CN103301479B - 一种模式动物斑马鱼鱼苗评价药物急性毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供易操作、快速、准确度高的一种用模式动物斑马鱼鱼苗评价药物毒性的方法。其特点在于：将药物以二甲亚砜或乙醇配成不同浓度的供试液，实验挑选受精后72小时发育正常的斑马鱼鱼苗，随机分配于多孔板，加入不同浓度的受试药物，并于受精后96小时在显微镜下观察。当鱼苗心脏停止跳动后，则判断死亡，计算各组斑马鱼鱼苗生存率并做统计。以GraphPad Prism软件拟合曲线计算半数致死量（LD50）值，以LD50值反应药物的急性毒性。该方法的有点在于：方法操作简单、快速、准确度高，能初步判断受试药物的急性毒性。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种用模式动物斑马鱼鱼苗评价药物急性毒性的方法。
背景技术
目前国际上公认的药物筛选和毒性与安全性评价实验方法分为体外（in vitro）和体内（in vivo）实验两种。体外实验通常为细胞培养或生化实验，通过评价化合物对细胞、生化酶学反应或者信号传导通路的影响来判断药物的疗效（efficacy）或毒性（toxicity）。体外实验具有快速高效的优点，但体外实验通常不涉及化合物的吸收、分布、代谢与排泄问题，其筛选结果与动物及人体试验结果常常不符，可比性差。体内实验指活体实验，即利用动物来验证化合物的疗效和毒性，常用的哺乳类动物包括老鼠、兔子、狗、猪、猴子及猩猩等。虽然目前常规的动物实验可提供可比性较高的筛选评价结果，但一般动物实验周期较长、成本高，不适用于高通量药物筛选。在欧美许多国家，有脊椎动物（包括老鼠）受到越来越严格的保护，动物来源受限，审批程序复杂，实验费用越来越昂贵，严重影响新药研发的进程及环境毒性物质的安全性评估。
斑马鱼是一种脊椎动物，体积小（可用微孔板分析），与人类基因和生理功能高度相似，体外受精，透明（可直接用肉眼和解剖显微镜观察），单次产卵数较高，具有能够融合体内和体外两种实验方法的优势。即作为一种体内筛选模式动物，斑马鱼模型兼具体外模型的高效优势和体内模型的可靠优势。在快速提供可信结果的同时，大幅度降低成本（与老鼠相比较，斑马鱼筛选实验的费用甚至不足其1/100）。斑马鱼模型用于新药筛选始于1998年，由于诸多优点，目前已有越来越多的生物、生化和天然药制药公司采用斑马鱼模式动物进行新药疗效、毒性与安全性评价，应用前景非常广阔。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种操作简单、快速、准确度高的一种用模式动物斑马鱼鱼苗评价药物急性毒性的方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种模式动物斑马鱼鱼苗评价药物急性毒性的方法，该方法包括以下步骤：
（1）将药物用二甲亚砜或乙醇配制成0.4～400μM的供试液；
（2）挑选受精72小时的发育正常的斑马鱼鱼苗，随机分配到多孔板中，每孔1-100条，于0.1-2ml培养液中，实验温度为28.5℃；
（3）在步骤（2）的多孔板中加入步骤（1）中的供试液，并且以含二甲亚砜或乙醇终浓度为0.1%-0.4%的实验组作为对照，作用24小时后，即受精96小时，在显微镜下观察每孔中鱼苗的情况，以心脏停止跳动计为死亡；
（4）计算各实验组斑马鱼鱼苗生存率，并作数据统计，GraphPad Prism软件拟合曲线，并计算LD50值。
所述步骤（1）中的药物为单体化合物、中药提取物或中药复方中的一种或几种。
所述步骤（2）中的培养液为鱼苗培养液，所述鱼苗培养液组成为：0.2g/L的Instantsea salt。
所述步骤（1）中的药物为雷公藤甲素或紫杉醇或烟曲霉素或金诺芬中的一种或几种。
在步骤（2）中，所用多孔板为12孔或24孔或48孔或96孔，每孔中的鱼苗数为1-100条。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：与其他评价方法相比，本发明的有益效果如下：（1）操作简单、快速，仅仅只需24小时既可判断出受试药物的毒性；（2）由于实验所用鱼苗很小，可用多孔板进行操作，因此比用成年斑马鱼为实验对象的方法更加具有高通量和操作方便的特点，也节约药物用量，微量受试药物也能用此方法检测。（3）斑马鱼鱼苗在该方法所涉及的发育阶段，身体透明，可用体式镜或显微镜实现对组织、器官乃至心脏跳动、血液流动的实时观察，实验获得的信息远远多于用成年斑马鱼为实验对象的方法。（4）斑马鱼鱼苗在该方法所涉及的发育阶段，不受成体动物的动物伦理管理条例限制，因此对实验者来说，省去很多实验手续。
附图说明
图1实施例1中雷公藤甲素浓度变化与模式动物斑马鱼鱼苗的生存率的关系图；
图2实施例2中紫杉醇浓度变化与模式动物斑马鱼鱼苗的生存率的关系图；
图3实施例3中烟曲霉素浓度变化与模式动物斑马鱼鱼苗的生存率的关系图；
图4实施例4中金诺芬浓度变化与模式动物斑马鱼鱼苗的生存率的关系图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
实施例1：
用模式动物斑马鱼鱼苗研究雷公藤甲素的急性毒性
受试药物：雷公藤甲素；
来源：sigma公司
理化性状：白色粉末，含量大于98%；
配制方法：根据所需浓度称取雷公藤甲素溶于100%DMSO中，再按0.1%比例将雷公藤甲素DMSO供试液稀释于斑马鱼鱼苗培养液中。
动物：斑马鱼，由南京大学模式动物研究所提供。
试剂：二甲亚砜（DMSO）购自sigma公司，鱼苗培养液为0.2g/L的Instantseasalt。Instantsea salt购自当地花鸟鱼虫市场。
实验方法：
取受精72小时，发育正常的斑马鱼鱼苗70条，随机分配于48孔板，每孔10条，于1ml培养液中。实验共分7组，分别为鱼苗培养液+0.1%DMSO对照组和含雷公藤甲素浓度依次为3.7,1.23,1,0.8,0.6,0.4μM的给药组，记录作用24小时后，不同实验组斑马鱼鱼苗的死亡数，计算存活率（%）。采用GraphPad Prism软件拟合曲线，并计算LD50值。
实验结果：
实验结果表明，对照组（鱼苗培养液+0.1%DMSO）无斑马鱼死亡，雷公藤甲素组斑马鱼的生存率与药物浓度呈负相关，采用GraphPad Prism软件进行曲线拟合，并得出LD50值为0.847μM，可客观地反应该药物的急性毒性。
实施例2
用模式动物斑马鱼鱼苗研究紫杉醇的急性毒性
受试药物：紫杉醇；
来源：sigma公司
理化性状：白色粉末，含量大于98%；
配制方法：根据所需浓度称取紫杉醇溶于100%DMSO中，再按0.1%比例将紫杉醇DMSO供试液稀释于斑马鱼鱼苗培养液中。
动物：斑马鱼，由南京大学模式动物研究所提供。
试剂：二甲亚砜（DMSO）购自sigma公司，鱼苗培养液为0.2g/L的Instantseasalt。Instant sea salt购自当地花鸟鱼虫市场。
实验方法：
取受精72小时，发育正常的斑马鱼鱼苗90条，随机分配于48孔板，每孔10条，于1ml培养液中。实验共分9组，分别为鱼苗培养液+0.1%DMSO对照组和含紫杉醇浓度依次为4,3.5,3,2.5,2,1.5,1,0.5μM的给药组，记录作用24小时后，不同实验组斑马鱼鱼苗的死亡数，计算生存率（%）。采用GraphPad Prism软件拟合曲线，并计算LD50值。
实验结果：
实验结果表明，对照组（鱼苗培养液+0.1%DMSO）无斑马鱼死亡，紫杉醇组斑马鱼的生存率与药物浓度呈负相关，采用GraphPad Prism进行曲线拟合曲线，并得出其LD50值为0.867μM，可客观地反应该药物的急性毒性。
实施例3
用模式动物斑马鱼鱼苗研究紫杉醇的急性毒性
受试药物：烟曲霉素；
来源：sigma公司
理化性状：白色粉末，含量大于98%；
配制方法：根据所需浓度称取烟曲霉素溶于100%DMSO中，再按0.1%比例将烟曲霉素DMSO供试液稀释于斑马鱼鱼苗培养液中。
动物：斑马鱼，由南京大学模式动物研究所提供。
试剂：二甲亚砜（DMSO）购自sigma公司，鱼苗培养液为0.2g/L的Instantseasalt。Instantsea salt购自当地花鸟鱼虫市场。
实验方法：
取受精72小时，发育正常的斑马鱼鱼苗70条，随机分配于48孔板，每孔10条，于1ml培养液中。实验共分7组，分别为鱼苗培养液+0.1%DMSO对照组和含烟曲霉素浓度依次为400,200,100,25,6.24,1.56μM的给药组，记录作用24小时后，不同实验组斑马鱼鱼苗的死亡数，计算生存率（%）。采用GraphPad Prism进行曲线拟合，并计算LD50值。
实验结果：
实验结果表明，对照组（鱼苗培养液+0.1%DMSO）无斑马鱼死亡，烟曲霉素组斑马鱼的生存率与药物浓度呈负相关，采用GraphPad Prism进行曲线拟合曲线，并得出其LD50值为209μM，可客观地反应该药物的急性毒性。
实施例4
用模式动物斑马鱼鱼苗研究金诺芬的急性毒性
受试药物：金诺芬；
来源：sigma公司
理化性状：白色粉末，含量大于98%；
配制方法：根据所需浓度称取金诺芬溶于100%DMSO中，再按0.1%比例将金诺芬DMSO供试液稀释于斑马鱼鱼苗培养液中。
动物：斑马鱼，由南京大学模式动物研究所提供。
试剂：二甲亚砜（DMSO）购自sigma公司，鱼苗培养液为0.2g/L的Instantseasalt。Instantsea salt购自当地花鸟鱼虫市场。
实验方法：
取受精72小时，发育正常的斑马鱼鱼苗70条，随机分配于48孔板，每孔10条，于1ml培养液中。实验共分7组，分别为鱼苗培养液+0.1%DMSO对照组和含金诺芬浓度依次为25,20,15,10,6.25,1.56μM的给药组，记录作用24小时后，不同实验组斑马鱼鱼苗的死亡数，计算生存率（%）。采用GraphPad Prism进行曲线拟合，并计算LD50值。
实验结果：
实验结果表明，对照组（鱼苗培养液+0.1%DMSO）无斑马鱼死亡，金诺芬组斑马鱼的生存率与药物浓度呈负相关，采用GraphPad Prism进行曲线拟合曲线，并得出其LD50值为10.8μM，可客观地反应该药物的急性毒性。
实施例5
与实施例4基本一样，所不同的在于，对照组采用鱼苗培养液+0.1%乙醇，实验结果和实施例4一样。
实施例6
与实施例3基本一样，所不同的在于，对照组采用鱼苗培养液+0.4%DMSO，实验结果和实施例3一样。
实施例7
与实施例5基本一样，所不同的在于，对照组采用鱼苗培养液+0.4%乙醇，实验结果和实施例5一样。
从上述的实施例中可以看出，斑马鱼对不同的药物作用情况不一样，用量也不一样，24小时后，对于雷公藤甲素组，当剂量为0.4μM以下时，没有斑马鱼死亡，当剂量为0.6μM-1μM时，斑马鱼呈线性死亡，当剂量为1.23μM以上时，斑马鱼全部死亡；对于紫杉醇组，当剂量为0.5μM-1.5μM时，斑马鱼呈线性死亡，当剂量为1.5μM以上时，斑马鱼全部死亡；对于烟曲霉素，当剂量为200μM以下时，没有斑马鱼死亡，当剂量为400μM以上时，斑马鱼全部死亡；对于金诺芬组，当剂量为1.56-10μM时，斑马鱼呈线性死亡，当剂量为15μM以上时，斑马鱼全部死亡；对于金诺芬组，当剂量为1.56-10μM时，斑马鱼呈线性死亡，当剂量为15μM以上时，斑马鱼全部死亡。从这些实施例可以看出，用斑马鱼鱼苗检测药物的急性毒性方便、快速、准确。
上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种模式动物斑马鱼鱼苗评价药物急性毒性的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）将药物用二甲亚砜或乙醇配制成0.4~400μM的供试液；所述药物为紫杉醇或烟曲霉素或金诺芬中的一种或几种；
（2）挑选受精72小时的发育正常的斑马鱼鱼苗，随机分配到多孔板中，每孔1-100条，于0.1-2ml培养液中，实验温度为28.5℃；所述培养液为鱼苗培养液，所述鱼苗培养液组成为：0.2g/L 的Instant ocean® sea salt；
（3）在步骤（2）的多孔板中加入步骤（1）中的供试液，并且以含二甲亚砜或乙醇终浓度为0.1%-0.4%的实验组作为对照，作用24小时后，即受精96小时，在显微镜下观察每孔中鱼苗的情况，以心脏停止跳动计为死亡；
（4）计算各实验组斑马鱼鱼苗生存率，并作数据统计，GraphPad Prism 软件拟合曲线，并计算LD50值。
2.根据权利要求1中所述的一种模式动物斑马鱼鱼苗评价药物急性毒性的方法，其特征在于在步骤（2）中，所用多孔板为12孔或24孔或48孔或96孔，每孔中的鱼苗数为1-100条。
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