CN103961339B - 新女贞子苷在抗阿霉素心肌毒性中的应用及以新女贞子苷为主要活性成分的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了新女贞子苷在抗阿霉素心肌毒性中的应用及以新女贞子苷为主要活性成分的药物组合物。本发明采用细胞膜完整性荧光探针与细胞核荧光探针同时标记心肌细胞,从不同的作用机制出发考察待筛选物质对心肌细胞的保护效果,发现了新女贞子苷在抗阿霉素心肌毒性中的新用途,表现为新女贞子苷对心肌细胞细胞膜和细胞核均具有较强保护作用,在FDA和hoechst33342荧光标记下,100μM的新女贞子苷对心肌细胞的保护率分别为29.5%、20.4%。
Description
技术领域
本发明属于药物筛选与评价方法领域,具体涉及新女贞子苷在抗阿霉素心肌毒性中的应用及以新女贞子苷为主要活性成分的药物组合物。
背景技术
新女贞子苷是橄榄中的有效成分,在地中海饮食中占有重要地位。在早期的研究中,人们认为是橄榄油的中橄榄苦苷发挥重要作用,经过不断深入研究发现,橄榄苦苷的水解产物新女贞子苷具有更强的生理活性。其结构简单,分子量小,具有良好的水溶性和脂溶性,能防止辐射、氧自由基及其他因素对视网膜造成损伤,具有良好的治疗和保健功能,受到国内外研究者的广泛关注。
有研究表明,新女贞子苷可诱导细胞内具有解毒作用的二酶相体系,能防止香烟中有毒成分丙烯醛对视网膜造成的损伤,调节线粒体功能,对视觉具有保护作用,对黄斑性变性等眼部疾病具有改善作用(ZhuLu,LiuZhongbo,FengZhihui,etal.HydroxytyrosolprotectsagainstoxidativedamagebysimultaneousactivationofmitochondrialbiogenesisandphaseIIdetoxifyingenzymesystemsinretinalpigmentepithelialcells[J].JNutrBiochem,2010,21(11):1089-1098.)。
公开号为CN101674817B的中国专利文献公开了新女贞子苷在诱导或增强软骨修复或软骨再生中的用途,该申请人发现,新女贞子苷能有效诱导或增强软骨细胞的增殖,刺激软骨细胞增殖和提高它们生产细胞外基质组分的能力,进而促进软骨修复和再生。
申请号为201210203464.3的中国专利文献公开了新女贞子苷用于改进线粒体功能的用途,该申请人发现,新女贞子苷通过线粒体呼吸链复合物的活化和线粒体生物发生的提高改进线粒体功能。
虽然现有技术中已报道新女贞子苷具有多种生物活性,但至今为止还未报道过新女贞子苷能够减轻阿霉素诱发的心肌毒性。
阿霉素(Doxorubicin,DOX)是临床上常用的广谱抗肿瘤药物之一,被广泛地应用于实体瘤、白血病、淋巴瘤、乳腺癌等肿瘤治疗。但阿霉素会产生累积性、剂量依赖性的心肌毒性,并进一步发展成不可逆性心肌损伤,最终导致充血性心力衰竭,因此严重地抑制了其临床应用。因此寻找获得抗阿霉素心肌毒性的活性物质对阿霉素的临床应用具有重要意义。
发明内容
本发明提供了新女贞子苷在抗阿霉素心肌毒性中的应用,申请人研究发现,新女贞子苷对因使用阿霉素而诱发的心肌毒性具有显著抗性,对心肌细胞具有较强的保护作用。
本发明的新女贞子苷新用途是通过如下方法发现的:
(1)将贞芪扶正颗粒用纯水溶解,离心取上清液;
(2)用大孔树脂将所述上清液依次用水、40%乙醇、95%乙醇洗脱,分别收集各洗脱组分,减压浓缩至干;
(3)将浓缩后的洗脱组分通过制备液相色谱进行分离,收集各馏分,干燥后作为待筛选物质,备用;
(4)取心肌细胞,加入待筛选物质进行预保护;
所述心肌细胞优选为对数生长期细胞,可选用常见的H9c2心肌细胞;细胞密度优选为1~100个/μL(对于96孔板为100~10000个/孔),更优选为20~40个/μL,最优选为40个/μL,适宜的细胞密度有利于染色后检测荧光强度并进行比较。
待筛选物质的终浓度可先进行预实验确定,以不会对心肌细胞产生毒性为宜,预保护时间优选为30~180min,更优选为30min。预保护时间过长可能会影响细胞活力,影响筛选和评价结果。
如未作特殊说明,本发明所述终浓度均是指物质加入到体系中后在总体系中的浓度。
(5)预保护完成后,加入阿霉素进行损伤;
作为优选,阿霉素的损伤浓度为0.3~0.6μM,损伤时间为6~24h。更优选的损伤浓度为0.3μM,损伤时间为24h,以模拟实际临床应用中阿霉素低剂量致慢性心肌毒性的过程。同时,适宜的损伤浓度和损伤时间可避免心肌细胞过度受损,影响筛选和评价结果。
(6)向损伤后的心肌细胞中同时加入具有不同激发和发射波长的细胞膜完整性荧光探针与细胞核荧光探针,进行荧光标记;
作为优选,所述细胞膜完整性荧光探针为二乙酸荧光素(FDA),其激发和发射波长分别为488nm和530nm。FDA是一种非极性酯类化合物,其本身并无荧光,但当它通过细胞膜后能被活细胞中的酶水解而产生极性的荧光物质(发绿色荧光);该荧光物质不能通过细胞膜,因此能在细胞膜完整的细胞内留存,而在细胞膜不完整的细胞内则散失很快,从而可以根据其荧光强度判断心肌细胞的膜完整性。
hoechst33342的最大激发和发射波长分别为346nm和460nm。hoechst33342(发蓝色荧光)能与细胞核双链DNA上的碱基特异性结合,DNA受损时,结合在DNA上的荧光探针就减少,荧光强度也相应减弱。与双链DNA结合后,hoechst33342的最大激发和发射波长分别为350nm和461nm。
FDA和hoechst33342的激发和发射波长互不重叠,保证采集荧光图像时不产生干扰。
作为优选,FDA和hoechst33342的荧光标记浓度为8~12μg/mL,荧光标记时间为10~20min,更优选的荧光标记浓度为8~12μg/mL,荧光标记时间为10min,高浓度和长时间的标记染色会对细胞造成一定的损伤。
阿霉素引起心肌毒性的损伤机制主要包括破坏细胞膜的完整性而引起的细胞活力下降,改变细胞线粒体膜电位和诱导细胞凋亡等。基于此,本发明选用了两种荧光探针,从不同的作用机制出发考察待筛选物质对心肌细胞的保护效果。
(7)染色完成后采集、分析细胞荧光图像,分别计算待筛选物质对心肌细胞细胞膜和细胞核的保护率;
保护率的计算公式为:
其中,f为加药保护组的荧光强度,Fm为损伤组的荧光强度,Fc为正常细胞组的荧光强度。
染色完成后,弃去培养液,用PBS洗一遍后吸干,在荧光倒置显微镜平台上读取荧光图像,荧光拍摄参数为:物镜放大倍数2.5倍,曝光时间1000ms,先用绿色荧光滤光片(激发光440-520nm,发射光505nm)拍摄,再用蓝色荧光滤光片(激发光320-400nm,发射光400nm)拍摄;每孔拍摄6幅图像,所得荧光图像经过FluoinsightCell工作站图像拼接、图像识别以及数据数据输出系统进行统计,计算得到保护率。
所述FluoinsightCell工作站图像拼接、图像识别以及数据数据输出系统已在公开号为CN101788480的中国专利文献公开。
(8)从待筛选物质中筛选出对心肌细胞的细胞膜和细胞核的保护率均大于15%的活性物质。
通过上述方法,本发明从贞芪扶正颗粒的提取液中发现,新女贞子苷具有较强的抗阿霉素心肌毒性活性,在FDA和hoechst33342荧光标记下,100μM的新女贞子苷对心肌细胞的保护率分别为29.5%、20.4%。
本发明还提供了一种以新女贞子苷为主要活性成分的药物组合物。
作为优选,所述药物组合物中,新女贞子苷的重量百分比为0.01~99.9%;更优选为30~99%,进一步优选为50~99%。
所述药物组合物的剂型可选用注射剂、注射用无菌粉末、片剂、胶囊剂、醑剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、酊剂、气雾剂、粉雾剂或栓剂;优选为注射剂、注射用无菌粉末、片剂、胶囊剂或糖浆剂;进一步优选为注射剂、片剂或胶囊剂。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明采用细胞膜完整性荧光探针与细胞核荧光探针同时标记心肌细胞,从不同的作用机制出发考察待筛选物质对心肌细胞的保护效果,发现了新女贞子苷在抗阿霉素心肌毒性中的新用途,表现为新女贞子苷对心肌细胞细胞膜和细胞核均具有较强保护作用,在FDA和hoechst33342荧光标记下,100μM的新女贞子苷对心肌细胞的保护率分别为29.5%、20.4%。
附图说明
图1为FDA标记细胞的荧光强度随细胞密度的变化曲线;
图2为Hoechst标记细胞的荧光强度随细胞密度的变化曲线;
图1、图2中,Fluorescenceintensity表示荧光强度,LogCellnumber表示细胞数量的对数值;
图3为Hoechst标记细胞的存活率随DOX浓度的变化曲线;
图4为FDA标记细胞的存活率随DOX浓度的变化曲线;
图3、图4中,CellSurvival(%)表示细胞存活率(%),LogDOX(μM)表示阿霉素浓度(μM)的对数值,Cellnumber表示细胞数量(/孔);
图5为单色荧光标记与双色荧光标记对细胞存活率的影响;
其中,CellSurvival(%)表示细胞存活率(%),LogDOX(μM)表示阿霉素浓度(μM)的对数值,monofluorescenceHoechst表示Hoechst单色荧光标记,monofluorescenceFDA表示FDA单色荧光标记,dualfluorescenceHoechst表示双色荧光标记中的Hoechst荧光标记,dualfluorescenceFDA表示双色荧光标记中的FDA荧光标记;
图6为双色荧光标记下芦丁对心肌细胞的保护效果图(10倍镜下观察);
其中,control表示正常细胞,DOX表示加0.3μM阿霉素处理24h后的细胞,DOX+rutin表示加100μMrutin预保护30min后加0.3μM阿霉素处理24h后的细胞;merge表示将FDA与Hoechst的荧光显微图片合并获得的双色荧光显微图片,通过双色荧光显微图片融合可清晰见到心肌细胞整体形态和细胞核位置;
图7为芦丁对心肌细胞保护作用的量效图;
其中,Rutin表示芦丁,ProtectivePercent(%)表示保护率(%),LogConcentration(μM)表示浓度(μM)的对数值;
图8a为40%乙醇提取物的制备组分中心肌保护活性成分筛选结果及LC-MS分析负离子模式下总离子流图;
图8b为95%乙醇提取物的制备组分中心肌保护活性成分筛选结果及LC-MS分析负离子模式下总离子流图;
图8a、8b中,ProtectivePercent(%)表示保护率(%),relativeabundance表示相对丰度,Time(min)表示出峰时间(分钟)。
图9为新女贞子苷对心肌细胞保护作用的量效图;
其中,Neonuezhenide表示新女贞子苷,ProtectivePercent(%)表示保护率(%),LogConcentration(μM)表示浓度(μM)的对数值。
具体实施方式
(1)FDA和Hoechst标记细胞密度线性考察
取对数生长期的H9c2细胞,用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液消化后,以不同的细胞密度(0,10,100,500,1000,2000,4000,6000,8000,10000个/孔)种于96孔板中间60孔中,周边用PBS代替以避免边缘效应,置于细胞培养箱中分别培养24h,48h,72h;弃去每孔中的培养液,避光,分别用浓度为10μg/mL的FDA和10μg/mL的Hoechst对不同培养时间的细胞进行单色荧光标记,在细胞培养箱中孵育10min,弃去培养液,PBS洗一遍,吸干,在荧光倒置显微镜平台上读取荧光图像。
荧光拍摄参数为:物镜放大倍数2.5倍,曝光时间1000ms,绿色荧光滤光片(激发光440-520nm、发射光505nm),蓝色荧光滤光片(激发光320-400nm,发射光400nm)。每孔拍摄6幅图像,并经过FluoinsightCell工作站荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统将结果进行统计,统计结果如图1、2所示。
由图1、2可见,细胞密度为0到10000个/孔时,FDA和Hoechst标记细胞的荧光强度随细胞密度的增大而增大,而且荧光强度随细胞培养时间的增加而增加,且呈良好的线性关系(R2>0.9)。说明这两种荧光染料的荧光强度在常规细胞实验所需细胞数范围内均能够较好地反映96孔板中细胞的实际数目,可用于准确评价阿霉素损伤程度和药物保护效果。
(2)FDA和Hoechst标记不同细胞密度的阿霉素浓度损伤线性考察
取对数生长期的H9c2细胞,用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液消化后,种于96孔板中间60孔中,周边用PBS代替以避免边缘效应,各板的细胞密度分别为100,500,1000,2000,4000,6000,8000,10000个/孔,置于细胞培养箱中培养24h,弃去培养液;每板加不同浓度的阿霉素(浓度梯度为0.001,0.01,0.1,0.5,1,2,6,10,100μM)进行损伤,损伤时间为24h;每板设置正常细胞组即不加阿霉素组;损伤完成后弃去每孔中的培养液,避光,分别加入100μL浓度为10μg/mL的FDA和10μg/mL的Hoechst对不同培养时间的细胞进行单色荧光标记,在细胞培养箱中孵育10min,弃去培养液,PBS洗一遍,吸干,在荧光倒置显微镜平台上读取荧光图像。
荧光拍摄参数以及处理分析方法同(1),统计结果如图3、4所示。
由图3可见,DOX浓度为0到2μM时,Hoechst标记细胞的存活率随DOX浓度增加而降低,2μM时细胞存活率接近为1%。
由图4可见,DOX为0.001到0.5μM时,FDA标记细胞的存活率随DOX浓度增加而降低,DOX为0.5到10μM时,出现了存活率平台期,当DOX为更高浓度100μM时,细胞存活率才降低。
由此推断,Hoechst能够较为敏感地呈现阿霉素对某细胞器损伤程度,从而反映心肌细胞的细胞核受损情况。
(3)单色荧光与双色荧光标记H9c2细胞下阿霉素毒性的量效关系比较
取对数生长期的H9c2细胞,用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液消化后,以4000个/孔的密度种于96孔板中间60孔中,周边用PBS代替以避免边缘效应,置于细胞培养箱中分别培养24h;弃去培养液,加入不同浓度的盐酸阿霉素(DOX)(0.01,0.1,0.3,0.5,1,2μM)损伤24h;设置正常细胞组即不加阿霉素组;一板用FDA标记,一板用Hoechst标记。染色条件及细胞荧光图像获取和处理方法同(1)。
一板同时用FDA和Hoechst标记,在培养液中同时加入FDA和Hoechst,使两者的终浓度均为10μg/mL,每孔加入100μL,在细胞培养箱中孵育细胞10min,弃去培养液,PBS漂洗一遍,先用绿色荧光滤光片(激发光440-520nm、发射光505nm),拍摄一遍,再用蓝色荧光滤光片(激发光320-400nm、发射光400nm)拍一遍。荧光图像获取及处理方法同(1)。
比较单色荧光标记与双色荧光标记下,H9c2细胞存活率与阿霉素浓度的量效关系,比较结果见图5。
由图5可见,当阿霉素浓度为0.01-2μM时,单色荧光标记和双色荧光标记所得的细胞存活率没有明显的差异,表明双色荧光标记时两个荧光探针不会影响彼此。由于Hoechst标记更为敏感,所以选择Hoechst标记细胞存活率约为50%时阿霉素的浓度(0.3μM)为损伤浓度。
(4)用于评价阳性化合物芦丁的抗阿霉素心肌毒性
取对数生长期的H9c2细胞,用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的消化液消化后,以4000个/孔的密度接种于96孔板中间60孔,周边用PBS代替以避免边缘效应,置于细胞培养箱中37℃孵育24h;分别加入浓度为10、20、40、60、80、100μmol/L的已知心肌保护化合物芦丁,预保护30min,不弃培养液,加入阿霉素,使其终浓度为0.3μM,设置正常细胞组(只加培养液不做其他处理)和模型组(只加阿霉素,不加芦丁),细胞培养箱中孵育24h;弃去每孔中的培养液,并用PBS洗涤一遍,避光加入100μL含10μg/mLFDA和10μg/mLHoechst的培养液,细胞培养箱中孵育10min;弃去培养液,PBS洗一遍,吸干,在荧光倒置显微镜平台上读取荧光图像;双色荧光图像的获取和处理方法同(3)(图6)。通过公式计算保护率并绘制保护率对浓度的量效曲线(图7)并计算芦丁的EC50值。保护率的计算公式为:
其中f为加药保护组的荧光强度,Fm为模型组即损伤组的荧光强度,Fc为正常细胞组的荧光强度。
由图6可见,在高倍镜下观察,FDA标记细胞,当细胞处于正常状态时(control,正常细胞组),形态呈梭形,细胞形态完整,绿色荧光比较亮;阿霉素损伤后(模型组),细胞形态变得不规则,有的细胞有空泡出现,同时绿色荧光强度降低;芦丁预保护后(加药保护组),细胞形态比模型组规则许多,有的甚至呈梭形,空泡减少,绿色荧光强度比模型组增加。Hoechst标记细胞,可以明显的看到模型组被标记的细胞核比正常细胞组的减少,加药保护组被标记的细胞核比模型组增加。证实了本发明的方法可较好的用于评价药物的心肌保护作用。
同时,如图7所示,芦丁对心肌细胞具有很好的保护作用,根据FDA和Hoechst荧光强度计算得到,在10-100μM范内,芦丁对心肌细胞的保护作用呈浓度依赖性,浓度为100μM时保护率分别约为53.6%(FDA染色)和38.9%(Hoechst染色)。
(5)本发明方法用于筛选贞芪扶正中的心肌保护成分
利用本发明方法对有心肌保护作用的贞芪扶正颗粒(购于修正药业)中的活性成分进行筛选,具体如下:
1)将贞芪扶正颗粒用纯水溶解,离心取上清液;
2)用大孔树脂将所述上清液依次用水、40%乙醇、95%乙醇洗脱,分别收集各洗脱组分,减压浓缩至干;
3)将浓缩后的洗脱组分通过制备液相色谱进行分离,收集各馏分,冷冻干燥后作为待筛选组分,用于筛选实验;
4)接种H9c2细胞于96孔板上,细胞密度为4000个/孔,培养24h后,加入含有50μg/mL待筛选组分的培养液(50μg/mL时有细胞毒作用的组分浓度降为25μg/mL或10μg/mL),预保护30min后,加入0.3μM的DOX损伤24h,并设置正常对照组(不加DOX)和模型对照组(0.3μM的DOX),依照第(4)部分中所建立的心肌保护物质的方法,使用FDA和Hoechst进行荧光标记,荧光标记完成后经FluoinsightCell工作站拍摄并处理,计算各待筛选组分对心肌细胞的保护率。
图8a、8b分别为40%、95%乙醇提取物的制备组分中心肌保护活性成分筛选结果及LC-MS分析负离子模式下总离子流图。筛选得到B5,B6,B19,B20,B22五个活性组分。
5)通过液质分析得到组分B19和B20中均含有新女贞子苷;
6)接种H9c2细胞于96孔板上,细胞密度为4000个/孔,培养24h后,加入含有不同浓度(10,20,40,60,80,100μM)新女贞子苷的培养液,预保护30min后,加入0.3μM的DOX损伤24h,并设置正常对照组(不加DOX)和模型对照组(0.3μM的DOX),依照第4)部分中所建立的心肌保护物质的筛选方法,使用FDA和Hoechst进行荧光标记,荧光标记完成后经FluoinsightCell工作站拍摄并处理,得到新女贞子苷对心肌细胞保护作用的量效图(图9)。
由图9可见,新女贞子苷对心肌细胞的保护活性与浓度呈正相关。FDA标记时,100μM新女贞子苷的保护率为29.5%;Hoechst标记时,100μM新女贞子苷的保护率为20.4%。表明FDA标记时比Hoechst标记时具有更高的保护率,提示新女贞子苷有更好的抗氧化作用。
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女贞子化学成分与药理作用的研究进展;靳晓明等;《中医药信息》;20080229;第25卷(第1期);第40至42页 * |
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