CN102980981A - 一种评价防治骨质疏松药物作用的新方法 - Google Patents
一种评价防治骨质疏松药物作用的新方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种模式生物斑马鱼评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，该方法通过选用斑马鱼作为模型动物，通过优化的实验分组方法进行实验分组设计，采用优选的药物给药方式进行给药，采用优选的方法对斑马鱼骨骼进行茜素红染色，采用直观的显微观察捕捉图像，并采用优选的图像分析软件分析骨骼染色区域以反应骨矿化量，整个实验方法可操作性强，能客观的反应药物在斑马鱼体内对骨量生成的影响，能快速、准确评价化合物及复杂中药成分防治骨质疏松的作用。能克服一般体外细胞实验难条件苛刻，难以体现在体效应综合结果的缺点，并克服哺乳动物体内实验耗时长，受试药量大、劳动强度高等缺点。该方法实验结果准确度高，且实验方法可重复性强，所需受试药物量少，成本低，劳动强度低，应用范围广泛，且可成批量进行实验研究，工作效率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种模式生物评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，具体涉及一种用模式生物斑马鱼评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法。
背景技术
活性筛选一直是药物发现的关键环节，也是中药物质基础、作用机理、质量控制、炮制机理、配伍规律等关键领域的不可或缺手段，活性筛选新模型、新方法的研究是中药研究的重要组成部分。
骨质疏松症是一种以骨量减少、骨组织显微结构异常和骨折危险性增加为特征的一类疾病，由于西药长期应用副作用大等缺陷，中药治疗骨质疏松的功效正日益受到重视。但壮骨中药及其成分特别是微量成分的活性评价却不能高效进行，主要存在2个瓶颈问题：一是评价模型问题：现有动物壮骨模型耗时长，用样量大，劳动强度大，使得活性筛选效率低；现有细胞模型成本高，试验条件要求较高，原代培养难度增加，一般的实验室不能进行，此外，体外细胞模型作用环节相对单一，不能体现在体试验的综合效果；二是化合物的数量问题：由于中药成分复杂，很难分离到能满足体内研究的足量化合物，大量的微量成分只能通过细胞模型进行筛选。可见，现有模型难以实现对中药及其成分壮骨活性的高效、灵敏、高通量的筛选。
模式生物是指在人们研究生命现象过程中长期、反复作为研究材料的物种，从这个物种研究中得出的许多生命活动规律往往代表了许多物种共同的规律。其中斑马鱼是一种极好的模式生物，是取代青蛙、果蝇、小白鼠等作为研究对象的优良试验模式鱼。斑马鱼喂养和维持的费用更便宜，所需空间场地不大，易于室内大规模饲养繁殖。成体鱼长3～4cm，养殖成本仅为养小鼠的0.1%-1%。斑马鱼同人类基因的相似度与小鼠相当，且在蛋白质水平上，其关键部位的同源性几乎是100%，所以可用斑马鱼模拟人类疾病[P. Goldsmith, Curr Opin Pharmacol, 4, 504-12 (2004)]。目前，人们已成功的用斑马鱼建立许多人类疾病模型，如神经系统、循环系统、听觉、视觉、癌症等方面的疾病[S. Sumanas and S. Lin, DDT: TARGETS, 3, 89-96 (2004)]。如中国专利200810019040.5公开了一种用斑马鱼研究药物毒性的方法，CN101810866A公开了一种用模式生物斑马鱼筛选抗肝损伤药物的方法，200310108710.8公开了利用斑马鱼基因治疗截瘫等疾病，201010258459.3公开了一种用模式生物斑马鱼研究药物代谢的新方法。斑马鱼与哺乳动物骨骼生长发育的分子机理极为相似，而且近年来越来越多的调节哺乳动物骨骼发育关键基因的同源基因在斑马鱼基因组中被发现。和哺乳动物一样，斑马鱼的骨骼是从三种胚胎干细胞系发育而来，已有研究表明斑马鱼幼鱼骨包含骨形成和骨吸收活动所需的细胞，是较完整体系。骨骼形成机制也包括软骨内骨化和膜内骨化，其过程都受到包括一系列转录因子和激素在内的复杂机制的严格调控，参与调控的关键基因，如runx2, osteonectin, osteoprogenin等与哺乳动物的相关基因具有高度的同源性。哺乳动物与斑马鱼头部骨骼生成所涉及到的转录因子具有极其相似的表达机制和调控方式[Li N, Felber K, Elks P, Croucher P and Roehl HH. Dev Dyn, 238 (2), 459-466(2009)]。斑马鱼具有与哺乳动物相似的调节骨骼发育的关键基因，具有与哺乳动物相似的骨骼形成机制，以及与哺乳动物相似的系统、酶系及基因，为研究人类许多常见疾病的发病机制提供了理想的实验模型，同时也为药物的作用机制、安全性评价及代谢研究提供了理想的实验模型。因此可将它作为具有完整骨骼体系的理想模式生物用于药物对骨骼的作用研究。国内在这方面的研究尚属空白。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种操作方便、成本低、化合物用量少、劳动强度低，且仅需在一般实验室就可进行的模式生物斑马鱼模型来快速评价防治骨质疏松的药物作用效果。
本发明的思路为：利用茜素红作为染色剂给斑马鱼加以染色并可反映出机体内骨矿化量和骨密度的机理为：茜素红与钙离子形成螯合物，使矿化的骨基质染成红色；再用专业图像分析软件计算茜素红染色区域的面积和累积光密度，以分别反应骨矿化量和骨密度，计算平均值，标准偏差，并进行检验；从而可以利用本方法来观察和评估防治骨质疏松药物作用的效果。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
本发明这种用模式生物斑马鱼评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，它包括以下步骤：
步骤一：斑马鱼受精卵的收集：控制斑马鱼成鱼日夜节律，昼夜时间控制在 14-12小时：10-12小时，收集受精卵，置于培养皿中，加入培养基(5mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33mM CaCl2, 0.33mM MgSO4, 10–5%亚甲基蓝)。置于恒温培养箱中培养，温度26°C-30°C。
步骤二：给药方案：
方案一：取受精后3天(3 dpf)斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的培养板中，根据培养板孔的大小每孔加入培养基0.1-2 mL，每个孔里放1-10条幼鱼，分为数组，每组5-15条幼鱼，溶媒阴性对照组和测试药物组。从4 dpf或5 dpf开始加入溶媒和测试药物，加药方法是吸净培养板孔里的培养基后迅速加入溶液，每个药物浓度做2或3份，溶媒对照浓度与药物测试组的溶媒浓度相当，将培养板密封放入26°C-30°C恒温培养箱中培养。培养周期5-7天，每天将每个孔里的溶液吸出一半，加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎受精后9-11天或者10-12天。
方案二：取受精后3天(3 dpf)斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的培养板中，加入培养基0.1-2mL，根据培养板孔的大小每个孔里放1-10条幼鱼，分为数组，每组5-15条鱼，溶媒阴性对照组、模型药物组(泼尼松龙或地塞米松)和测试药物组。造模药和溶媒从4 dpf或5 dpf开始加入，测试药可与模型药同时在4 dpf 或者5 dpf加入，也可在模型药物加入48小时后加入，加药方法同“方案一”，即吸净培养孔板里的培养基后迅速加入溶液，每个药物浓度做2或3份，溶媒对照浓度与药物测试组的溶媒浓度相当，将培养板密封放入26°C-30°C恒温培养箱中培养。培养周期5-7天，每天将每个孔里的溶液吸出一半，加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎受精后9-11天或者10-12天。
步骤三： 斑马鱼骨骼茜素红染色：将培养至受精后9-11天或者10-12天的斑马鱼幼鱼用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)处死，然后将幼鱼固定于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中2-3 h。将固定液4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液去除，然后将斑马鱼幼鱼置于50%乙醇中10 min，去除乙醇，加入用0.5%KOH配制的茜素红染色液，放置过夜，去除染色液，加入超纯水洗去多余的染液后加入新鲜配制的漂白剂(1.5%H2O2和1%KOH)，放置20 min-2 h，去除漂白剂后，加入3:1的0.5%KOH和甘油的混合溶液30 min-8 h，然后更换溶液为1:1的0.5% KOH和甘油的混合溶液6 h-24 h，最后更换溶液为1:3的0.5% KOH和甘油的混合溶液6 h-24 h，最后保存于纯甘油中。
步骤四：斑马鱼骨骼染色的检测与分析：用倒置显微镜观察步骤三中茜素红染色的斑马鱼头骨腹面，用成像软件采集图像(放大100倍)，所有的图像均采用相同的光强度和曝光设置。用专业图像分析软件计算茜素红染色区域的面积和累积光密度(IOD)，以分别反应骨矿化量和骨密度。计算平均值，标准偏差，并进行t检验。
作为优选方案，以上所述的模式生物斑马鱼评价防治骨质疏松药物作用的新方法，其中步骤二中的溶媒阴性对照组、模型药物组和测试药物组均平行设3个组，保证实验的科学性。
作为优选方案，其中步骤一和步骤二所述的培养温度为28°C-29°C。
作为优选方案，其中步骤二所述的培养板为96孔、48孔、24孔、12孔或6孔培养板，其中较优的为24孔板，每孔加入培养基0.5-1.5mL，每孔放5-10条幼鱼。
作为优选方案，其中步骤二所述的溶媒为水或者是含有0~1%二甲基亚砜(DMSO)助溶剂的水溶液。对于水溶性较差的药物，采用二甲基亚砜助溶，可以有效提高药物的水溶性，使药物均匀分散于水溶中。
作为优选方案，步骤二的方案一所述的测试药不含造模药(泼尼松龙或地塞米松)；步骤二的方案二所述的测试药含有造模药(泼尼松龙或地塞米松)，且所含造模药的浓度与模型组的造模药浓度相同。
作为优选方案，步骤二中斑马鱼鱼龄选择受精后3天的斑马鱼幼鱼，溶媒和药物从斑马鱼受精后4天或者受精后5天开始加入，培养周期为5天，培养至受精后9天或者10天。
作为优选方案，步骤二中方案二的测试药加入有两种方法：一种是与溶媒或模型药物的加入方法相同，在斑马鱼幼鱼4 dpf或者5 dpf加入；另一种是在模型药诱导48小时后加入测试药。均培养至受精后9天或者10天。
作为优选方案，以上所述的评价防治骨质疏松药物作用的模式生物斑马鱼新方法，其中步骤三中采用斑马鱼骨骼茜素红染色，茜素红骨骼固定染色是经典、可靠、组织特异性强的染色方法，不仅可对幼鱼染色，也可分析成鱼骨骼。
作为优选方案，以上所述的评价防治骨质疏松药物作用的模式生物斑马鱼新方法，用倒置显微镜观察茜素红染色的斑马鱼头骨腹面，并采集头部骨骼图像。
作为优选方案，步骤四中分析茜素红染色的面积采用专业图像分析软件Image pro plus 6.0进行分析，首先对茜素红染色的区域的色调，饱和度和强度设定一个阈值，样品阈值设定后应用于同一板幼鱼的其他所有图像中，再计算图像茜素红染色区域的面积和累积光密度(IOD)，作为斑马鱼骨骼的检测指标，来反应骨骼矿化量。
作为优选方案，本发明所述的评价防治骨质疏松药物作用的模式生物斑马鱼新方法，筛选的受试药物可为化学药品、中药及其提取物、中药复方及其提取物、天然药物，或它们的组合物，作为进一步的优选方案，所述的受试药物为鲑鱼降钙素、依替膦酸二钠、续断提取物、续断皂苷类及淫羊藿黄酮类化合物等。
地塞米松为肾上腺皮质激素类药。具有抗炎、抗过敏、抗风湿、免疫抑制等作用，长期使用有骨质疏松及骨折的副作用，是大鼠骨质疏松模型常用造模药物。
泼尼松龙为肾上腺皮质激素类药物。具有抗炎、抗过敏和抑制免疫等多种药理作用，长期使用也会产生骨质疏松的副作用，也是大鼠骨质疏松模型常用的造模药物。
故本发明选择地塞米松和泼尼松龙为诱导斑马鱼骨质疏松的模型药物。
鲑鱼降钙素是调节钙代谢，抑制甲状旁腺素的激素之一，它能显著地降低高周转性骨病的骨钙丢失，如骨质疏松症，它能抑制破骨细胞活性，同时刺激成骨细胞形成，也能抑制溶骨作用。临床用于骨质疏松症和痛性骨病等。
依替膦酸二钠是抗骨质疏松药，为骨吸收抑制剂。在低剂量时，通过抑制破骨细胞活性，防止骨的吸收、降低骨转换率而达到骨钙调节作用。
故本发明选择鲑鱼降钙素、依替膦酸二钠为西药代表测试药。
续断是传统壮骨中药，具补肝肾、强筋骨、调血脉、续折伤及止崩漏之功效。用于腰背酸痛；肢节痿痹；跌扑创伤、损筋折骨、胎动漏红、血崩、遗精、痈疽带下、疮肿，临床在骨伤科用药非常广泛，续断中主要含有三萜皂苷类、生物碱类和环烯醚萜类等成分，续断能有效促进成骨细胞的分化、增殖,防止成骨细胞凋亡[程志安, 吴燕峰, 黄智清, 曾志勇, 谢文峰, 罗懿明, 萧劲夫和刘尚礼. 中医正骨, 16(16), 1-3 (2004)]，其中皂苷类化合物是续断促进骨损伤愈合作用的活性组分，川续断皂苷VI是主要活性皂苷，具有促进人骨髓间充值细胞向成骨细胞方向转化的活性[武密山, 赵素芝, 任立中, 王茹, 白霞, 韩红伟和李彬. 中国药理学通报, 28(28), 222-6 (2012)]。
淫羊藿也是知名传统壮骨中药，具有补肾阳，强筋骨，祛风湿的功效。用于肾阳虚衰，阳痿遗精，筋骨痿软，风湿痹痛，麻木拘挛。淫羊藿中主要含黄酮类化合物、生物碱、挥发油等成分，其中淫羊藿总黄酮具有促进成骨细胞增殖和分化的功能，黄酮单体具有抗骨质疏松作用，如淫羊藿苷元及其苷类在体外具有促进成骨细胞活性、抑制破骨细胞活性的作用[J Huang, L Yuan, X Wang, TL Zhang and K Wang. Life sciences, 81(81), 832-40 (2007)]。
故本发明选择续断、淫羊藿及其活性成分为中药代表测试药。
与小鼠、大鼠、犬等哺乳动物不同，斑马鱼的体积较小，口服或注射给药方式很困难，因此，步骤二中本发明将受试药物溶解于斑马鱼所生活的溶媒中，斑马鱼会自主的通过腔道和皮肤连续的从溶液中吸收受试药物。
有益效果：本发明提供的评价防治骨质疏松药物作用效果的模式生物斑马鱼新方法和现有技术相比具有以下优点：
本发明提供的评价防治骨质疏松药物作用效果的模式生物斑马鱼新方法，选用斑马鱼作为模型动物，通过优化的实验分组方法，保证实验结果的准确性，尤其是对斑马鱼鱼龄的优选、药物给药方式和给药时间的优选、斑马鱼骨骼染色、显微检测、图像捕获及图像软件分析骨矿化量的优选，整个实验方法条件简单、可操作性强，能客观的反应药物对斑马鱼骨骼作用的真实情况，实验结果准确度高，能克服一般体外成骨和破骨细胞活性评价实验条件苛刻、难以体现在体效应综合结果的缺点，且能克服一般体内防治骨质疏松药效实验耗时长、所用药量大、劳动强度大的缺点，且实验方法可重复性强，尤其是所需受试药物量少(μg～mg数量样品)，成本低，劳动强度低，应用范围广泛，且可在培养板中高通量成批进行实验研究，工作效率高。
附图说明
图1 0.5%DMSO溶媒对照组斑马鱼骨检测照片
图2模型药物组(10 μM地塞米松)斑马鱼骨检测照片
图3模型药物组(10 μM泼尼松龙)斑马鱼骨检测照片
图4模型药物组(25 μM泼尼松龙)斑马鱼骨检测照片
图5依替膦酸二钠组(15 μg/mL依替膦酸二钠)斑马鱼骨检测照片
图6依替膦酸二钠组(含10 μM地塞米松的15 μg/mL依替膦酸二钠)斑马鱼骨检测照片
图7依替膦酸二钠组(含10 μM泼尼松龙的30 μg/mL依替膦酸二钠)斑马鱼骨检测照片
图8 鲑鱼降钙素组(含25 μM泼尼松龙的8.3 ng/mL鲑鱼降钙素)斑马鱼骨检测照片
图9淫羊藿苷组 (含10 μM泼尼松龙的20 ng/mL淫羊藿苷)斑马鱼骨检测照片
图10淫羊藿总黄酮组 (10 ng/mL淫羊藿总黄酮)斑马鱼骨检测照片
图11川续断皂苷VI组(含25 μM泼尼松龙的25 ng/mL川续断皂苷VI )斑马鱼骨检测照片
图12续断总皂苷组(含10 μM泼尼松龙的100 ng/mL续断总皂苷)斑马鱼骨检测照片
图13空白培养基组斑马鱼骨检测照片
图14续断总提物组(25 ng生药/mL续断总提物)斑马鱼骨检测照片
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的样品浓度、给药方式与方法、斑马鱼骨骼染色与检测条件及斑马鱼骨矿化分析方法与结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例一
地塞米松诱导斑马鱼产生骨质疏松
1. 材料与仪器
受试药物：地塞米松
配制方法：精密称取地塞米松适量，加入少量DMSO使溶解，用培养基配制成1 μM、2.5 μM、10 μM和25 μM的0.5%DMSO的溶液。
实验动物：斑马鱼成鱼(南京大学模式动物研究所)。
试剂：地塞米松(sigma-aldrich，批号：077K10501；≥97%)；茜素红S(郑州四季化工产品有限公司，批号：Sj20110806)；多聚甲醛(成都市科龙化工试剂厂，批号：20100504)；MS-222 (Acros Organics，批号：A0288328)。
仪器：ZEISS荧光倒置显微镜Axio observer.A1(蔡司光学仪器国际贸易有限公司)；生化培养箱SPX-80(宁波海曙赛褔实验仪器厂)。
相关软件：图像采集软件：AxioVisionRel.4.6；图像分析软件：Image pro plus 6.0
2. 实验方法
2.1给药
将3 dpf(受精后3天)的斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的24孔板中，每孔加入培养基1 mL，每孔放5条幼鱼，10-15条鱼/组，分为模型药物组(地塞米松)、溶媒阴性(0.5%DMSO)对照组，每组做2份。从4 dpf开始加入药物(1 μM、2.5 μM、10 μM和25 μM地塞米松和0.5%DMSO)，吸净24孔板里的培养基后迅速加入溶液，将24孔板密封放入28.5°C恒温培养箱中培养。培养周期5天，每天将每个孔里的溶液用移液枪吸出一半，加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎9 dpf。
2.2斑马鱼骨骼染色
培养9 dpf的斑马鱼置于MS-222中麻醉致死，去除MS-222溶液，置于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定2 h-3 h，去除4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液固定液，置于50%乙醇中10 min，去除乙醇，加入用0.5%KOH配制的茜素红染色液，放置过夜，去除染色液，加入超纯水洗去多余的染液后加入新鲜配制的漂白剂(1.5%H2O2和1%KOH)，放置20 min-2 h，去除漂白剂后，加入3:1的0.5%KOH和甘油的混合溶液30 min-8 h，然后更换溶液为1:1的0.5% KOH和甘油的混合溶液6 h-24 h，最后更换溶液为1:3的0.5% KOH和甘油的混合溶液6 h-24 h，最后保存于纯甘油中。
2.3染色的矿化骨骼定量分析
用ZEISS荧光倒置显微镜观察茜素红染色的斑马鱼头骨腹面，用AxioVisionRel.4.6成像软件采集图像(100倍)，所有的图像均采用相同的光强度和曝光设置。用专业图像分析软件Image pro plus 6.0计算茜素红染色区域的面积和累积光密度(IOD)，以分别反应骨矿化量和骨密度。用Excel软件计算平均值，标准偏差，并进行t-检验。
2.4斑马鱼骨骼染色的显微检测重复性
对斑马鱼幼鱼骨骼染色后，将一条幼鱼用荧光倒置显微镜观察，捕获、采集图像。再将幼鱼转移到新的孔中，重新定位后再次进行图像的捕获、采集。重复5次。用图像分析软件计算染色面积和累积光密度(IOD)。计算平均值、标准偏差及变异系数。
3. 实验结果
斑马鱼骨骼染色的显微检测重复性：斑马鱼幼鱼用茜素红染色后，头骨骨骼部分呈红色，而非骨组织耳石部分呈棕黑色。显微成像后用图像分析软件计算红色部分面积之和以及累积光密度。重复性试验结果良好：红色染色面积之和的平均值为21352.6，标准差SD为256.00，变异系数CV为1.19%(n=5)；红色染色部分累积光密度(IOD)的平均值为14100.97，标准差SD为459.13，变异系数CV为3.25%(n=5)。
采用AxioVisionRel.4.6软件采集放大100倍的图像，采用图像分析软件Image pro plus 6.0对染色区域进行定量分析，得到头部骨骼染色面积以及累积光密度(IOD)值(具体实验结果表1)。
结果：与阴性对照组0.5%DMSO(见图1)相比，低浓度地塞米松(1 μM)对斑马鱼骨矿化面积影响不明显，但随着地塞米松浓度的增加，骨矿化面积呈显著降低趋势。当地塞米松浓度为10 μM(见图2)和25 μM时，斑马鱼骨骼矿化量和骨密度与溶媒阴性对照组相比差异呈显著性(P<0.001，P<0.01)。提示2.5 μM~25 μM地塞米松可诱导斑马鱼形成骨质疏松。
表1 地塞米松对斑马鱼骨骼染色面积和累积光密度的影响(n=5-7)
t检验：*P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001 vs 对照组DMSO。
实施例二
泼尼松龙诱导斑马鱼产生骨质疏松
1. 材料与仪器
受试药物：泼尼松龙
配制方法：精密称取泼尼松龙适量，加入少量DMSO使溶解，用培养基配制成1 μM、2.5 μM、10 μM和25 μM的0.5%DMSO的溶液。
试剂：泼尼松龙(苏州亚科化学试剂股份有限公司，批号：YK2012020101)；茜素红S、多聚甲醛和MS-222同实施例一。
实验动物和仪器同实施例一。
相关软件同实施例一。
2. 实验方法
2.1给药
将3 dpf(受精后3天)的斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的24孔板中，每孔加入培养基1 mL，每孔放5条幼鱼，10条幼鱼/组/2孔，分为模型药物组(泼尼松龙)、溶媒阴性(0.5%DMSO)对照组。从4 dpf开始加入药物(1 μM、2.5 μM、10 μM和25 μM泼尼松龙和0.5%DMSO)，吸净24孔板里的培养基后迅速加入溶液，将24孔板密封放入28.5°C恒温培养箱中培养。培养周期5天，每天将每个孔里的溶液用移液枪吸出一半，加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎9 dpf。
2.2. 斑马鱼骨骼染色
参见“实施例一中2.2斑马鱼骨骼染色”。
2.3染色的矿化骨骼定量分析
参见“实施例一中2.3染色的矿化骨骼定量分析”。
3. 实验结果
采用AxioVisionRel.4.6图像采集软件将图像采集后放大100倍，采用图像分析软件Image pro plus 6.0对染色区域进行定量分析，得到头部骨骼染色面积以及累积光密度(IOD)(具体实验结果表2)。
结果：与阴性对照组0.5%DMSO相比，低浓度泼尼松龙(1 μM)对斑马鱼骨矿化面积影响不明显，但随着泼尼松龙浓度的增加，骨矿化面积呈显著降低趋势。当泼尼松龙浓度为2.5 μM和10 μM(见图3)时，斑马鱼骨骼染色面积和累积光密度(IOD)与溶媒阴性对照组(0.5%DMSO)相比呈显著性降低(P<0.01)，当泼尼松龙浓度提高至25 μM(见图4)时，这种差异呈极显著性(P<0.001)。提示2.5~25 μM泼尼松龙可诱导斑马鱼骨骼矿化量显著降低，成功诱导斑马鱼形成骨质疏松。
表2 泼尼松龙对斑马鱼骨骼染色面积和累积光密度的影响(n=5-8)
t检验：*P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001 vs 对照组DMSO。
实施例三
依替膦酸二钠对斑马鱼骨骼的影响
1. 材料与仪器
受试药物：依替膦酸二钠
配制方法：精密称取依替膦酸二钠置于10 mL容量瓶中，加入少量DMSO使溶解并定容，用培养基配制成2.5 μg/mL、15 μg/mL、30 μg/mL的依替膦酸二钠溶液。
试剂：依替膦酸二钠(中国药品生物制品检定所，批号：101174-201001)；茜素红S、多聚甲醛和MS-222同实施例一。
实验动物和仪器同实施例一
相关软件：图像采集软件：AxioVisionRel.4.6，图像分析软件：Image J。
2. 实验方法
2.1给药
将3 dpf(受精后3天)的斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的24孔板中，分成4组，10条幼鱼/组/2孔，每孔加入培养基1 mL，到斑马鱼4 dpf，吸净24孔板中的培养基，1组给予0.5%DMSO阴性对照，其余3组给予2.5 μg/mL、15 μg/mL和30 μg/mL的依替膦酸二钠溶液，28.5°C恒温培养，每天将每个孔里的溶液用移液枪吸出一半，加入等体积新溶液，培养至9 dpf。
2.2斑马鱼骨骼染色
参见“实施例一中2.2斑马鱼骨骼染色”。
2.3染色的矿化骨骼定量分析
参见“实施例一中2.3染色的矿化骨骼定量分析”。
3. 实验结果
采用AxioVisionRel.4.6软件采集放大100倍的图像，采用图像分析软件Image J对染色区域进行定量分析，得到头部骨骼染色面积以及累积光密度(IOD)(具体实验结果表3)。
结果：与阴性对照组0.5%DMSO相比，15 μg/mL(见图5)和30 μg/mL的依替膦酸二钠组的斑马鱼染色面积和累积光密度(IOD)都显著性增加，随着依替膦酸二钠浓度的增加，其增加的趋势更明显，提示依替膦酸二钠可增加斑马鱼骨骼矿化量。
表3依替膦酸二钠对斑马鱼骨骼染色面积和累积光密度的影响(n=5-7)
t检验：*P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001 vs 对照组DMSO。
实施例四
依替膦酸二钠对地塞米松诱导的斑马鱼骨质疏松的防治作用
1. 材料与仪器
受试药物：依替膦酸二钠
配制方法：精密称取依替膦酸二钠置于10 mL容量瓶中，加入少量DMSO使溶解并定容，用培养基配制成含10 μM地塞米松的2.5 μg/mL、15 μg/mL、30 μg/mL的依替膦酸二钠溶液。
试剂：地塞米松、茜素红S、多聚甲醛和MS-222同实施例一；依替膦酸二钠同实施例三。
实验动物和仪器同实施例一。
相关软件同实施例一
2. 实验方法
2.1给药
将3 dpf(受精后3天)的斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的24孔板中，分成5组，10条幼鱼/组/2孔，每孔加入培养基1 mL，到斑马鱼4 dpf，吸净24孔板中的培养基，1组给予0.5%DMSO阴性对照，其余4组给予10 μM地塞米松模型药，28.5°C恒温培养，48 h后，将其中3组模型药分别换为含10 μM地塞米松的2.5 μg/mL、15 μg/mL和30 μg/mL的依替膦酸二钠溶液，每天将每个孔里的溶液用移液枪吸出一半，加入等体积新溶液，培养至9 dpf。
2.2斑马鱼骨骼染色
参见“实施例一中2.2斑马鱼骨骼染色”。
2.3染色的矿化骨骼定量分析
参见“实施例一中2.3染色的矿化骨骼定量分析”。
3. 实验结果
采用AxioVisionRel.4.6软件采集放大100倍的图像，采用图像分析软件Image pro plus 6.0对染色区域进行定量分析，得到头部骨骼染色面积以及累积光密度(IOD)(具体实验结果表4)。
结果：10 μM地塞米松模型组与0.5%DMSO组的矿化面积和IOD值存在极显著性差异(P<0.001和P<0.01)，提示地塞米松成功诱导斑马鱼骨质疏松。与地塞米松模型组比，依替膦酸二钠组随着药物依替膦酸二钠浓度的增加，矿化面积和IOD值均呈增加的趋势，当依替膦酸二钠浓度为15 μg/mL(见图6)和30 μg/mL时，矿化面积和IOD值极显著性增加(P<0.01)，提示依替膦酸二钠可防止并扭转地塞米松诱导的斑马鱼骨量丢失。
表4 依替膦酸二钠对地塞米松诱导的斑马鱼骨骼染色面积和累积光密度减少的影响(n=5-7)
t检验：*P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001 vs 10 μM地塞米松。
实施例五
依替膦酸二钠对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松的防治作用
1. 材料与仪器
受试药物：依替膦酸二钠
配制方法：精密称取依替膦酸二钠置于10 mL容量瓶中，加入少量DMSO使溶解并定容，用培养基配制成含10 μM泼尼松龙的 2.5 μg/mL、15 μg/mL、30 μg/mL的依替膦酸二钠溶液。
试剂：泼尼松龙同实施例二；依替膦酸二钠同实施例三；茜素红S、多聚甲醛和MS-222同实施例一。
实验动物和仪器同实施例一。
相关软件同实施例一
2. 实验方法
2.1给药
将3 dpf(受精后3天)的斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的24孔板中，分成5组，10条幼鱼/组/2孔，每孔加入培养基1 mL，到斑马鱼4 dpf，吸净24孔板中的培养基，1组给予0.5%DMSO阴性对照，其余4组给予10 μM泼尼松龙模型药，28.5°C恒温培养，48h后，将其中3组模型药分别换为含10 μM泼尼松龙的2.5 μg/mL、15 μg/mL和30 μg/mL的依替膦酸二钠溶液，每天将每个孔里的溶液用移液枪吸出一半，加入等体积新溶液，培养至9 dpf。
2.2斑马鱼骨骼染色
参见“实施例一中2.2斑马鱼骨骼染色”。
2.3染色的矿化骨骼定量分析
参见“实施例一中2.3染色的矿化骨骼定量分析”。
3. 实验结果
采用AxioVisionRel.4.6软件采集放大100倍的图像，采用图像分析软件Image pro plus 6.0对染色区域进行定量分析，得到头部骨骼染色面积以及累积光密度(IOD)(具体实验结果表5)。
结果：10 μM泼尼松龙模型组与DMSO组的矿化面积和IOD值存在极显著性差异(P<0.01)，提示泼尼松龙成功诱导斑马鱼骨质疏松。与泼尼松龙模型组比，依替膦酸二钠组随着药物依替膦酸二钠浓度的增加，矿化面积和IOD均呈增加的趋势，当依替膦酸二钠浓度为15 μg/mL和30 μg/mL(见图7)时，矿化面积和IOD值极显著性增加(P<0.01)，提示依替膦酸二钠可防止并扭转泼尼松龙诱导的斑马鱼骨量丢失。
表5 依替膦酸二钠对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨骼染色面积和累积光密度减少的影响(n=5-8)
t检验： **P<0.01, *** P<0.001 vs 10 μM泼尼松龙。
实施例六
鲑鱼降钙素对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松的防治作用
1. 材料与仪器
受试药物：鲑鱼降钙素
配制方法：精密量取鲑鱼降钙素置于10 mL容量瓶中，用培养基配制成含25 μM泼尼松龙的0.83 ng/mL、1.66 ng/mL、8.3 ng/mL的鲑鱼降钙素溶液。
试剂：泼尼松龙同实施例二；鲑鱼降钙素注射液(诺华制药，批号：S0172)；茜素红S、多聚甲醛和MS-222同实施例一。
实验动物和仪器同实施例一。
相关软件：图像采集软件：AxioVisionRel.4.6，图像分析软件：ImageEX。
2. 实验方法
2.1给药
将3 dpf(受精后3天)的斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的24孔板中，分成5组，10条幼鱼/组/2孔，每孔加入培养基1 mL，到斑马鱼5 dpf，吸净24孔板中的培养基，1组给予0.5%DMSO阴性对照，其余4组给予25 μM泼尼松龙模型药，28.5°C恒温培养，48 h后，将其中3组模型药分别换为含25 μM泼尼松龙的0.83 ng/mL、1.66 ng/mL、8.3 ng/mL的鲑鱼降钙素溶液，每天将每个孔里的溶液用移液枪吸出一半，加入等体积新溶液，培养至10 dpf。
2.2斑马鱼骨骼染色
参见“实施例一中2.2斑马鱼骨骼染色”。
2.3染色的矿化骨骼定量分析
参见“实施例一中2.3染色的矿化骨骼定量分析”。
3. 实验结果
采用AxioVisionRel.4.6软件采集放大100倍的图像，采用图像分析软件ImageEX对染色区域进行定量分析，得到头部骨骼染色面积以及累积光密度(IOD)(具体实验结果表6)。
结果：25 μM泼尼松龙模型组与0.5%DMSO组的骨骼矿化面积和IOD值存在极显著性差异(P<0.001)，提示泼尼松龙成功诱导斑马鱼骨质疏松。与泼尼松龙模型组比，鲑鱼降钙素组随着药物浓度的增加，矿化面积和IOD均呈增加的趋势，鲑鱼降钙素浓度为0.83 ng/mL时，矿化面积和IOD值极显著性增加(P<0.01)，且在1.66 ng/mL鲑鱼降钙素的矿化面积和8.3 ng/mL鲑鱼降钙素(见图8)的IOD值极显著性增加(P<0.001)，提示鲑鱼降钙素可防止并扭转泼尼松龙诱导的斑马鱼骨量丢失。
表6 鲑鱼降钙素对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨骼染色面积和累积光密度减少的影响(n=5-8)
t检验：*P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001 vs 25μM泼尼松龙。
实施例七
淫羊藿苷对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松的防治作用
1. 材料与仪器
受试药物：淫羊藿苷
配制方法：精密称取淫羊藿苷置于10 mL容量瓶中，加入少量DMSO使溶解并定容，用培养基配制成含25 μM泼尼松龙的10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL的淫羊藿苷溶液。
试剂：泼尼松龙同实施例二；淫羊藿苷(中国药品生物制品检定所；批号：110737-200415)；茜素红S、多聚甲醛和MS-222同实施例一。
实验动物和仪器同实施例一。
相关软件同实施例一
2. 实验方法
2.1给药
将3 dpf(受精后3天)的斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的24孔板中，分成5组，10条幼鱼/组/2孔，每孔加入培养基1 mL，到斑马鱼5 dpf，吸净24孔板中的培养基，1组给予0.5%DMSO阴性对照，其余4组给予25 μM泼尼松龙模型药，28.5°C恒温培养，48 h后，将其中3组模型药分别换为含25 μM泼尼松龙的10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL的淫羊藿苷溶液，每天将每个孔里的溶液用移液枪吸出一半，加入等体积新溶液，培养至10 dpf。
2.2斑马鱼骨骼染色
参见“实施例一中2.2斑马鱼骨骼染色”。
2.3染色的矿化骨骼定量分析
参见“实施例一中2.3染色的矿化骨骼定量分析”。
3. 实验结果
采用AxioVisionRel.4.6软件采集放大100倍的图像，采用图像分析软件Image pro plus 6.0对染色区域进行定量分析，得到头部骨骼染色面积以及累积光密度(IOD)(具体实验结果表7)。
结果：25 μM泼尼松龙模型组与0.5%DMSO组的矿化面积和IOD值存在极显著性差异(P<0.01和P<0.001)，提示泼尼松龙成功诱导斑马鱼骨质疏松。与25 μM泼尼松龙模型组相比，10 ng/mL和20 ng/mL(见图9)的淫羊藿苷具有显著性扭转泼尼松龙所致斑马鱼骨量减少的作用，其染色面积显著性增加，但是随着浓度的加大，染色面积和累积光密度增加的幅度不大。
表7 淫羊藿苷对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨骼染色面积和累积光密度减少的影响(n=5-8)
t检验：*P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001 vs 25 μM泼尼松龙。
实施例八
淫羊藿总黄酮对斑马鱼骨骼的影响
1. 材料与仪器
受试药物：淫羊藿总黄酮
配制方法：精密称取淫羊藿总黄酮置于10 mL容量瓶中，加入少量DMSO使溶解并定容，用培养基配制成2.5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL和100 ng/mL的淫羊藿总黄酮溶液。
试剂：淫羊藿总黄酮(总黄酮含量为63%)；茜素红S、多聚甲醛和MS-222同实施例一。
实验动物和仪器同实施例一。
相关软件同实施例一。
2. 实验方法
2.1给药
将3 dpf(受精后3天)的斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的24孔板中，分成5组，10条幼鱼/组/2孔，每孔加入培养基1 mL，到斑马鱼4 dpf，吸净24孔板中的培养基，1组给予0.5%DMSO阴性对照，其余4组给予2.5 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL和100 ng/mL的淫羊藿总黄酮溶液，28.5°C恒温培养，每天将每个孔里的溶液用移液枪吸出一半，加入等体积新溶液，均培养至9dpf。
2.2斑马鱼骨骼染色
参见“实施例一中2.2斑马鱼骨骼染色”。
2.3染色的矿化骨骼定量分析
参见“实施例一中2.3染色的矿化骨骼定量分析”。
3. 实验结果
采用AxioVisionRel.4.6软件采集放大100倍的图像，采用图像分析软件Image pro plus 6.0对染色区域进行定量分析，得到头部骨骼染色面积以及累积光密度(IOD)值(具体实验结果表8)。
结果：与阴性对照组0.5%DMSO相比，10 ng/mL淫羊藿总黄酮组(见图10)的斑马鱼染色面积和累积光密度(IOD)值都显著性增加，提示淫羊藿总黄酮有增加斑马鱼骨骼矿化量的作用。
表8 淫羊藿总黄酮对斑马鱼骨骼染色面积和累积光密度的影响(n=5-8)
t检验：*P<0.05 vs 对照组DMSO。
实施例九
续断皂苷VI对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松的防治作用
1. 材料与仪器
受试药物：续断皂苷VI
配制方法：精密称取续断皂苷VI置于10 mL容量瓶中，加入少量DMSO使溶解并定容，用培养基配制成含25 μM泼尼松龙的 2.5 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的续断皂苷VI溶液。
试剂：泼尼松龙同实施例二；续断皂苷VI(自制，含量≥98%)；茜素红S、多聚甲醛和MS-222同实施例一。
实验动物和仪器同实施例一。
相关软件同实施例一。
2. 实验方法
2.1给药
将3 dpf(受精后3天)的斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的24孔板中，分成6组，10条幼鱼/组/2孔，每孔加入培养基1 mL，到斑马鱼5 dpf，吸净24孔板中的培养基，1组给予0.5%DMSO阴性对照，1组给予25 μM泼尼松龙溶液，其余4组给予含25 μM泼尼松龙的 2.5 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的续断皂苷VI溶液，28.5°C恒温培养，每天将每个孔里的溶液用移液枪吸出一半，加入等体积新溶液，均培养至10 dpf。
2.2斑马鱼骨骼染色
参见“实施例一中2.2斑马鱼骨骼染色”。
2.3染色的矿化骨骼定量分析
参见“实施例一中2.3染色的矿化骨骼定量分析”。
3. 实验结果
采用AxioVisionRel.4.6软件采集放大100倍图像，采用图像分析软件Image pro plus 6.0对染色区域进行定量分析，得到头部骨骼染色面积以及累积光密度(IOD)(具体实验结果表9)。
结果：25μM泼尼松龙模型组与0.5%DMSO组的矿化面积和IOD值存在极显著性差异(P<0.01)，提示泼尼松龙成功诱导斑马鱼骨质疏松。与泼尼松龙模型组比，2.5 ng/mL、25 ng/mL(见图11)和50 ng/mL续断皂苷VI组斑马鱼的骨矿化面积和IOD值有显著性增加，但至100 ng/mL时，染色面积和IOD值变化不明显，提示2.5 ng/mL-50 ng/mL续断皂苷VI可防止并扭转泼尼松龙诱导的斑马鱼骨量丢失。
表9 续断皂苷VI对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨骼染色面积和累积光密度减少的影响(n=5-8)
t检验：*P<0.05, **P<0.01 vs 25 μM泼尼松龙。
实施例十
续断总皂苷对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松的防治作用
1. 材料与仪器
受试药物：续断总皂苷
配制方法：精密称取续断总皂苷置于10 mL容量瓶中，加入少量DMSO使溶解并定容，用培养基配制成含10 μM泼尼松龙的 2.5 ng/mL、25 ng/mL和100 ng/mL的续断总皂苷溶液。
试剂：泼尼松龙同实施例二；续断总皂苷(自制，含续断总皂苷82%)；茜素红S、多聚甲醛和MS-222同实施例一。
实验动物和仪器同实施例一。
相关软件同实施例一。
2. 实验方法
2.1给药
将3 dpf(受精后3天)的斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的24孔板中，分成5组， 10条幼鱼/组/2孔，每孔加入培养基1 mL，到斑马鱼5 dpf，吸净24孔板中的培养基，1组给予0.5%DMSO阴性对照，其余4组给予10 μM泼尼松龙模型药，28.5°C恒温培养，48 h后，将其中3组模型药分别换为含10 μM泼尼松龙的2.5 ng/mL、25 ng/mL和100 ng/mL的续断总皂苷溶液，每天将每个孔里的溶液用移液枪吸出一半，加入等体积新溶液，培养至10 dpf。
2.2斑马鱼骨骼染色
参见“实施例一中2.2斑马鱼骨骼染色”。
2.3染色的矿化骨骼定量分析
参见“实施例一中2.3染色的矿化骨骼定量分析”。
3. 实验结果
采用AxioVisionRel.4.6软件采集放大100倍的图像，用图像分析软件Image pro plus 6.0对染色区域进行定量分析，得到头部骨骼染色面积以及累积光密度(IOD)值(具体实验结果表10)。
结果：10 μM泼尼松龙模型组与0.5%DMSO组的矿化面积和IOD值存在极显著性差异(P<0.01)，提示泼尼松龙成功诱导斑马鱼骨质疏松。与泼尼松龙模型组比，25 ng/mL续断总皂苷斑马鱼骨染色面积有显著性增加，至100 ng/mL(见图12)时斑马鱼染色面积的增加呈极显著性；IOD值的变化与骨骼染色面积相似，至100 ng/mL时，IOD值有显著性增加，提示续断总皂苷可防止并扭转泼尼松龙诱导的斑马鱼骨量丢失。
表10续断总皂苷对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨骼染色面积和累积光密度减少的影响(n=5-7)
t检验：*P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001 vs 10 μM泼尼松龙。
实施例十一
续断总提物对斑马鱼骨骼的影响
1. 材料与仪器
受试药物：续断总提物
配制方法：称取100 g续断晒干药材，打粉，用80%乙醇加热回流提取2次，提取液回收乙醇至无醇味后浓缩至100 mL(1g生药/1mL)，取适量用培养基配制成25 ng生药/mL、50 ng生药/mL、100 ng生药/mL和10000 ng生药/mL的续断总提物溶液。
试剂：续断总提物(自制)；茜素红S、多聚甲醛和MS-222同实施例一。
实验动物和仪器同实施例一。
相关软件：图像采集软件：AxioVisionRel.4.6，图像分析软件：Image J。
2. 实验方法
2.1给药
将3 dpf(受精后3天)的斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的24孔板中，分为5组，每孔加入培养基1 mL，每孔放5条幼鱼，10条幼鱼/组/2孔，到斑马鱼5 dpf，吸净24孔板中的培养基，1组作为培养基阴性对照，其余4组给予25 ng生药/mL、50 ng/生药mL、100 ng生药/mL和10000 ng生药/mL的续断总提物溶液，28.5°C恒温培养，每天将每个孔里的溶液用移液枪吸出一半，加入等体积新溶液，培养至10 dpf。
2.2斑马鱼骨骼染色
参见“实施例一中2.2斑马鱼骨骼染色”。
2.3染色的矿化骨骼定量分析
参见“实施例一中2.3染色的矿化骨骼定量分析”。
3. 实验结果
采用AxioVisionRel.4.6软件采集放大100倍的图像，用图像分析软件Image J对染色区域进行定量分析，得到头部骨骼染色面积以及累积光密度(IOD)值(具体实验结果表11)。
结果：与培养基阴性对照组(见图13)比，25 ng生药/mL至10000生药ng/mL续断总提物均使斑马鱼骨骼染色面积显著性增加，特别是25 ng生药/mL(见图14)和10000生药ng/mL续断总提物使斑马鱼骨染色面积有极显著性增加(**P<0.01, *** P<0.001)，IOD值的变化与骨骼染色面积相似，提示续断总提物可增加斑马鱼骨骼矿化量。
表11 续断总提物对斑马鱼骨骼染色面积和累积光密度的影响(n=5-8)
t检验：*P<0.05, **P<0.01, *** P<0.001 vs 培养基。
通过以上实验结果表明，本发明提供的一种用模式生物斑马鱼评价防治骨质疏松药物作用的新方法可行性强，能客观准确反应药物如地塞米松、泼尼松龙、鲑鱼降钙素、依替膦酸二钠、传统壮骨中药续断及淫羊藿等在体内对骨量生成的影响，特别是能客观准确反应防治骨质疏松西药如鲑鱼降钙素、依替膦酸二钠及中药续断提取物、续断皂苷类成分及淫羊藿黄酮类成分在体内增加骨生成，防止并扭转地塞米松或泼尼松龙诱导的骨质疏松，说明该方法能快速、准确评价化合物及复杂中药成分防治骨质疏松的作用，为防治骨质疏松药物的早期发现以及中药防治骨质疏松作用的物质基础提供高通量筛选方法。
本发明巧妙地利用了茜素红与骨骼系统中的钙离子结合能形成红色的螯合物，再通过图像采集软件对显微镜放大的图像进行采集，最后运用图像分析软件来对结果进行处理来达到评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，多次实验显示，使用专业图像分析软件Image pro plus 6.0，操作简单易使用。
总结：斑马鱼与哺乳动物骨骼生长发育的分子机理极为相似。和哺乳动物一样，斑马鱼的骨骼是从三种胚胎干细胞系发育而来，已有研究表明斑马鱼幼鱼骨包含骨形成和骨吸收活动所需的细胞，是较完整体系。骨骼形成机制也包括软骨内骨化和膜内骨化，其过程都受到包括一系列转录因子和激素在内的复杂机制的严格调控，参与调控的关键基因，如runx2, osteonectin, osteoprogenin等与哺乳动物的相关基因具有高度的同源性。哺乳动物与斑马鱼头部骨骼生成所涉及到的转录因子具有极其相似的表达机制和调控方式。所以本发明选用斑马鱼作为模型动物，通过优化的实验分组方法，药物溶解方法优化，给药方式与方法，尤其是斑马鱼骨骼染色与检测条件及斑马鱼骨矿化分析方法的优选，能客观的反应药物在体内对骨生成影响的情况，能克服一般体外细胞实验难以体现在体药效综合结果的缺点，并克服哺乳动物体内实验耗时长，受试药量大、劳动强度高等缺点。该方法实验结果准确度高，且实验方法可重复性强，所需受试药物量少，劳动强度低，工作效率高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种用于评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，利用茜素红可特异性地与钙离子螯合从而使矿化的骨基质染成红色的特性，其特征在于运用模式生物斑马鱼为评价模型，在给予斑马鱼幼鱼防治骨质疏松药物后，通过对其骨骼进行茜素红染色后的图像进行采集和分析，计算出染色区域的面积和累积光密度，即反映骨矿化量和骨密度的数据，以此作为对药物作用效果的评价指标；
具体包括以下步骤：
步骤一：斑马鱼受精卵的收集：控制斑马鱼成鱼日夜节律，昼夜时间控制在14-12小时：10-12小时，收集受精卵，置于培养皿中，加入培养基，于26°C-30°C恒温培养箱中培养；
步骤二：给药方案：取受精后3天斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的培养板中，根据培养板孔的大小每孔加入培养基0.1-2mL，每个孔里放1-10条幼鱼，分为数组，每组5-15条鱼，溶媒阴性对照组和测试药物组，从受精后4天或受精后5天开始加入溶媒和测试药物，加药方法是吸净培养板孔里的培养基后迅速加入溶液，溶媒对照浓度与药物测试组的溶媒浓度相当，将培养板密封放入26°C-30°C恒温培养箱中培养，培养周期5-7天，每天将每个孔里的溶液吸出一半，加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎受精后9-11天或者10-12天；
步骤三：斑马鱼骨骼茜素红染色：将培养至斑马鱼胚胎受精后9-11天或者10-12天的幼鱼用间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐处死，然后将幼鱼固定于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中2-3h，将固定液4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液去除，然后将斑马鱼幼鱼置于50%乙醇中10min，去除乙醇，加入用0.5%KOH配制的茜素红染色液，放置过夜，去除染色液，加入超纯水洗去多余的染液后加入新鲜配制的漂白剂，放置20min-2h，去除漂白剂后，加入3:1的0.5%KOH和甘油的混合溶液30min-8h，然后更换溶液为1:1的0.5%KOH和甘油的混合溶液6h-24h，最后更换溶液为1:3的0.5%KOH和甘油的混合溶液6h-24h，最后保存于纯甘油中；
步骤四：斑马鱼骨骼染色的检测与分析：用倒置显微镜观察步骤三中茜素红染色的斑马鱼头骨腹面，用成像软件采集图像，所有的图像均采用相同的光强度和曝光设置，用专业图像分析软件计算茜素红染色区域的面积和累积光密度，以分别反应骨矿化量和骨密度，计算平均值，标准偏差，并进行t-检验。
2.根据权利要求1所述的一种用于评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，其特征在于：
步骤二：给药方案：取受精后3天斑马鱼胚胎放入盛有胚胎培养基的培养板中，根据培养板孔的大小每孔加入培养基0.1-2mL，每孔放1-10条幼鱼，分为数组，每组5-15条鱼，溶媒阴性对照组、泼尼松龙或地塞米松模型药物组和测试药物组；造模药和溶媒从斑马鱼胚胎受精后4天或斑马鱼胚胎受精后5天开始加入，测试药可与模型药同时在受精后4天或者受精后5天加入，也可在模型药物加入48小时后加入，加药方法是吸净培养板孔里的培养基后迅速加入溶液，溶媒对照浓度与药物测试组的溶媒浓度相当，将培养板密封放入26°C-30°C恒温培养箱中培养，培养周期5-7天，每天将每个孔里的溶液吸出一半，加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎受精后9-11天或者10-12天。
3.根据权利要求1或2所述的一种评价防治骨质疏松药物作用的新方法，其特征在于：
步骤一中控制斑马鱼成鱼日夜节律，昼夜时间控制在14小时：10小时，收集受精卵；培养基组成为：5mM NaCl，0.17mM KCl，0.33mM CaCl2，0.33mM MgSO4，10-5%亚甲基蓝；
斑马鱼胚胎和幼鱼培养温度为：28°C-29°C；
步骤二中的培养板为96孔、48孔、24孔、12孔或6孔培养板，其中较优的为24孔板，每孔加入培养基0.5-1.5mL，每孔放5-10条幼鱼；
步骤二中斑马鱼鱼龄选择受精后3天的斑马鱼幼鱼，溶媒和药物从斑马鱼受精后4天或者受精后5天开始加入，培养周期为5天，培养至受精后9天或者10天；
配制药物的溶媒为水或者是含有0~1%二甲基亚砜助溶剂的水溶液；
步骤三中茜素红采用0.5%KOH溶解；漂白剂由1.5%H2O2和1%KOH组成，且需新鲜配制；
步骤四中用ZEISS荧光倒置显微镜观察茜素红染色的斑马鱼头骨腹面，用成像软件采集图像，放大倍数为100倍；用专业图像分析软件计算茜素红染色区域的面积和累积光密度；用Excel软件计算平均值，标准偏差，并进行t检验。
4.根据权利要求1或2所述的一种用于评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，其特征在于，所述的受试药物为化学药品、中药、中药复方、天然药物或它们的组合物。
5.根据权利要求3所述的一种用于评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，其特征在于，所述的受试药物为化学药品、中药、中药复方、天然药物或它们的组合物。
6.根据权利要求4所述的一种用于评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，其特征在于，所述的受试药物为鲑鱼降钙素、依替膦酸二钠及中药续断提取物、续断皂苷类成分及淫羊藿黄酮类成分等。
7.根据权利要求5所述的一种用于评价防治骨质疏松药物作用效果的新方法，其特征在于，所述的受试药物为鲑鱼降钙素、依替膦酸二钠及中药续断提取物、续断皂苷类成分及淫羊藿黄酮类成分等。
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