CN102405878A - 一种抑郁症动物模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抑郁症动物模型的构建方法，创建了大小鼠束缚制动高脂饮食抑郁模型。通过模拟临床抑郁症病因病状的抑郁模型，给予老鼠高脂饮食，并每天采用束缚筒束缚4h以上，来模拟临床抑郁患者多食高脂高能量的食物以及缺少运动的状态，造模21天以上，通过测定糖水消耗及进行敞箱、自主活动、悬尾试验、强迫游泳等行为学试验，以及测定脑内单胺递质含量，证明了该方法成功地建立了抑郁症模型，为抗抑郁中药的筛选提供了研究基础。

Description

一种抑郁症动物模型的构建方法

(一)技术领域

本发明涉及一种抑郁症动物模型的构建方法，属于医疗评价、检测技术领域。

(二)背景技术

抑郁症又称心境恶劣障碍，是一种以持久的心境低落为主要临床特征的神经症性障碍。抑郁症的患病率及复发率在人群的各年龄层均较高，被称为精神病学中的感冒，严重危害人类的健康。目前已成为全球第二大疾病，给人类造成严重负担，带给患者及其家属身心双重折磨与痛苦，对社会造成的损失更是其他疾病所无法比拟的。《精神病学》书中指出抑郁状态主要临床表现为典型的“三低”，即持久的情绪低落(愉快感缺失、心烦压抑、孤独无助，严重者极度绝望)；兴趣和活动性减退(丧失对以往生活的热忱和乐趣，对任何事物都兴趣索然，疏远亲友，回避社交；懒言少动、行动缓慢、思维迟缓、学习工作能力下降，严重者可能不吃不动，生活不能自理)；自我评价降低(信心缺失、无价值感和无助感，严重时可出现自罪观念)；还有些病人会出现消极及自杀行为，或伴随出现紧张焦虑心理。

抑郁症是多种因素综合的疾病，目前对其发病机制还缺乏深入确切的认识，抑郁症的机制研究和抗抑郁症新药的开发都离不开有效地动物模型，加强抗抑郁药及其药效作用机制的研究，对人类健康生存具有十分重要的意义。目前，抑郁症动物模型最常用的是应激模型，通过给予动物各种刺激，使动物产生应激反应，表现出抑郁的状态。此外，也有通过改变动物脑内的单胺神经递质导致抑郁的神经生化模型。

疾病病因机制的基础研究需要依靠动物模型，动物模型的建立应从疾病的发病原因、症状表现、病理生理和临床已有疗效药物对其作用效果等多方面综合考虑。也就是说，模型建造过程中引起动物行为改变的原因，动物表现出的各种躯体及精神症状，造成动物行为改变的病理生理基础以及临床已有疗效的抗抑郁药对动物模型的有效性均应与临床相似。在进行抗抑郁药理学研究时，现存类别有限的抑郁动物模型，无法满足所有抗抑郁中药的筛选，部分研究中使用的抑郁动物模型往往不一定正确，导致不能准确地反应药物的真正作用机制。

在临床治疗中发现，很多抑郁症患者都有过食高脂高能量食物，并且长期处于运动量少的状态，使摄入过剩的能量无所出，只能堆积于体内，导致脾胃运化失调，致血液供应不足，心、肝、肺等脏腑无所养，则使淤积于脏腑中的郁气无法疏泄，久淤成病，表现为精力减退、情绪低落、兴趣缺失、思维能力下降等。因此模拟中医临床抑郁症病因、病症，建立基于高脂饮食、制动因素相关动物模型，不但可用于探究这两因素对抑郁症的科学内涵，还能对新药的筛选提供能反应疾病本质的动物模型。

(三)发明内容

本发明的目的是构建一种新的抑郁症动物模型。

本发明采用的技术方案是：

一种新的抑郁症动物模型的构建方法，所述方法包括：用高脂饲料喂养大鼠或小鼠，并进行束缚4h以上/天(时间越长越好，一般4～6h即可)，如此连续喂养21天以上(时间越长越好，一般30天即可造模成功)，直至获得抑郁症动物模型。所述高脂饲料是指是指能诱导大小鼠患高脂血症的饲料，可采用市购商品或自行配制，可由基础饲料(按实验动物配合饲料国家标准(GB14924-2001)配制)添加胆固醇、蛋黄、猪油和的胆盐(Bile salt，是由肝细胞分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合而形成的钠盐或钾盐)配制而成。所述束缚是将大鼠或小鼠置于一个能限制其四肢活动但不影响正常呼吸的圆形塑料筒(如图1)中。造模过程中给予正常饮水，不限制进食量。

本发明中所述高脂饲料制备方法：将基础饲料与质量为基础饲料质量1～5％的胆固醇、10～20％的蛋黄、5～20％的猪油及0.2～1.0％的胆盐搅拌均匀后，压制成条状，低温烘干即得。

所述的大鼠或小鼠为常规用于动物实验的大鼠或小鼠，如清洁级SD大鼠或Wistar大鼠和清洁级ICR小鼠或昆明种小鼠。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种简单方便的抗抑郁动物模型构建方法，为抗抑郁中药的筛选提供了研究基础。

(四)附图说明

图1为本发明束缚装置图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

一.材料与仪器

1.材料

雄性清洁级SD大鼠32只(体重200±20g)，由浙江中医药大学提供。动物饲养条件：温度23±2℃。自由饮水进食，适应性饲养一周后进行实验。

高脂饲料：在基础饲料(鼠饲料，浙江省实验动物饲料生产基地，执行标准GB14924-2001)中加2.5％(w/w，下同)胆固醇(上海朗瑞精细化学品有限公司)、15％蛋黄、10％猪油和0.5％三号胆盐(上海江莱生物科技有限公司)配制而成。

2.实验仪器

大鼠束缚筒；Smart动物行为分析系统(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；YLS-EB多功能大鼠自主活动记录仪(山东省医学科学院设备站)；YLS-18A悬尾测试仪(济南益延科技发展有限公司)；游泳桶；秒表

二.方法

1.动物分组及模型建立

(1)空白组：正常喂养。

(2)束缚+高脂饮食组：给予高脂饲料，定时将大鼠置于一个能限制其四肢活动但不影响正常呼吸的圆形塑料筒中，每天束缚6h。

(3)束缚+正常饮食：给予基础饲料，每天定时束缚6h。

(4)高脂饮食组：给予高脂饲料。

以上各组四只一笼，实验过程中给予正常饮水，不限制进食量。造模30天后进行行为学测试。

2.体重测定及行为观察

在造模第1、7、14、21、30天束缚前称量各大鼠体重，并观察其行为的变化，如精神状态，对抓取的反应，每次观察约20min。

3.糖水消耗实验

利用大鼠对蔗糖水的喜好来模拟人类的兴趣感，若糖水消耗量减少则可模拟抑郁患者兴趣下降的症状。先训练大鼠饮用1％蔗糖水，即在开始的适应阶段48h给予双瓶水，一瓶1％蔗糖水一瓶自来水，供大鼠自由饮用。在造模第30天束缚后，将称重过的盛有纯水和蔗糖水的饮水瓶，分别插入鼠笼盖左右两端(蔗糖水在左，纯水在右)4h后取下，称量饮水瓶重量，计算大鼠的糖水消耗量。

糖水消耗量＝蔗糖水饮用量/对应大鼠的体重×100％

4.敞箱实验

采用大鼠自发活动视频系统，通过轨迹跟踪和记录站立次数来评价大鼠的自发行为，每只进行5min实验。

5.自主活动

实验前在记录仪上设定实验时间，将大鼠放入自主活动桶后，按下开始按钮，时间一到，仪器自动停止记数，记录5min内大鼠的活动数作为自主活动指标。

6.悬尾实验

将大鼠尾端2cm的部位用胶布固定在一根水平棒上，使大鼠头向下呈倒悬挂，倒挂于黑色悬尾箱中，其头部离水平面5～6cm，隔开相邻大鼠的视线，实验时按下计时按钮，记录每只大鼠6min内累计活动时间，时间一到，仪器自动停止计时。以总时间减去活动时间为不动时间作为悬尾试验指标。

7.强迫游泳实验

将大鼠放入高60cm，直径40cm的塑料圆桶中，内装23～25℃温水，水深30cm，使大鼠不能触及圆桶底部。观察6min内每5s末，大鼠的攀爬行为及静止不动行为，每种行为分别出现的频率。攀爬行为，指大鼠在泳池中沿着泳池内壁使用爪向上攀爬的行为；静止不动行为，指大鼠除了为避免没入水中而向上的主动运动外，无其他行为。

8.采用HPLC-FLD法测定脑内单胺递质

大鼠麻醉腹主动脉放血后，心尖推注20mL生理盐水，迅速取脑，称重，投入液氮中存放。实验时，取出迅速将脑剪碎拌匀，精密称取约0.4g脑组织，加入高氯酸溶液在玻璃匀浆器中匀浆，每100mg组织中加入高氯酸溶液700μL，用于沉淀蛋白并且提取单胺递质，离心(4℃，13300r/min，20min)，精密吸取0.4mL上清液于一新离心管中，并加入2倍体积磷酸二氢钠溶液，上下颠倒混匀，离心(4℃，13300r/min，20min)取上清液，得脑组织提取液。

色谱条件：Kromasil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相pH 4.84缓冲液(含1mmol/L庚烷磺酸钠；30mmol/L磷酸二氢钠)-甲醇(80∶20)，流速：1.0mL/min；柱温：35℃；进样量：50μL。荧光检测器：激发波长为290nm，发射波长为330nm。

9.数据分析

各组数据均以均数±标准偏差

表示，采用统计软件SPSS17.0进行统计学分析，组间采用T检验。P＜0.05为有统计学差异，P＜0.01为显著统计学差异。

三.结果

1.大鼠体重变化

各组大鼠体重变化见表1，经过30天束缚制动高脂饮食造模后，各组大鼠体重都有所增加。与空白组比较，束缚+高脂饮食组和束缚+正常饮食组体重增长均没有空白组快，且在造模14、21、30天与空白组相比都具有显著统计学差异(P＜0.01)。高脂饮食组比空白组体重增长更快，在造模第7和14天增长最显著，具有显著统计学差异(P＜0.01)。

表1：束缚制动高脂饮食对大鼠体重的影响(x±s，n＝6)单位：g

与空白组比较：**P＜0.01

2.糖水消耗

结果见表2，经过30天造模后，与空白组比较，束缚+高脂饮食组糖水消耗量明显减少，具有统计学差异(P＜0.05)。束缚+正常饮食组消耗量变化不大，不具统计学意义(P＞0.05)；高脂饮食组消耗量减少量也较大，但没有束缚+高脂饮食组那么明显，仍不具统计学差异。说明束缚和高脂饮食这两个因素在一定程度上降低大鼠的糖水消耗量，但单纯束缚不会导致大鼠糖水消耗量较大的变化。

表2：束缚制动高脂饮食对大鼠糖水消耗的影响(x±s，n＝6)

与空白组比较：*P＜0.05

3.敞箱实验

结果见表3，经过30天造模后，与空白组比较，束缚+高脂饮食组在水平活动距离和垂直活动次数上都显著减少，具有显著统计学差异(P＜0.01)。与空白组比较，束缚+正常饮食组在水平活动距离上显著减少，具有显著统计学差异，而垂直活动次数有减少但不具有统计学差异(P＞0.05)。相比于空白组，高脂饮食组在水平活动距离方面显著减少具显著统计学差异(P＜0.01)，在垂直活动次数方面明显减少，具有统计学差异(P＜0.05)。

表3：束缚制动高脂饮食对大鼠敞箱活动的影响(x±s，n＝6)

与空白组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

4.自主活动

结果见表4，经过30天造模后，与空白组比较，束缚+高脂饮食组自主活动量显著减少，具显著统计学差异(P＜0.01)；束缚+正常饮食组直观上有减少，但不具统计学差异(P＞0.05)；高脂饮食组活动量也显著减少，具有显著统计学差异(P＜0.01)。

表4：束缚制动高脂饮食对大鼠自主活动的影响(x±s，n＝6)  单位：次

与空白组比较：**P＜0.01

5.悬尾实验

结果见表5，经过30天造模后，与空白组比较，束缚+高脂饮食组悬尾不动时间显著延长具显著统计学差异(P＜0.01)；束缚+正常饮食组和高脂饮食组不动时间均有延长，但不具统计学差异(P＞0.05)。

表5：束缚制动高脂饮食对大鼠悬尾不动时间的影响(x±s，n＝6)  单位：s

与空白组比较：**P＜0.01

6.强迫游泳实验

结果见表6，经过30造模后，与空白组比较，束缚+高脂饮食组静止不动次数显著增加具显著统计学差异(P＜0.01)，攀爬次数明显减少具统计学差异(P＜0.05)；束缚+正常饮食组在直观上静止不动次数增加和攀爬次数减少，但都不具统计学差异(P＞0.05)；高脂饮食组静止不动次数显著增加、攀爬次数显著减少，均具显著统计学差异(P＜0.01)。

表6：束缚制动高脂饮食对大鼠强迫游泳行为的影响(x±s，n＝6)单位：次

与空白组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

7.大鼠脑内单胺神经递质含量变化

结果见表7，经过30天造模后，与空白组比较，束缚+高脂饮食组和高脂饮食组NE含量显著减少具显著统计学差异(P＜0.01)，束缚+正常饮食组明显减少具统计学差异(P＜0.05)；高脂饮食组DA含量显著减少具显著统计学差异(P＜0.01)，而其余两组模型组不具统计学差异(P＞0.05)；束缚+高脂饮食组和束缚+正常饮食组5-HT含量明显减少具统计学差异(P＜0.05)，而高脂饮食组5-HT含量显著减少具显著统计学差异(P＜0.01)。

表7：束缚制动高脂饮食对大鼠脑内单胺递质的影响(x±s，n＝6)单位：μg/g

与空白组比较：*P＜0.05，**P＜0.01

四.结论

30天造模结束后，通过体重变化、糖水消耗、敞箱活动、自主活动量、悬尾不动时间、游泳不动时间的检测，结果表明束缚+高脂饮食模型对造成大鼠抑郁行为最有效，其次是高脂饮食模型，而束缚+正常饮食模型效果不明显，说明高脂饮食和束缚这两个因素在此模型建造中起着至关重要的作用。在对大鼠脑内单胺递质含量测定中发现，行为学变化明显的束缚+高脂饮食组脑内NE、5-HT含量也发生了明显的降低。

束缚制动高脂饮食模型大鼠表现出抑郁障碍症状，即运动能力和探索能力下降，对不能逃逸出的恶劣环境更早的表现出绝望状态。模型大鼠行为改变的原因与抑郁临床患者多吃少动的病因基本相似，脑内NE和5-HT含量具有不同程度的减少，与抑郁症患者脑内单胺递质含量减少的变化一致，基本已符合抑郁症动物模型可靠性、有效性的几项判定指标，即疾病的发病原因、症状表现、病理生理，说明按照本发明方法，能够成功获得抑郁症动物模型。

Claims (4)

1.一种抑郁症动物模型的构建方法，所述方法包括：用高脂饲料喂养大鼠或小鼠，并进行束缚4h以上/天，造模21天以上，获得抑郁症动物模型。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述大鼠为清洁级SD大鼠或Wistar大鼠。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述小鼠为清洁级ICR小鼠或昆明种小鼠。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述高脂饲料由基础饲料添加质量为基础饲料质量1～5％的胆固醇、10～20％的蛋黄、5～20％的猪油和0.2～1.0％的胆盐配制而成。

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