CN102949399B - 丹参酮iia在制备抑制角质形成细胞增殖疾病药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及丹参酮IIA在制备抑制角质形成细胞过度增殖疾病药中的应用，所述角质形成细胞过度增殖疾病包括银屑病、鱼鳞病和角质形成细胞肿瘤。本发明的优点在于：发掘了丹参酮IIA在制药上的新用途，开拓了一个新的应用领域；对由角质形成细胞过度增殖引起的，或以角质形成细胞过度增殖为特征的皮肤病症，如银屑病、鱼鳞病和角质形成细胞肿瘤，具有良好的治疗效果；丹参酮IIA已经在临床的其他药物中使用，证明其毒副作用极小，可放心使用；物质原料来源丰富、价格低廉、制备工艺简单，具有广阔的产业化前景，适于广泛推广使用。

Description

丹参酮IIA在制备抑制角质形成细胞增殖疾病药中的应用

技术领域

本发明涉及丹参酮IIA在制药领域中的新用途，具体地说，涉及丹参酮IIA在制备抑制角质形成细胞增殖疾病药中的应用。

背景技术

丹参是活血化瘀药物的代表药物之一，最早记载于《神农本草经》，被列为上品。记载有“养血，去新股痼疾，结气”、“一味丹参散，功同四物汤”的说法，常用于治疗淤血症。近年来临床研究发现，丹参能明显改善微循环，扩张冠状动脉，调整心律，降低血脂，促进组织修复与再生。

丹参中含有许多有效成分，其中，丹参酮IIA（TanshinoneIIA）是丹参中研究最为深入的有效成分之一，其结构式为：

该化合物的分子式是：C₁₉H₁₈O₃，分子量294.33，为红褐色粉末或红色晶体粉末，在甲醇、乙醇、氯仿、丙酮中溶解。该化合物可由唇形科植物丹参的干燥根中提取制得，也可直接从生产厂家购买，如上海中国药品生物制品鉴定所。已知丹参酮IIA具有促进多种肿瘤细胞凋亡的作用，可用作多种肿瘤药物的活性组分。

人体的皮肤是由表皮、真皮及皮下组织三部分组成。角质形成细胞是表皮的一种角质蛋白细胞，是构成表皮的重要组成部分。正常情况下，人体表皮细胞有规律地进行增殖、分化和脱落，维持着皮肤糖、蛋白质、脂肪、水和电解质的平衡，具有保护自身、调节体温、排泄废物和免疫调节等功能。正常人的皮肤看上去自然、平滑、滋润、有光泽、且富有弹性。但当角质形成细胞增殖异常时，则会引发一些疾病。目前临床上常见的多种皮肤病症，如银屑病、鱼鳞病以及角质形成细胞肿瘤等，都和角质形成细胞的过度增殖有关。这类皮肤病的主要特征之一为角化度高。例如银屑病，该病是一种常见的复发性炎症性皮肤病，俗称牛皮癣，皮损为对称性泛发的上覆银白鳞屑的斑丘疹、斑块，与正常人的角质形成细胞相比，银屑病的角质形成细胞增殖、分化、调节及代谢异常，表皮细胞过度增殖，表皮细胞核分裂速度及表皮细胞的更新较正常人明显加快，表现为表皮增厚和有明显的银白色鳞屑，从而引起皮肤的免疫、分泌等多方面功能障碍，且该病的发病机制非常复杂，至今尚未完全阐明。这类皮肤病症还表现出难于彻底根治和易复发的特点，严重影响着患者的生活和工作，对他们的身心健康更是造成严重的伤害。因此，亟需一种可抑制角质形成细胞增殖，进而减少鳞屑产生的药物，以缓解或根治银屑病、鱼鳞病和角质形成细胞肿瘤。但是目前关于丹参酮IIA在抑制角质形成细胞增殖中的用途还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种丹参酮IIA在制药中的新用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

丹参酮IIA在制备抑制角质形成细胞过度增殖疾病药中的应用。

所述细胞过度增殖疾病为银屑病；

所述细胞过度增殖疾病为鱼鳞病；

所述细胞过度增殖疾病为角质形成细胞肿瘤。

本发明优点在于：

1、本发明发掘了丹参酮IIA在制药上的新用途，开拓了一个新的应用领域。

2、丹参酮IIA可显著抑制角质形成细胞增殖，对由角质形成细胞过度增殖引起的，或以角质形成细胞过度增殖为特征的皮肤病症，如银屑病、鱼鳞病和角质形成细胞肿瘤，具有良好的治疗效果。

3、丹参酮IIA已经在临床的其他药物中使用，证明其毒副作用极小，因此，对于应用在治疗角质形成细胞过度增殖疾病，治疗银屑病、鱼鳞病和角质形成细胞肿瘤方面，可放心使用。

4、丹参酮IIA物质原料来源丰富、价格低廉、制备工艺简单，具有广阔的产业化前景，适于广泛推广使用。

附图说明

附图1是丹参酮IIA对小鼠角质形成细胞增殖的影响。

附图2是丹参酮IIA抑制小鼠角质形成细胞集落形成图。

附图3是丹参酮IIA处理的小鼠角质形成细胞BrDU染色图。

附图4是丹参酮IIA处理的小鼠角质形成细胞台酚蓝染色图。

附图5是丹参酮IIA诱导小鼠角质形成细胞凋亡调控图。

附图6是Caspase-3抑制剂AC-DVED-CHO对丹参酮IIA处理的小鼠角质形成细胞的影响。

附图7是丹参酮IIA诱导角质形成细胞凋亡不通过凋亡诱导因子的核移位介导的分析图。

附图8是丹参酮IIA对角质形成细胞细胞周期的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

实施例1

丹参酮IIA抑制质形成细胞增殖试验

本实验所用丹参酮IIA购自上海中国药品生物制品鉴定所。取4mg丹参酮IIA溶于1ml二甲基亚砜（购于美国Sigma公司），配成浓度为4mg/ml的储存液，4℃冰箱备用。临用时，用Cnt-07培养液（购于瑞士CELLnTEC公司）配比稀释，使其最终浓度分别为2.5μg/ml，5.0μg/ml，10.0μg/ml和20.0μg/ml。所用小鼠角质形成细胞是通过培养美国癌症研究会小鼠原代角质形成细胞制得。

1、MTS/PMS法检测丹参酮IIA对角质形成细胞增殖的影响

通过MTS/PMS法检测丹参酮IIA对角质形成细胞增殖的抑制作用，结果显示：对于不同浓度的丹参酮IIA药物处理组，处理时间分别24h、48h和72h，丹参酮IIA对角质形成细胞的增殖都表现出抑制作用，且抑制作用具有时间和浓度依赖性。随着作用时间的延长和药物浓度的增加，细胞抑制效果越明显，丹参酮IIA对小鼠角质形成细胞的生长具有量-效、时-效关系（见图1）。计算得到丹参酮IIA对小鼠角质形成细胞的半数抑制浓度IC50在24h、48h和72h分别为4.33±1.35,1.89±0.65,1.14±0.87μg/ml。

2、细胞集落形成实验检测丹参酮IIA对角质形成细胞增殖的影响

单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。集落形成率表示细胞独立生存能力。为观察丹参酮IIA对单个细胞增殖形成细胞集落能力的影响，我们采用细胞集落形成实验，连续观察7d丹参酮IIA对角质形成细胞集落形成（细胞数目≥50个/集落）的干预情况。研究发现，对照组细胞生长良好，细胞集落数量不断增加，在第7d时，细胞几乎长满整个培养皿，而不同浓度丹参酮IIA干预的各组均出现不同程度的细胞集落形成数量的降低。同样发现，随着浓度和时间的增加，角质形成细胞集落形成的数量在不断的减少，提示丹参酮IIA对细胞集落形成能力的抑制也存在时间和剂量的双重影响。在2.5μg/ml浓度下，前3d与对照组相比并没有统计学差异，细胞集落形成较密集。而在5μg/ml与10μg/ml浓度，则显著抑制了细胞集落的形成。特别是在10μg/ml浓度下，从种植细胞第1d开始，就已经几乎没有观察到细胞集落形成（见图2）。

3、5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrDU）掺合法检测丹参酮IIA对角质形成细胞增殖的影响

BrDU染色的原理是：在细胞周期的S期，和细胞一起孵育的BrdU能渗入DNA分子中，再结合BrdU抗体与渗入DNA的BrdU特异性结合，就能够检测到DNA复制活跃的细胞。因此，利用BrDU在特定时间内掺入细胞的多少就可以反应出细胞增殖的状态。我们采用BrDU掺合法进一步观察丹参酮IIA对角质形成细胞增殖的影响。BrDU在对数增殖期4h内掺合进入细胞核的多少，反应了细胞在该时期增殖的活跃程度。如图3A、图3B所示，对照组细胞增殖活跃，在BrDU干预4h内，BrDU进入到绝大多数的细胞核内，提示对照组细胞增殖活跃。而采用丹参酮IIA干预后，BrDU进入细胞核使得细胞呈现核表达的阳性细胞数目不断降低，呈现剂量依赖关系。同时，免疫荧光及Westernblot分析细胞增殖相关抗原PCNA的表达，显示PCNA蛋白降低，进一步佐证细胞增殖水平的降低（见图3C）。

4、台酚蓝染色观察丹参酮IIA处理下的细胞存活率

通常认为细胞膜丧失完整性，细胞即可被认为已经死亡。台盼蓝是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。依据此原理，细胞经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对细胞存活率比较精确的定量分析。我们采用台酚兰染色观察丹参酮IIA对角质形成细胞细胞的影响，结果显示：随着丹参酮IIA浓度的增加，台酚兰阳性细胞数目亦增加，表明较多细胞出现死亡。而空白对照组台酚兰染色阳性率低，大部分细胞为正常存活细胞（见图4）。由此可见，丹参酮IIA可诱导角质形成细胞的死亡。

5、丹参酮IIA抑制角质形成细胞增殖的机理研究

5.1丹参酮IIA诱导角质形成细胞凋亡伴随Caspase-3蛋白的激活

为研究丹参酮IIA诱导细胞凋亡的可能机制，我们采用Westernblot检测了凋亡相关指标DNA修复酶PARP，Caspase-3蛋白的变化，通过免疫组化检测Caspase-3特异性抑制剂干预下的Caspase-3的变化，并通过ELISA方法检测了干预上清液中Caspase-3，Caspase-8的活性。结果显示，不同浓度的丹参酮IIA处理细胞后，出现PARP和Caspase-3的活化，依赖丹参酮IIA浓度的增加而表达增强（见图5A）。加入Casepase-3特异性抑制剂AC-DVED-CHO干预后，免疫组化检测显示，Caspase-3表达降低（见图5B）。上清液ELISA检测显示，Caspase-3表达增强，而Caspase-8活性没有变化。

5.2丹参酮IIA诱导角质形成细胞凋亡依赖Caspase-3蛋白的表达

前述免疫组化结果提示Caspase-3在丹参酮IIA诱导的细胞凋亡活动中占有关键作用。为进一步明确该诱导的凋亡效应是否属于Caspase-3依赖效应，我们采用Caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO干预后行流式细胞检测凋亡数量的定量分析，结果如图6A所示，在10μ/ml条件下，丹参酮IIA诱导角质形成凋亡数目为21.2%，而采用40μMAc-DEVD-CHO干预后，凋亡百分比降低至4.2%（见图6B），两者具有显著的统计学差异。Caspase-3特异性抑制剂能明显降低丹参酮IIA诱导的凋亡百分比，提示其诱导细胞的凋亡是通过Caspase-3信号途径发挥作用。

5.3丹参酮IIA诱导角质形成细胞凋亡不通过凋亡诱导因子（AIF）的核移位介导

采用荧光免疫检测AIF的核移位与凋亡的关系（见图7A）。其中红色荧光为AIF，主要分布在胞浆，蓝色荧光为荧光染料DAPI，染细胞核。若发生AIF核移位现象，则两者的重叠图上应表现为粉红色。在对照组，AIF全部定位在线粒体，呈环形分布，胞浆结构清晰。丹参酮IIA不同治疗浓度下，AIF并没有出现明显核移位。如图7B，Westernblot显示，细胞核中的AIF也没有随着干预药物浓度和时间的增加而明显增加。提示丹参酮IIA诱导的角质形成细胞凋亡，并不依赖于凋亡诱导因子的核移位来介导。

5.4丹参酮IIA诱导角质形成细胞细胞周期的阻滞

细胞增殖另一个重要的因素即是细胞周期的改变。为观察丹参酮IIA对角质形成细胞细胞周期的影响，我们采用Krishanstain染色结合流式细胞仪进行了检测。研究发现，在10μg/ml干预浓度下，G0/G1期细胞百分比在24h，48h和72h分别为55.5%,51.9%and39.2%。而对照组则高达69.20%（见图8A）。连续多次实验显示，随着丹参酮IIA浓度的增加，S期，G2/M期分布的百分比数目亦不断增加（见图8B）。同时，Westernblot检测S期周期相关蛋白发现，pCDK2和CyclinA蛋白表达下降（见图8C）。提示细胞周期阻滞伴随相关蛋白水平的降低。

综上所述，丹参酮IIA可抑制角质形成细胞增殖，其作用机制与诱导细胞S期阻滞、激活Caspase凋亡信号通路相关，且不依赖AIF的核转移。

实施例2

称取30mg丹参酮IIA粉末（购自上海中国药品生物制品鉴定所），加入1000ml70%的乙醇溶液，搅拌，充分溶解混匀后，分装到无菌药瓶中密封，消毒制成产品，阴凉干燥处保存。

疗效试验1：针对60例病龄3年以上，病情相似的银屑病患者，设治疗组：20例，擦涂本实施例的丹参酮IIA溶液；对照组：20例，擦涂西藏红花露（购于西藏红花路藏秘堂）；空白组：20例，擦涂生理盐水。三组的治疗方法均为：用消毒棉签蘸取涂抹物，直接涂到银屑病皮损处，早晚各一次，一个疗程30天，连续使用6个疗程。观察每位患者的皮损角化程度和皮损炎症程度，计算每组患者上述两个指标的平均值，结果对比见表1。

表1

	治疗组	对照组	空白组
				皮损角化程度（%）	10%	38%	57%
皮损炎症程度（%）	21%	30%	46%

从表1中可以看出，本实施例的丹参酮IIA溶液对银屑病治疗效果明显，尤其是针对皮肤角化的病征，效果显著。

疗效试验2：针对45例病龄2年以上，病情相似的鱼鳞病患者，设治疗组：15例，擦涂本实施例的丹参酮IIA溶液；对照组：15例，擦涂美国癣清（购于西安荣源生物药业有限公司）；空白组：15例，擦涂生理盐水。三组的治疗方法均为：用消毒棉签蘸取涂抹物，直接涂到鱼鳞病病灶处，每日2次，一个疗程30天，连续使用4个疗程。观察每位患者的皮损角化程度，结果表明，治疗组有9例痊愈，4例皮肤角化程度减轻75%，2例皮肤角化程度减轻50%；对照组有4例痊愈，7例皮肤角化程度减轻60%，4例皮肤角化程度减轻30%；空白组3例皮肤角化程度减轻25%，7例无明显变化，剩余5例角化程度加重。说明本实施例的丹参酮IIA溶液对治疗鱼鳞病效果比较明显，证实了丹参酮IIA能有效抑制角质形成细胞增殖。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.丹参酮IIA在制备抑制角质形成细胞过度增殖疾病药中的应用，所述的细胞过度增殖疾病为鱼鳞病或角质形成细胞肿瘤。