CN105169415B - 一种筛选具有保护斑马鱼肝功能活性化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种筛选具有保护斑马鱼肝功能活性化合物的方法。该方法将能造成肝损伤的甲萘威与待测化合物共同作用于斑马鱼，或者先用甲萘威作用于斑马鱼造成肝脏损伤然后再用待测化合物处理损伤后的斑马鱼，利用肝脏面积指数变化作为检测肝脏功能的指标，分析待测化合物是否具有保护或改善肝功能活性。本发明首次利用甲萘威建立斑马鱼肝功能损伤模型，建立的斑马鱼肝功能损伤模型具有制作简单、快速、稳定可靠和重复性好的优点，降低了肝功能损伤模型的制作成本，提高了实验研究结果的可靠性。

Description

一种筛选具有保护斑马鱼肝功能活性化合物的方法

技术领域

本发明涉及一种筛选具有保护斑马鱼肝功能活性化合物的方法，特别涉及一种利用甲萘威制备斑马鱼肝功能损伤模型并利用其筛选具有保护斑马鱼肝功能活性化合物的方法，属于药物筛选技术领域。

背景技术

肝脏是药物浓集、转化、代谢的主要器官，尤其是口服药物由胃肠道吸收后即进入肝脏，药物在肝脏内的浓度高于血液及其他器官。由于药物或其代谢产物的毒性作用或机体对药物产生过敏反应，肝脏极易受到损害。目前已知多种药物可导致肝损伤，如抗肿瘤的化疗药、抗结核药、解热镇痛药、免疫抑制剂、降糖降脂药、抗细菌、抗真菌及抗病毒药等。随着我国人民生活水平日益提高，脂肪肝、酒精肝等慢性肝病发病趋势也逐渐升高。肝脏疾病已经成为人们健康的主要危害之一。目前应用的保肝药物具有药价昂贵、停药后易反跳、易产生耐药性等缺点，急需研究新的高效的保肝药物。因此，建立一种快速、有效的筛选保护或改善肝功能活性化合物的方法，加快创新药物的研发，对肝脏疾病的预防和治疗具有重大意义。

药物筛选模型分为三类：整体动物水平模型、组织器官水平模型和细胞分子水平模型。目前整体动物水平模型主要以哺乳动物作为药物筛选的观察对象，具有结果可靠、综合全面的优点，但是耗时、耗资、耗力，不适合高通量筛选。体外实验虽然操作简单、周期短，但不能准确反应药物在体内微环境下的活性。而斑马鱼作为一种理想的脊椎模式生物，其复制出的疾病与人类疾病有高度相似性，近年来被广泛作为药物筛选和安全性评价的工具。与其他哺乳动物模型比，斑马鱼产卵量高，发育周期短，药物用量少，可重复性强，可直观地反应出药物的治疗效果及毒副作用，更适用于大规模的化合物筛选研究。研究发现斑马鱼在出生后48小时肝脏形态已初步形成，出生后60-72小时肝脏迅速生长直至达到合适比例大小。在分子水平上，斑马鱼肝脏发育的分子机制与哺乳动物一致，其肝细胞功能以及在多种肝脏病变中的组织病理学变化与人类亦非常相似。

因此，选择斑马鱼制备肝功能损伤模型并进一步作为保肝药物筛选模型具有较高的应用前景。但目前，制备肝功能损伤模型的损伤程度及对应保肝药物筛选模型的评价标准由于误差较大，评价结果差异过大，无法实际应用。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种筛选具有保护斑马鱼肝功能活性化合物的方法。

本发明的技术方案如下：

一种斑马鱼肝功能损伤模型的制备方法，步骤如下：

将受精后2～3天发育正常的斑马鱼置于含有甲萘威浓度为5～30μM的培养水溶液中，26～30℃下恒温培养24～72小时，制得斑马鱼肝功能损伤模型；

根据本发明优选的，所述的培养水溶液包括如下组分：

NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl₂0.4mM，MgSO₄0.16mM，去离子水配制。

根据本发明进一步优选的，所述培养水溶液还包括体积浓度不大于0.5％的二甲基亚枫。

根据本发明优选的，甲萘威浓度为10μM。

一种筛选具有保护斑马鱼肝功能活性化合物的方法，步骤如下：

(1)将受精后3天的发育正常的斑马鱼置于含有甲萘威浓度为5～30μM的培养水溶液中，培养24～72小时，制得肝损伤组斑马鱼；将发育3天的斑马鱼置于含有甲萘威浓度为5～30μM、待测化合物浓度为0.1μM～1000μM的培养水溶液中，培养24～72小时，制得治疗组斑马鱼；将发育3天的斑马鱼采用培养水在相同条件下培养24～72小时，制得正常组斑马鱼；

或者，将受精后3天的发育正常的斑马鱼，置于含有甲萘威浓度为5～30μM的培养水溶液中，培养20～28小时，去除死亡斑马鱼，用纯水洗净斑马鱼表面残留液，然后将斑马鱼分为两组，一组移入培养水中，另一组移入含有待测化合物的培养水溶液中，将两组斑马鱼继续培养24～48小时，培养水培养的一组为肝损伤组斑马鱼，含有待测化合物的培养水溶液培养的一组为治疗组斑马鱼；将发育3天的斑马鱼采用培养水在相同条件下培养斑马鱼44～76小时，制得正常组斑马鱼；

(2)观察步骤(1)制得的正常组斑马鱼、肝损伤组斑马鱼、治疗组斑马鱼，记录并计算斑马鱼肝脏面积和斑马鱼体面积，按照如下公式计算肝脏面积指数：

肝脏面积指数＝肝脏面积/体面积×100％；

(3)当肝损伤组斑马鱼的肝脏面积指数超出正常组斑马鱼的肝脏面积指数范围，且达到统计学上的显著性水平(P<0.05)，则成功造成斑马鱼肝脏功能损伤模型；在斑马鱼肝脏功能发生损伤前提下，当治疗组斑马鱼的肝脏面积指数高于肝损伤组，且达到统计学上的显著性水平(P<0.05)，则待测化合物具有保护或改善肝脏功能的活性；

所述的正常斑马鱼的肝脏面积指数为：

受精后4d的斑马鱼肝脏面积指数为1.99～2.66％，受精后5d的斑马鱼肝脏面积指数为3.07～3.82％，受精后6d的斑马鱼肝脏面积指数为3.93～4.84％，受精后的7d斑马鱼肝脏面积指数为3.25～4.39％。

根据本发明优选的，所述斑马鱼胚胎为肝脏特异表达荧光的斑马鱼胚胎。肝脏特异表达荧光的斑马鱼胚胎可采用本领域普通市售产品，如国家斑马鱼资源中心销售的转基因斑马鱼。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的培养，温度为26～30℃，光照培养，每天更换培养水或培养水溶液。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，正常组斑马鱼、肝损伤组斑马鱼、治疗组斑马鱼均至少做三组平行实验，每组斑马鱼总数不低于15枚。进一步优选的，每组斑马鱼总数为30～50枚。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，甲萘威浓度为10μM。

根据本发明进一步优选的，所述培养液组分如下：

NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl₂0.4mM，MgSO₄0.16mM，去离子水配制。

根据本发明优选的，所述步骤(2)还包括观察前的预处理步骤：将需要观察的斑马鱼胚胎用质量浓度为0.3‰的三卡因浸泡40～90s进行麻醉，然后用3％甲基纤维素固定于载玻片上。

根据本发明优选的，所述步骤(2)的观察为在荧光显微镜下观察。

根据本发明优选的，所述步骤(2)的记录为拍照记录。

根据本发明优选的，所述步骤(2)的计算为利用图像处理软件计算。

有益效果

1、本发明首次利用甲萘威建立斑马鱼肝功能损伤模型，建立的斑马鱼肝功能损伤模型具有制作简单、快速、稳定可靠和重复性好的优点，降低了肝功能损伤模型的制作成本，提高了实验研究结果的可靠性；

2、本发明在利用甲萘威建立斑马鱼肝功能损伤模型的前提下，采用首次将肝脏面积指数作为斑马鱼肝功能评价的检测指标，二者结合后，更加科学、客观，提高了结果的准确性，克服了现有技术误差较大的缺陷；

3、本发明中所用的模式生物斑马鱼，既具有体外细胞株可快速筛选的优点，又具有活体动物体内验证的优势，利用斑马鱼胚胎进行大规模化合物的肝功能保护活性评价，有助于提高实验效率和降低实验成本。

附图说明

图1为甲萘威对斑马鱼肝功能损伤的形态学照片；

图中：a为空白对照组；b为溶剂对照组；c为5μM的甲萘威处理组；d为10μM的甲萘威处理组；e为15μM的甲萘威处理组；f为20μM的甲萘威处理组；g为30μM的甲萘威处理组；L标注部分为肝脏，Y标注部分为卵黄。

图2为甲萘威对斑马鱼肝功能损伤的肝脏荧光照片；

图中：a为空白对照组；b为溶剂对照组；c为5μM的甲萘威处理组；d为10μM的甲萘威处理组；e为15μM的甲萘威处理组；f为20μM的甲萘威处理组；g为30μM的甲萘威处理组。图中划线部分为肝脏。

图3为甲萘威对斑马鱼肝脏面积指数的影响；

图中：*：与空白对照组比较，P<0.05；**：与空白对照组比较，P<0.01。

图4为还原型谷胱甘肽对甲萘威引起斑马鱼肝功能损伤的修复作用形态学照片；

图中：a为正常组；b为肝损伤组；c为治疗组3；L标注部分为肝脏。

图5为还原型谷胱甘肽对甲萘威引起斑马鱼肝功能损伤的修复作用肝脏荧光照片；

图中：a为正常组；b为肝损伤组；c为治疗组1；d为治疗组2；e为治疗组3；图中划线部分为肝脏。

图6为还原型谷胱甘肽对肝损伤斑马鱼肝脏面积指数的影响；

图中：*：与正常组比较，P<0.05；**：与正常组比较，P<0.01；#：与肝损伤组比较，P<0.05；##：与肝损伤组比较，P<0.01。

图7为维生素C对甲萘威引起斑马鱼肝功能损伤的修复作用形态学照片；

图中：a为正常组；b为肝损伤组；c为治疗组3；L标注部分为肝脏。

图8为维生素C对甲萘威引起斑马鱼肝功能损伤的修复作用肝脏荧光照片；

图中：a为正常组；b为肝损伤组；c为治疗组1；d为治疗组2；e为治疗组3；图中划线部分为肝脏。

图9为维生素C对肝损伤斑马鱼肝脏面积指数的影响；

图中：**：与正常组比较，P<0.01；##：与肝损伤组比较，P<0.01。

图10为硫代乙酰胺对斑马鱼的形态学照片；

图中：a为空白对照组；b为1mM的硫代乙酰胺处理组；c为5mM的硫代乙酰胺处理组；d为10mM的硫代乙酰胺处理组；e为15mM的硫代乙酰胺处理组；f为20mM的硫代乙酰胺处理组。

图11为硫代乙酰胺对斑马鱼肝功能损伤的肝脏荧光照片；

图中：a为空白对照组；b为1mM的硫代乙酰胺处理组；c为5mM的硫代乙酰胺处理组；d为10mM的硫代乙酰胺处理组；e为15mM的硫代乙酰胺处理组；f为20mM的硫代乙酰胺处理组。图中划线部分为肝脏。

图12为硫代乙酰胺对斑马鱼肝脏面积指数的影响；

其中：*：与空白对照组比较，P<0.05；**：与空白对照组比较，P<0.01。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实验动物：采用肝脏特异表达荧光的斑马鱼，购自国家斑马鱼资源中心。雌雄斑马鱼在照明14h/黑暗10h、28℃标准条件下分开饲养，定时喂以颗粒状饵料和丰年虾。用卵时，取健康性成熟的斑马鱼，按雌雄1/1或1/2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，半小时后将成鱼捞出，使排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，对受精卵进行消毒和清洗后，移入斑马鱼胚胎培养用水中，28℃下控光培养，中间每24h换约1/2水，并及时吸出死亡胚胎。

试剂配制：甲萘威标准品购自上海市农药研究所，用二甲基亚枫溶解配制成50mM的储液。L-还原型谷胱甘肽(L-Glutathione reduced，CAS号70-18-8)、维生素C(L-Ascorbic acid，CAS号50-81-7)均购自Sigma公司，分别用纯水溶解配制成10mM的储液。所有样品储液放于4℃保存，实验时用培养水稀释至所需浓度。

培养水组分如下：

NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl₂0.4mM，MgSO₄0.16mM，去离子水配制。

实施例1：斑马鱼肝功能损伤模型的建立方法

1.斑马鱼幼鱼的获得与使用

采用健康性成熟的肝脏特异表达荧光的斑马鱼，按雌雄1/1或1/2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，半小时后将成鱼捞出，使排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，对受精卵进行消毒和清洗后，移入斑马鱼胚胎培养用水中，并向所述培养水中加入0.2ppm亚甲基蓝，28℃下控光培养。从斑马鱼胚胎出生后12小时加入0.2mM的苯硫脲，中间每24h换约1/2水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后3天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼仔鱼，放入24孔板中，每孔5尾，每组3个平行孔。

2.化合物处理

设置7个实验组：1个空白对照组，1个溶剂对照组，5个肝功能损伤诱导剂处理组。移除微孔板中的培养水，空白对照组中加入2ml培养水，溶剂对照组加入2ml含体积浓度0.5％二甲基亚砜的培养水溶液，肝功能损伤诱导剂处理组2ml分别加入浓度为5μM，10μM，15μM，20μM，30μM的甲萘威溶液，由培养水与相应浓度的甲萘威储液配制获得。然后，放入28℃恒温培养箱中培养72小时。每24h换液一半。

3.定性分析

于施药后72小时，将斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉，然后用3％甲基纤维素固定于载玻片上，体式显微镜下观察肝脏形态。

空白对照组和溶剂对照组肝脏形态正常。5μM的甲萘威处理组未见肝脏形态学改变，但卵黄囊肿。10μM的甲萘威处理组出现肝脏萎缩、颜色变暗、透光性差，卵黄囊肿。15μM和20μM的甲萘威处理组肝脏中毒现象更加明显，肝脏萎缩、颜色变暗，卵黄囊吸收延滞现象加重，并出现不同程度的心包水肿、出血等。30μM的甲萘威处理组斑马鱼发育严重畸形，脊柱弯曲，卵黄囊凝结，肝脏严重萎缩、变黑，并导致大量斑马鱼死亡(图1)。

4.定量分析

荧光显微镜下拍照记录斑马鱼肝脏荧光情况。与空白对照组和溶剂对照组相比，甲萘威处理后的幼鱼肝组织荧光面积明显下降，肝脏明显萎缩退化(图2)。

利用图像处理软件计算所述模型的肝脏面积和体面积。

根据如下公式计算各组斑马鱼的肝脏面积指数：肝脏面积指数＝肝脏面积/体面积×100％

各组斑马鱼肝脏面积指数以表示，采用独立样本t检验法分析比较组间差异的显著性。

统计结果显示，与空白对照组相比，5μM的甲萘威处理组斑马鱼肝脏面积指数无显著性变化，10μM、15μM、20μM和30μM的甲萘威处理组斑马鱼肝脏面积指数显著降低，差异具有显著统计学意义(P<0.01)(图3)。

以实施例1制备的所述斑马鱼肝功能损伤模型为研究对象，考察本发明所述的斑马鱼肝脏损伤的评价指标，即肝脏面积指数的降低与现有技术中的肝脏常规评价指标即谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的相关性，进一步验证斑马鱼肝脏面积指数的降低作为评价斑马鱼肝功能损伤模型是否建立的可靠指标。

以实施例1制备的所述斑马鱼肝功能损伤模型，制备斑马鱼幼鱼组织匀浆，测定组织中ALT、AST水平。与空白对照组相比，5μM的甲萘威处理组ALT、AST含量未见显著性升高，10μM、15μM、20μM和30μM的甲萘威处理组ALT、AST含量均显著性升高(P<0.05，P<0.01)(表1)。可见，斑马鱼肝脏面积指数的减小与转氨酶生化指标升高在反映斑马鱼肝脏损伤程度上具有相关性，肝脏面积指数的降低可作为斑马鱼肝功能损伤模型的评价指标。与空白对照组相比，10μM的甲萘威处理组斑马鱼肝脏面积指数显著性降低，ALT、AST含量显著性升高，同时该剂量组斑马鱼未出现水肿、畸形及大量幼鱼死亡现象。因此，选择10μM的甲萘威处理组作为斑马鱼肝功能损伤模型组。

表1甲萘威对斑马鱼幼鱼转氨酶的影响

*P<0.05significantly different from the control；**P<0.01significantlydifferent from the control.

实施例2：还原型谷胱甘肽对甲萘威引起的斑马鱼肝功能损伤的保护作用

1.斑马鱼幼鱼的获得与使用

采用健康性成熟的肝脏特异表达荧光的斑马鱼，按雌雄1/1或1/2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，半小时后将成鱼捞出，使排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，对受精卵进行消毒和清洗后，移入斑马鱼胚胎培养用水中，并向所述培养水中加入0.2ppm亚甲基蓝，28℃下控光培养。从斑马鱼胚胎出生后12小时加入0.2mM的苯硫脲，中间每24小时换约1/2水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后3天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼仔鱼，放入24孔板中，每孔5尾。每组3个平行孔。

2.化合物处理

设置5个实验组：1个正常组，1个肝损伤组，3个治疗组。将受精后3天的发育正常的斑马鱼置于含有甲萘威浓度为10μM的培养水溶液中，培养72小时，制得肝损伤组斑马鱼；将发育3天的斑马鱼置于含有甲萘威浓度为10μM和不同浓度还原型谷胱甘肽的混合溶液，还原型谷胱甘肽的浓度依次为5μM，50μM，150μM，分别作为治疗组1、治疗组2和治疗组3，培养72小时，制得治疗组斑马鱼；将发育3天的斑马鱼采用含0.5％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)的培养水在相同条件下培养72小时，制得正常组斑马鱼。每24h换液一半。各孔溶液终体积均为2mL。

3.定性分析

于施药后72小时，将斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉，然后用3％甲基纤维素固定于载玻片上，体式显微镜下观察肝脏形态。

正常组斑马鱼的肝脏透明，结构正常；肝损伤组斑马鱼的肝脏颜色变暗、透光性差。随着还原型谷胱甘肽浓度的增加，肝脏形态逐渐恢复正常，150μM还原型谷胱甘肽治疗组肝脏形态明显改善，接近正常组斑马鱼肝脏形态(图4)。因此，可通过观察肝脏形态定性分析还原型谷胱甘肽的肝脏损伤保护作用。

4.定量分析

荧光显微镜下拍照记录斑马鱼肝脏荧光情况。利用图像处理软件计算所述模型的肝脏面积和体面积。根据如下公式计算各组斑马鱼的肝脏面积指数：肝脏面积指数＝肝脏面积/体面积×100％。各组斑马鱼肝脏面积指数以表示，采用独立样本t检验法分析比较组间差异的显著性。

统计结果显示，与正常组相比，肝损伤组斑马鱼的肝脏面积指数显著降低。随着治疗组还原型谷胱甘肽浓度的提高，斑马鱼的肝脏面积指数显著升高，接近正常(图5和图6)。因此，可通过计算肝脏面积指数定量评价还原型谷胱甘肽的肝脏损伤保护作用。

实施例3：维生素C对甲萘威引起的斑马鱼肝功能损伤的保护作用

1.斑马鱼幼鱼的获得与使用

采用健康性成熟的肝脏特异表达荧光的斑马鱼，按雌雄1/1或1/2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，半小时后将成鱼捞出，使排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，对受精卵进行消毒和清洗后，移入斑马鱼胚胎培养用水中，并向所述培养水中加入0.2ppm亚甲基蓝，28℃下控光培养。从斑马鱼胚胎出生后12小时加入0.2mM的苯硫脲，中间每24小时换约1/2水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后3天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼仔鱼，放入24孔板中，每孔5尾。每组3个平行孔。

2.化合物处理

设置5个实验组：1个正常组，1个肝损伤组，3个治疗组。将受精后3天的发育正常的斑马鱼，置于含有甲萘威浓度为10μM的培养水溶液中，培养24小时，去除死亡斑马鱼，用纯水洗净斑马鱼表面残留液，然后将斑马鱼分为两组，一组移入培养水中，另三组移入含有不同浓度维生素C的培养水溶液中，将四组斑马鱼继续培养48小时，培养水培养的一组为肝损伤组斑马鱼，另三组维生素C的浓度依次为1μM，10μM，100μM，分别作为治疗组1、治疗组2和治疗组3；将发育3天的斑马鱼采用含0.5％(v/v)二甲基亚砜(DMSO)的培养水在相同条件下培养斑马鱼72小时，制得正常组斑马鱼。每24h换液一半。各孔溶液终体积均为2mL。

3.定性分析

于施药后72小时，将斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉，然后用3％甲基纤维素固定于载玻片上，体式显微镜下观察肝脏形态。

正常组斑马鱼的肝脏透明，结构正常；肝损伤组斑马鱼的肝脏颜色变暗、透光性差。随着维生素C浓度的增加，肝脏形态逐渐恢复正常(图7)。因此，可通过观察肝脏形态定性分析维生素C的肝脏损伤保护作用。

4.定量分析

荧光显微镜下拍照记录斑马鱼肝脏荧光情况。利用图像处理软件计算所述模型的肝脏面积和体面积。根据如下公式计算各组斑马鱼的肝脏面积指数：肝脏面积指数＝肝脏面积/体面积×100％。各组斑马鱼肝脏面积指数以表示，采用独立样本t检验法分析比较组间差异的显著性。

统计结果显示，与正常组相比，肝损伤组斑马鱼的肝脏面积指数显著减小。随着治疗组维生素C浓度的提高，斑马鱼的肝脏面积指数显著升高，逐渐恢复正常(图8和图9)。因此，可通过计算肝脏面积指数定量评价维生素C的肝脏损失保护作用。

对比例：利用硫代乙酰胺制备斑马鱼肝功能损伤模型

1.斑马鱼幼鱼的获得与使用

采用健康性成熟的肝脏特异表达荧光的斑马鱼，按雌雄1/1或1/2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，半小时后将成鱼捞出，使排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，对受精卵进行消毒和清洗后，移入斑马鱼胚胎培养用水中，并向所述培养水中加入0.2ppm亚甲基蓝，28℃下控光培养。从斑马鱼胚胎出生后12小时加入0.2mM的苯硫脲，中间每24h换约1/2水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后3天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼仔鱼，放入24孔板中，每孔5尾，每组3个平行孔。

2.化合物处理

设置6个实验组：1个空白对照组，5个硫代乙酰胺肝功能损伤诱导剂处理组。移除微孔板中的培养水，空白对照组中加入2ml培养水，肝功能损伤诱导剂处理组2ml分别加入浓度为1mM，5mM，10mM，15mM，20mM的硫代乙酰胺溶液，由培养水与相应浓度的硫代乙酰胺储液配制获得。然后，放入28℃恒温培养箱中培养72小时。每24h换液一半。

3.定性分析

于施药后72小时，将斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉，然后用3％甲基纤维素固定于载玻片上，体式显微镜下观察肝脏形态。

空白对照组幼鱼肝脏形态正常。1mM和5mM硫代乙酰胺处理组未见畸形和肝脏形态学改变。10mM和15mM硫代乙酰胺处理组出现肝脏萎缩、颜色变暗、透光性差，卵黄囊肿，但同时发育明显滞后，鱼鳔完全缺失，心包水肿明显。20mM硫代乙酰胺处理组斑马鱼发育严重畸形，脊柱弯曲，卵黄囊凝结，肝脏严重萎缩、变黑，并导致大量斑马鱼死亡(图10)。

4.定量分析

荧光显微镜下拍照记录斑马鱼肝脏荧光情况。与空白对照组和溶剂对照组相比，1mM和5mM硫代乙酰胺处理组的幼鱼肝组织荧光面积无明显变化，10mM，15mM，20mM硫代乙酰胺处理组的幼鱼肝组织荧光面积明显下降，肝脏明显萎缩退化(图11)。

利用图像处理软件计算所述模型的肝脏面积和体面积。根据如下公式计算各组斑马鱼的肝脏面积指数：

肝脏面积指数＝肝脏面积/体面积×100％。

各组斑马鱼肝脏面积指数以表示，采用独立样本t检验法分析比较组间差异的显著性。

统计结果显示，与空白对照组相比，1mM和5mM的硫代乙酰胺处理组斑马鱼肝脏面积指数无显著性变化，10mM，15mM，20mM的硫代乙酰胺处理组斑马鱼肝脏面积指数显著降低，差异具有显著统计学意义(P<0.01)(图12)。

选用硫代乙酰胺制备的斑马鱼肝脏损伤模型，当给药浓度小于10mM时，斑马鱼未见畸形，肝脏形态、肝脏面积指数也未发生显著性变化，未造成斑马鱼肝脏损伤。当给药浓度大于10mM时，斑马鱼肝脏萎缩、肝脏面积指数显著降低，斑马鱼出现肝脏损伤，但同时观察到斑马鱼心包严重水肿、脊柱弯曲、发育滞后。与硫代乙酰胺相比，10μM的甲萘威可明显降低斑马鱼肝脏指数，造成斑马鱼肝脏损伤，但对其他脏器毒性较小，未出现斑马鱼严重水肿、脊柱弯曲、发育滞后等毒性。因此选用甲萘威建立斑马鱼肝损伤模型，利用肝脏面积指数变化作为检测肝脏功能的指标，分析待测化合物是否具有保护或改善肝功能活性，更加科学、客观。

结果分析

由上述实施例和对比例的结果可以看出，本发明所述的模型相对已报道的保肝药物筛选模型有以下优点：(1)首次利用甲萘威建立斑马鱼肝功能损伤模型。与目前常用的肝损伤药物如四氯化碳、硫代乙酰胺等相比，甲萘威毒性较低，无体内积累作用。(2)甲萘威是直接加入养鱼水中，相对灌胃法或腹腔注射的方法操作较简便。(3)甲萘威诱导斑马鱼肝损伤的时间相对较短，有效的缩短了实验周期。(4)采用肝脏特异表达荧光的斑马鱼，可在荧光显微镜下直接观察化合物对斑马鱼肝脏形态、大小的影响。(5)首次将肝脏面积指数作为斑马鱼肝功能评价的检测指标。

肝脏是鱼类中间代谢的主要器官和营养储存场所，当生存条件发生变动时，肝脏会相应的发生显著变化，而鱼体变化较缓，因此肝脏面积指数不仅可以去除个体差异的影响，又可快速、定量评价化合物对斑马鱼肝脏损伤的修复作用，更加科学、客观，提高了结果的准确性，适用于保护或改善肝功能活性化合物的高通量筛选。

Claims (4)

1.一种斑马鱼肝功能损伤模型的制备方法，其特征在于，步骤如下：

将受精后2～3天发育正常的斑马鱼置于含有甲萘威浓度为5～30μM的培养水溶液中，26～30℃下恒温培养24～72小时，制得斑马鱼肝功能损伤模型。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的培养水溶液包括如下组分：

NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl₂ 0.4mM，MgSO₄ 0.16mM，去离子水配制。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述培养水溶液还包括体积浓度不大于0.5%的二甲基亚枫。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，甲萘威浓度为10 μM。