CN1869204A

CN1869204A - 淫羊藿素在诱导干细胞体外定向分化方面的用途

Info

Publication number: CN1869204A
Application number: CNA2006100508300A
Authority: CN
Inventors: 朱丹雁; 王志强; 楼宜嘉
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2006-05-19
Filing date: 2006-05-19
Publication date: 2006-11-29

Abstract

本发明提供淫羊藿素在诱导干细胞体外定向分化为多种单一类型细胞中应用，所述的干细胞包括胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞，所述的单一类型细胞包括神经细胞、骨细胞、胰岛细胞、内皮细胞。所述的单一类型细胞在制备干细胞移植治疗神经退行性疾病药物中的应用。所述的单一类型细胞在制备修复重建损伤神经组织的促细胞分化剂中应用。所述的单一类型细胞在构建高效率药效筛选模型、并利用该模型进行药物药效初步筛选与评价中应用。本发明开拓了淫羊藿素的新用途，明确了具备药理活性的成分淫羊藿素，为中药防治作用提供物质基础，另一方面药效机制的阐明为中药现代化开发拥有自主知识产权的新药提供借鉴。

Description

淫羊藿素在诱导干细胞体外定向分化方面的用途

技术领域

本发明属细胞生物学和药理学领域，涉及一种中药单体化合物的用途，具体涉及淫羊藿素在诱导干细胞体外定向分化方面的用途，可用于干细胞移植治疗神经退行性疾病和修复重建损伤神经组织的促细胞分化剂。

背景技术

淫羊藿(Herba Epimedii)系小檗科淫羊藿属(Epimedium)植物，具有补肾壮阳、祛风除湿等功效。现代药理研究证明，淫羊藿含有特殊的化学成分和显著的生物活性，是一种具有广泛药理活性的中药材。淫羊藿中黄酮醇类化合物具有治疗心脑血管疾病、防治骨质疏松等药理活性。淫羊藿素是淫羊藿中主要有效成分淫羊藿苷的苷元，既为淫羊藿苷的体内代谢产物，也均少量存在于淫羊藿药材中，属黄酮醇类化合物，化学结构式如下：

淫羊藿素 R＝CH₃，R1＝R2＝H

其制备过程为：淫羊藿苷超声溶解在尽可能少的甲醇中，边搅拌边缓慢加入含纤维素酶的缓冲液，37℃反应过夜。使淫羊藿苷结构上的葡萄糖和鼠李糖被充分水解，乙酸乙酯萃取水解产物，旋转蒸发仪挥干即得淫羊藿素。

到目前为止，有关淫羊藿素的药理活性研究报道较少。本研究对淫羊藿苷的体内代谢过程及代谢产物相关药理活性进行了大量研究，结果发现淫羊藿素是淫羊藿苷大鼠经口给药后，体内经肠道内细菌代谢的产物之一。而传统中药制剂淫羊藿苷均为口服用药，其在人体内的代谢可能存在此相同的过程。另有研究报道，淫羊藿提取物体内药理实验显示具有性激素样作用，能使雌性小鼠子宫增重，雌二醇含量升高。但真正的雌激素活性成分仍不清楚。本研究室对淫羊藿苷及其代谢产物的相关药理活性研究发现，淫羊藿素能显著促进人乳腺癌MCF-7细胞的增殖，具有雌激素样作用药理活性，而淫羊藿苷却未呈现此作用。提示淫羊藿苷具有的多方面药理作用的物质基础可能是其体内代谢产物淫羊藿素。植物雌激素是一类具有雌激素活性的天然植物化合物，具有抗氧化、抗血管生成、抑制癌细胞分化等作用。研究表明，植物雌激素对激素依赖性癌症、心血管疾病以及绝经后骨质疏松和更年期不适症、早老年性痴呆有较好的预防和治疗作用。鉴于淫羊藿素的植物雌激素样活性，此化合物可以在上述几方面加以应用。

但迄今未见国内外对淫羊藿素诱导干细胞定向分化为神经细胞效应的研究报道。

发明内容：

本发明的一个目的是提供淫羊藿素的一种新用途，是由淫羊藿素诱导干细胞(包括胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞)体外定向分化为多种单一类型细胞，包括神经细胞、骨细胞、胰岛细胞、内皮细胞等。

本发明的另一个目的是利用淫羊藿素能诱导干细胞(包括胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞)体外定向分化获得的单一类型细胞，用于干细胞移植治疗神经退行性疾病和修复重建损伤神经组织的促细胞分化剂。

本发明的又一个目的是利用淫羊藿素能诱导干细胞(包括胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞)体外定向分化获得的单一类型细胞，用于构建高效率药效筛选模型，并利用该模型进行药物药效初步筛选与评价。

本发明在细胞层面上对淫羊藿素的药效进行了严格论证，对其中蕴藏的大量生物学信息进行了初步探讨，具体有以下优点：

(1)本发明开拓了淫羊藿素的新用途，即诱导干细胞(包括胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞)定向分化为多种单一类型细胞(神经细胞、骨细胞、胰岛细胞、内皮细胞等)。

(2)淫羊藿素可用作干细胞移植治疗神经退行性疾病和修复重建损伤神经组织的促细胞分化剂。干细胞移植治疗神经退行性疾病目前正处于实验研究阶段(含临床实验研究)，预计促细胞分化剂淫羊藿素的介入将有助于该领域的研究。

(3)本发明一方面明确了具备药理活性的成分淫羊藿素，为中药防治作用提供物质基础，另一方面药效机制的阐明为中药现代化开发拥有自主知识产权的新药提供借鉴。

附图说明

图1为淫羊藿素诱导ES-D3细胞体外定向分化为神经细胞的量效和时效关系图。

图2为ES细胞定向分化为神经细胞形态的相差显微镜观察。

图3为结晶紫染色和免疫荧光法鉴定神经细胞形态。

具体实例方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。此外应理解，下面的优选具体实施方案仅仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

淫羊藿素诱导胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)体外定向分化为神经细胞的研究

1.ES细胞支持培养：

ES细胞D3细胞株(ES-D3细胞)在基础培养基(含高糖DMEM、非必需氨基酸、10％胎牛血清、白血病抑制因子)中，按1×10⁶个/ml的密度接种于饲养层细胞(小鼠成纤维细胞)上，2～3天进行传代培养。

2.淫羊藿素诱导ES细胞定向分化为神经细胞的培养：

ES-D3细胞用胰酶消化，用分化培养基(含高糖DMEM、非必需氨基酸、10％胎牛血清、不含白血病抑制因子)将其制成单细胞悬液，按约600个/30μL接种于培养皿盖子内表面上，将盖子翻转形成悬滴，置培养箱中培养3天。此后将已形成拟胚体的悬滴转入盛有10mL分化培养基的培养皿内，继续悬浮培养1天。第二天加入中药单体淫羊藿素与ES细胞拟胚体悬浮共培养4天。之后，再将拟胚体转移到预铺了多聚鸟氨酸及层粘连蛋白的96孔板内，每孔加入100μL ES细胞分化培养基(DMEM/F12+N2/B27+1％胎牛血清)及药物淫羊藿素。此时开始用倒置显微镜每天观察细胞，以捕获出现神经样细胞(细胞突起的长度为胞体直径的5倍以上)的最初时间。

实施例2淫羊藿素诱导ES细胞定向分化为神经细胞在药效评价方面的用途由实施例1获得的拟胚体，若能出现神经样细胞(细胞突起的长度为胞体直径的5倍以上)，则以此作为定向分化成神经细胞的指标，计算分化出神经样细胞的拟胚体占拟胚体总数的比例，并作出药物淫羊藿素对ES-D3细胞诱导分化的量效和时效关系曲线(参见图1)，以此作为药效评价指标。可用于药物开发和中药活性成分的筛选。参见图1，淫羊藿素诱导ES细胞定向分化为神经细胞作用非常明显，且具有很好的量效关系，其与ES细胞拟胚体共孵育8-10天时，就有80％以上拟胚体出现神经样细胞，参见图2，图2为ES细胞定向分化为神经细胞形态的相差显微镜观察，其中(A)0.1％溶剂对照组，×100(B)阳性对照药维A酸诱导组，×100(C)淫羊藿素10^-6mol/L诱导组，×100(D)淫羊藿素10^-6mol/L诱导组，×400。结晶紫染色呈紫色，并有神经元和神经胶质细胞特异性蛋白的表达上调(参见图3)，图3中：(A)ES细胞定向分化为神经细胞结晶紫染色的形态，×400(B)神经干细胞特异性nestin蛋白表达，×400(C)神经元细胞特异性β-tubulin III蛋白表达，×400(D)神经胶质细胞特异性GFAP蛋白表达，×400。镜下观察ES细胞可被诱导为神经元样细胞，并有轴突出现，多个神经元之间形成网络。Nestin是一种中间丝蛋白，它是神经干细胞特异性标志物。本研究结果显示，诱导3d后的细胞nestin表达阳性，证明该细胞具有部分神经干细胞特性。大多数分化后细胞神经元标志物β-TubulinIII表达为阳性，少数细胞表达神经胶质细胞标志物GFAP，证明由ES细胞分化成的细胞不仅形态学上发生改变，而且在分子水平上也发生了改变。

淫羊藿素对ES细胞分化为神经细胞这一过程具有显著诱导分化作用。药物淫羊藿素有望成为一种以神经为作用靶点的新型诱导分化剂。由于在淫羊藿素诱导ES细胞定向分化为神经细胞过程中富含发育依赖性生物信息，能提供很多靶点供药效评价用，因此可将神经发育依赖性特殊基因和蛋白表达等能够反映神经细胞功能的指标，借助PCR、免疫组化、Western Blot等技术对淫羊藿素的药效进行深入评价，以论证淫羊藿素对神经细胞生长和功能改善的促进作用。

实施例3：淫羊藿素诱导ES细胞定向分化为神经细胞在其他方面的用途

利用淫羊藿素诱导ES细胞定向分化为神经细胞，若能将其成功引入损伤的神经系统并与宿主细胞一起工作，则这条途径能够成为移植治疗神经退行性疾病和修复重建损伤神经组织的重要组织细胞来源，用这种方法可以培育大量神经细胞克隆，提供组织工程学等其它方面研究。

实施例4：淫羊藿素诱导骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)定向分化为神经细胞的研究

BMSCs具有干细胞的自我复制和多向分化潜能两个特性，可以向多种结缔组织和部分来源于外胚层和中胚层的组织分化，其中包括神经细胞。

1.BMSCs的分离培养：取大鼠股骨、胫骨骨髓置于离心管中，微吸管反复吸吹骨髓，形成分散的单细胞悬液，加入配制的PERCOLL分离液，密度为11073g/mL，离心2000r/min，20min后可见中间有一层约1～2mm厚的白色层，其成分主要为MSCs，仔细用吸管吸取这一层，再用PBS离心后，按1×10⁴个/mL细胞密度接种至含10％FBS的DMEM培养基中培养。

2.将传至第3，5，7代的BMSCs按照0.4×10⁶/ml接种于事先放置有消毒盖玻片的六孔板内制备细胞爬片。当细胞达到70％～80％融合时，弃培养液，加入含bFGF和20％FCS的L-DMEM培养液预诱导24h后，更换培养液，PBS洗两次，再分别加入不同浓度淫羊藿素对BMSCs进行诱导分化，采用免疫细胞化学检测神经细胞特异性表达蛋白。

实施例5：淫羊藿素诱导神经干细胞定向分化为神经细胞的研究

神经干细胞(neural stem cells，NSCs)是神经系统终生保持增殖能力和分化潜能的细胞，可通过对称或不对称分裂，生成新的干细胞和分化潜能逐渐降低的子细胞，最终生成神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞。

取孕13天胎鼠大脑，在无菌条件下用机械法将其制备成单细胞悬液，加入含B27，bFGF和insulin的DMEM/F12培养液培养。NSC培养7～10天后，形成神经球，呈悬浮状生长。收集NSCs集落，以800r/min离心5min后，计数后接种于预先用多聚赖氨酸处理过的6孔板内，加入含不同浓度淫羊藿素的DMEM/F12分化培养液进行诱导培养。采用免疫细胞化学检测神经细胞特异性表达蛋白。

实施例6：淫羊藿素诱导干细胞定向分化为骨细胞的研究

淫羊藿素对干细胞具有很强的诱导作用，鉴于其具有植物雌激素样活性，对骨细胞有滋养保护作用。可选择贴壁培养方法，用淫羊藿素诱导干细胞定向分化为骨细胞。

参照实施例1中ES-D3细胞和实施例4中BMSCs的支持培养方法，诱导分化时换用含有成骨细胞诱导剂的培养基(0.105mmol/L AsAp，10mmol/Lβ-GP，10mol/L Dex)，同时加入不同浓度淫羊藿素共培养。采用酶组化法检测碱性磷酸酶活性进行成骨细胞鉴定。同时结合Von Kossa染色检测细胞外钙结节的沉积。

实施例7：淫羊藿素诱导干细胞定向分化为其他种类细胞的研究

将淫羊藿素以合适的浓度与干细胞共孵育，采用不同的培养方法可以将干细胞定向分化为各种其他类型的细胞，如胰岛细胞、内皮细胞、心肌细胞等，均可用于构建药物筛选模型和移植性治疗研究。

Claims

1.淫羊藿素在诱导干细胞体外定向分化为多种单一类型细胞中应用，所述的干细胞包括胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞，所述的单一类型细胞包括神经细胞、骨细胞、胰岛细胞、内皮细胞。

2.根据权利要求1所述的淫羊藿素在诱导干细胞体外定向分化为多种单一类型细胞中应用，其特征是：所述的单一类型细胞在制备干细胞移植治疗神经退行性疾病药物中的应用。

3.根据权利要求1所述的淫羊藿素在诱导干细胞体外定向分化为多种单一类型细胞中应用，其特征是：所述的单一类型细胞在制备修复重建损伤神经组织的促细胞分化剂中应用。

4.根据权利要求1所述的淫羊藿素在诱导干细胞体外定向分化为多种单一类型细胞中应用，其特征是：所述的单一类型细胞在构建高效率药效筛选模型、并利用该模型进行药物药效初步筛选与评价中应用。