CN117384830A - 高效制备无异源成分iPSCs的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效制备无异源成分iPSCs的方法，涉及生物技术领域。本发明提供的高效制备无异源成分iPSCs的方法，包括：将经红系细胞扩增培养后的单个核细胞进行电转重编程，然后于iMatrix‑511或iMatrix‑511MG包被的培养容器中培养，介导iPSCs克隆的形成；将获得的iPSCs转移至Vitronectin‑XF或Vitronectin‑N包被的培养容器中进行扩增培养，获得iPS细胞库。该方法充分发挥了iMatrix‑511和Vitronectin基质的优势，更高效的实现了无异源成分iPSCs的制备。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种高效制备无异源成分iPSCs的方法。
背景技术
诱导多能干细胞(iPSCs)是通过向体细胞内转入重编程因子而转变成的干细胞，具有与胚胎干细胞(ESCs)类似的无限增值和分化成三个胚层所有细胞的能力。iPSCs能有效地规避胚胎干细胞存在的伦理问题和异体移植免疫排斥的问题，是药物筛选和细胞替代治疗的理想细胞来源，目前hiPSCs来源的产品已经用于临床治疗。
小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)是适用于小鼠或人胚胎干细胞及诱导多能干细胞的饲养层细胞，能产生抑制胚胎干细胞自主分化和促进胚胎干细胞增殖的因子，能够有效促进细胞的增殖并维持其未分化的特性和多能性。但是该饲养层培养法需对MEF细胞传代培养并使用丝裂霉素处理，存在步骤繁琐、工作量大、MEF细胞等异源成分残留的问题，难以达到临床应用的要求，因此简单易行的无饲养层培养法更为实用。
人多能干细胞在无饲养层培养体系下需要额外添加细胞外基质才能贴壁生长。(MAT)是一种从小鼠Englebreth-Holm-Swarm骨肉瘤(一种富含细胞外基质蛋白的肿瘤)中提取的可溶性基底膜制剂，新鲜提取的Matrigel中主要包括层粘连蛋白、IV型胶原、巢蛋白、基底膜聚糖、表皮生长因子、类胰岛素生长因子及其他生长因子等成分。以Matrigel作为iPS细胞重编程后的细胞培养底物，可以减少对饲养细胞的需求，有效地支持人多能干细胞的长期增殖。但Matrigel是成分复杂的混合物，且存在不明确成分，其潜在的异源成分对iPSCs的临床应用存在一定的风险。
玻连蛋白(Vitronectin)是一种结构蛋白，可在细胞外基质中形成纤维状网络结构，参与细胞外基质与细胞内骨架的连接，对细胞的粘附、迁移、增殖、分化等过程发挥重要作用，加入Vitronectin可以显著提高iPS细胞的生长速率和维持多能性的能力。STEMCELLTechnologies的人重组玻连蛋白Vitronectin XFTM(VTN)是一个成分单一且明确的，无异源成分的细胞培养基质，可以在无血清无饲养层的条件下支持人多能干细胞的生长，可以有效地替代Matrigel基质胶。
层粘连蛋白(laminin)是存在于动物基底膜的一种细胞外基质，通过与细胞表面受体α6β1整合素结合，有助于人多能干细胞的生长和维持。MATRIXOME公司的iMatrix-511(i511)是通过CHO-S细胞表达系统高度纯化精制而成的人层粘连蛋白511-E8片段的重组蛋白，含有laminin-511的整合素结合位点，具有整合蛋白连接功能，可以促进各种细胞粘附和伸展。iMatrix-511相比较全长型laminin、vitronectin和Matrigel，具有更强的粘连作用和贴壁特性。iMatrix-511是一种改进型的干细胞培养基质，成分单一且明确的，为干细胞培养提供了一种无异源成分的培养环境，并且允许在不含饲养层的情况下使用。除此之外，iMatrix-511MG，是根据日本独立行政法人医药品医疗器械综合机构(PMDA)的建议来进行生产，符合生物原料的标准，在基础研究中运用的iMatrix-511系列，可平稳过渡到临床应用。
然而，饲养层细胞MEF和Matrigel能为干细胞体外扩增提供适宜的培养条件，但是其异源成分的残留制约了干细胞的临床转化应用；Vitronectin XF培养制备iPSCs的效率低。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效制备无异源成分iPSCs的方法，以解决上述问题中的至少一种。
第一方面，本发明提供了一种高效制备无异源成分iPSCs的方法，包括以下步骤：
a.将经红系细胞扩增培养后的单个核细胞进行电转重编程，然后于iMatrix-511或iMatrix-511 MG包被的培养容器中培养，介导iPSCs克隆的形成；
b.将a步骤获得的iPSCs于Vitronectin-XF或Vitronectin-N包被的培养容器中进行扩增培养，获得iPS细胞库。
作为进一步技术方案，经红系细胞扩增培养后的单个核细胞的CD71+≥95％且CD3+<1％且CD19+<1％。
作为进一步技术方案，所述电转重编程为向单个核细胞中转入表达Yamanaka重编程因子的EBNA1/oriP载体。
作为进一步技术方案，所述iMatrix-511或iMatrix-511 MG的包被密度为0.1-1.0μg/cm2。
作为进一步技术方案，a步骤中，培养容器中培养所用的培养基包括Essential 8完全培养基(E8完全培养基)、mTeSR 1、mTeSR E8或NutriStem hPSC XF完全培养基；
优选地，a步骤中，培养所用的培养基为含有丁酸钠的培养基；
优选地，所述丁酸钠的工作浓度为0.2-0.3mM。
作为进一步技术方案，b步骤中，将a步骤获得的iPSCs在iMatrix-511或iMatrix-511 MG包被的培养容器中进行传代扩增培养1-3代，然后再于Vitronectin-XF或Vitronectin-N包被的培养容器中进行扩增培养。
作为进一步技术方案，所述Vitronectin-XF或Vitronectin-N的包被密度为0.8-1.2μg/cm2。
作为进一步技术方案，b步骤中，扩增培养所用的培养基包括Essential8完全培养基、mTeSR 1、mTeSR E8或NutriStem hPSC XF完全培养基。
作为进一步技术方案，b步骤中，扩增接种时，所用的培养基为含有Y27632或CEPT的培养基，培养18-24h后更换不含Y27632或CEPT的培养基；
优选地，所述Y27632的浓度为8-12μM。
作为进一步技术方案，所述单个核细胞的来源包括脐带血、外周血、间充质干细胞、皮肤成纤维细胞或脂肪来源的基质细胞。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了的高效制备无异源成分iPSCs的方法，采用iMatrix-511或iMatrix-511 MG基质介导iPSCs克隆的形成，采用Vitronectin-XF或Vitronectin-N基质进行扩增培养，该方法充分发挥了iMatrix-511和Vitronectin基质的优势，更高效的实现了无异源成分iPSCs的制备。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为重编程后的细胞在MEF、Matrigel、Vitronectin XF和iMatrix-511四种培养基质上成长起来的iPSCs集落；
图2为试验例3中不同基质上扩增培养的时长；
图3为Matrigel、Vitronectin XF和iMatrix-511基质上成长起来的克隆形态；
图4为对重编程后iMatrix-511基质上成长起来的iPSCs克隆分别挑取至iMatrix-511或者Vitronectin-XF基质上的克隆直径和存活率的统计；
图5为P3代成长三天后的成像；
图6为实施例1提供的iPSCs的制备流程图。
具体实施方式
下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，本发明中“工作浓度”是指细胞培养时，该培养体系中某物质的终浓度。本发明中，iPS细胞库是指将iPS大规模的建库。
第一方面，本发明提供了一种高效制备无异源成分iPSCs的方法，包括以下步骤：
a.将经红系细胞扩增培养后的单个核细胞进行电转重编程，然后于iMatrix-511或iMatrix-511 MG包被的培养容器中培养，介导iPSCs克隆的形成；
b.将a步骤获得的iPSCs于Vitronectin-XF或Vitronectin-N包被的培养容器中进行扩增培养，获得iPS细胞库。
经发明人研究发现，相比于MEF和Matrigel，Vitronectin XF(或Vitronectin-N)和iMatrix-511(或iMatrix-511 MG)基质成分明确且无异源成分污染，预铺基质操作简单。相比于MEF、Matrigel和iMatrix-511，培养在Vitronectin XF上的iPSCs表现出最好细胞形态，克隆致密，细胞核质比高，形态均一，边缘清晰立体。但使用Vitronectin XF基质介导重编程后iPS单克隆形成时，由于其粘附性较低，导致重编程效率很低，不能够满足一般iPSCs单克隆建库对克隆数量的需求。而iMatrix-511基质比Vitronectin XF基质具有更高的黏附作用，重编程后使用iMatrix-511基质单克隆形成率高，能获得满足建库需求的克隆株数。但是iMatrix-511的高黏附作用使其不便于iPSCs大体积培养时的消化和传代，表现出消化困难，消化不充分的特性，而培养在Vitronectin XF上的iPSCs易于消化和传代。因而，本发明采用iMatrix-511与Vitronectin XF结合使用的方法构建iPSCs库，解决了二者在构建iPSCs库时的缺点，提高iPSCs库的规模与质量。
在一些可选的实施方式中，经红系细胞扩增培养后的单个核细胞的CD71+≥95％且CD3+<1％且CD19+<1％。
通过有培养使得单个核细胞成长为最适于重编程的细胞。
在一些可选的实施方式中，所述电转重编程为向单个核细胞中转入表达Yamanaka重编程因子的EBNA1/oriP载体。
在一些可选的实施方式中，所述iMatrix-511或iMatrix-511 MG的包被密度例如可以为，但不限于0.1μg/cm2、0.3μg/cm2、0.5μg/cm2、0.75μg/cm2或1μg/cm2。
在一些可选的实施方式中，a步骤中，培养容器中培养所用的培养基包括Essential 8完全培养基、mTeSR 1、mTeSR E8或NutriStem hPSC XF完全培养基；
优选地，a步骤中，培养所用的培养基为含有丁酸钠的培养基；
优选地，所述丁酸钠的工作浓度例如可以为，但不限于0.2mM、0.25mM或0.3mM。
经发明人研究发现，适宜浓度的丁酸钠有助于促进iPSCs克隆的形成。
在一些可选的实施方式中，b步骤中，将a步骤获得的iPSCs在iMatrix-511或iMatrix-511 MG包被的培养容器中进行传代扩增培养1-3代，然后再于Vitronectin-XF或Vitronectin-N包被的培养容器中进行扩增培养。
经发明人研究发现，a步骤获得的iPSCs细胞数量较少，克隆仍处于并不太稳定的状态，Vitronectin XF的低黏附作用并不能最好的将克隆维持培养下去，会损失一小部分的克隆，因此优选将a步骤获得的iPSCs先于iMatrix-511或iMatrix-511 MG包被的培养容器中初步传代扩增，然后再于Vitronectin-XF或Vitronectin-N包被的培养容器中进行扩增培养，有助于提供iPSCs的制备效率。
在一些可选的实施方式中，所述Vitronectin-XF或Vitronectin-N的包被密度例如可以为，但不限于0.8μg/cm2、0.9μg/cm2、1μg/cm2、1.1μg/cm2或1.2μg/cm2。
在一些可选的实施方式中，使用CellAdhereTM Dilution Buffer稀释VitronectinXF或Vitronectin-N，然后转入培养容器中静置，弃上清后完成Vitronectin XF或Vitronectin-N的包被。
在一些可选的实施方式中，b步骤中，扩增培养所用的培养基包括Essential 8完全培养基、mTeSR 1、mTeSR E8或NutriStem hPSC XF完全培养基。
在一些可选的实施方式中，b步骤中，扩增接种时，所用的培养基为含有Y27632或CEPT的培养基，培养18-24h后更换不含Y27632或CEPT的培养基；
CEPT是美国国立卫生研究院(NIH)开发的小分子混合物。由4种成分组成，并取其组成成分(Chroman 1、Emricasan、Polyamines、Trans-ISRIB)的开头字母命名为“CEPT”。
研究表明，CEPT可防止人ES/iPS细胞(人多能干细胞；hPSCs)在细胞传代中的细胞应激和DNA损伤。与强效ROCK抑制剂Y27632相似，可提高细胞传代和冻存时hPSCs的存活率。
优选地，所述Y27632的浓度例如可以为，但不限于8μM、9μM、10μM、11μM或12μM。
CEPT可购买于GLP Bio、MCE或wako公司。本发明中培养基中CEPT的用量例如可以为Chroman 1工作浓度为50nM，Emricasan工作浓度为5μM，Trans-ISRIB工作浓度为0.7μM，1,000×Polyamine Solution 1：1000使用。
在一些可选的实施方式中，所述单个核细胞的来源包括但不限于脐带血、外周血、间充质干细胞、皮肤成纤维细胞或脂肪来源的基质细胞。
下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1
iPSCs的制备方法，如图6所示。
1.CBMC诱导培养及重编程
使用新鲜脐带血、冻存脐带血或外周血作为起始材料，使用Ficoll密度梯度离心法分离其中的单个核细胞，然后进行红系祖细胞诱导培养，使其成长为最适于重编程的细胞。对以上经红系诱导培养以后且达到标准(CD71+>95％，CD3+和CD19+<1％)的细胞进行电转重编程。重编程使用Lonza 4D电转仪，向细胞内转入表达Yamanaka重编程因子的非整合型附加体质粒(EBNA1/oriP载体)。
2.iPSCs单克隆的形成
1)以0.5μg/cm2 iMatrix-511密度包被6孔板，即使用2mL DPBS稀释9.6μLiMatrix-511(0.5mg/mL)，温和混匀后立即转入6孔板的一个孔中，水平摇匀且室温静置一个小时后弃去上清即可使用。
2)将以上电转后的细胞，使用原培养液轻柔重悬后，直接接种在预铺iMatrix-511基质的6孔板中，温和混匀，静置在37℃，5％CO2，20％O2培养箱中，记为第0天。
3)48小时后，即第2天，一方面，轻柔收集iPSCs培养液上清，300g离心5min，弃去离心后的培养上清，使用1mL E8完全培养基重悬细胞沉淀，接入原6孔板中；另一方面，在吸取iPSCs培养上清后，立即温和地向原6孔板中加入1mL原红系诱导培养液，避免已经贴壁的iPSCs由于干燥缺水而死去。将细胞转移至37℃，低氧(5％CO2，3％O2，92％N2)培养箱中培养24小时。
4)第3天时，吸弃以上iPSCs培养液1.5mL，温和地加入2mLE8完全培养基。将细胞放置在37℃，低氧(5％CO2，3％O2，92％N2)培养箱中培养48小时。
5)第5天时，吸弃以上iPSCs培养液，温和地加入2mL新鲜含0.25mM丁酸钠的E8完全培养基。继续在37℃，低氧(5％CO2，3％O2，92％N2)培养箱中培养。
6)以后每天更换2mL新鲜含0.25mM丁酸钠的E8完全培养基。继续在37℃，低氧(5％CO2，3％O2，92％N2)培养箱中培养，直至克隆完全形成，平均直径大约在500μm左右。
3.单克隆的挑取
1)以0.5μg/cm2 iMatrix-511密度包被24孔板，即使用0.5mL DPBS稀释2.4μLiMatrix-511(0.5mg/mL)，温和混匀后立即转入24孔板的一个孔中，水平摇匀且室温静置一个小时后弃去上清即可使用。
2)在显微镜下确定需要挑取的克隆，给克隆拍照编号后，进行挑取。尽量选取周边没有杂细胞的独立单个圆形克隆。使用10微升的微量移液器，接10微升的白色吸头。在显微镜下小心地将所要挑取地克隆周围地杂质细胞刮掉。更换新的白色吸头后，沿着克隆边缘开始，使用吸头刮取克隆，同时将剥离下来地克隆吸走并转移至预包被iMatrix-511的24孔板中。使用含10μM Y27632的E8完全培养基培养转移至24孔板中的单克隆。此时记为P1代克隆。每天更换新鲜的E8完全培养基，等待克隆长大但又未出现堆叠生长之前，进行传代扩增。
4.单克隆的扩增培养
1)以0.5μg/cm2 iMatrix-511密度包被12孔板和6孔板，使用1mL DPBS稀释4.8μLiMatrix-511(0.5mg/mL)，温和混匀后立即转入12孔板的一个孔中；6孔板包被iMatrix-511的用量同上。水平摇匀且室温静置一个小时后弃去上清即可使用。
2)弃去培养液，使用1×DPBS清洗细胞，加入500μL，0.5mM EDTA，置于37℃细胞培养箱消化6分钟。吸弃消化液，使用含10μM Y27632的E8完全培养基吹打克隆，并转移至预包被iMatrix-511的12孔或6孔板中，于37℃，5％CO2，20％O2培养箱中静置培养。此时记为P2代克隆。每天更换新鲜的E8完全培养基，等待克隆长大但又未出现堆叠生长之前，进行传代扩增。
3)以10μg/mL Vitronectin XFTM密度包被T25细胞培养瓶，即使用3mLCellAdhereTM Dilution Buffer稀释120μL Vitronectin XFTM，温和混匀后立即转入一个T25瓶中，水平摇匀且室温静置一个小时后弃去上清即可使用。
4)弃去培养液，使用1×DPBS清洗细胞，加入1mL，0.5mM EDTA，置于37℃细胞培养箱消化6分钟。吸弃消化液，使用含10μM Y27632的E8完全培养基吹打克隆，并转移至预包被Vitronectin XFTM的T25瓶中，于37℃，5％CO2，20％O2培养箱中静置培养。此时记为P3代克隆。每天更换新鲜的E8完全培养基，等待克隆融合度达到60％-70％时，进行传代扩增。
5)以同样的方法进行消化和传代扩增，细胞均在Vitronectin XF基质上维持培养。收获P6代和P9代的克隆分别作为原始细胞库和主细胞进行冻存，并进行多能性和安全性的检测。
对比例1
一种iPSCs的制备方法，与实施例1的区别在于将Vitronectin XF和iMatrix-511基质替换为MEF。
对比例2
一种iPSCs的制备方法，与实施例1的区别在于将Vitronectin XF和iMatrix-511基质替换为Matrigel。
对比例3
一种iPSCs的制备方法，与实施例1的区别在于将iMatrix-511基质替换为Vitronectin XF(包被密度为10μg/mL)。
对比例4
一种iPSCs的制备方法，与实施例1的区别在于将Vitronectin XF基质替换为iMatrix-511(包被密度为0.5μg/cm2)。
试验例1
图1为重编程后的细胞在MEF、Matrigel(MAT)、Vitronectin XF(VTN)和iMatrix-511(i511)四种培养基质上成长起来的iPSCs集落，经碱性磷酸酶染色后的形态，图中的点(染色后为紫红色)即为碱性磷酸酶着色的克隆。
从图1中可以看出，使用MEF、Matrigel、Vitronectin XF和iMatrix-511四种不同的干细胞培养基质介导克隆的形成时，饲养层细胞MEF上生长起来的单克隆数量最多。Matrigel基质上的成长起来的单克隆数量略高于iMatrix-511基质。而使用VitronectinXF基质介导克隆形成时，得到的单克隆数量极少，不能够满足建库对单克隆数量的需求。考虑使用MEF与Matrigel基质介导克隆的形成，会导致获得的iPSCs存在异源成分的残留而限制其后期的临床应用。所以，使用iMatrix-511基质介导克隆的形成是最优的选择。
试验例2
对对比例3-4中iMatrix-511基质和Vitronectin XF基质上生长的iPSCs进行消化研究。发现iMatrix-511比Vitronectin XF具有更强的黏附作用，这可能是其在介导克隆形成时具有更好的表现的原因。但是，在挑取单克隆以后，尤其是在克隆的大体积扩增时，使用0.5mM EDTA对iMatrix-511基质上生长的iPSCs难以消化，在T25小瓶中需要消化20到30分钟，并且需要进行多次吹打才能将部分的iPSCs从底板基质上剥离下来，这并不便于iPSCs的大规模建库操作。而Vitronectin XF基质上成长起来的克隆，使用0.5mM EDTA仅需消化5到6分钟，并且仅需轻轻拍打瓶身便能使绝大部分iPSCs从底板基质上脱落下来，这减少了对iPSCs造成的化学和机械损伤，也便于建库和生产操作。
试验例3
图2为对重编程后的细胞在MEF、Matrigel、Vitronectin XF和iMatrix-511四种培养基质上成长起来的iPSCs集落进行单克隆的挑取，分别在Matrigel、Matrigel、Vitronectin XF和iMatrix-511基质上进行后续的扩增培养，统计从单克隆挑取(记为P1)到第五代(P5)达到70～80％融合度时，一共经历的时长。
结果表明，对比四种基质上成长起来的iPSCs克隆，Vitronectin XF基质上的克隆生长速度最快，获得原始细胞库所需的天数最少。
试验例4
图3为Matrigel、Vitronectin XF和iMatrix-511基质板中成长起来的克隆形态。结果表明，对比Matrigel和iMatrix-511基质上成长起来的iPSCs克隆，Vitronectin XF基质上的克隆外表圆润光滑，克隆边缘立体清晰，细胞均一且致密，细胞核质比高，表现出最好的干细胞形态。
因此综合以上iMatrix-511和Vitronectin XF的优点，在构建iPSCs时，我们使用iMatrix-511作为介导重编程后克隆形成的基质，使用Vitronectin XF作为克隆扩增培养和建库用的基质。
试验例5
图4中左图为对重编程后iMatrix-511基质上成长起来的分别挑取至iMatrix-511或者Vitronectin-XF基质上的iPSCs克隆直径的统计；右图为对重编程后iMatrix-511基质上成长起来的iPSCs克隆分别挑取至iMatrix-511或者Vitronectin-XF基质上的存活率的统计。
如果在单克隆挑取时，就将iMatrix-511基质上成长起来的单克隆，转移至Vitronectin XF基质上时，由于此时的克隆含有的细胞总数较少，克隆仍处于并不太稳定的状态，Vitronectin XF的低黏附作用并不能最好的将克隆维持培养下去，会损失一小部分的克隆。如图所示4，尽管从iMatrix-511基质上挑取至Vitronectin XF的克隆直径较大，但是其P1代的单克隆存活率低于挑取至iMatrix-511基质，对于此时成长尚不稳定的单克隆，iMatrix-511基质是更优的培养基质。
将重编程后iMatrix-511基质上成长起来的iPSCs分别挑取至包被有iMatrix-511、iMatrix-511或者Vitronectin-XF基质的T25小瓶上，并在该基质上维持至P2融合度达到70～80％，分别在P3代时接种在包被有iMatrix-511、Vitronectin-XF或者Vitronectin-XF基质的T25小瓶上，在P3代成长三天后进行成像观察，结果如图5(图5中的左图为将iPSCs依次在iMatrix-511和iMatrix-511基质上培养的结果，图5中的中图为将iPSCs依次在iMatrix-511和Vitronectin-XF基质上培养的结果，图5中的左图为将iPSCs依次在Vitronectin-XF和Vitronectin-XF基质上培养的结果)所示。
由于iMatrix-511基质上的克隆难以消化在T25小瓶中才更加凸显，所以我们选择在接种至T25瓶时，将培养基质更换成Vitronectin XF。在P3代接种时，直接使用Vitronectin XF并未表出任何异常，克隆可以直接平稳地从iMatrix-511基质转入Vitronectin XF基质上培养。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种高效制备无异源成分iPSCs的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将经红系细胞扩增培养后的单个核细胞进行电转重编程，然后于iMatrix-511或iMatrix-511 MG包被的培养容器中培养，介导iPSCs克隆的形成；
b.将a步骤获得的iPSCs于Vitronectin-XF或Vitronectin-N包被的培养容器中进行扩增培养，获得iPS细胞库。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，经红系细胞扩增培养后的单个核细胞的CD71+≥95％且CD3+<1％且CD19+<1％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述电转重编程为向单个核细胞中转入表达Yamanaka重编程因子的EBNA1/oriP载体。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述iMatrix-511或iMatrix-511 MG的包被密度为0.1-1.0μg/cm2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，a步骤中，培养容器中培养所用的培养基包括Essential 8完全培养基、mTeSR 1、mTeSR E8或NutriStem hPSC XF完全培养基；
优选地，a步骤中，培养所用的培养基为含有丁酸钠的培养基；
优选地，所述丁酸钠的工作浓度为0.2-0.3mM。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，b步骤中，将a步骤获得的iPSCs在iMatrix-511或iMatrix-511 MG包被的培养容器中进行传代扩增培养1-3代，然后再于Vitronectin-XF或Vitronectin-N包被的培养容器中进行扩增培养。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Vitronectin-XF或Vitronectin-N的包被密度为0.8-1.2μg/cm2。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，b步骤中，扩增培养所用的培养基包括Essential 8完全培养基、mTeSR 1、mTeSR E8或NutriStem hPSC XF完全培养基。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，b步骤中，扩增接种时，所用的培养基为含有Y27632或CEPT的培养基，培养18-24h后更换不含Y27632或CEPT的培养基；
优选地，所述Y27632的浓度为8-12μM。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述单个核细胞的来源包括脐带血、外周血、间充质干细胞、皮肤成纤维细胞或脂肪来源的基质细胞。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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