CN107022526B - 一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法 - Google Patents

一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法，包括以下步骤：(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液的配制；(2)诱导培养基的配制；(3)hAMSCs的分离与原代培养；(4)hAMSCs的传代培养与扩增；(5)hAMSCs表型检测；(6)hAMSCs诱导分化。本发明提供的一种诱导hAMSCs向神经元样细胞分化的方法，能够在体外高效诱导hAMSCs向神经元样细胞分化。本发明的方法无需加用生长因子诱导，仅应用淫羊藿次苷Ⅱ即可诱导hAMSCs向神经元样细胞分化，是一种通过单分子诱导剂高效诱导hAMSCs分化为神经元样细胞的方法。本发明方法具有诱导hAMSCs向神经元样细胞分化率高的特点。

Description

一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法
技术领域
本发明涉及一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法，具体属于细胞工程技术领域。
背景技术
人羊膜间充质干细胞(humman amnion-derived mesenchymal stem cells，hAMSCs)是从娩出的胎盘附属物羊膜中分离而得，具有部分胚胎干细胞的特征，表达Oct4、Nanog、SOX2等胚性标志分子，可分化为三个胚层不同类型的细胞；且因来源丰富，原为废弃物，伦理争议小，羊膜中所含羊膜间充质干细胞数量级高，为再生医学的一种新细胞资源。研究表明，采用经典的体外诱导方案或移植到损伤的组织器官，hAMSCs不但可分化为心肌细胞、胰岛细胞、肝细胞及神经元细胞等，还具有免疫原性低、不表达CD80、CD86及HLA-DR等共刺激分子的优点，并可分泌多种活性因子，发挥免疫调节、抗炎、促进血管生成，改善微环境等作用，对肝肾损伤、心肌梗死、糖尿病及神经元退行性疾病和多种自身免疫性疾病等都具有明显治疗作用，具有诱人的临床应用前景。目前国内外报道了多种诱导hAMSCs向神经元样细胞分化的方法，诸如化学诱导法、细胞因子诱导法、细胞共培养法、中药诱导法等。这些方法都需要加用生长因子诱导。因此，研究一种通过单分子诱导剂能高效率诱导hAMSCs分化为神经元样细胞的方法，显得尤为必要。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法，能够在体外高效诱导hAMSCs向神经元样细胞分化。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法，包括以下步骤：(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液的配制；(2)诱导培养基的配制；(3)hAMSCs的分离与原代培养；(4)hAMSCs的传代培养与扩增；(5)hAMSCs表型检测；(6)hAMSCs诱导分化。
前述诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法中，步骤(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液的配制，具体为：取0.001g淫羊藿次苷Ⅱ和0.6mL～2mLDMSO，混匀后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷Ⅱ母液。
优选地，前述诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法中，取0.001g淫羊藿次苷Ⅱ和2mLDMSO，混匀后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷Ⅱ母液。
前述诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法中，步骤(2)诱导培养基的配制，具体为：取HG-DMEM加入淫羊藿次苷Ⅱ母液或淫羊藿次苷Ⅱ母液和DMSO配制成1μmol/L～10μmol/L含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基。
优选地，前述诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法中，取100mLHG-DMEM加入300μL淫羊藿次苷Ⅱ母液配制成3μmol/L含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基。
前述诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法中，步骤(3)hAMSCs的分离与原代培养，具体为：按照专利号为2011100809686的发明专利所述方法进行培养。本申请中分离和原代培养的方法，通过采用特定的酶消化浓度以及消化时间，使得hAMSCs的分离与原代培养效果最佳。
前述诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法中，步骤(4)hAMSCs的传代培养与扩增，具体为：待细胞长满培养瓶80％～90％，弃去培养基，用PBS清洗2次，加入质量浓度为0.125％胰酶，盖过细胞即可，消化2～3min，待贴壁细胞收缩变圆，少许悬浮，予加入与胰酶等体积的含血清LG-DMEM/F12培养基终止消化，用1mL移液枪轻轻吹打贴壁细胞，直至全部悬浮，吸入离心管中，在1500rpm条件下离心10min，弃去上清，加入含血清LG-DMEM/F12培养基，轻轻吹打悬浮细胞，分瓶培养。
前述诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法中，步骤(5)hAMSCs表型检测，具体为：取融合率80％以上的第3代和第4代hAMSCs，加入荧光标记的抗人单抗CD44-PE、CD90-FITC、CD105-PerCP-Cy5.5、CD73-APC、CD34-PE、CD45-PE、CD11b-PE、CD19-PE、DR-PE及相应的同型对照，混匀，避光孵育，PBS洗涤后，加入4％多聚甲醛固定，BDCalliber流式细胞仪采集不少于1×105个细胞，Cell Quest软件分析hAMSCs上述CD分子的百分率。从而可以确认该细胞为hAMSCs细胞。
前述诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法中，步骤(6)hAMSCs诱导分化，具体为：取传至第4代hAMSCs，PBS清洗2次，予以质量浓度为0.125％胰酶消化悬浮细胞，调整细胞密度至4×104个/mL，传代接种于植入TC处理细胞爬片的12孔板内，加入含血清LG-DMEM/F12培养基培养，隔天换液，待细胞贴壁50％～60％时，吸去LG-DMEM/F12培养基，PBS洗2次，加入含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基，隔60小时换液，诱导21天，即得。
为了确保本发明方法的科学、合理，发明人进行了相应的实验研究和筛选，才得以确定本发明的技术方案。具体实验内容如下：图1是本申请的诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法流程示意图。按照图1中步骤进行相关实验。
本申请中所用试剂和仪器为：淫羊藿次苷II(纯度99.1％)：上海泽朗医药技术有限公司，PBS磷酸盐缓冲液：北京中山金桥生物技术有限公司，L-DMEM/F12：HyClone公司，H-DMEM：HyClone公司，胎牛血清：HyClone公司，L-谷氨酰胺：Gibco公司，DMSO：北京索莱宝科技有限公司，抗GFAP抗体：Cell Signaling Technology公司，抗MAP-2抗体(ab32454)：abcam公司，抗NeuN抗体(ab104225)：abcam公司，抗NSE抗体(ab53025)：abcam公司，用于流式细胞抗体：BD公司，抗兔抗体(Alexa Fluor 488标记)：Cell Signaling Technology公司，抗鼠抗体(Alexa Fluor 594标记)：Cell Signaling Technology公司，-80℃冰箱：Thermo公司，离心机：Eppendorf公司，分析天平：Sartorius公司，倒置相差显微镜：Olympus公司，荧光显微镜：Olympus公司。
一、实验过程。
1、淫羊藿次苷Ⅱ母液配制
(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液1：取淫羊藿次苷Ⅱ0.001g和DMSO 2mL，混匀后在-20℃保存。
(2)淫羊藿次苷Ⅱ母液2：取淫羊藿次苷Ⅱ0.001g和DMSO 600μL，混匀后在-20℃保存。
2、诱导培养基配制
取100mLHG-DMEM加入300μL淫羊藿次苷Ⅱ母液2，配制成10μmol/L含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基；
取100mLHG-DMEM加入300μL淫羊藿次苷Ⅱ母液1，配制成3μmol/L含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基；
取100mLHG-DMEM加入30μL淫羊藿次苷Ⅱ母液2和270μLDMSO，配制成1μmol/L含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基。
3、hAMSCs的分离与原代培养
按照专利号2011100809686的发明专利所述方法进行。具体为：无菌条件下从胎盘组织上机械分离羊膜，用D-PBS冲洗残留血迹。无菌操作台内将新鲜羊膜放入到无菌方盘中，用载玻片轻轻刮除羊膜上残留的血块，将羊膜剪成1×1cm2大小的组织块，放入50mL离心管中，按体积比1:1比例加入质量浓度为0.05％的胰酶，37℃恒温摇床水浴消化40min，倒入200目细胞网过滤，弃去滤液。加入质量浓度为0.05％的胰酶再次消化40min，倒入200目滤网过滤。将滤网上的残留组织按体积比为1:1的比例加入含0.075mg/mL DNaseI的0.75mg/mLⅡ型胶原酶，37℃恒温摇床水浴消化90min，将消化好的组织倒入200目细胞网过滤。收集滤液，1500rpm离心10min，去上清，加入含血清的LG-DMEM/F12培养基吹打混匀，种在T75培养瓶中继续培养，每隔2天更换培养基。
4、hAMSCs的传代培养与扩增
待细胞长满培养瓶80％-90％时，弃去培养基，用PBS清洗2次，加入质量浓度为0.125％的胰酶(T75培养瓶加入6mL，T25培养瓶加入2mL)消化2-3min，待贴壁细胞收缩变圆，少许悬浮，加入与胰酶等体积的含血清LG-DMEM/F12培养基终止消化，用1mL移液枪轻轻吹打贴壁细胞，直至全部悬浮，吸入15mL离心管中，于离心机中在1500rpm条件下离心10min，小心弃去上清，加入含血清LG-DMEM/F12培养基，轻轻吹打悬浮细胞，分瓶培养。传代培养中，在倒置相差显微镜下观察细胞生长与形态。
5、hAMSCs细胞表型检测
取融合率80％左右的第3至第4代hAMSCs，按试剂盒说明书加入荧光标记的抗人单抗CD44-PE、CD90-FITC、CD105-PerCP-Cy5.5、CD73-APC、CD34-PE、CD45-PE、CD11b-PE、CD19-PE、DR-PE及相应的同型对照，混匀，避光孵育，PBS洗涤后，加入4％多聚甲醛固定，BDCalliber流式细胞仪采集不少于1×105个细胞，Cell Quest软件分析hAMSCs上述CD分子的百分率。在荧光显微镜下观察细胞形态。
6、hAMSCs诱导分化
取传至第4代hAMSCs，PBS清洗2次，予以质量浓度为0.125％的胰酶消化悬浮细胞，调整细胞密度至4×104个/mL，传代接种于植入TC处理细胞爬片的12孔板内，加入含血清LG-DMEM/F12培养基培养，隔天换液，待细胞贴壁约50～60％时，吸去LG-DMEM/F12培养基，PBS洗2次，分别加入含体积浓度为0.3％的DMSO的1μmol/L、3μmol/L、10μmol/L的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基及含体积浓度为0.3％的DMSO溶剂对照培养基1mL培养，隔60小时量换液，诱导21天。
7、hAMSCs诱导分化为神经元样细胞的形态学特征与特有标志鉴定
培养细胞在诱导分化后21天进行免疫荧光染色，检查神经细胞及神经胶质细胞特有标志物，鉴定步骤如下：(1)吸出板中诱导培养基，加入PBS小心清洗2次，每次3min。(2)予以质量浓度为4％的多聚甲醛固定15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min。(3)体积浓度为0.4％的Triton X-100(PBS稀释)室温通透15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min。(4)吸干PBS，滴加质量浓度为3％的BSA于37℃温箱封闭30min。(5)吸掉封闭液，不洗，其中一组滴加PBS稀释的兔来源抗NeuN(1:1000)抗体、小鼠来源抗GFAP(1:200)抗体，其他组分别加入兔来源抗MAP-2(1:1000)抗体、抗NSE(1:800)抗体，放入湿盒，4℃冰箱孵育过夜。(6)第二天PBS浸洗爬片3次，每次3min，吸干爬片上多余液体后，避光滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中37℃孵育30min，PBS浸洗切片3次，每次3min。(7)滴加4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光孵育5min，对标本进行染核，PBS浸洗切片4次，每次3min洗去多余的DAPI。(8)吸干爬片上的液体，用PBS稀释的50％甘油封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
二、实验结论
1、hAMSCs的形态学与表型检测
图2是hAMSCs的形态图。如图2所示。原代培养48h，可见大量梭形细胞贴壁生长和少量形态不规则细胞，5-7天传代，培养至第3代hAMSCs形态呈现均一的梭型、漩涡样排列生长，2～3天传代一次。
流式细胞术分析hAMSCs免疫表型结果显示，第3、4代hAMSCs均高表达CD44、CD73、CD105、CD90，不表达CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR。如图3所示。从而可以确认该细胞为hAMSCs细胞。研究表明，hAMSCs在体外经数代培养后能保持间充质干细胞的外显和遗传特性,并且未见染色体核型异常改变。本次申请中实验需要细胞量较大，为避免不同样本间差异，通过传代提供足够的细胞，因此本申请中选用传至第4代hAMSCs进行诱导分化。
2、hAMSCs诱导分化为神经元样细胞的形态学特征与特有标志鉴定
细胞形态学变化：hAMSCs在分别加入1、3、10μmol/L的淫羊藿次苷Ⅱ诱导神经元分化培养基中，培养第2天开始，倒置相差显微镜下可见，个别细胞的突触样结构即已可见，随着时间的延长，至第5天时，已可见80％左右细胞具有典型突触样结构，呈神经元细胞的典型分支结构，神经元样细胞分化的数量和结构持续保持至第21天，85％的细胞形态成胞体扁平状或硕型，多形性，有多个较长突起形成，甚至突起间交叉连接。最长可达28天，保持稳定的形态结构。图4是诱导分化后21天的细胞形态图。
细胞免疫荧光染色：培养至21天时，免疫荧光染色发现，大多数细胞的细胞核表达NeuN，胞浆表达NSE，细胞突起MAP-2阳性，仅少数细胞(低于10-15％的)同时表达GFAP。其中以3μmoL/L淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基组表达最为明显。如图5～图8所示。
本发明的有益之处在于：本发明提供的一种诱导hAMSCs向神经元样细胞分化的方法，能够在体外高效诱导hAMSCs向神经元样细胞分化。本发明的方法无需加用生长因子诱导，仅应用淫羊藿次苷Ⅱ即可诱导hAMSCs向神经元样细胞分化，是一种通过单分子诱导剂高效诱导hAMSCs分化为神经元样细胞的方法。采用本发明方法，第5天至21天，即可使hAMSCs分化为神经元样细胞，并在体外培养中保持神经元细胞形态较长时间。分化后的细胞具有典型的神经元细胞形态特征，大多数细胞表达NeuN、NSE、MAP-2等神经细胞特有标志物，表明淫羊藿次苷Ⅱ可高效诱导hAMSCs向神经元样细胞分化。本发明方法具有向神经元样细胞分化率高的特点。该方法的建立可为神经系统相关性疾病的细胞移植治疗、神经组织工程技术提供一种简便、高效的诱导方法。
附图说明
图1是本发明的本申请的诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法流程示意图；
图2是hAMSCs的形态图(40×)；
图3是流式细胞术分析hAMSCs免疫表型图；
图4是诱导分化后21天的细胞形态图；
图5是诱导分化后21天细胞NeuN表达免疫荧光图(200×)；
图6是诱导分化后21天细胞NSE表达免疫荧光图(200×)；
图7是诱导分化后21天细胞MAP-2表达免疫荧光图(200×)；
图8是诱导分化后21天细胞GFAP表达免疫荧光图(200×)；
图中附图标记的含义：图2：A-原代培养hAMSCs，B-培养第三代hAMSCs；图3：a-CD44，b-CD90，c-CD105，d-CD73，e-YIN；图4：A-原代hAMSCs细胞形态(40×)，B-传至第3代hAMSCs的细胞形态(40×)，C-诱导分化21天细胞形态(100×)。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的介绍。
实施例1
一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法，包括以下步骤：
(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液的配制：取0.001g淫羊藿次苷Ⅱ和0.6mLDMSO，混匀后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷Ⅱ母液；
(2)诱导培养基的配制：取HG-DMEM加入淫羊藿次苷Ⅱ母液配制成1μmol/L含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基；
(3)hAMSCs的分离与原代培养：按照专利号为2011100809686的发明专利所述方法进行培养；
(4)hAMSCs的传代培养与扩增：充质干细胞向神经元样细胞分化的方法中，步骤(4)hAMSCs的传代培养与扩增，具体为：待细胞长满培养瓶80％～90％，弃去培养基，用PBS清洗2次，加入质量浓度为0.125％胰酶，盖过细胞即可，消化2～3min，待贴壁细胞收缩变圆，少许悬浮，加入与胰酶等体积的含血清LG-DMEM/F12培养基终止消化，用1mL移液枪轻轻吹打贴壁细胞，直至全部悬浮，吸入离心管中，在1500rpm条件下离心10min，弃去上清，加入含血清LG-DMEM/F12培养基，轻轻吹打悬浮细胞，分瓶培养；
(5)hAMSCs表型检测：取融合率80％以上的第3代和第4代hAMSCs，加入荧光标记的抗人单抗CD44-PE、CD90-FITC、CD105-PerCP-Cy5.5、CD73-APC、CD34-PE、CD45-PE、CD11b-PE、CD19-PE、DR-PE及相应的同型对照，混匀，避光孵育，PBS洗涤后，加入4％多聚甲醛固定，BD Calliber流式细胞仪采集不少于1×105个细胞，Cell Quest软件分析hAMSCs上述CD分子的百分率；
(6)hAMSCs诱导分化：取传至第4代hAMSCs，PBS清洗2次，予以质量浓度为0.125％胰酶消化悬浮细胞，调整细胞密度至4×104个/mL，传代接种于植入TC处理细胞爬片的12孔板内，加入含血清LG-DMEM/F12培养基培养，隔天换液，待细胞贴壁50％～60％时，吸去LG-DMEM/F12培养基，PBS洗2次，加入含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基，隔60小时换液，诱导21天，即得。
实施例2
一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法，包括以下步骤：
(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液的配制：取0.001g淫羊藿次苷Ⅱ和0.6mLDMSO，混匀后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷Ⅱ母液；
(2)诱导培养基的配制：取HG-DMEM加入淫羊藿次苷Ⅱ母液和DMSO配制成10μmol/L含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基；
(3)hAMSCs的分离与原代培养：按照专利号为2011100809686的发明专利所述方法进行培养；
(4)hAMSCs的传代培养与扩增：充质干细胞向神经元样细胞分化的方法中，步骤(4)hAMSCs的传代培养与扩增，具体为：待细胞长满培养瓶80％～90％，弃去培养基，用PBS清洗2次，加入质量浓度为0.125％胰酶，盖过细胞即可，消化2～3min，待贴壁细胞收缩变圆，少许悬浮，加入与胰酶等体积的含血清LG-DMEM/F12培养基终止消化，用1mL移液枪轻轻吹打贴壁细胞，直至全部悬浮，吸入离心管中，在1500rpm条件下离心10min，弃去上清，加入含血清LG-DMEM/F12培养基，轻轻吹打悬浮细胞，分瓶培养；
(5)hAMSCs表型检测：取融合率80％以上的第3代和第4代hAMSCs，加入荧光标记的抗人单抗CD44-PE、CD90-FITC、CD105-PerCP-Cy5.5、CD73-APC、CD34-PE、CD45-PE、CD11b-PE、CD19-PE、DR-PE及相应的同型对照，混匀，避光孵育，PBS洗涤后，加入4％多聚甲醛固定，BD Calliber流式细胞仪采集不少于1×105个细胞，Cell Quest软件分析hAMSCs上述CD分子的百分率；
(6)hAMSCs诱导分化：取传至第4代hAMSCs，PBS清洗2次，予以质量浓度为0.125％胰酶消化悬浮细胞，调整细胞密度至4×104个/mL，传代接种于植入TC处理细胞爬片的12孔板内，加入含血清LG-DMEM/F12培养基培养，隔天换液，待细胞贴壁50％～60％时，吸去LG-DMEM/F12培养基，PBS洗2次，加入含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基，隔60小时换液，诱导21天，即得。
实施例3
一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法，包括以下步骤：
(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液的配制：取0.001g淫羊藿次苷Ⅱ和2mLDMSO，混匀后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷Ⅱ母液；
(2)诱导培养基的配制：取100mLHG-DMEM加入300μL淫羊藿次苷Ⅱ母液配制成3μmol/L含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基；
(3)hAMSCs的分离与原代培养：按照专利号为2011100809686的发明专利所述方法进行培养；
(4)hAMSCs的传代培养与扩增：充质干细胞向神经元样细胞分化的方法中，步骤(4)hAMSCs的传代培养与扩增，具体为：待细胞长满培养瓶80％～90％，弃去培养基，用PBS清洗2次，加入质量浓度为0.125％胰酶，盖过细胞即可，消化2～3min，待贴壁细胞收缩变圆，少许悬浮，加入与胰酶等体积的含血清LG-DMEM/F12培养基终止消化，用1mL移液枪轻轻吹打贴壁细胞，直至全部悬浮，吸入离心管中，在1500rpm条件下离心10min，弃去上清，加入含血清LG-DMEM/F12培养基，轻轻吹打悬浮细胞，分瓶培养；
(5)hAMSCs表型检测：取融合率80％以上的第3代和第4代hAMSCs，加入荧光标记的抗人单抗CD44-PE、CD90-FITC、CD105-PerCP-Cy5.5、CD73-APC、CD34-PE、CD45-PE、CD11b-PE、CD19-PE、DR-PE及相应的同型对照，混匀，避光孵育，PBS洗涤后，加入4％多聚甲醛固定，BD Calliber流式细胞仪采集不少于1×105个细胞，Cell Quest软件分析hAMSCs上述CD分子的百分率；
(6)hAMSCs诱导分化：取传至第4代hAMSCs，PBS清洗2次，予以质量浓度为0.125％胰酶消化悬浮细胞，调整细胞密度至4×104个/mL，传代接种于植入TC处理细胞爬片的12孔板内，加入含血清LG-DMEM/F12培养基培养，隔天换液，待细胞贴壁50％～60％时，吸去LG-DMEM/F12培养基，PBS洗2次，加入含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基，隔60小时换液，诱导21天，即得。
实施例4
一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法，包括以下步骤：
(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液的配制：取0.001g淫羊藿次苷Ⅱ和1.5mLDMSO，混匀后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷Ⅱ母液；
(2)诱导培养基的配制：取HG-DMEM加入淫羊藿次苷Ⅱ母液配制成5μmol/L含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基；
(3)hAMSCs的分离与原代培养：按照专利号为2011100809686的发明专利所述方法进行培养；
(4)hAMSCs的传代培养与扩增：充质干细胞向神经元样细胞分化的方法中，步骤(4)hAMSCs的传代培养与扩增，具体为：待细胞长满培养瓶80％～90％，弃去培养基，用PBS清洗2次，加入质量浓度为0.125％胰酶，盖过细胞即可，消化2～3min，待贴壁细胞收缩变圆，少许悬浮，加入与胰酶等体积的含血清LG-DMEM/F12培养基终止消化，用1mL移液枪轻轻吹打贴壁细胞，直至全部悬浮，吸入离心管中，在1500rpm条件下离心10min，弃去上清，加入含血清LG-DMEM/F12培养基，轻轻吹打悬浮细胞，分瓶培养；
(5)hAMSCs表型检测：取融合率80％以上的第3代和第4代hAMSCs，加入荧光标记的抗人单抗CD44-PE、CD90-FITC、CD105-PerCP-Cy5.5、CD73-APC、CD34-PE、CD45-PE、CD11b-PE、CD19-PE、DR-PE及相应的同型对照，混匀，避光孵育，PBS洗涤后，加入4％多聚甲醛固定，BD Calliber流式细胞仪采集不少于1×105个细胞，Cell Quest软件分析hAMSCs上述CD分子的百分率；
(6)hAMSCs诱导分化：取传至第4代hAMSCs，PBS清洗2次，予以质量浓度为0.125％胰酶消化悬浮细胞，调整细胞密度至4×104个/mL，传代接种于植入TC处理细胞爬片的12孔板内，加入含血清LG-DMEM/F12培养基培养，隔天换液，待细胞贴壁50％～60％时，吸去LG-DMEM/F12培养基，PBS洗2次，加入含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基，隔60小时换液，诱导21天，即得。
实施例5
一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法，包括以下步骤：
(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液的配制：取0.001g淫羊藿次苷Ⅱ和0.8mLDMSO，混匀后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷Ⅱ母液；
(2)诱导培养基的配制：取HG-DMEM加入淫羊藿次苷Ⅱ母液和DMSO配制成8μmol/L含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基；
(3)hAMSCs的分离与原代培养：按照专利号为2011100809686的发明专利所述方法进行培养；
(4)hAMSCs的传代培养与扩增：充质干细胞向神经元样细胞分化的方法中，步骤(4)hAMSCs的传代培养与扩增，具体为：待细胞长满培养瓶80％～90％，弃去培养基，用PBS清洗2次，加入质量浓度为0.125％胰酶，盖过细胞即可，消化2～3min，待贴壁细胞收缩变圆，少许悬浮，加入与胰酶等体积的含血清LG-DMEM/F12培养基终止消化，用1mL移液枪轻轻吹打贴壁细胞，直至全部悬浮，吸入离心管中，在1500rpm条件下离心10min，弃去上清，加入含血清LG-DMEM/F12培养基，轻轻吹打悬浮细胞，分瓶培养；
(5)hAMSCs表型检测：取融合率80％以上的第3代和第4代hAMSCs，加入荧光标记的抗人单抗CD44-PE、CD90-FITC、CD105-PerCP-Cy5.5、CD73-APC、CD34-PE、CD45-PE、CD11b-PE、CD19-PE、DR-PE及相应的同型对照，混匀，避光孵育，PBS洗涤后，加入4％多聚甲醛固定，BD Calliber流式细胞仪采集不少于1×105个细胞，Cell Quest软件分析hAMSCs上述CD分子的百分率；
(6)hAMSCs诱导分化：取传至第4代hAMSCs，PBS清洗2次，予以质量浓度为0.125％胰酶消化悬浮细胞，调整细胞密度至4×104个/mL，传代接种于植入TC处理细胞爬片的12孔板内，加入含血清LG-DMEM/F12培养基培养，隔天换液，待细胞贴壁50％～60％时，吸去LG-DMEM/F12培养基，PBS洗2次，加入含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基，隔60小时换液，诱导21天，即得。
实施例6
一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法，包括以下步骤：
(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液的配制：取0.001g淫羊藿次苷Ⅱ和2mLDMSO，混匀后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷Ⅱ母液；
(2)诱导培养基的配制：取100mLHG-DMEM加入300μL淫羊藿次苷Ⅱ母液配制成3μmol/L含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基；
(3)hAMSCs的分离与原代培养：按照传统方法进行hAMSCs的分离与原代培养；
(4)hAMSCs的传代培养与扩增：充质干细胞向神经元样细胞分化的方法中，步骤(4)hAMSCs的传代培养与扩增，具体为：待细胞长满培养瓶80％～90％，弃去培养基，用PBS清洗2次，加入质量浓度为0.125％胰酶，盖过细胞即可，消化2～3min，待贴壁细胞收缩变圆，少许悬浮，加入与胰酶等体积的含血清LG-DMEM/F12培养基终止消化，用1mL移液枪轻轻吹打贴壁细胞，直至全部悬浮，吸入离心管中，在1500rpm条件下离心10min，弃去上清，加入含血清LG-DMEM/F12培养基，轻轻吹打悬浮细胞，分瓶培养；
(5)hAMSCs表型检测：取融合率80％以上的第3代和第4代hAMSCs，加入荧光标记的抗人单抗CD44-PE、CD90-FITC、CD105-PerCP-Cy5.5、CD73-APC、CD34-PE、CD45-PE、CD11b-PE、CD19-PE、DR-PE及相应的同型对照，混匀，避光孵育，PBS洗涤后，加入4％多聚甲醛固定，BD Calliber流式细胞仪采集不少于1×105个细胞，Cell Quest软件分析hAMSCs上述CD分子的百分率；
(6)hAMSCs诱导分化：取传至第4代hAMSCs，PBS清洗2次，予以质量浓度为0.125％胰酶消化悬浮细胞，调整细胞密度至4×104个/mL，传代接种于植入TC处理细胞爬片的12孔板内，加入含血清LG-DMEM/F12培养基培养，隔天换液，待细胞贴壁50％～60％时，吸去LG-DMEM/F12培养基，PBS洗2次，加入含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基，隔60小时换液，诱导21天，即得。

Claims (3)

1.一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液的配制：取0.001g淫羊藿次苷Ⅱ和0.6mL～2mLDMSO，混匀后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷Ⅱ母液；
(2)诱导培养基的配制：取HG-DMEM加入淫羊藿次苷Ⅱ母液或淫羊藿次苷Ⅱ母液和DMSO配制成1μmol/L～10μmol/L含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基；
(3)hAMSCs的分离与原代培养：无菌条件下从胎盘组织上机械分离羊膜，用D-PBS冲洗残留血迹，无菌操作台内将新鲜羊膜放入到无菌方盘中，用载玻片轻轻刮除羊膜上残留的血块，将羊膜剪成1×1cm2大小的组织块，放入50mL离心管中，按体积比1:1比例加入质量浓度为0.05％的胰酶，37℃恒温摇床水浴消化40min，倒入200目细胞网过滤，弃去滤液，加入质量浓度为0.05％的胰酶再次消化40min，倒入200目滤网过滤，将滤网上的残留组织按体积比为1:1的比例加入含0.075mg/mL DNaseI的0.75mg/mLⅡ型胶原酶，37℃恒温摇床水浴消化90min，将消化好的组织倒入200目细胞网过滤，收集滤液，1500rpm离心10min，去上清，加入含血清的LG-DMEM/F12培养基吹打混匀，种在T75培养瓶中继续培养，每隔2天更换培养基；
(4)hAMSCs的传代培养与扩增：待细胞长满培养瓶80％～90％，弃去培养基，用PBS清洗2次，加入质量浓度为0.125％胰酶，盖过细胞即可，消化2～3min，待贴壁细胞收缩变圆，少许悬浮，加入与胰酶等体积的含血清LG-DMEM/F12培养基终止消化，用1mL移液枪轻轻吹打贴壁细胞，直至全部悬浮，吸入离心管中，在1500rpm条件下离心10min，弃去上清，加入含血清LG-DMEM/F12培养基，轻轻吹打悬浮细胞，分瓶培养；
(5)hAMSCs表型检测：取融合率80％以上的第3代和第4代hAMSCs，加入荧光标记的抗人单抗CD44-PE、CD90-FITC、CD105-PerCP-Cy5.5、CD73-APC、CD34-PE、CD45-PE、CD11b-PE、CD19-PE、DR-PE及相应的同型对照，混匀，避光孵育，PBS洗涤后，加入体积浓度为4％的多聚甲醛固定，BD Calliber流式细胞仪采集不少于1×105个细胞，Cell Quest软件分析hAMSCs上述CD分子的百分率；
(6)hAMSCs诱导分化：取传至第4代hAMSCs，PBS清洗2次，予以质量浓度为0.125％胰酶消化悬浮细胞，调整细胞密度至4×104个/mL，传代接种于植入TC处理细胞爬片的12孔板内，加入含血清LG-DMEM/F12培养基培养，隔天换液，待细胞贴壁50％～60％时，吸去LG-DMEM/F12培养基，PBS洗2次，加入含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基，隔60小时换液，诱导21天，即得。
2.根据权利要求1所述的诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法，其特征在于：所述步骤(1)淫羊藿次苷Ⅱ母液的配制方法为：取0.001g淫羊藿次苷Ⅱ和2mLDMSO，混匀后在-20℃下保存即得淫羊藿次苷Ⅱ母液。
3.根据权利要求1所述的诱导人羊膜间充质干细胞向神经元样细胞分化的方法，其特征在于：所述步骤(2)诱导培养基的配制方法为：取100mL HG-DMEM加入300μL淫羊藿次苷Ⅱ母液配制成3μmol/L含体积浓度为0.3％的DMSO的淫羊藿次苷Ⅱ诱导培养基。
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