CN105115951B - 一种快速评价化合物对斑马鱼肝脏功能损伤作用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速评价化合物对斑马鱼肝脏功能损伤作用的方法，包括如下步骤：(1)将受精后正常斑马鱼胚胎移入培养孔中；(2)对培养孔中的斑马鱼胚胎连续给药孵育，记为待测化合物组；(3)观察斑马鱼胚胎肝脏，记录并计算斑马鱼胚胎肝脏面积和斑马鱼胚胎体面积；(4)根据待测化合物组的斑马鱼胚胎的肝脏面积指数与正常斑马鱼胚胎的肝脏面积指数的范围的关系，判断待测化合物是否具有肝脏毒性；本发明首次将肝脏面积指数作为斑马鱼肝功能评价的检测指标，更加科学、客观，提高了结果的准确性。建立的化合物对斑马鱼肝功能损伤作用的评价模型具有制作简单、快速、稳定可靠和重复性好的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速评价化合物对斑马鱼肝脏功能损伤作用的方法，属于毒理学检测技术领域。
背景技术
药物毒性问题是医药行业发展的关键问题，药物性肝损伤是最常见的药物不良反应。随着新药的不断问世，药物性肝损伤的发病率也相应增加。很多药物的赋形剂、中草药以及保健药亦有导致肝损伤的可能。药物引起的肝脏毒性是导致新药研发失败或上市后从市场撤出的主要原因之一，据统计大约有1/3的药物因为肝脏毒性从市场撤出。美国FDA批准上市的药物中，80％以上的黑框警告药物属于严重肝毒性药物，肝毒性研究位于所有药物不良反应研究的首位。
虽然近年来对候选化合物或新药的肝脏毒性早期筛查越来越引起人们的重视，但与之相适应的快速动物筛选模型、简单的分析检测技术和精确的评价指标仍较匮乏。目前在临床前研究中，主要使用大鼠、小鼠体内实验和人肝细胞体外实验检测药物肝脏毒性。这些检测方法具有一定的局限性，细胞实验不能准确反应药物在体内微环境下的活性。哺乳动物模型虽然具有结果可靠、综合全面的优点，但是所需的候选物样品量大，且耗时、耗资、耗力，不适合高通量筛选与毒性评价研究。
近十多年来，国外的研究发现斑马鱼可用于建立多种人类疾病模型并用于药物毒性研究。斑马鱼的优势在于：(1)斑马鱼全基因组测序于2009年完成，与人类基因的相似度达87％。两者在基因和蛋白质的序列和功能上表现很高的保守性，意味着在斑马鱼上做药物毒性试验所得结果在多数情况下也适用于人体。(2)胚胎体外发育，受精后24h，主要器官原基已形成，相当于28d的人类，实验周期短。(3)胚胎透明，可在显微镜下直接观察胚胎发育过程，全程、完整观察药物对其体内器官的毒性作用，避免处死或解剖动物。(4)物种稳定，繁殖周期短，饲养方便，费用低。斑马鱼拥有其他动物所无法相比的优点，其复制出的疾病与人类疾病有高度相似性，具有可靠性、可控性、易行性和经济性等特点。采用斑马鱼进行药物肝毒性评价不仅可减少受试药物的用量，克服早期新药研发中候选物样品量不足导致无法采用传统的动物实验对药物的潜在毒性作用进行深入评价的问题，同时可在短期内完成对化合物毒性评价与毒性机制的研究工作，明显缩短研究周期，降低研究成本，有助于在细胞和分子水平阐明药物肝脏毒性作用机理。
中国专利文献CN(申请号201010170675.2)公开了一种用模式生物斑马鱼筛选肝损伤药物的方法，但是该方法利用成年斑马鱼进行筛选，实验周期长、所需费用高、不适合高通量筛选。
中国专利文献CN102353663A(申请号201110190076.1)专利公开了一种用斑马鱼定量评价化合物肝毒性的方法，该方法通过选定斑马鱼整个肝脏区域，计算肝脏明亮度总和来评价化合物的肝脏毒性，但是该方法使用普通斑马鱼幼鱼，体式显微镜下观察肝脏与其他脏器的界限不是完全清晰可辨，肝脏区域的选择误差较大，导致肝脏明亮度总和的计算误差大，影响实验结果的准确性。
中国专利文献CN104297222A(申请号201410548844.X)公开了一种斑马鱼胚胎酒精肝检测模型的构建方法，但是该方法未考虑到斑马鱼幼鱼本身发育的个体差异问题，导致实验结果的误差较大。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种快速评价化合物对斑马鱼肝脏功能损伤作用的方法，建立一种具有快速、准确、高通量特点的化合物肝脏毒性评价体系。
本发明的技术方案如下：
一种快速评价化合物对斑马鱼肝脏功能损伤作用的方法，包括如下步骤：
(1)将受精后2～4天的发育正常斑马鱼胚胎移入培养孔中；
(2)对培养孔中的斑马鱼胚胎连续给药孵育1～3天，记为待测化合物组；
(3)观察斑马鱼胚胎肝脏，记录并计算斑马鱼胚胎肝脏面积和斑马鱼胚胎体面积，按照如下公式计算肝脏面积指数：
肝脏面积指数＝肝脏面积/体面积×100％；
(4)当步骤(3)计算的待测化合物组的斑马鱼胚胎的肝脏面积指数不在正常斑马鱼胚胎的肝脏面积指数的范围内，且达到统计学上的显著性水平(P<0.05)，则待测化合物具有肝脏毒性；当步骤(3)计算的待测化合物组的斑马鱼胚胎的肝脏面积指数在正常斑马鱼胚胎的肝脏面积指数范围内，则待测化合物不具有肝脏毒性；
所述的正常斑马鱼胚胎的肝脏面积指数为：
受精后3d的斑马鱼肝脏面积指数为0.40～0.68％，受精后4d的斑马鱼肝脏面积指数为1.99～2.66％，受精后5d的斑马鱼肝脏面积指数为3.07～3.82％，受精后6d的斑马鱼肝脏面积指数为3.93～4.84％，受精后的7d斑马鱼肝脏面积指数为3.25～4.39％。
根据本发明优选的，所述斑马鱼胚胎为肝脏特异表达荧光的斑马鱼胚胎。肝脏特异表达荧光的斑马鱼胚胎可采用本领域普通市售产品，如国家斑马鱼资源中心销售的转基因斑马鱼。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中斑马鱼胚胎为受精3～6天的斑马鱼胚胎。受精3天以上，斑马鱼胚胎肝脏已完成发育，有利于实验效果的准确性。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中孵育，温度为26～30℃，光照孵育，每天更换含待测化合物的培养液。
根据本发明进一步优选的，所述培养液组分如下：
NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl2 0.4mM，MgSO4 0.16mM，去离子水配制。
根据本发明优选的，所述步骤(3)还包括观察前的预处理步骤、；将需要观察的斑马鱼胚胎用质量浓度为0.3‰的三卡因浸泡40～90s进行麻醉，然后用3％甲基纤维素固定于载玻片上。
根据本发明优选的，所述步骤(3)的观察为在荧光显微镜下观察。
根据本发明优选的，所述步骤(3)的记录为拍照记录。
根据本发明优选的，所述步骤(3)的计算为利用图像处理软件计算。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中，待测化合物组至少做三组平行实验，每组斑马鱼胚胎总数不低于15枚。进一步优选的，每组斑马鱼胚胎总数为30～50枚。
原理分析
本发明随机选取不同的健康斑马鱼雌雄亲鱼，配对产卵，收集得到不同发育阶段的斑马鱼胚胎，每组30个，按上述方法利用图像处理软件计算斑马鱼的肝脏面积、体面积。根据如下公式计算各组斑马鱼的肝脏面积指数：
肝脏面积指数＝肝脏面积/体面积×100％。
根据如下公式计算各组斑马鱼肝脏面积和肝脏面积指数的变异系数 变异系数是衡量各检测值变异程度的一个统计量，为无量纲量，可以消除单位和(或)平均数不同对两个或多个检测指标变异程度比较的影响。变异系数越小，测定结果的偏差程度越小；反之，变异系数越大，测定结果的偏差程度越大。结果发现各组斑马鱼肝脏面积指数的变异系数均小于肝脏面积的变异系数，说明肝脏面积指数的检测结果比肝脏面积的检测结果更稳定，离散度更小，精密度更高。结果如表1所示：
表1不同发育阶段斑马鱼的肝脏面积和肝脏面积指数的变异系数(％)
连续分批检测不同发育阶段(3dpf、4dpf、5dpf、6dpf、7dpf)的斑马鱼肝脏面积、体面积，每批30个胚胎，连续检测5批，按上述方法中步骤(2)(3)，利用图像处理软件计算斑马鱼的肝脏面积、体面积。根据如下公式计算各批次斑马鱼的肝脏面积指数：肝脏面积指数＝肝脏面积/体面积×100％。根据如下公式计算各批次间斑马鱼肝脏面积和肝脏面积指数的变异系数结果发现不同发育阶段的斑马鱼肝脏面积指数各批次间的变异系数均小于肝脏面积的批间变异系数，说明肝脏面积指数的检测结果比肝脏面积的检测结果的重现性更佳。结果如表2所示下：
表2不同批次间斑马鱼的肝脏面积和肝脏面积指数的变异系数(％)
依据所建立的定量分析方法对不同发育阶段的斑马鱼肝脏面积指数的生理正常值进行检测，结果如表3所示：
表3不同发育阶段的斑马鱼肝脏面积指数(％)(n＝150)
单样本K-S检验分析显示上述各组数据均服从正态分布，用确定95％可信区间，确定不同发育龄正常斑马鱼肝脏面积指数的正常界值范围为：
受精后3d的斑马鱼肝脏面积指数为0.40～0.68％，受精后4d的斑马鱼肝脏面积指数为1.99～2.66％，受精后5d的斑马鱼肝脏面积指数为3.07～3.82％，受精后6d的斑马鱼肝脏面积指数为3.93～4.84％，受精后的7d斑马鱼肝脏面积指数为3.25～4.39％。
通过待测化合物组的斑马鱼胚胎的肝脏面积指数与上述正常斑马鱼肝脏面积指数进行比较，得出待测化合物是否对斑马鱼肝脏功能有损伤的结果。
有益效果
1、本发明首次将肝脏面积指数作为斑马鱼肝功能评价的检测指标，更加科学、客观，提高了结果的准确性。建立的化合物对斑马鱼肝功能损伤作用的评价模型具有制作简单、快速、稳定可靠和重复性好的优点。
2、本发明中所用的模式生物斑马鱼，既具有体外细胞株可快速筛选的优点，又具有活体动物体内验证的优势，利用斑马鱼胚胎进行大规模化合物的肝脏毒性评价，有助于提高实验效率和降低实验成本。
附图说明
图1为甲萘威对斑马鱼肝功能损伤的肝脏荧光照片；
图中：a为空白对照组；b为15μM的甲萘威处理组；图中划线部分为肝脏。
图2为斑马鱼肝脏组织切片(HE染色)照片。
图中：a为空白对照组斑马鱼肝脏组织切片照片；b为15μM的甲萘威处理组斑马鱼肝脏组织切片照片；
图3为异烟肼对斑马鱼肝功能损伤的肝脏荧光照片；
图中：a为空白对照组；b为16mM的异烟肼处理组；图中划线部分为肝脏。
图4为斑马鱼肝脏组织切片(HE染色)照片。
图中：a为空白对照组斑马鱼肝脏组织切片照片；b为16mM的异烟肼处理组斑马鱼肝脏组织切片照片；
图5为吡嗪酰胺对斑马鱼肝功能损伤的肝脏荧光照片；
图中：a为空白对照组；b为5mM的吡嗪酰胺处理组；图中划线部分为肝脏。
图6为斑马鱼肝脏组织切片(HE染色)照片；
图中：a为空白对照组斑马鱼肝脏组织切片照片；b为5mM的吡嗪酰胺处理组斑马鱼肝脏组织切片照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实验动物：采用肝脏特异表达荧光的斑马鱼，购自国家斑马鱼资源中心。雌雄斑马鱼在照明14h/黑暗10h、28℃标准条件下分开饲养，定时喂以颗粒状饵料和丰年虾。用卵时，取健康性成熟的斑马鱼，按雌雄1/1或1/2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，半小时后将成鱼捞出，使排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，对受精卵进行消毒和清洗后，移入斑马鱼胚胎培养用水中，28℃下控光培养，中间每24h换约1/2水，并及时吸出死亡胚胎。
试剂配制：甲萘威标准品购自上海市农药研究所，用二甲基亚枫溶解配制储液。异烟肼(INH，CAS号54-85-3)购自Fluka公司、吡嗪酰胺(PZA，CAS号98-96-4)购自Sigma公司，分别用纯水溶解配制储液。所有样品储液放于4℃保存，实验时用培养水稀释至所需浓度。
培养水组分如下：
NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl2 0.4mM，MgSO4 0.16mM，去离子水配制。
实施例1：评价甲萘威对斑马鱼肝脏的毒性作用
1.斑马鱼幼鱼的获得与使用
采用健康性成熟的肝脏特异表达荧光的斑马鱼，按雌雄1/1或1/2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，半小时后将成鱼捞出，使排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，对受精卵进行消毒和清洗后，移入斑马鱼胚胎培养用水中，并向所述培养水中加入0.2ppm亚甲基蓝，28℃下控光培养。从斑马鱼胚胎出生后12小时加入0.2mM的苯硫脲，中间每24h换约1/2水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后3天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼仔鱼，放入6孔板中，每孔10尾，每组3个平行孔。
2.化合物处理
设置7个实验组：1个空白对照组，1个溶剂对照组，5个甲萘威处理组。移除微孔板中的培养水，空白对照组中加入5mL培养水，溶剂对照组加入5mL含体积浓度0.5％二甲基亚砜的培养水溶液，甲萘威处理组分别加入5mL浓度为5μM，10μM，15μM，20μM，30μM的甲萘威溶液。然后，放入28℃恒温培养箱中培养72小时。每24h换液一半。
3.定量分析
于施药后72小时，将斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉1min，然后用3％甲基纤维素固定于载玻片上，将斑马鱼固定侧面体位进行拍照。
荧光显微镜下拍照记录斑马鱼肝脏荧光情况。与空白对照组和溶剂对照组相比，甲萘威处理后的幼鱼肝组织荧光面积和荧光强度明显下降，肝脏明显萎缩退化(图1)。
利用图像处理软件计算所述模型的肝脏面积、体面积。
根据如下公式计算各组斑马鱼的肝脏面积指数：
肝脏面积指数＝肝脏面积/体面积×100％
各组斑马鱼肝脏面积指数以表示，采用独立样本t检验法分析比较组间差异的显著性。
统计结果显示，与空白对照组相比，5μM的甲萘威处理组斑马鱼肝脏面积指数无显著性变化；10μM的甲萘威处理组斑马鱼肝脏面积指数降低，具有统计学意义(P<0.05)；15μM、20μM和30μM的甲萘威处理组斑马鱼肝脏面积指数均明显降低并具有剂量依赖性，差异具有显著统计学意义(P<0.01)(表4)。
以实施例1制备的所述斑马鱼肝功能损伤评价模型为研究对象，考察本发明所述的斑马鱼肝脏损伤的评价指标，即肝脏面积指数的降低与现有技术中的肝脏常规评价指标即谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的相关性，进一步验证斑马鱼肝脏面积指数的降低作为快速评价化合物对斑马鱼肝脏功能损伤作用的指标的可靠性。
制备实施例1中的斑马鱼幼鱼组织匀浆，测定组织中ALT、AST水平。与空白对照组相比，5μM的甲萘威处理组ALT、AST含量未见显著性升高，10μM、15μM、20μM和30μM的甲萘威处理组ALT、AST含量均显著性升高(P<0.05，P<0.01)(表4)。可见，斑马鱼肝脏面积指数的降低与转氨酶生化指标升高在反映甲萘威对斑马鱼的肝脏损伤程度上具有相关性。
表4甲萘威对斑马鱼幼鱼肝脏面积指数和转氨酶的影响(n＝30)
*P<0.05significantly different from the control；**P<0.01significantlydifferent from the control.
为进一步研究斑马鱼肝脏面积指数和转氨酶生化指标之间的相关性，分别在7个实验组(空白对照组、溶剂对照组、5μM甲萘威处理组、10μM甲萘威处理组、15μM甲萘威处理组、20μM甲萘威处理组和30μM甲萘威处理组)中选取3批样本，共计21个样本。每批30个斑马鱼，计算每批各组斑马鱼的肝脏面积指数和转氨酶生化指标的平均值。采用Pearson相关系数，分析肝脏面积指数与血生化指标之间的相关性，检验水准：P<0.05。
Pearson相关系数计算公式如下：
相关系数r的性质有：①相关系数的取值范围为-1≤r≤+1；②r为正值时，两变量为正相关，r为负值时，两变量为负相关；③相关系数的绝对值│r│愈大，两变量间相关程度愈密切。r＝+1，为完全正相关；r＝-1，为完全负相关；r＝0，两变量完全无关。相关系数大小的一般解释见表5：
表5相关系数大小的一般解释
相关性分析表明，斑马鱼肝脏面积指数与ALT、AST水平之间均呈负相关，均存在非常强的相关性(│r│>0.8，P<0.01)，其中肝脏面积指数与ALT水平的相关性最好，AST水平次之。如表6所示：
表6肝脏面积指数与谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的相关性
对正常组和甲萘威处理组斑马鱼做病理切片和HE染色，结果显示，正常斑马鱼幼鱼肝脏结构完整，肝细胞质均匀红染。甲萘威处理斑马鱼72h后，5μM处理组斑马鱼的肝细胞未发生明显变化，10μM、15μM处理组斑马鱼幼鱼部分肝细胞内出现空泡，胞质稀疏。20μM、30μM处理组斑马鱼幼鱼部分肝细胞轮廓不清晰，胞质更加稀疏，空泡显著增加(图2)。
在本方法中，经甲萘威(10μM、15μM、20μM、30μM)处理后斑马鱼的肝脏面积指数下降，并超过相应的正常界值范围，结合转氨酶和肝脏组织病理切片结果，表明甲萘威具有肝脏毒性作用，同时也证明肝脏面积指数的降低可作为快速评价化合物对斑马鱼肝功能损伤作用的评价指标。
实施例2：评价异烟肼对斑马鱼肝脏的毒性作用
1.斑马鱼幼鱼的获得与使用
采用健康性成熟的肝脏特异表达荧光的斑马鱼，按雌雄1/1或1/2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，半小时后将成鱼捞出，使排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，对受精卵进行消毒和清洗后，移入斑马鱼胚胎培养用水中，并向所述培养水中加入0.2ppm亚甲基蓝，28℃下控光培养。从斑马鱼胚胎出生后12小时加入0.2mM的苯硫脲，中间每24小时换约1/2水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后4天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼仔鱼，放入6孔板中，每孔10尾。每组3个平行孔。
2.化合物处理
设置4个实验组：1个空白对照组，3个异烟肼处理组。移除微孔板中的培养水，空白对照组中加入5mL培养水，异烟肼处理组分别加入5mL浓度为4mM，8mM，16mM的异烟肼溶液。然后，放入28℃恒温培养箱中培养48小时。每24h换液一半。
3.定量分析
于施药后72小时，将斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉40s，然后用3％甲基纤维素固定于载玻片上，将斑马鱼固定侧面体位进行拍照。
荧光显微镜下拍照记录斑马鱼肝脏荧光情况。与空白对照组和溶剂对照组相比，异烟肼处理后的幼鱼肝组织荧光面积和荧光强度明显下降，肝脏明显萎缩退化(图3)。
利用图像处理软件计算所述模型的肝脏面积、体面积。
根据如下公式计算各组斑马鱼的肝脏面积指数：
肝脏面积指数＝肝脏面积/体面积×100％
各组斑马鱼肝脏面积指数以表示，采用独立样本t检验法分析比较组间差异的显著性。
统计结果显示，与空白对照组相比，4mM的异烟肼处理组斑马鱼肝脏面积指数无显著性变化；8mM和16mM的异烟肼处理组斑马鱼肝脏面积指数显著降低(P<0.05)，均超过相应的正常界值范围(如表7所示)。
以实施例2制备的所述斑马鱼肝功能损伤评价模型为研究对象，考察本发明所述的斑马鱼肝脏损伤的评价指标，即肝脏面积指数的降低与现有技术中的肝脏常规评价指标即谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的相关性，进一步验证斑马鱼肝脏面积指数的降低作为快速评价化合物对斑马鱼肝脏功能损伤作用的指标的可靠性。
制备实施例2中的斑马鱼幼鱼组织匀浆，测定组织中ALT、AST水平。与空白对照组相比，4mM的异烟肼处理组ALT、AST含量未见显著性升高，8mM的异烟肼处理组ALT含量显著性升高(P<0.05)，16mM的异烟肼处理组ALT、AST含量均显著性升高(P<0.01)(表7)。可见，斑马鱼肝脏面积指数的降低与转氨酶生化指标升高在反映异烟肼对斑马鱼的肝脏损伤程度上具有相关性。
表7异烟肼对斑马鱼幼鱼肝脏面积指数和转氨酶的影响(n＝30)
*P<0.05significantly different from the control；**P<0.01significantlydifferent from the control.
为进一步研究斑马鱼肝脏面积指数和转氨酶生化指标之间的相关性，分别在4个实验组(空白对照组、4mM异烟肼处理组、8mM异烟肼处理组和16mM异烟肼处理组)中选取3批样本，共计12个样本。每批30个斑马鱼，计算每批各组斑马鱼的肝脏面积指数和转氨酶生化指标的平均值。采用Pearson相关系数，分析肝脏面积指数与血生化指标之间的相关性，检验水准：P<0.05。
Pearson相关系数计算公式如下：
相关性分析表明，斑马鱼肝脏面积指数与ALT水平之间呈负相关，存在非常强的相关性(│r│>0.8，P<0.01)；斑马鱼肝脏面积指数与AST水平之间呈负相关，存在强相关性(0.6<│r│<0.8，P<0.01)。如表8所示：
表8肝脏面积指数与谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的相关性
对正常组和异烟肼处理组斑马鱼做病理切片和HE染色，结果显示，正常斑马鱼幼鱼肝脏结构完整，肝细胞质均匀红染。异烟肼处理斑马鱼72h后，4mM处理组斑马鱼的肝细胞未发生明显变化，8mM、16mM处理组斑马鱼幼鱼部分肝细胞轮廓不清晰，出现空泡(图4)。
在本方法中，经异烟肼(8mM、16mM)处理后斑马鱼的肝脏面积指数下降，并超过相应的正常界值范围，结合转氨酶和肝脏组织病理切片结果，表明异烟肼具有肝脏毒性作用，同时也证明肝脏面积指数的降低可作为快速评价化合物对斑马鱼肝功能损伤作用的评价指标。
实施例3：评价吡嗪酰胺对斑马鱼肝脏的毒性作用
1.斑马鱼幼鱼的获得与使用
采用健康性成熟的肝脏特异表达荧光的斑马鱼胚胎，按雌雄1/1或1/2的比例放入交配缸内，中间放置隔板，置于黑暗环境中，次日亮灯前抽去隔板，光照刺激使其排卵，半小时后将成鱼捞出，使排卵时间控制在半小时内，以降低胚胎间发育时间的差异。收集受精卵，对受精卵进行消毒和清洗后，移入斑马鱼胚胎培养用水中，并向所述培养水中加入0.2ppm亚甲基蓝，28℃下控光培养。从斑马鱼胚胎出生后12小时加入0.2mM的苯硫脲，中间每24小时换约1/2水，并及时吸出死亡胚胎。将出生后2天的斑马鱼置于解剖镜下，选取发育正常的斑马鱼仔鱼，放入6孔板中，每孔10尾。每组3个平行孔。
2.化合物处理
设置4个实验组：1个空白对照组，3个吡嗪酰胺处理组。移除微孔板中的培养水，空白对照组中加入5mL培养水，吡嗪酰胺处理组分别加入5mL浓度为1mM，2.5mM，5mM的吡嗪酰胺溶液。然后，放入28℃恒温培养箱中培养96小时。每24h换液一半。
3.定量分析
于施药后72小时，将斑马鱼用质量浓度为0.3‰的三卡因麻醉90s，然后用3％甲基纤维素固定于载玻片上，将斑马鱼固定侧面体位进行拍照。
荧光显微镜下拍照记录斑马鱼肝脏荧光情况。与空白对照组和溶剂对照组相比，吡嗪酰胺处理后的幼鱼肝组织荧光面积和荧光强度明显下降，肝脏明显萎缩退化(图5)。
利用图像处理软件计算所述模型的肝脏面积、体面积。
根据如下公式计算各组斑马鱼的肝脏面积指数：肝脏面积指数＝肝脏面积/体面积×100％
各组斑马鱼肝脏面积指数以表示，采用独立样本t检验法分析比较组间差异的显著性。
统计结果显示，与空白对照组相比，1mM的吡嗪酰胺处理组斑马鱼肝脏面积指数无显著性变化；2.5mM和5mM的吡嗪酰胺处理组斑马鱼肝脏面积指数均显著性降低(P<0.01)，超过相应的正常界值范围(表9)。
以实施例3制备的所述斑马鱼肝功能损伤评价模型为研究对象，考察本发明所述的斑马鱼肝脏损伤的评价指标，即肝脏面积指数的降低与现有技术中的肝脏常规评价指标即谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的相关性，进一步验证斑马鱼肝脏面积指数的降低作为快速评价化合物对斑马鱼肝脏功能损伤作用的指标的可靠性。
制备实施例3中的斑马鱼幼鱼组织匀浆，测定组织中ALT、AST水平。与空白对照组相比，1mM的吡嗪酰胺处理组ALT、AST含量均未见升高，2.5mM和5mM的吡嗪酰胺处理组ALT、AST含量均显著性升高(P<0.01，P<0.05)(表9)。可见，斑马鱼肝脏面积指数的降低与转氨酶生化指标升高在反映吡嗪酰胺对斑马鱼的肝脏损伤程度上具有相关性。
表9吡嗪酰胺对斑马鱼幼鱼肝脏面积指数转氨酶的影响(n＝30)
*P<0.05significantly different from the control；**P<0.01significantlydifferent from the control.
为进一步研究斑马鱼肝脏面积指数和转氨酶生化指标之间的相关性，分别在4个实验组(空白对照组、1mM吡嗪酰胺处理组、2.5mM吡嗪酰胺处理组和5mM吡嗪酰胺处理组)中选取3批样本，共计12个样本。每批30个斑马鱼，计算每批各组斑马鱼的肝脏面积指数和转氨酶生化指标的平均值。采用Pearson相关系数，分析肝脏面积指数与血生化指标之间的相关性，检验水准：P<0.05。
Pearson相关系数计算公式如下：
相关性分析表明，斑马鱼肝脏面积指数与ALT、AST水平之间均呈负相关，均存在非常强的相关性(│r│>0.8，P<0.01)。如表10所示：
表10肝脏面积指数与谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的相关性
对正常组和吡嗪酰胺处理组斑马鱼做病理切片和HE染色，结果显示，正常斑马鱼幼鱼肝脏结构完整，肝细胞质均匀红染。吡嗪酰胺处理斑马鱼72h后，1mM处理组斑马鱼的肝细胞未发生明显变化，2.5mM、5mM处理组斑马鱼幼鱼部分肝细胞轮廓不清晰，出现大量空泡，胞质稀疏(图6)。
在本方法中，经吡嗪酰胺(2.5mM、5mM)处理后斑马鱼的肝脏面积指数显著下降，并超过相应的正常界值范围，结合转氨酶和肝脏组织病理切片结果，表明吡嗪酰胺具有肝脏毒性作用，同时也证明肝脏面积指数的降低可作为快速评价化合物对斑马鱼肝功能损伤作用的评价指标。
Claims (11)
1.一种快速评价化合物对斑马鱼肝脏功能损伤作用的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将受精后2～4天的发育正常斑马鱼胚胎移入培养孔中；
(2)对培养孔中的斑马鱼胚胎连续给药孵育1～3天，记为待测化合物组；
(3)观察斑马鱼胚胎肝脏，记录并计算斑马鱼胚胎肝脏面积和斑马鱼胚胎体面积，按照如下公式计算肝脏面积指数：
肝脏面积指数＝肝脏面积/体面积×100％；
(4)当步骤(3)计算的待测化合物组的斑马鱼胚胎的肝脏面积指数不在正常斑马鱼胚胎的肝脏面积指数的范围内，且达到统计学上的显著性水平(P<0.05)，则待测化合物具有肝脏毒性；当步骤(3)计算的待测化合物组的斑马鱼胚胎的肝脏面积指数在正常斑马鱼胚胎的肝脏面积指数范围内，则待测化合物不具有肝脏毒性；
所述的正常斑马鱼胚胎的肝脏面积指数为：
受精后3d的斑马鱼肝脏面积指数为0.40～0.68％，受精后4d的斑马鱼肝脏面积指数为1.99～2.66％，受精后5d的斑马鱼肝脏面积指数为3.07～3.82％，受精后6d的斑马鱼肝脏面积指数为3.93～4.84％，受精后的7d斑马鱼肝脏面积指数为3.25～4.39％。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述斑马鱼胚胎为肝脏特异表达荧光的斑马鱼胚胎。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中斑马鱼胚胎为受精3～6天的斑马鱼胚胎。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中孵育，温度为26～30℃，光照孵育，每天更换含待测化合物的培养液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养液组分如下：
NaCl 5mM，KCl 0.17mM，CaCl2 0.4mM，MgSO4 0.16mM，去离子水配制。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)还包括观察前的预处理步骤；
将需要观察的斑马鱼胚胎用质量浓度为0.3‰的三卡因浸泡40～90s进行麻醉，然后用3％甲基纤维素固定于载玻片上。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的观察为在荧光显微镜下观察。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的记录为拍照记录。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的计算为利用图像处理软件计算。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，待测化合物组至少做三组平行实验，每组斑马鱼胚胎总数不低于15枚。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，每组斑马鱼胚胎总数为30～50枚。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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