido conjuntivo naturalmente segregadas pelas células do estroma ligadas e envolvendo substancialmente uma estrutura composta por um material não vivo, biocompatível, constituído numa estrutura tridimensional possuindo espaços intersticiais unidos em ponte pelas células do estroma;

(c) a incubação do tecido do estroma, vivo, inoculado, num mmeio nutriente de modo que as células inoculadas proliSrem em cultura; e (d) a determinação da presença de células malignas nas células proliferadas em cultura.

60 - Processo para diagnosticar ou controlar uma doença maligna de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por as células do estroma serem fibroblastos. 61 - Processo para diagnosticar ou controlar uma doença maligna de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por as células do estroma serem uma combinação de fibroblastos e células

endoteliais, pericitos, macrófagos, monócitos, leucócitos, células plasmáticas, mastócitos ou adipócitos.

62 - Processo para diagnosticar ou controlar uma doença maligna de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por a estrutura ser composta por um material biodegradável.

63 - Processo para diagnosticar ou controlar uma doença maligna de acordo com a reivindicação 62, caracterizado por o material biodegradável ser algodão, poli(ácido glicólico), suturas de catgut, celulose, gelatina ou dextrana.

64 - Processo para diagnosticar ou controlar uma doença maligna de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por a estrutura ser composta de materiais não biodegradáveis.

65 - Processo para diagnosticar ou controlar uma doença maligna de acordo com a reivindicação 64, caracterizado por o material não biodegradável ser uma poliamida, um poliéster, um

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6261-006-118 poliestireno, um polipropileno, um poliacrilato, um polivinilo, um policarbonato, um politetrafluoroetileno ou um composto de nitrocelulose.

66 - Processo para diagnosticar ou controlar uma doença maligna de acordo com a reivindicação 62, 63, 64 ou 65, caracterizado por a estrutura ser pré-revestida com colagéneo.

67 - Processo de acordo com a reivindicação 59, 60, 61, 62, 63, 64 ou 65, caracterizado por a estrutura ser uma rede.

68 - Processo de acordo com a reivindicação 66, caracterizado por a estrutura ser uma rede.

69 - Processo para diagnosticar ou controlar uma doença maligna de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por as células parenquimatosas serem células hematopoiéticas.

70 - Processo para diagnosticar ou controlar uma doença maligna de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por as células parenquimatosas serem melanócitos e queratinócitos.

71 - Processo para diagnosticar ou controlar uma doença maligna de acordo com a reivindicação 59, caracterizado por as células parenquimatosas serem hepatócitos.