CN101836976B - 淫羊藿素在制备抗血管生成药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属中药领域，涉及中药有效成分淫羊藿素的新的药用用途，具体涉及淫羊藿素在制备抗血管生成药物中的应用。本发明经体外实验观察了淫羊藿素对人脐静脉内皮细胞细胞增殖及迁移的影响，体内实验观察了淫羊藿素对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响，结果证实淫羊藿素可有效抗血管生成，且该作用不是通过细胞毒性实现的。所述的淫羊藿素可以作为药物有效成分，加以药物学上可接受的载体，制备抗血管生成的药物组合物。

Description

淫羊藿素在制备抗血管生成药物中的应用

技术领域

本发明属中药领域，涉及中药有效成分淫羊藿素的新的药用用途，具体涉及淫羊藿素在制备抗血管生成药物中的应用。

背景技术

血管生成是指血管内皮细胞从现有的血管系统中分化、迁移而形成新的微血管的复杂生物学过程，研究显示，有多种生长因子、胞外基质成分、蛋白水解酶和细胞黏附分子等参与了该过程。1971年Folkman首次提出肿瘤的生长和转移具有血管依赖性之后，肿瘤血管生长的调节机制和抗血管生成在肿瘤治疗中的意义得到广泛关注。研究显示，当肿瘤长到1～2mm时，必须有新生血管的产生来提供不断生长所需的营养，同时由于肿瘤诱导产生的新生血管结构异常，如基膜不完整、血管壁很薄且易通透，使肿瘤细胞易于漏入到这种血管内，所以肿瘤新生血管的形成不仅是肿瘤可持续性生长的基础，也为其侵袭和转移创造了十分有利的条件。

抗血管生成疗法(Anti-angiogenesis therapy)是通过防止和抑制肿瘤新血管的生成，阻止肿瘤原发灶和微转移灶向血管生成表型转换，限制肿瘤生长。抗血管生成已经成为肿瘤治疗的新策略之一。近年来随着对肿瘤血管生成机制研究的不断深入，抗血管生成药物也得以快速研发，天然药物是其中的重要研发方向。一般认为，抗炎药物多具有抗血管生成作用。许多抗炎天然药物也显示了抗血管生成作用，如人参皂苷Rb1、金雀黄素、槲皮素、白藜芦醇、青蒿琥酯等。

淫羊藿素属黄酮醇类化合物，少量存在于淫羊藿药材中，其化学结构式如下：

淫羊藿素    R＝CH₃，R1＝R2＝H

目前有关淫羊蕾素的药理活性研究报道较少。中国专利CN1869204A公开了“淫羊藿素在诱导干细胞体外定向分化方面的用途”。中国专利CN1194701C公开了“淫羊藿素或去甲基淫羊藿素在制备雌激素受体调节剂中的应用”。本发明的前期研究显示，淫羊藿素为天然抗炎药物，目前关于淫羊藿素抗血管生成方面的用途未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供淫羊藿素的新的药用用途，具体涉及淫羊藿素在制备抗血管生成药物中的应用。

本发明所采用的淫羊藿素(可市购)属黄酮醇类化合物，少量存在于淫羊藿药材中，其化学结构式如下：

淫羊藿素  R＝CH₃，R1＝R2＝H

本发明将上述淫羊藿素进行了HUVEC迁移实验和抗鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成实验，实验结果表明，所述的淫羊藿素可有效抗血管生成，且该作用不是通过细胞毒性实现的。

所述的淫羊藿素可以作为药物有效成分，加以药物学上可接受的载体，制备抗血管生成的药物组合物。尤其用于制备抗肿瘤血管生成或抗其他与血管生成有关疾病的药物。

附图说明

图1是淫羊藿素对HUVEC迁移实验的影响，

其中A：空白对照组，B：淫羊藿素1×10^-6mol/L组，

C1：淫羊藿素1×10^-7mol/L组，C2：淫羊藿素1×10^-8mol/L组，

D：人参皂苷Rb1 1×10^-7mol/L组。

图2是淫羊藿素对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响，

其中，A：空白对照组，B：淫羊藿素1×10^-6mol/L组，

C1：淫羊藿素1×10^-7mol/L组，C2：淫羊藿素1×10^-8mol/L组，

D：人参皂苷Rb1 1×10^-7mol/L组

具体实施方式

实施例1淫羊藿素对HUVEC迁移实验影响的研究

1.细胞株

人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)购自中国科学院上海细胞库。用含有10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃、体积分数为5％CO₂、完全饱和湿度条件下常规培养，48h更换培养基，细胞生长达饱合状态时，用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化传代，2~3d传代1次，实验选用对数生长期细胞。

2.实验药品

淫羊藿素和人参皂苷Rb1，采用DMSO助溶，并以DMEM培养基稀释至相应浓度。

3.HUVEC细胞增殖的检测

调整HUVEC细胞悬液浓度为1×10⁵/mL，加入96孔培养板内，每孔100μL，置37℃5％CO₂孵箱培养6h。吸除旧培养液，分别加入含淫羊藿素(1×10^-6mol/L，1×10^-7mol/L，1×10^-8mol/L)和含人参皂苷Rb1(1×10^-7mol/L)的DMEM培养基，空白组加含0.1％DMSO的培养基，每组均设6复孔，继续培养22h。加入10μL CCK-8溶液，培养2h。在490nm处检测各孔的吸光值。实验重复3遍以上。

4.HUVEC迁移实验(划痕法)

调整HUVEC细胞悬液浓度为1×10⁶/mL，取1mL细胞悬液加入6孔培养板，于37℃、5％CO₂饱和湿度条件下孵育24h，吸弃旧培养基。加入无血清培养基继续培养12h，吸弃旧培养基。用无菌10μL枪头在培养孔中垂直划出一条无细胞细痕，以无血清DMEM培养基洗去划痕处细胞，而后分别加入含淫羊藿素(1×10^-6mol/L，1×10^-7mol/L，1×10^-8mol/L)和含人参皂苷Rb1(1×10^-7mol/L)的培养基1ml，作用24h后吸弃培养基，冷PBS清洗一遍，每孔加入事先预冷的甲醛1ml，固定5min，倒置显微镜下观察细胞迁移情况，并用数码相机拍照。

采用SPSS15.0统计软件进行分析。数据以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用方差分析(ANOVA)进行比较，P＜0.05为差异有显著意义。

各组HUVEC细胞增殖的检测结果显示：

与空白组相比，淫羊藿素各剂量组和人参皂苷组对HUVEC细胞增殖无明显作用(P＞0.05)。提示淫羊藿素在1×10^-6-1×10^-8mol/L浓度范围内未显示出细胞毒性。

表1是各组HUVEC细胞增殖的检测结果(x±s)

注：P＜0.05为差异有显著意义

HUVEC迁移实验(划痕法)的检测结果显示，

在空白对照组划痕处发生迁移的细胞数目明显多于淫羊藿素各剂量组和人参皂苷Rb1组。淫羊藿素抗HUVEC的有效浓度为(1×10^-6-1×10^-8mol/L)，以1×10^-8mol/L效果最佳。

实施例2淫羊藿素抗鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的研究实验材料与方法

1.实验药物：

同实施例1

2.种蛋：

选择表面清洁，蛋壳均质，重量50g~65g，外形规范，气室、气孔均匀，受精率＞90％的种蛋为受试对象。孵育前用温水(40~50℃)清洗两次，以1∶1000新洁尔灭溶液浸洗擦干。将种蛋置于(37.0±0.5℃)培养箱中孵化，且钝端向上，呈45℃倾斜放于6孔培养板中，培养箱内置一湿盘保持相对湿度在65~70％。在孵化过程中每天翻蛋2次，以防止胚胎发生粘连，并且促进鸡羊膜运动。每日用透射灯检查胚胎发育情况，识别胚胎发育的标志特征，随时淘汰死弱精种蛋及胚胎发育不良的种蛋。

3.实验方法：

待鸡胚孵化7d后，在透射灯下观察并确定CAM，用碘酒及酒精消毒种蛋气室表面，先用牙科钻在气室顶端打开直径约1~2mm的小孔以便减压。在胚头前1cm，两条卵黄静脉之间的卵壳投影部位，用铅笔勾画出1.5cm×2cm区域，碘酒及酒精消毒后用砂轮在蛋壳表面划刻出凹痕，滴少量生理盐水于凹痕内，用眼科镊轻揭凹陷处蛋皮，撕掉内壳膜，此时该处CAM下陷，形成假气室(区别于种蛋白身的气室)。制备假气室时切勿损伤CAM。用透明封口膜封闭假气室，形成透明观察窗，可供观察和加药操作。鸡胚随机分为5组，每组6只。用微量进样器向明胶海绵分别滴加含淫羊藿素(1×10^-6mol/L，1×10^-7mol/L，1×10^-8mol/L)和含人参皂苷Rb1(1×10^-7mol/L)的培养基，同时设立空白对照组，每个鸡胚滴加0.1ml不同药物。给药结束后用封口胶封闭窗口，将鸡胚置于培养箱中继续孵育，72h后揭开封口胶，滴入10％福尔马林液固定15min，待CAM上的血管凝固后，剥离假气室周围的蛋壳，使CAM充分暴露，以载体为中心用眼科剪剪下约3cm×3cm的尿囊膜，平铺于平皿中展开，晾干，置于显微镜下观察。取出CAM放在滤纸上，并以滤纸为背景，在自然光线下用数码相机采用近距离模式原位拍摄以载体为中心的鸡胚照片，拍照时禁用闪光灯。

结果显示：

生理盐水组CAM血管生长良好，呈叶脉样、放射状分布，结构清晰，主血管粗状，长势旺盛。淫羊藿素及人参皂苷Rb1组新生毛细血管生成受到明显抑制，血管密度降低，管径变细，结构被破坏，呈模糊或透明样结构，颜色变浅，血管分支多处断开，分布零乱，甚至产生视觉可见的无血管区域。淫羊藿素的抗CAM血管生成的有效浓度为(1×10^-6-1×10^-8mol/L)，以1×10^-8mol/L效果最佳。

Claims (2)

1.如下化学结构的淫羊藿素在制备抗血管生成药物中的应用，

淫羊藿素       R＝CH₃，R1＝R2＝H

2.按权利要求1所述的应用，其中所述的血管生成是肿瘤血管生成。