JP2002535981A - 造血幹細胞および/または前駆細胞を維持および増加するための方法および装置 - Google Patents
造血幹細胞および/または前駆細胞を維持および増加するための方法および装置Info
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Abstract
Description
より詳しくは、本発明は、造血幹細胞を維持および/または増加、および/また
は、造血幹細胞を維持および/または増加させるための馴化培地(condit
ioned medium)を作製するための3次元の間質細胞栓流バイオリア
クター(plug flow bioreactor)に関する。
旺盛な増殖能力、分化能力および自己複製能力をもつ多能性幹細胞までにわたる
、不均一な細胞集団からなる(1〜3)。造血幹細胞(HSC)は、移植後の造
血系再構成に専ら必要とされ、また、遺伝子治療の一次的な標的となる。幹細胞
は、造血系維持に決定的な役割を果たしているにも拘わらず、造血組織における
出現頻度が非常に低く、また、未分化の幹細胞を生体外で長時間にわたって維持
または増加させにくいことは、肝心の臨床応用にこれらの細胞を用いる上での相
変わらずの大きな欠点であるだけでなく、新規の幹細胞制御因子が現在まで利用
できず、またそれらを必要としていることを反映している。
細胞間連絡または短距離の相互作用によって集団的にそれらの分化と自己複製を
もたらす分子シグナルを提供することと密接に関連していると広く認められてい
る(7)。これらのニッチは、「造血誘導微小環境」(HIM)の一部であり、
例えば、マクロファージ、線維芽細胞、脂肪細胞、および上皮細胞(8)などの
骨髄間質細胞からなる。骨髄間質細胞は、細胞−細胞間連絡を促す細胞外マトリ
ックス(ECM)タンパク質および基底膜成分を提供することによってHIMの
機能的な完全性を維持する(9〜11)。制御された造血細胞分化と増殖に必要
なさまざまな可溶性または常在性のサイトカインも提供する(12〜14)。
ステムを開発するための努力が、主に、予め樹立された初代骨髄間質細胞の単層
を使用することに集中したのは驚きではない。これらには、非照射ヒト初代骨髄
間質細胞(Dexter培養細胞、15)または照射後初代骨髄間質細胞(16
〜19)の長期培養、およびヒトまたはマウスの間質細胞株(16、19〜24
)が含まれ、外部からサイトカインを加えたものや加えなかったものがある。H
SCの出力アッセイ法は、このような幹細胞を長時間(5〜7週間)培養した後
、これらの細胞が骨髄細胞の後代(長時間培養開始細胞(long−term
culture initiating cells);LTC−IC)を産生
するか、敷石状の形態をもつコロニー(敷石状領域形成細胞(cobblest
one area forming cells; CAFC))を形成する能
力に依存する(16、17)。しかし、LTC−ICアッセイ法およびCAFC
アッセイ法が広範に使用されているにもかかわらず、これらのアッセイ法は、本
当に再増殖した造血幹細胞(25、26)よりも非常に原始的な前駆細胞を検出
することが次第に明らかになってきている。
球系、およびCD34+の前駆細胞集団を生じさせる、非肥満−糖尿病(NOD
)/SCIDマウス(27)の骨髄細胞に存在するSCID再増殖細胞(SRC
)を検出する(28〜30)。SRCは、専ら、CD34+38−表面抗原(3
1)を発現する造血細胞画分に見られ、CB(1/3×105細胞)におけるそ
の頻度は、BM(1/9×105細胞)または動員されたPB(1/6×106 細胞)と比較すると高くなっている(32)。つい最近の研究で、SRCは、C
D34+/38−/CXCR4+細胞の亜集団の中に存在することが示された(
33)。ケモカイン間質細胞由来因子1(SDF−1、34)の表面レセプター
であるCXCR4は、明らかに、NOD/SCIDの骨髄におけるヒト造血幹細
胞のホーミングおよび移植に必須である(33)。
ドポイント法として、主に、CAFC、LTC−ICまたはCD34+38−表
現型に基づいていた(16、19〜24)。間質細胞培養においてSRCが維持
/増加されたという稀少な報告も、長期間にわたる有意な支持を示せないでいる
。例えば、同種異系のヒト骨髄間質は、長期間(7日間)のSRC維持を誘導し
、その後急速に(6倍)活性が低下することが分かった(26)。間質細胞層上
の移植可能なヒト幹細胞の長期間にわたる維持/増加を支持できないのは、これ
らの細胞のインビトロ培養に関連するいくつかの要素によるものであろう。それ
らの一つには、骨髄の自然な3次元構造中における生体内増殖条件を反映してい
ない間質細胞単層を使用することが含まれる。このような条件だと、最適で適切
な支持的な微小環境を提供するという間質細胞の能力が失われると同時に、特異
的なニッチに局在して、間質細胞およびその産物と物理的に相互作用するという
幹細胞の能力も失われるであろう。実際、造血前駆細胞の生物活性に対する3次
元(3D)構造の重要性に関する証拠は、ヒト造血細胞株を3Dコラーゲンマト
リックス中の間質細胞上に播くと、この細胞の単層上に播いたときよりも優れた
増殖を示すことから明らかである(35)。より重要なのは、3Dのタンタル被
覆多孔性生物素材が、細胞のみ、または骨髄間質細胞単層上で培養した場合に較
べると、マカク類LTCICまたはCD34+38−細胞の短期間の維持を促進
することが最近分かったことである(36)。しかしながら、間質細胞で被覆さ
れた3D担体の効果は、まだ調べられていない。
ただし、増加はなし)を支持するには、ヒト間質細胞よりもマウスAFT024
細胞株の方が優れている。この細胞株では、膜結合タンパク質(21、38、3
9)をコードする新規のHIM遺伝子がいくつか発現しているのが見られるが、
それらが、幹細胞の生理に必須の役割をもつのかもしれない。これらまたはその
他の遺伝子が、間質細胞の3D骨髄微小環境をより正確に模倣した条件下では、
間質細胞によって発現され、それによって間質細胞が最適な生理学的機能活性を
もつようになるという可能性はまだ結論づけられていない。
は間質馴化培地(SCM)(21、42〜44)は、それだけで、またはサイト
カインとともに、原始的な造血前駆細胞の生体外での維持または増加を支持する
ことができることが分かった。また、SCMが、これらの細胞の回収効率および
形質転換効率を向上させることも分かっている(45、46)。これらの知見は
、再び、可溶性間質細胞因子重要性を強調しているが、それらのアッセイ法にお
けるLTC−IC、CAFC、またはCD34+38−のエンドポイントの使用
は、移植可能なHSCの維持/増加に対するSCMの効果を反映させることがで
きない。さらに、間質細胞の単層培養から得られたSCMが、実際に、ヒトHS
Cの生理現象に関与する間質細胞関連遺伝子産物のすべてを含んでいるか否かは
分かっていない。
イン添加懸濁培養の樹立に集中している(47〜53)。これらの研究は、本プ
ロセスにおける主要関連サイトカイン、例えば、幹細胞因子(SCF)、FLT
3リガンド、および血小板産生因子(TPO)のような早期作用因子の同定に役
立ってきた。それにもかかわらず、さまざまな結果が得られていて、短期間での
消失(48、49)、維持(50〜52)を示しているが、2〜4週間培養した
後にSRCが増加したという稀な例もある(47、53)。これらのサイトカイ
ンと間質細胞の、3D増殖条件下における、SRCの維持/増殖を支える相互作
用能力については、まだ明らかにされていない。
うための方法および装置で、上記の制約をもたず、先行技術に記載された結果と
比較して優れた結果を示すものに対する需要が広く認められており、また、それ
らがあれば非常に有益であろう。
殖と長期間の維持を支持することのできる栓流バイオリアクター装置を開発した
。間質細胞を、ポリエステル製不織繊維マトリックス(54)でできた多孔性有
機担体上に播き、比較的少量で細胞数が多くなるような増殖を可能にした。担体
の構造と充填が、局所的濃度と間質細胞産物(例えば、ECMタンパク質、サイ
トカイン等、55)の遊離だけでなく、酸素と栄養分の移転に主な影響を与える
。さらに、この装置で培養された間質細胞の、直接的な細胞−細胞接触によって
、移植可能なヒト造血幹細胞の維持/増加を促進する能力は、先行技術による方
法よりも遙かに優れていることが測定されている。さらに、本システムで培養さ
れた馴化培地の、そこに含まれている新規の間質細胞関連幹細胞因子によって、
移植可能なヒト造血幹細胞の維持/増加を促進する能力は、先行技術による方法
よりも遙かに優れていることが測定されている。
持する方法において、(a)未分化の造血幹細胞または前駆細胞を得る工程、お
よび、(b)上記未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、生理学的に許容できる
3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状
担体の上に3次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアク
ターの中に播いて、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する工程を
含む方法が提供される。
血幹細胞または前駆細胞を単離する工程を含む。
する方法において、(a)未分化の造血幹細胞または前駆細胞を得る工程、およ
び(b)上記未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、生理学的に許容できる3次
元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体
の上に3次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアクター
の中で培養して、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する工程を含
む方法が提供される。
する上で有用な間質細胞馴化培地を調製する方法において、(a)固定相栓流バ
イオリアクターの中で、生理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成
している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に間質細胞培養を樹立し
て、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する工程、および(b)所
望の間質細胞密度に達したら、該固定相栓流バイオリアクターから培地を回収し
て、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する上で有用な間質細胞馴
化培地を得る工程を含む方法が提供される。
ピエントに移植する方法において、(a)(i)未分化の造血幹細胞または前駆
細胞を得る工程、および(ii)上記未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、生
理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリッ
クスを含むシート状担体の上に3次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定
相栓流バイオリアクターの中に播いて、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増
加/維持する工程によって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持す
る工程、および、(b)工程(a)で得られた未分化の造血幹細胞または前駆細
胞をレシピエントに移植する工程を含む方法が提供される。
の前に未分化の造血幹細胞または前駆細胞を単離する工程を含む。
ピエントに移植する方法において、(a)(i)未分化の造血幹細胞または前駆
細胞を得る工程、および(ii)上記未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、生
理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリッ
クスを含むシート状担体の上に3次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定
相栓流バイオリアクターから得られた間質細胞馴化培地を含む培地の中で培養し
て、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する工程によって、未分化
の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する工程を含む方法が提供される。
学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリック
スを含み、担体1立方センチメートルあたり少なくとも5×106個の間質細胞
を支持しているシート状担体を含む容器を含むバイオリアクタープラグが提供さ
れる。 本発明のさらに別の態様によって、上記バイオリアクタープラグを含む栓流バ
イオリアクターが提供される。
幹細胞または前駆細胞は、臍帯血、動員された末梢血、および骨髄からなるグル
ープより選択された組織から単離される細胞である。
細胞、および間質細胞培養の間質細胞は共通のHLA抗原をもつ。
細胞、および間質細胞培養の間質細胞は単一個体に由来する。
細胞、および間質細胞培養の間質細胞は異なった個体に由来する。
細胞、および間質細胞培養の間質細胞は同一種に由来する。
細胞、および間質細胞培養の間質細胞は異種に由来する。
細胞、および間質細胞培養の間質細胞は、担体1立方センチメートルあたり少な
くとも5×106細胞という密度にまで増殖している。
細胞、および間質細胞培養の間質細胞は、担体1立方センチメートルあたり少な
くとも107細胞という密度にまで増殖している。
中に未分化の造血幹細胞または前駆細胞を播く工程が行われてから少なくとも1
0時間該バイオリアクターの中の流れが停止される。
合にして40%から95%を構成し、孔の大きさが10ミクロンから100ミク
ロンである。
が0.5ミクロンから50ミクロンである、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維
、およびそれらの混合繊維からなるグループより選択された繊維からできている
。
からであるリボン状繊維から構成されている。好適な態様の記載中のさらなる特
徴によれば、繊維の厚さに対する幅の割合が少なくとも2:1である。
る割合が60%から95%の孔容量をもつ。
000μmである。
ステル、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ
スチレン、ポリスルホン、酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金
属繊維からなるグループより選択される。
グ形、円盤形、および十字形からなるグループより選択される。
ンで被覆されている。
することによって、現在知られている構成の短所に対処することに成功している
。
はそれらを併用して、選択された作業または工程を実施または完遂することが含
まれるかもしれない。その上、本発明に係る方法およびバイオリアクターの好適
な態様である実際の機器および装置によっては、選択された工程のいくつかは、
ハードウエア、または何らかのファームウエアのオペレーティングシステム上の
ソフトウエア、またはそれらの併用によって実施することができるかもしれない
。例えば、ハードウエアとして、選択された本発明の工程をチップまたは回路と
して行なうことができるかもしれない。ソフトウエアとして、選択された本発明
の工程を、何らかの適当なオペレーティングシステムを用いてコンピュータが実
行するソフトウエアによる複数の命令として実施することができる。いずれの場
合にも、本発明に係る方法およびバイオリアクターの選択された工程は、複数の
命令を実行するためのコンピュータ用プラットホームなどのデータプロセッサに
よって実行されるものとして説明することもできよう。 ここで、添付の図面を参照しながら、実施例のみによって本発明を説明する。
以下では図面を説明しながら具体的に説明してゆくが、示された各図面は、具体
例を示すことによって、本発明の好適な態様を具体的に検討する目的のためだけ
のものであり、最も有用、かつ容易に理解できると考える、発明の原理および概
念的態様に関する記載を提供するために提示されたものであることをここで強調
しておく。この点で、図面とともに説明を読めば、当業者は、発明のいくつかの
形を実際に具体化する方法が明らかになるという程度に発明を基本的に理解する
以上には、発明の構成の詳細を詳述する意図はない。 図面において、 図1は、本発明を実施するときに役立つよう、栓流バイオリアクター20の例
を図解したものである。1−培地貯蔵容器;2−気体混合用容器;3−気体濾過
装置;4−注入ポイント;5−栓流バイオリアクター20のプラグまたは容器;
6−液流監視装置;6a−液流バルブ;7−馴化培地回収/分離用容器;8−培
地交換用容器;9−蠕動ポンプ;10−サンプリングポイント;11−培地交換
用容器;12−O2モニター;14−ステアリング装置;PH−pH測定針。 図2は、14F1.1細胞によるCAFC維持を示している。臍帯血CD34
+細胞を、限界稀釈して、照射済みの14F1.1または初代ヒト骨髄間質細胞
上に播いた。5週間後に敷石形成を測定した。結果は、2回の独立実験による平
均値±SDを表す。 図3は、14F1.1細胞によるLTC−IC維持を示している。臍帯血CD
34+細胞を、限界稀釈して、照射済みの14F1.1または初代ヒト骨髄間質
細胞上に播いた。7週間後にミエロイドコロニー形成を測定した。FLT3リガ
ンド(300ng/ml)、TPO(300ng/ml)およびSCF(100
ng/ml)を毎週培地を交換するときに添加した。結果は、2回の実験による
平均値±SDを表す。 図4は、14F1.1および初代ヒト骨髄間質細胞上でのCD34+38−細
胞の増加を示している。CD34+細胞を、14F1.1または70CD34+
38−における初代ヒト骨髄間質細胞上に播いた。サイトカインを毎週添加した
。7〜21日後に培養細胞をトリプシン処理した。FACS解析によってCD3
4+CD38−を測定した。結果は、2回の実験による平均値±SDを表す。 図5a〜bは、14F1.1間質細胞株を播いた担体の10日後(図5a)ま
たは40日後(図b)の走査式電子顕微鏡写真(SEM)である。倍率:×15
0。 図6a〜bは、CD34+38−の増加に対する3D対2Dの14F1.1馴
化培地の効果を示している。14F1.1および初代ヒト骨髄間質細胞に由来す
る、さまざまな濃度の馴化培地存在下で、CD34+細胞を懸濁培地に播いた。
FACS解析によってCD34+CD38−細胞数を測定した。結果は、2回の
実験による平均値±SDを表す。 図7は、間質細胞被覆担体上でのCD34+38−細胞の維持を示している。
間質細胞被覆担体は、3D装置から取りだして、シリコン被覆した96穴プレー
トに移し、1.5×104のCD34+細胞を加えた。対照は、担体のみを含む
ものと、担体と同じ数の単層(2D)増殖させた14F1.1細胞を含むもので
あった。一定の時点で細胞を回収して、FACSによって解析した。結果は、2
回の独立実験による平均値±SDを表す。
的に使用することのできる造血幹細胞を増加/維持する方法およびバイオリアク
ターに関するものである。具体的には、本発明は、さまざまな応用に用いること
のできる、造血幹細胞を維持および/または増加、および/または、造血幹細胞
を維持および/または増加させるための馴化培地を作製するための3次元の間質
細胞栓流バイオリアクターである。
理解できよう。
以下の説明で示されるか、図面に描かれた要素の詳しい構成および配置に限定さ
れないことを理解されるべきである。本発明は、他の実施態様をとることができ
、または、さまざまな方法で実施することができる。また、ここで使用する語句
および用語は、説明のためのものであって、限定的なものではないことも理解さ
れるべきである。
とを目的とする現在の方法は、今までのところ、限定的な成功しか収めていない
。骨髄の微小環境を正確に模倣して、骨髄の間質細胞の増殖を支持し、長期間維
持することができる新規の3次元(3D)栓流バイオリアクターをここで説明す
る。間質細胞を、ポリエステル製の不織繊維マトリックスでできた多孔性の担体
に播くと、比較的少量で多数の細胞を増殖させることが可能になる。次の実施例
の項で提示されている実例では、バイオリアクターにマウス14F1.1間質細
胞株を播くか、あるいは、初代ヒト骨髄間質細胞を播いた。細胞を播いてから4
0日後までに、担体は、100倍の細胞密度をもつようになった。さまざまなレ
ベルのカラムで密度は同一であり、このことは、酸素と栄養分が均一に細胞まで
移動したことを示している。ヒト臍帯血(CB)CD34+38−細胞の長期間
維持を支持するには、間質細胞によって馴化された、バイオリアクター内の培地
(3D SCM)の方が、間質細胞の単層(2D)SCMよりも優れていた。ま
た、3D SCMは、SCID/NOD再増殖細胞(SRC)を代表するCD3
4+38−CXCR4+細胞の増加を支持することもできた。サイトカイン(F
LT3リガンドとTPO)存在下では、3D SCMは、幹細胞の自己複製を促
進し、分化を抑制したが、2D SCM+サイトカインによって、これと反対の
効果が誘導された。また、3次元の間質−幹細胞培養は、単層の間質細胞上で培
養したときよりも優れたCD34+38−細胞維持を示した。これらの知見は、
3D栓流バイオリアクターが、優れた間質細胞−幹細胞接触によって、そして、
おそらく、既知および/または新規の幹細胞制御因子によって、ヒトHSCを生
体外で維持/増加するのに適した装置を提供することを示している。
度が非常に減少すること、および、最終分化がないときに、幹細胞の自己複製を
誘導することができる増殖因子を今の所利用できないことが、相変わらず、この
ような方法を実施したり、HSC「バンク」を大規模に準備する上での主な障害
となっている。
ろ、限定的にしか成功していない。サイトカイン添加懸濁培養を用いた最近の研
究では、いくらかのSRC増加が示されたが、この処理過程は、初期造血前駆細
胞の大量の増加もともなっていた(53、62)。このことは、幹細胞の分化が
かなりの程度起こっていることを示すものである。理想的な装置は、例えば、、
SRCが増加しても、LTC−ICは少ない数のままでいるようなものである。
(米国特許第5,646,043号参照)、または間質細胞単層(米国特許第5
,605,822号参照)上に播いて用いる。前者の装置では、関係する前駆細
胞の膨大な産生が起こるが、後者では、単層の間質細胞−幹細胞相互作用という
非生理学的な性質が問題となる。幹細胞を増加させるための別の装置では、間質
細胞馴化培地の使用が記載されている(米国特許第4,536,151号、およ
び第5,437,994号)。しかし、後者は、間質細胞単層から得られたもの
であり、本明細書において、3D SCMと比較して幹細胞活性化能力が劣り、
また異なっていると明示されている(実施例の項の表3を参照)。最近になって
、間質細胞被覆ガラスビーズを用いた固定相バイオリアクターが記述されている
(米国特許第5,906,940号)が、このビーズは、生理学的な3D構造を
提供しておらず、本発明を実施したときに用いる担体と比較すると、間質細胞を
1mlあたり10倍少ない数しか増殖させることができない。3D由来のSCM
、または3D間質細胞培養が優れたCD34+38−細胞維持能力をもつという
、ここで示された知見によって、単層間質細胞培養に対する3Dの利点が明確に
なる(図6と7参照)。3D SCMの優れた効果は、既知のサイトカインまた
は新規の幹細胞制御因子の量が上昇したためであろう。
等)を組み合わせたときのCD34+38−CXCR4+(またはSRC)の維
持/増加に対する効果を評価するための実験(表3)は、FLT3リガンドおよ
びTPOが存在するときには3D SCMの有利な効果が示されたが、SCFで
は示されなかった。これら知見は、幹細胞分化に対する3D SCMの相対的な
阻害効果によるものかもしれない。これらの知見は、3D条件下では、それ自体
は活性が低いが、こうしたサイトカインと協働的に作用する新規の間質細胞関連
因子が産生されたことを強く示している。CD34+の出力に加えて、LTC−
ICおよび関連前駆細胞(GM−CFU)出力値を使用することによって、幹細
胞分化をテストできるようになる。
組み合わせた点でユニークである。連続的な培地の流動のない3D間質細胞−造
血細胞システムについては最近の記述が見られる(米国特許第5,541,10
7号)が、本明細書で説明する知見(例えば、図7参照)によれば、連続的に流
動させない場合には、単層と比較した場合の3D間質細胞培養の利点は減少する
ことが明らかになっている。
質細胞の長期増殖を支持することができる。バイオリアクターにおける間質細胞
の使用は、優れた間質細胞−幹細胞の接触(ユニークな「ニッチ」、および細胞
−細胞、細胞−ECM相互作用による)を確保するために必須であるだけでなく
、間質細胞による既知または新規の可溶性膜結合サイトカインの産生にも必須で
ある。遺伝子工学的に作製されたサイトカイン産生変異株を用いることによって
、間質細胞は、このようなバイオリアクターに適当なサイトカインを補充するの
を容易にすることができる。
スパッケージング用細胞株となって、幹細胞の中に遺伝物質を効率よく導入する
ことができるように改造することができる。また、バイオリアクターの中でさま
ざまな幹細胞を使用することによって、間質細胞に接着する能力が低いことで知
られているPh陽性幹細胞(63)を排除するのに最も適した担体を選択できる
かもしれない。初代間質細胞には、「自家性」の間質細胞−幹細胞バイオリアク
ターで、自家性の幹細胞または臍帯血幹細胞でさえも増加することができ、移植
する前に間質細胞を除去する必要がないというバイオリアクターを樹立できると
いう利点がある。
収率はどちらかといえば低かったが、細胞を播いた後の培地の流速と、最初にバ
イオリアクターの中に播くCD34+細胞の数は容易に最適化することができる
。細胞を播いた後の早い時点(1〜4日後)でのCD34+38−CXCR4+
解析が、このような最適化には必須である。
な構造基盤を模倣するよう、間質細胞を接着させるために利用できる接着表面が
かなり増加している増殖用マトリックスを使用する。例えば、0.5mmの高さ
の増殖用マトリックスでは、増殖用マトリックスの基盤からの突起から計算する
と、少なくとも5〜30倍増加している。約5〜30倍という、このような増加
は、層単位あたりであり、積み重なっていようと、スペーサーなどによって離れ
ていようと、このような層が複数用いられていれば、このような構造物の一枚あ
たりについて、5〜30倍という係数が適用される。マトリックスが、好ましく
は、不織繊維シートである、シートという形、または開孔発泡ポリマーのシート
にして用いるときは好適な厚さは約50〜1000μm以上で、細胞の侵入、栄
養分の侵入に適し、また、排出産物をシートから除去するのに適した孔が提供さ
れる。好適な実施態様によれば、孔の効果的な直径は10μmから100μmで
ある。このようなシートは、さまざまな厚さの繊維から調製することができ、好
ましい繊維の厚さまたは繊維の直径は約0.5μmから20μmの範囲であり、
さらにより好ましい繊維は、直径が約10μmから15μmの範囲である。
トまたはスクリーンによって支持されるか、さらによいのは、それに結合するこ
とができる。
だりして、約0.2mm2から約10mm2までの突起領域をもち、同じ範囲の
厚さ(約50から1000μm)をもつ粒子を提供することができる。
ックスの使用および/または長所が、米国特許第5,168,085号と、特に
、第5,266,476号に記載されており、これらは両方とも、ここにおいて
参照として組み込まれる。
らには限定されない、さまざまな応用場面に用いることができる、増大した未分
化造血幹細胞の集団を提供する:(i)移植前に間質細胞−幹細胞を分離する必
要のない、レシピエントの間質上でのヒト幹細胞(自家性または臍帯血由来)の
増加、(ii)自家環境における、間質細胞−幹細胞相互作用によるPh+CM
L幹細胞の枯渇、(iii)バイオリアクター内にあるか、またはバイオリアク
ターから回収してからの自己複製幹細胞の中への遺伝子移入;(iv)未分化造
血幹細胞を生体外で維持/増加させるための、懸濁培養または幹細胞バイオリア
クターにおける、3D間質細胞馴化培地(SCM)の生産;(v)分化のない状
態で幹細胞の自己複製を誘導する新規タンパク質、および、さらに別の生物学的
機能をもつタンパク質の単離;(vi)新規の間質細胞関連幹細胞制御因子、お
よび、さらに別の生物学的機能をもつ幹細胞遺伝子産物をクローニングするため
の3D幹細胞RNAの単離。
持する方法が提供される。本発明の本態様による方法は、以下の方法工程を踏む
ことによってもたらされる。まず、未分化造血幹細胞または前駆細胞を得る。次
に、この未分化造血幹細胞または前駆細胞を、図1に、その実例が参照用の番号
とともに図示されている固定相栓流バイオリアクターの中に播くが、その中では
、生理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マト
リックスを含むシート状担体の上に、間質細胞株または初代間質細胞培養のいず
れかの3次元の間質細胞培養が予め樹立されている。こうして、さらに上述され
、また、次の実施例の項で例示されているように、未分化造血幹細胞または前駆
細胞が増加/維持される。
幹細胞」という語句は、まだ特定化されていない造血細胞を意味する。
いう語句は、特定化されているが、未成熟の造血細胞を意味する。
の造血幹細胞または前駆細胞を得ること」という語句、およびそれと同義の「未
分化の造血幹細胞または前駆細胞が得られる」という語句は、どちらも、単離さ
れた未分化の造血幹細胞および/または前駆細胞、または、未分化の造血幹細胞
および前駆細胞を含むCD34+細胞の集団を取得することを意味する。
と」および「増加」という語は、実質的に分化のない細胞増殖、すなわち、細胞
の増加に伴う分化なしに細胞集団が増加することを意味する。
胞の自己複製、すなわち、細胞の定常化に伴う分化のない実質的に定常的な細胞
集団を意味する。
的な種類に変化することを意味する。さまざまな細胞系譜の細胞分化は、充分に
記述されているプロセスであるから、ここでさらに記述する必要はない。
例えば、試験管)で増殖される細胞を意味する。
光活性化細胞選別、および親和性基質による親和分離法などであるが、これらに
限定されない、さまざまな親和分離/標識技術によって単離することができる。
このような単離法を実施するために使用できる親和性分子には、例えば、CD3
4+細胞に結合する抗CD34抗体などがある。
するもう一つの方法が提供される。本発明の本態様による方法は、以下の方法工
程を踏むことによってもたらされる。まず、未分化造血幹細胞または前駆細胞を
得る。次に、この未分化造血幹細胞または前駆細胞を全成分または添加成分とし
て間質細胞馴化培地を含む培地の中で培養するが、この間質細胞馴化培地は、生
理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリッ
クスを含むシート状担体の上に、間質細胞株または初代間質細胞培養のいずれか
の3次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアクターから
得られるものであり、これによって、さらに上述され、また、次の実施例の項で
例示されているように、未分化の造血幹細胞または前駆細胞が増加し/維持され
る。
/維持する上で有用な間質細胞馴化培地を調製する方法が提供される。本発明の
本態様による方法は、以下の方法工程を踏むことによってもたらされる。まず、
固定相栓流バイオリアクターの中で、生理学的に許容できる3次元の繊維ネット
ワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に間質細胞
株または初代間質細胞培養のいずれかの間質細胞培養を樹立して、未分化の造血
幹細胞または前駆細胞を増加/維持する。次に、所望の間質細胞密度すなわち、
例えば、マトリックス1立方センチメートルあたり約5×106または107を
超える密度に達したら、固定相栓流バイオリアクターから培地を回収すると、さ
らに上述され、また、次の実施例の項で例示されているように、未分化の造血幹
細胞または前駆細胞を増加/維持する上で有用な間質細胞馴化培地が得られる。
ピエントに移植する方法が提供される。本発明の本態様による方法は、以下の方
法工程を踏むことによってもたらされる。まず、上記の方法のいずれかによって
、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する。次に、最初の工程で得
られた未分化の造血幹細胞または前駆細胞をレシピエントに移植する。
アクタープラグで、典型的にはカラムの形をしており、入り口と出口をもち、ま
た、その中に、生理学的に許容できる3次元の繊維ネットワークを形成している
不織繊維マトリックスを含み、担体1立方センチメートルあたり、間質細胞株ま
たは初代間質細胞培養のいずれかの少なくとも5×106個、好ましくは、少な
くとも107個の間質細胞を支持するシート状担体を含むものが提供される。
イオリアクターが提供される。
ころで、照射などの手段を用いて、さらなる細胞増殖を中断させて、担体によっ
て支持される細胞の正確な数を調節する。
未分化の造血幹細胞または前駆細胞は、臍帯血、サイトカインにより動員された
末梢血(例えば、白血球搬出によって回収されたもの)、および骨髄など、その
すべてが未分化の造血幹細胞または前駆細胞を含むことが知られている組織で、
しかもこれらに限定されない組織から精製または単離することができる。このよ
うな分離を行なう方法は、当技術分野において公知であるが、もっともよく用い
られるのは、フルオロフォアによる親和標識でまず細胞を標識してから回収する
蛍光活性化細胞選別法である。
質細胞培養の間質細胞は、共通のHLA抗原をもつ。本発明の別の好適な態様に
よれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の間質細胞は
、単一個体に由来する。したがって、それをレシピエントに移植する場合には細
胞を分離する必要はない。
、および間質細胞培養の間質細胞は、異なった個体に由来する。例えば、未分化
の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞の将来のレシピエントを間質細胞
を提供するために用いることもできるが、このような細胞をレシピエントに提供
するため、HLA適合性によって選択されたドナーから未分化の造血幹細胞また
は前駆細胞、および間質細胞を得ることもできる。したがって、ここでも、移植
前に細胞を分離する必要はない。
、および間質細胞培養の間質細胞は、同一種に由来する。しかし、本発明のさら
に別の好適な態様によれば、未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細
胞培養の間質細胞は、異種に由来する。
化の造血幹細胞または前駆細胞を播く工程が行われてから少なくとも10時間バ
イオリアクターの中の流れが停止され、それによって、細胞を間質細胞で被覆さ
れたマトリックスに固定することができる。
行なう。
て40%から95%が孔を形成し、孔の大きさは10ミクロンから100ミクロ
ンである。別の態様によれば、担体を作るマトリックスは、へん平繊維、非丸形
繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維からなるグループより選択された繊維
でできており、繊維の直径または幅は0.5ミクロンから50ミクロンである。
さらに別の態様によれば、マトリックスは、幅2ミクロンからの幅をもつ繊維か
ら形成されたリボンから構成される。さらなる態様によれば、繊維の厚さに対す
る幅の割合は少なくとも2:1である。さらに別の態様によれば、担体を作るマ
トリックスは、全容量に対する割合で60%から95%の孔容量をもつ。さらに
別の態様によれば、マトリックスの高さは50〜1000μmであるが、ただし
、それらを積み重ねたものを用いることができる。さらに別の態様によれば、担
体を作るマトリックスの材料は、ポリエステル、ポリアルキレン、ポリフルオロ
クロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、酢酸セルロー
ス、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループより選択される
。さらに別の態様によれば、マトリックスは、四角形、リング形、円盤形、およ
び十字形からなるグループより選択された形である。さらに別の態様によれば、
マトリックスはポリ−D−リジンで被覆されている。
ば、当業者に明らかとなろうが、実施例は、制限を意図したものではない。さら
に、上記で概略され、後述する請求の範囲の項で請求されている、本発明のさま
ざまな実施態様および態様はそれぞれ、以下の実施例で実験的に裏付けられてい
ることが分かる。
を非限定的な方法で具体的に示すものである。
順には、分子的、生化学的、微生物学的、および組換えDNAによる技術などが
ある。このような技術は、文献中で詳細に説明されている。例えば、「分子クロ
ニーング:実験マニュアル(Molecular Cloning: A La
boratory Manual)」、Sambrookら、(1989);「
分子生物学の最新プロトコール(Current Protocols in
Molecular Biology)」第IからIII巻、Ausubel,
R. M.編(1994); Ausubelら、「分子生物学の最新プロト
コール(Current Protocols in Molecular B
iology)」、メリーランド州ボルティモア(Baltimore, Ma
ryland)にあるジョンワイリーアンドサンズ社(John Wiley
and Sons)(1989);Perbal、「分子クロニーングの実践的
手引き(A Practical Guide to Molecular C
loning)」ニューヨークにあるジョンワイリーアンドサンズ社(John
Wiley & Sons)(1988);Watsonら、「組換えDNA
(Recombinant DNA)」、ニューヨークにあるサイエンティフッ
クアメリカンブックス社(Scientific American Book
s);Birrenら、(編)「ゲノム解析:実験マニュアルシリーズ(Gen
ome Analysis: A Laboratory Manual Se
ries)」、第1〜4巻、ニューヨークにあるコールドスプリングハーバーラ
ボラトリープレス社(Cold Spring Harbor Laborat
ory Press)(1998);米国特許第4,666,828号、第4,
683,202号、第4,801,531号、第5,192,659号および第
5,272,057号で開示されている方法;「細胞生物学:実験室ハンドブッ
ク(Cell Biology: A Laboratory Handboo
k)」、第IからIII巻、Cellis, J.E.,編(1994);「免
疫学の最新プロトコール(Current Protocols in Imm
unology)」第IからIII巻、Coligan, J. E.,編(1
994);Stitesら、(編)「基礎および臨床免疫学(Basic an
d Clinical Immunology)」(第8版)、コネティカット
州ノーウォーク(Norwalk, CT)にあるアップルトンアンドラング社
(Appleton & Lange)(1994);Mishell and
Shiigi(編)「細胞免疫学の精選された方法(Selected Me
thods in Cellular Immunology)」、ニューヨー
クにあるW.H.フリーマン社(W.H. Freeman and Co.)
(1980);利用可能な免疫アッセイ法が、特許文献および科学論文で広範に
記載されている。例えば、米国特許第3,791,932号、第3,839,1
53号、第3,850,752号、第3,850,578号、第3,853,9
87号、第3,867,517号、第3,879,262号、第3,901,6
54号、第3,935,074号、第3,984,533号、第3,996,3
45号、第4,034,074号、第4,098,876号、第4,879,2
19号、第5,011,771号、第5,281,521号を参照;「オリゴヌ
クレオチド合成(Oligonucleotide Synthesis)」、
Gait, M.J. ら、(1984);「核酸ハイブリダイゼーション(N
ucleic Acid Hybridization)」、Hames, B
.D. and Hggins S. J.編(1985);「転写と翻訳(T
ranscription and Translation)」、Hames
, B.D. and Hggins S. J.編(1984);「動物細胞
培養(Animal Cell Culture)」、Freshney, R
. I.,編(1986);「固定化細胞および酵素(Immobilized
Cells and Enzymes)」、IRLプレス社(IRL Pre
ss)、(1986);「分子クロニーングの実践的手引き(A Practi
cal Guide to Molecular Cloning)」、Per
bal, B., (1984)および「酵素学における方法(Methods
in Enzymology)」1〜317巻、アカデミックプレス社(Ac
ademic Press);「PCRプロトコール:方法と応用への手引き(
PCR Protocols; A Guide To Methods An
d Applications)」、カリフォルニア州サンディエゴ(San
Diego, CA)にあるアカデミックプレス社(Academic Pre
ss)(1990);Marshakら、「タンパク質精製と特徴付けの方法:
実験コースマニュアル(Strategies for Protein Pu
rification and Characterization−A La
boratory Course Manual)」、CSHLプレス(CSH
L Press)(1996)を参照のこと。そして、これらはすべて、本明細
書において完全に開示されているものとして、参照して本明細書に組み入れられ
る。その他の一般的な参考文献は、本書類全部にわたって提示されている。それ
らに含まれている情報はすべて、参照してここに組み込まれる。
図1に記載の設計にしたがって構築された。ガラス用具は、テクニオン社(Te
chnion)(イスラエル)で設計製造され、シリコンチューブ(デガニア社
(Degania)、イスラエル)で接続した。担体を、Ca+2とMg+2を
含まないリン酸緩衝食塩水(PBS;ベイトハエメックインダストリー社(Be
it Ha'Emek Industries)、イスラエル)の中で一晩回転
させて、その後、PBSと遊離した残渣を除去した。各カラムに10mlのパッ
クされた担体を入れた。バイオリアクターをPBS−Ca−Mgで満たし、出口
をすべて密封し、この装置をオートクレーブした(120℃、30分間)。容器
[8]を通してPBSを取り除いてから、37℃の保温器の中で、10%の熱で
不活化したウシ胎児血清(FCS;ベイトハエメックインダストリー社(Bei
t Ha'Emek Industries)、イスラエル)、およびPen−
Strep−Nystatin混合液(100U/ml:100μg/ml:1
.25μn/ml;ベイトハエメックインダストリー社(Beit Ha'Em
ek))を含む300mlのダルベッコの高グルコース培地(DMEM;ギブコ
BRL社(GIBCO BRL))で48時間にわたってバイオリアクターを循
環させた。循環している培地を、上記+2mML−グルタミンを含む新鮮なDM
EM(ベイトハエメックインダストリー社(Beit Ha'Emek))と交
換した。
、10%FCSを添加したDMEMに入れて37℃で維持した。細胞は、組織培
養用フラスコ(コーニング社(Corning))の中で増殖させ、コンフルエ
ントな状態になったところでトリプシン処理をして分割した。初代ヒト骨髄間質
細胞培養は、開心術を受けている血液学的には正常なドナーの吸引胸骨髄から樹
立した。簡単に説明すると、骨髄吸引物をハンクス平衡塩溶液(HBSS;ギブ
コBRL社(GIBCO BRL))で3倍に稀釈して、フィコール−ハイペー
ク(Ficoll−Hypaque)(カリフォルニア州サニーベール(Sun
nyvale, CA)にあるリボンズサイエンティフィック社(Ribbon
s Scientific Corp.))密度勾配遠心にかけた。骨髄の単核
細胞(<1.077gr/cm3)を回収して、HBSSで3回洗浄してから、
12.5%FCS、12.5%ウマ血清(ベイトハエメックインダストリー社(
Beit Ha'Emek))、10−4Mのβ−メルカプトエタノール(メル
ク社(Merk))、および10〜6mol/Lのハイドロコルトワゾン(hy
drocortwasone)コハク酸ナトリウム(シグマ社(Sigma))
を添加したDMEMからなる長期培養用(LTC)培地に再懸濁した。細胞を2
5mlの組織培養用フラスコ(コーニング社(Corning))に入れて、3
7℃で3日間(5%CO2)インキュベートしてから、毎週培地を交換しながら
33℃(同様)でインキュベートした。個別のドナーからの間質細胞が各バイオ
リアクターに対して用いられた。3Dおよび単層を実験するために、初代間質細
胞培養を10日毎にトリプシン処理(0.25%トリプシンおよびEDTAを含
むパックス食塩水(Puck's Saline);(ベイトハエメックインダ
ストリー社(Beit Ha'Emek))して分割して、間質細胞を十分に増
加させた。LTC−ICおよびCAFC(下記参照)については、137Cs線
源を用いて間質細胞を照射(1500cGy)してから、培養物をLTC培地中
33℃で維持した。
初代骨髄間質細胞をトリプシン処理し、HBSSで3回洗浄してから、バイオリ
アクター用培地に再懸濁し(上記参照)、細胞数を数えて、106細胞/mlの
細胞10mlを注射ポイント([4]、図1)を通して、バイオリアクターのガ
ラスカラムの中の担体10mlの上に播種した。播種直後から16時間循環を停
止して、細胞を担体上に定着させた。担体を取り出して、MTT法(56)で細
胞数を数えることによって、バイオリアクター内での間質細胞の増殖を監視した
。間質細胞細胞がコンフルエントになったら、さらに実験を続ける(SCMの調
製、幹細胞の播種など)ために、培地をLTC培地と交換した。
リアクターの間質細胞に新鮮なLTC培養培地を補充した。細胞を一晩インキュ
ベートした後SCMを回収した。このために、3D培養の培地の流れを16時間
停止して、循環を再開する前にカラムから直接取り出した。SRCの間質細胞産
生に与えるCD34+細胞の効果を解析するために、3D装置にCD34+を播
いた後さまざまな時間(2〜7日間)を置いて循環を停止し、上記したようにし
て、カラムから培地を回収した。SCMを回転させ(1000×g、10分間)
、濾過してから−20℃に保存した。バイオリアクター中の無血清培地の中でも
間質細胞を増殖させて、SCMを回収し、それによって、不確定の変数を除去し
た。
フィコール−ハイペーク(Ficoll−Hypaque)上で分画して、浮遊
性(<1.077gr/cm3)の単核細胞を回収した。各CBサンプルから得
られた細胞をプールして、抗CD34抗体とともにインキュベートし、ミディM
ACS(ミルテニルバイオテック社(Miltenyl Biotech))に
よって単離した。
300ng/mlのFLT3リガンド、SCFまたはTPOを単独で、または組
み合わせて添加するか、または全く添加しないものを24穴プレート(TPP、
スイス)に入れ、その中でCB CD34+細胞(5×105/ウエル)をイン
キュベートした。対照は、LTC培地にサイトカインを加えたものか加えないも
のであった。細胞は、空気中5% CO2、37℃でインキュベートした。培養
培地は毎週交換した。播種前のさまざまな時点(1〜3週間)で細胞を回収し、
CD34+/38−/CXCR4+をフローサイトメトリーによって数を数えて
測定した。出力アッセイ法は、SRC、CAFCおよびLTC−ICを含むこと
もある。
数(約5×105)になるよう、単層上、または、コンフルエントな間質細胞と
同じくらいの密度状態のバイオリアクターに播いた。バイオリアクターに添加す
るときには、間質細胞と接触できるよう、培地の流れを16時間停止した後、1
分間あたり0.1〜1.0mlという速さで再開した。対照実験のため、培地交
換をしないで、CD34+細胞を播いた間質細胞担体を取り出した。サイトカイ
ン入りか、サイトカインなしのLTC培地中で同時培養を続けた。さまざまな時
点(4週間後まで)で、非接着細胞を、単層の上清から、または循環している培
養培地から容器([8]、図1)を通して回収した。連続的にトリプシン処理を
行ない、さらに、EDTAを主成分とする解離用バッファー(ギブコBRL社)
に曝した後、ゆっくりと細胞をピペッティングして、接着細胞を回収した。こう
して得られた懸濁液の中に間質細胞が混じらないようにするため、細胞をHBS
S+10%FCSに再懸濁し、プラスチック製の培養皿(コーニング社)に入れ
て、37℃で60分間接着処理を行なった。循環する造血細胞と担体に単離され
た造血細胞を洗って、別々に、フローサイトメトリーによって、CD34+/3
8−/CXCR4+を数えて測定した。出力アッセイ法は、SRC、CAFCお
よびLTC−ICを含むこともある。
P抗体(ベクトン−ディキンソン社(Beckton−Dickinson))
、抗−CXCR4−フルオロセインイソチオシアネート抗体(FITC、R&D
システムズ社(R&D Systems))、およびフィコエリトリン抗体(P
E、ベクトン−ディキンソン社)とともに細胞を4℃で30分間インキュベート
した。5%熱不活性化FCSを含む氷冷PBSで細胞を2回洗浄してから、FA
CSscan(ベクトン−ディキンソン社)上で3色フローサイトメトリーを行
なうために再懸濁した。
7)にしたがって、単離したばかりのCD34+細胞、間質細胞との同時培養か
懸濁培養から単離した細胞を、LTC−ICとCAFCについて測定した。コン
フルエントな初代骨髄間質細胞をトリプシン処理してから照射し(1500cG
y)、96穴プレート(コーニング社)0.1mlの中に1.5×104/ウエ
ルになるよう播いた。24反復用ウエル/グループを樹立した。間質細胞の上を
CD34+細胞の連続稀釈(500〜5細胞/ウエル)を含むLTC培地0.1
ml、またはさまざまなアッセイから回収した細胞の連続稀釈液で覆った。培養
液はそのまま、毎週半分の培地を交換しながら、33℃で5週間インキュベート
した。プレートを1000rpmで10分間スピンダウンし、培養上清を取り除
き、以前の記載(57)にしたがって、メチルセルロース培養液、および骨髄前
駆細胞アッセイを行うためのサイトカインをオーバーレイした。14日後にコロ
ニー数を数え、37%の陰性培養になる被験細胞の濃度の逆数によって(16)
LTC−ICの頻度を決定した。CAFCアッセイ法は、メチルセルロースおよ
びサイトカインをオーバーレイしない点を除いて、基本的には上記と同様に行な
った。被験細胞懸濁液を連続稀釈して播いてから6週間後に、間質細胞層の下に
ある少なくとも5個の細胞(敷石領域)のうち少なくとも位相が濃い造血細胞ク
ローンが一つあるウエルを判定した。
本の平行栓流バイオリアクターユニット[5]を含んでいた。各バイオリアクタ
ーユニットには、ポリエステルの不織繊維マトリックス(58)でできた1 g
の多孔性担体が入っていた(直径4mm)。これらの担体は、比較的小さい容量
で多数の細胞を増殖させることができる。担体の構造と詰め方が、酸素と栄養分
の移動、また、局所的な濃度および遊離した間質細胞産物(例えば、ECMタン
パク質、サイトカインなど、59)に主要な影響を与える。バイオリアクターは
、インキュベーターにおいて37℃で維持した。
。各バイオリアクターは、サンプリングポイントと注入ポイント[4]をもって
いて、間質細胞と造血細胞を連続的に播種できるようになっている。培養培地は
、貯蔵容器[1]からpH7.0で供給された[13]。貯蔵容器には、カラム
からの出口で5〜40%の溶解酸素が維持できるよう、バイオリアクター内の細
胞密度に応じて決まるさまざまなな空気/CO2/O2[2]の割合を含む濾過
混合気体[3]を供給した。監視装置[12]によって測定したところ、O2の
割合は、バイオリアクターの出口の所で溶解しているO2レベルに適合していた
。混合気体は、シリコンチューブを経由して貯蔵用容器に送られる。培養培地は
、循環する非接着細胞を回収することのできる別の容器[7]を通って来る。培
地の循環は、0.1〜3ml/分という速度で動く蠕動ポンプ[9]という手段
によって得られた。バイオリアクターユニットは、さらに、サンプリングポイン
ト[10]と、10〜50ml/日の速度で連続的に培地を交換するための2つ
の容器[8、11]を備えていた。4本平行になったバイオリアクターユニット
を使用することによって、細胞の取り出し、走査式電子顕微鏡、組織学法、免疫
組織化学法、RNA抽出等の目的で、周期的に取り外すことが可能になっている
。
含むバイオリアクター装置で、分化を開始したヒト骨髄前駆細胞の増殖を支持す
ることが以前示されているバイオリアクター(24)を確立した。この細胞株は
、初代ヒト骨髄間質細胞だけでなく、ヒトCB CAFC(図2)、LTC−I
C(図3)、およびCD34+38−細胞(図4)も同様に支持することができ
る。また、これらの図に示された結果は、FLT3リガンド+TPOをこれらの
培養細胞に添加したとき、LTC−ICには効果を与えなかったが、CAFCお
よびCD34+38−細胞の出力を有意に促進したことを示している。これに対
して、SCFは、LTC−ICとCAFCの両方で減少を招いた。培養容量10
mlあたり1.5×106個の細胞をバイオリアクターに播種すると、14F1
.1細胞が増殖して、担体上に広がった(図5)。播種後40日目までに、担体
の細胞密度は100倍、すなわち、約1.5×106細胞/担体、1.5×10 7 細胞/mlという密度まで増加した(表1)。
、細胞への酸素と栄養分の移動が均一であったことを示している。これらの細胞
について培養条件を最適化させると、培養培地(ダルベッコの高グルコース培地
+10%ウシ胎児血清)、流速(1ml/分)、培地交換頻度(週に1回)、初
回播種濃度(上記の通り)となった。コラーゲンまたはポリL−リジンによる担
体被覆には、14F1.1細胞の増殖率と最終濃度に有利な効果がないことが分
かった。初代ヒト骨髄間質細胞による予備的知見(表1)は、14F1.1と初
代間質細胞が、それぞれ播種後10日目と14日目で同じ密度になることを明ら
かにした。
D34+細胞を播種した懸濁培養におけるCD34+38−細胞に対する、バイ
オリアクターカラム(3D SCM)から得られた間質細胞馴化培地(SCM)
の効果を判定した。活性を同じ濃度の間質細胞を含む単層培養(2D SCM)
から得られたSCMと比較した。図6に示したように、14F1.1細胞からの
SCMは、初代骨髄間質細胞からのSCMと同等またはそれ以上にヒトCB C
D34+38−細胞の維持を支持できることが分かった。14F1.1 SCM
の最大効果は、常に、初代骨髄SCMよりも低い濃度で見られた。さらに、3D
SCMは、ヒトCB CD34+38−細胞の増加を支持する上で、どちらの
細胞型の2D SCMよりも優れていることが分かった。2Dと3D SCMの
間における活性の違いは、培養期間が長いほど(14日対21日)はっきりした
。14F1.1 3D SCMをヒトCB CD34+細胞に加えても、培地の
みを含む対照培養と較べると、CD34+38−CXCR4+細胞が維持される
結果になった(表2)。
ンの効果を示している。この結果は、CD34+38−、およびより重要なこと
には、CD34+38−CXCR4+(SRC)サブセットの両方を維持する上
で、3D SCMが2D SCMよりも優れていることを示している。
細胞分化に対する効果が強かったことと関連するのかもしれない。TPO+FL
T3リガンドは、2D SCM存在下ではCD34+38−/CD34+38−
CXCR4+の収率を低下させたが、3D SCMを添加した培地での収率を上
昇させた。CD34+表面マーカーによって測定したところ、これもまた、3D
装置における分化の程度が低いことに起因するのかもしれない。2D SCMお
よび3D SCMの両培養において、SCFは、幹細胞分化の顕著な増加と、C
D34+38−/CD34+38−CXCR4+の収量の顕著な低下を引き起こ
した。
るため、間質細胞(14F1.1)で被覆した担体上でのCD34+38−細胞
の維持/増加を最初に評価した。担体をバイオリアクターから取り出して、シリ
コン被覆した96穴プレートに入れ、CD34+細胞を加えた。対照は、担体の
みを含み、担体と同数の単層14F1.1細胞を含んでいた。図7に示すように
、CD34+38−細胞の生存は、担体のみの存在下で促進され、3D構造物が
、初期前駆細胞(36)の生存/維持に有益な効果を与えることが確認された。
間質細胞で被覆された担体は、CD34+38−細胞の7日後の生存/維持を促
進するときに、担体のみ、または単層14F1.1細胞よりも優れていた。長期
培養(14日目)は、14F1.1単層と14F1.1被覆担体の両培養におい
て、CD34+38−数の増加をもたらした。
リアクター中の、350mlの循環する培養培地に、6×106個のプールした
CB CD34+(3×105のCD34+38−)を播種した。16時間培地
の流れを停止させ、その後、正常な速さ(1ml/分)で培養を続けた。培養4
日目に、回収した生細胞をFACS解析したところ、循環培地には、最初に播種
したCD34+38−細胞の10%が含まれていた。培養18日目には、循環培
地には、CD34+38−細胞の0.4%が含まれていたが、担体に接着した細
胞は、最初に播種したCD34+38−集団の3%を含んでいた。
が可能であることは当業者にとって明らかなことである。したがって、本明細書
に添付した請求の範囲の精神と広範な範囲に含まれる限り、そのような代替、改
変、変更も本発明に含まれるものである。本明細書で引用した刊行物のすべてを
、全文、参照して組み込む。本願で引用または確認した参考文献を、それらの文
献が、本発明の先行技術として利用できるものとして許可していると解してはな
らない。
たものである。
を示している。
図b)の走査式電子顕微鏡写真(SEM)である。
示している。
Claims (99)
- 【請求項1】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する方法に
おいて、 (a)未分化の造血幹細胞または前駆細胞を得る工程、および (b)上記未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、生理学的に許容できる3次
元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体
の上に3次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアクター
の中に播いて、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する工程を含む
方法。 - 【請求項2】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞が、臍帯血、動員された
末梢血、および骨髄からなるグループより選択された組織から単離された細胞で
ある、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の
間質細胞が、共通のHLA抗原をもつ、請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の
間質細胞が、単一個体に由来する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項5】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の
間質細胞が、異なった個体に由来する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項6】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の
間質細胞が、同一種に由来する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養の
間質細胞が、異種に由来する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項8】 間質細胞培養の間質細胞が、担体1立方センチメートルあた
り少なくとも5×106細胞という密度にまで増殖している、請求項1に記載の
方法。 - 【請求項9】 間質細胞培養の間質細胞が、担体1立方センチメートルあた
り少なくとも107細胞という密度にまで増殖している、請求項1に記載の方法
。 - 【請求項10】 固定相栓流バイオリアクターの中に未分化の造血幹細胞ま
たは前駆細胞を播く工程が行われてから少なくとも10時間該バイオリアクター
の中の流れが停止される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項11】 繊維の孔が、全容量に対する割合にして40%から95%
を構成し、孔の大きさが10ミクロンから100ミクロンである、請求項1に記
載の方法。 - 【請求項12】 マトリックスが、直径または幅が0.5ミクロンから50
ミクロンである、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維
からなるグループより選択された繊維からできている、請求項1に記載の方法。 - 【請求項13】 マトリックスが、幅2ミクロンから20ミクロン、繊維の
厚さに対する幅の割合が少なくとも2:1であるリボン状繊維から構成されてい
る、請求項1に記載の方法。 - 【請求項14】 マトリックスが、全容量に対する割合が60%から95%
の孔容量をもつ、請求項1に記載の方法。 - 【請求項15】 マトリックスの高さが50〜1000μmである、請求項
1に記載の方法。 - 【請求項16】 マトリックスの材料が、ポリエステル、ポリアルキレン、
ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、
酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループよ
り選択される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項17】 マトリックスが、四角形、リング形、円盤形、および十字
形からなるグループより選択される、請求項1に記載の方法。 - 【請求項18】 マトリックスが円盤の形をしている、請求項1に記載の方
法。 - 【請求項19】 マトリックスがポリ−D−リジンで被覆されている、請求
項1に記載の方法。 - 【請求項20】 さらに、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を単離する工
程を含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項21】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する方法
において、 (a)未分化の造血幹細胞または前駆細胞を得る工程、および (b)上記未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、生理学的に許容できる3次
元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体
の上に3次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアクター
から得られた間質細胞馴化培地を含む培地の中で培養する工程を含む方法。 - 【請求項22】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞が、臍帯血、動員され
た末梢血、および骨髄からなるグループより選択された組織から単離された細胞
である、請求項21に記載の方法。 - 【請求項23】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養
の間質細胞が、共通のHLA抗原をもつ、請求項21に記載の方法。 - 【請求項24】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養
の間質細胞が、単一個体に由来する、請求項21に記載の方法。 - 【請求項25】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養
の間質細胞が、異なった個体に由来する、請求項21に記載の方法。 - 【請求項26】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養
の間質細胞が、同種に由来する、請求項21に記載の方法。 - 【請求項27】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養
の間質細胞が、異種に由来する、請求項21に記載の方法。 - 【請求項28】 間質細胞培養の間質細胞が、担体1立方センチメートルあ
たり少なくとも5×106細胞という密度にまで増殖している、請求項21に記
載の方法。 - 【請求項29】 間質細胞培養の間質細胞が、担体1立方センチメートルあ
たり少なくとも107細胞という密度にまで増殖している、請求項21に記載の
方法。 - 【請求項30】 繊維の孔が、全容量に対する割合にして40%から95%
を構成し、孔の大きさが10ミクロンから100ミクロンである、請求項21に
記載の方法。 - 【請求項31】 マトリックスが、直径または幅が0.5ミクロンから50
ミクロンである、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維
からなるグループより選択された繊維からできている、請求項21に記載の方法
。 - 【請求項32】 マトリックスが、幅2ミクロンから20ミクロン、繊維の
厚さに対する幅の割合が少なくとも2:1であるリボン状繊維から構成されてい
る、請求項21に記載の方法。 - 【請求項33】 マトリックスが、全容量に対する割合が60%から95%
の孔容量をもつ、請求項21に記載の方法。 - 【請求項34】 マトリックスの高さが50〜1000μmである、請求項
21に記載の方法。 - 【請求項35】 マトリックスの材料が、ポリエステル、ポリアルキレン、
ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、
酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループよ
り選択される、請求項21に記載の方法。 - 【請求項36】 マトリックスが、四角形、リング形、円盤形、および十字
形からなるグループより選択される、請求項21に記載の方法。 - 【請求項37】 マトリックスが円盤の形をしている、請求項21に記載の
方法。 - 【請求項38】 マトリックスがポリ−D−リジンで被覆されている、請求
項21に記載の方法。 - 【請求項39】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する上で
有用な間質細胞馴化培地を調製する方法において、 (a)固定相栓流バイオリアクターの中で、生理学的に許容できる3次元の繊
維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状担体の上に
間質細胞培養を樹立して、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する
工程、および (b)所望の間質細胞密度に達したら、該固定相栓流バイオリアクターから培
地を回収して、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する上で有用な
間質細胞馴化培地を得る工程を含む方法。 - 【請求項40】 間質細胞培養の間質細胞が、担体1立方センチメートルあ
たり少なくとも5×106細胞という密度にまで増殖している、請求項39に記
載の方法。 - 【請求項41】 間質細胞培養の間質細胞が、担体1立方センチメートルあ
たり少なくとも107細胞という密度にまで増殖している、請求項39に記載の
方法。 - 【請求項42】 繊維の孔が、全容量に対する割合にして40%から95%
を構成し、孔の大きさが10ミクロンから100ミクロンである、請求項39に
記載の方法。 - 【請求項43】 マトリックスが、直径または幅が0.5ミクロンから50
ミクロンである、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維
からなるグループより選択された繊維からできている、請求項39に記載の方法
。 - 【請求項44】 マトリックスが、幅2ミクロンから20ミクロン、繊維の
厚さに対する幅の割合が少なくとも2:1であるリボン状繊維から構成されてい
る、請求項39に記載の方法。 - 【請求項45】 マトリックスが、全容量に対する割合が60%から95%
の孔容量をもつ、請求項39に記載の方法。 - 【請求項46】 マトリックスの高さが50〜1000μmである、請求項
39に記載の方法。 - 【請求項47】 マトリックスの材料が、ポリエステル、ポリアルキレン、
ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、
酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループよ
り選択される、請求項39に記載の方法。 - 【請求項48】 マトリックスが、四角形、リング形、円盤形、および十字
形からなるグループより選択される、請求項39に記載の方法。 - 【請求項49】 マトリックスが円盤の形をしている、請求項39に記載の
方法。 - 【請求項50】 マトリックスがポリ−D−リジンで被覆されている、請求
項39に記載の方法。 - 【請求項51】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞をレシピエントに移植
する方法において、 (a) (i)未分化の造血幹細胞または前駆細胞を得ること、および (ii)上記未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、生理学的に許容できる
3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状
担体の上に3次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアク
ターの中に播いて、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持することに
よって、未分化の造血幹細胞または前駆細胞を増加/維持する工程、および (b)工程(a)で得られた未分化の造血幹細胞または前駆細胞をレシピエン
トに移植する工程を含む方法。 - 【請求項52】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞が、臍帯血、動員され
た末梢血、および骨髄からなるグループより選択された組織から単離された細胞
である、請求項51に記載の方法。 - 【請求項53】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養
の間質細胞が、共通のHLA抗原をもつ、請求項51に記載の方法。 - 【請求項54】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養
の間質細胞が、単一個体に由来する、請求項51に記載の方法。 - 【請求項55】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養
の間質細胞が、異なった個体に由来する、請求項51に記載の方法。 - 【請求項56】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養
の間質細胞が、同種に由来する、請求項51に記載の方法。 - 【請求項57】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養
の間質細胞が、異種に由来する、請求項51に記載の方法。 - 【請求項58】 間質細胞培養の間質細胞が、担体1立方センチメートルあ
たり少なくとも5×106細胞という密度にまで増殖している、請求項51に記
載の方法。 - 【請求項59】 間質細胞培養の間質細胞が、担体1立方センチメートルあ
たり少なくとも107細胞という密度にまで増殖している、請求項51に記載の
方法。 - 【請求項60】 固定相栓流バイオリアクターの中に未分化の造血幹細胞ま
たは前駆細胞を播く工程が行われてから少なくとも10時間該バイオリアクター
の中の流れが停止される、請求項51に記載の方法。 - 【請求項61】 繊維の孔が、全容量に対する割合にして40%から95%
を構成し、孔の大きさが10ミクロンから100ミクロンである、請求項51に
記載の方法。 - 【請求項62】 マトリックスが、直径または幅が0.5ミクロンから50
ミクロンである、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維
からなるグループより選択された繊維からできている、請求項51に記載の方法
。 - 【請求項63】 マトリックスが、幅2ミクロンから20ミクロン、繊維の
厚さに対する幅の割合が少なくとも2:1であるリボン状繊維から構成されてい
る、請求項51に記載の方法。 - 【請求項64】 マトリックスが、全容量に対する割合が60%から95%
の孔容量をもつ、請求項51に記載の方法。 - 【請求項65】 マトリックスの高さが50〜1000μmである、請求項
51に記載の方法。 - 【請求項66】 マトリックスの材料が、ポリエステル、ポリアルキレン、
ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、
酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループよ
り選択される、請求項51に記載の方法。 - 【請求項67】 マトリックスが、四角形、リング形、円盤形、および十字
形からなるグループより選択される、請求項51に記載の方法。 - 【請求項68】 マトリックスが円盤の形をしている、請求項51に記載の
方法。 - 【請求項69】 マトリックスがポリ−D−リジンで被覆されている、請求
項51に記載の方法。 - 【請求項70】 さらに、工程(b)の前に、未分化の造血幹細胞または前
駆細胞を単離する工程を含む、請求項51に記載の方法。 - 【請求項71】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞をレシピエントに移植
する方法において、 (a) (i)未分化の造血幹細胞または前駆細胞を得ること、および (ii)上記未分化の造血幹細胞または前駆細胞を、生理学的に許容できる
3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含むシート状
担体の上に3次元の間質細胞培養が予め樹立されている固定相栓流バイオリアク
ターから得られた間質細胞馴化培地を含む培地の中で培養して、未分化の造血幹
細胞または前駆細胞を増加/維持することによって、未分化の造血幹細胞または
前駆細胞を増加/維持する工程を含む方法。 - 【請求項72】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞が、臍帯血、動員され
た末梢血、および骨髄からなるグループより選択された組織から単離された細胞
である、請求項71に記載の方法。 - 【請求項73】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養
の間質細胞が、共通のHLA抗原をもつ、請求項71に記載の方法。 - 【請求項74】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養
の間質細胞が、単一個体に由来する、請求項71に記載の方法。 - 【請求項75】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養
の間質細胞が、異なった個体に由来する、請求項71に記載の方法。 - 【請求項76】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養
の間質細胞が、同種に由来する、請求項71に記載の方法。 - 【請求項77】 未分化の造血幹細胞または前駆細胞、および間質細胞培養
の間質細胞が、異種に由来する、請求項71に記載の方法。 - 【請求項78】 間質細胞培養の間質細胞が、担体1立方センチメートルあ
たり少なくとも5×106細胞という密度にまで増殖している、請求項71に記
載の方法。 - 【請求項79】 間質細胞培養の間質細胞が、担体1立方センチメートルあ
たり少なくとも107細胞という密度にまで増殖している、請求項71に記載の
方法。 - 【請求項80】 繊維の孔が、全容量に対する割合にして40%から95%
を構成し、孔の大きさが10ミクロンから100ミクロンである、請求項71に
記載の方法。 - 【請求項81】 マトリックスが、直径または幅が0.5ミクロンから50
ミクロンである、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維
からなるグループより選択された繊維からできている、請求項71に記載の方法
。 - 【請求項82】 マトリックスが、幅2ミクロンから20ミクロン、繊維の
厚さに対する幅の割合が少なくとも2:1であるリボン状繊維から構成されてい
る、請求項71に記載の方法。 - 【請求項83】 マトリックスが、全容量に対する割合が60%から95%
の孔容量をもつ、請求項71に記載の方法。 - 【請求項84】 マトリックスの高さが50〜1000μmである、請求項
71に記載の方法。 - 【請求項85】 マトリックスの材料が、ポリエステル、ポリアルキレン、
ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、
酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループよ
り選択される、請求項71に記載の方法。 - 【請求項86】 マトリックスが、四角形、リング形、円盤形、および十字
形からなるグループより選択される、請求項71に記載の方法。 - 【請求項87】 マトリックスが円盤の形をしている、請求項71に記載の
方法。 - 【請求項88】 マトリックスがポリ−D−リジンで被覆されている、請求
項71に記載の方法。 - 【請求項89】 入り口と出口をもつ容器で、その中に生理学的に許容でき
る3次元の繊維ネットワークを形成している不織繊維マトリックスを含み、担体
1立方センチメートルあたり少なくとも5×106個の間質細胞を支持している
シート状担体を含む容器を含むバイオリアクタープラグ。 - 【請求項90】 繊維の孔が、全容量に対する割合にして40%から95%
を構成し、孔の大きさが10ミクロンから100ミクロンである、請求項89に
記載のバイオリアクター。 - 【請求項91】 マトリックスが、直径または幅が0.5ミクロンから50
ミクロンである、へん平繊維、非丸形繊維、中空繊維、およびそれらの混合繊維
からなるグループより選択された繊維からできている、請求項89に記載のバイ
オリアクター。 - 【請求項92】 マトリックスが、幅2ミクロンから20ミクロン、繊維の
厚さに対する幅の割合が少なくとも2:1であるリボン状繊維から構成されてい
る、請求項89に記載のバイオリアクター。 - 【請求項93】 マトリックスが、全容量に対する割合が60%から95%
の孔容量をもつ、請求項89に記載のバイオリアクター。 - 【請求項94】 マトリックスの高さが50〜1000μmである、請求項
89に記載のバイオリアクター。 - 【請求項95】 マトリックスの材料が、ポリエステル、ポリアルキレン、
ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、ポリスルホン、
酢酸セルロース、ガラスファイバー、および不活性金属繊維からなるグループよ
り選択される、請求項89に記載のバイオリアクター。 - 【請求項96】 マトリックスが、四角形、リング形、円盤形、および十字
形からなるグループより選択される、請求項89に記載のバイオリアクター。 - 【請求項97】 マトリックスが円盤の形をしている、請求項89に記載の
バイオリアクター。 - 【請求項98】 マトリックスがポリ−D−リジンで被覆されている、請求
項89に記載のバイオリアクター。 - 【請求項99】請求項89に記載のバイオリアクタープラグを含む栓流バイ
オリアクター。
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