CN110199921A

CN110199921A - 一种雷公藤多苷肝损伤动物模型的构建方法及其应用

Info

Publication number: CN110199921A
Application number: CN201910577130.4A
Authority: CN
Inventors: 付晓春; 蒋平; 沈小莉
Original assignee: Guangdong Food and Drugs Vocational College
Current assignee: Guangdong Food and Drugs Vocational College
Priority date: 2019-06-28
Filing date: 2019-06-28
Publication date: 2019-09-06

Abstract

本发明公开了一种雷公藤多苷肝损伤动物模型的构建方法及其应用。本发明通过实验发现，雷公藤多苷浓度为42.5、128和383μg/mL时，可明显破坏斑马鱼肝脏组织结构，雷公藤多苷高剂量(雷公藤多苷浓度为383μg/mL)组可升高ALT、AST、ALP含量，表明雷公藤多苷高剂量具有肝损伤作用。本发明用雷公藤多苷溶液处理斑马鱼，成功构建得到雷公藤多苷肝损伤动物模型。本发明的构建方法具有可靠、快速、高效、低廉、高性价比等优点，开启了后续科研工作者全面、系统地研究雷公藤多苷肝毒性特征及机理的新途径，为筛选保肝药物和雷公藤多苷解毒药物提供理论依据。

Description

一种雷公藤多苷肝损伤动物模型的构建方法及其应用

技术领域：

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种雷公藤多苷肝损伤动物模型的构建方法及其应用。

背景技术：

雷公藤多苷是我国的传统中药，在临床上广泛使用，具有确切疗效，但易发肝毒性，限制其临床应用。已有研究认为，常用的大、小鼠不是雷公藤多苷肝毒性研究的敏感动物。目前，雷公藤多苷肝毒性的研究在何种模式生物上开展成为制约科研工作者探究雷公藤安全性的一个瓶颈。为全面、深入地探究雷公藤多苷肝毒性特征及机理，寻求合理的配伍解毒方法，拟建立一种雷公藤多苷肝损伤动物模型的构建方法，为筛选雷公藤多苷解毒药物提供理论依据。

发明内容：

本发明的目的是为了克服现有技术的缺陷，提供一种雷公藤多苷肝损伤动物模型的构建方法及其应用。

本发明用雷公藤多苷溶液处理3日龄斑马鱼48h后，进行肝脏病毒学分析、斑马鱼肝功能酶学活性检测和肝脏氧化应激损伤指标(CAT、SOD、MDA)含量测定。实验结果发现，雷公藤多苷浓度为42.5、128、383μg/mL时可明显破坏斑马鱼肝脏组织结构，雷公藤多苷高剂量(雷公藤多苷浓度为383μg/mL)组可升高ALT、AST、ALP含量，表明雷公藤多苷高剂量具有肝损伤作用，故能够成功构建得到雷公藤多苷肝损伤动物模型。

因此，本发明的第一个目的是提供雷公藤多苷肝损伤动物模型的构建方法，包括以下步骤：用雷公藤多苷溶液处理斑马鱼，得到雷公藤多苷肝损伤动物模型。

所述的斑马鱼优选为野生型AB品系斑马鱼。

所述的斑马鱼优选为3日龄斑马鱼。

所述的雷公藤多苷溶液优选为浓度383μg/mL的雷公藤多苷溶液。

本发明的第二个目的是提供所述的构建方法构建得到的雷公藤多苷肝损伤动物模型在筛选保肝药物或雷公藤多苷解毒药物中的应用。

本发明通过实验发现，雷公藤多苷浓度为42.5、128和383μg/mL时，可明显破坏斑马鱼肝脏组织结构，雷公藤多苷高剂量(雷公藤多苷浓度为383μg/mL)组可升高ALT、AST、ALP含量，表明雷公藤多苷高剂量具有肝损伤作用。本发明用雷公藤多苷溶液处理斑马鱼，成功构建得到雷公藤多苷肝损伤动物模型。本发明的构建方法具有可靠、快速、高效、低廉、高性价比等优点，开启了后续科研工作者全面、系统地研究雷公藤多苷肝毒性特征及机理的新途径，为筛选保肝药物和雷公藤多苷解毒药物提供理论依据。

附图说明：

图1为雷公藤多苷“浓度-死亡率”效应曲线；

图2为雷公藤多苷对斑马鱼肝脏组织结构的影响(×400)；

图3为雷公藤多苷处理后斑马鱼体内过氧化氢酶活力(units)；

图4为雷公藤多苷处理后斑马鱼体内SOD活力(U/mg蛋白)；

图5为雷公藤多苷处理后斑马鱼体内MDA含量(μmol/mg蛋白)。

具体实施方式：

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的饲养条件、测定及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：

1材料与方法

1.1实验动物野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后3d(即3日龄斑马鱼)。斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中。实验动物使用许可证号：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证的要求。

1.2药物与试剂二甲基亚砜(DMSO)：Sigma，France。雷公藤多苷片：浙江得恩德制药股份有限公司，国药准字Z33020422，保存于阴凉柜，临用前用DMSO配制成100mg/mL母液，按需稀释，现配现用。对乙酰氨基酚：购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，白色粉末，批号为I1706064，临用前用DMSO配制成800mM，现配现用。4％多聚甲醛：鼎国生物，批号：814001300。二甲苯：阿拉丁，批号：G1705032。苏木素：碧云天，批号：C0107。伊红：依赫生物，批号：YH00606。盐酸：西陇化工股份有限公司，批号：140517。过氧化氢酶检测试剂盒：碧云天，批号070618180802。总SOD活性检测试剂盒：碧云天，批号052818180726。脂质氧化检测试剂盒：碧云天，批号032318180730。

1.3主要仪器解剖显微镜：SZX7，OLYMPUS，Japan；精密电子天平：CP214，奥豪斯；滚轮切片机：货号：KD-2258金华科迪。多功能酶标仪：LB940，Berthold Technologies，Germany。

1.4方法

1.4.1雷公藤多苷最大非致死浓度(MNLC)和LC₁₀的测定随机选取正常3日龄野生型AB品系斑马鱼，分为7组，分别为：正常对照组、溶剂对照组(0.5％DMSO)、雷公藤多苷300、350、400、450和500μg/mL浓度处理组，每组30尾斑马鱼。雷公藤多苷处理斑马鱼直至120hpf(即斑马鱼从3日龄到5日龄)，观察记录每个实验组斑马鱼的死亡情况并计算死亡率(％)，用Origin 8.0统计学软件绘制最佳的“浓度-死亡率”效应曲线并分别计算雷公藤多苷对斑马鱼的MNLC和LC₁₀。

1.4.2雷公藤多苷肝损伤动物模型的构建随机选取正常3日龄野生型AB品系斑马鱼(3dpf野生型AB品系斑马鱼)，分为5组，分别为正常对照组、对乙酰氨基酚(8mM)组、雷公藤多苷42.5、128和383μg/mL浓度组，每组60尾斑马鱼，药物处理48h。

1.4.2.1雷公藤多苷对斑马鱼肝脏结构的影响随机选取步骤1.4.2药物处理48h后的正常对照组、对乙酰氨基酚(8mM)组、雷公藤多苷42.5、128和383μg/mL浓度组斑马鱼各10条置于4％多聚甲醛固定，固定后将斑马鱼转移到70％乙醇中，进行脱水、包埋、切片、HE染色和封片。在显微镜下对染色后的斑马鱼切片进行肝脏病理学分析。

1.4.2.2雷公藤多苷对氧化应激生化指标的影响随机选取步骤1.4.2药物处理48h后的正常对照组、对乙酰氨基酚(8mM)组、雷公藤多苷42.5、128和383μg/mL浓度组斑马鱼各10条，分别按照过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)试剂盒说明书检测CAT和SOD活性及MDA含量。

1.4.2.3雷公藤多苷对斑马鱼肝功能酶学的影响随机选取步骤1.4.2药物处理48h后的正常对照组、对乙酰氨基酚(8mM)组、雷公藤多苷42.5、128和383μg/mL浓度组斑马鱼各10条，收集并处理检测样本，分别按照ALT、AST和ALP试剂盒说明书检测活性。

1.5统计学处理采用SPSS19.0软件，计量数据用表示，数据分析采用方差分析和Dunnett’s T-检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1斑马鱼最大非致死浓度(MNLC)和LC₁₀结果根据雷公藤多苷对斑马鱼的“死亡率-浓度”统计数据(表1)，利用Origin软件模拟得到雷公藤多苷对斑马鱼的MNLC为383μg/mL，LC₁₀为417μg/mL；“死亡率-浓度”效应曲线见图1。

表1.雷公藤多苷MNLC和LC₁₀实验“浓度-死亡数”原始数据(n＝30)

2.2雷公藤多苷破坏斑马鱼肝脏结构的实验结果HE染色结果提示：对乙酰氨基酚对斑马鱼有明显肝毒性，主要表现为细胞肿大，细胞核模糊且细胞间质变大；雷公藤多苷浓度为42.5μg/mL时，斑马鱼肝脏组织结构略有改变，组织间隙增大，对肝脏细胞影响不大；雷公藤多苷片浓度为128μg/mL时，明显破坏了斑马鱼肝脏组织结构，表现为组织结构紊乱，细胞质变大；雷公藤多苷片浓度为383μg/mL时，明显破坏了斑马鱼肝脏组织结构，表现为组织结构紊乱，细胞质变大，此外细胞核大小不一，见图2。

2.3雷公藤多苷诱导斑马鱼肝细胞凋亡的结果

2.3.1对CAT的影响对乙酰氨基酚组斑马鱼体内CAT活力为0.159units，与正常对照组(0.187units)比较降低了15.00％，但差异无统计学意义(P＞0.05)，提示对乙酰氨基酚对斑马鱼体内CAT活力影响不显著。雷公藤多苷42.5、128和383μg/mL浓度组斑马鱼体内CAT活力分别为0.156、0.146和0.152units，与正常对照组比较分别降低了16.60％、21.90％和18.70％，但差异无统计学意义(P＞0.05)，提示雷公藤多苷在本实验浓度条件下对斑马鱼体内CAT活力影响不明显，见图3。

2.3.2对SOD的影响对乙酰氨基酚组斑马鱼体内SOD活力为0.082U/mg蛋白，与正常对照组(0.083U/mg蛋白)比较降低了1.20％，但差异无统计学意义(P＞0.05)，提示对乙酰氨基酚对斑马鱼体内SOD活力无影响。雷公藤多苷42.5、128和383μg/mL浓度组斑马鱼体内SOD活力分别为0.0104、0.063和0.083U/mg蛋白，与正常对照组比较分别降低了25.30％、24.10％和0，但差异无统计学意义(P＞0.05)，提示雷公藤多苷在本实验浓度条件下对斑马鱼体内SOD活力影响不明显，见图4。

2.3.3对MDA的影响对乙酰氨基酚组斑马鱼体内MDA含量为0.0011μmol/mg蛋白，与正常对照组(0.0014μmol/mg蛋白)比较升高了27.30％，但差异无统计学意义(P＞0.05)，提示对乙酰氨基酚能增加斑马鱼体内MDA含量，但无明显差异。雷公藤多苷42.5、128和383μg/mL浓度组斑马鱼体内MDA含量分别为0.0020、0.0018和0.0015μmol/mg蛋白，与正常对照组比较分别升高了81.80％、63.60％和36.40％，但差异无统计学意义(P＞0.05)，提示雷公藤多苷在本实验浓度条件下能促进斑马鱼体内MDA含量，但无明显差异，见图5。

2.4雷公藤多苷对斑马鱼肝功能酶学影响的实验结果

表2显示，与正常对照组比较，对乙酰氨基酚组ALT、AST、ALP水平显著升高(P<0.01)；与正常对照组比较，雷公藤多苷高剂量(雷公藤多苷浓度为383μg/mL)组ALT、AST、ALP水平显著升高(P<0.05)；与正常对照组比较，雷公藤多苷中、低剂量(雷公藤多苷浓度为42.5和128μg/mL)组ALT、AST、ALP水平无明显变化(P>0.05)。

表2.雷公藤多苷处理后斑马鱼体内肝功能酶学的影响(U/L)n＝10)

^##P<0.01vs nomal group，^#P<0.05vs nomal group

3讨论

肝脏是人体非常重要的器官，也是体内最大的解毒器官，肩负着消化、代谢、解毒、凝血、免疫调节等重要的功能。作为体内最大的解毒器官，肝脏与药物的代谢密切相关，当肝脏受到伤害时，肝脏相应的功能将受到影响。肝脏的ALT、AST、ALP活性是反映肝功能损伤的重要敏感指标。本实验发现，乙酰氨基酚组三者活性明显升高，表明对乙酰氨基酚组造模出现了肝损伤，符合实验要求，雷公藤多苷高剂量组可升高ALT、AST、ALP含量，表明雷公藤多苷高剂量具有肝损伤作用，能够成功构建雷公藤多苷肝损伤动物模型组。

Claims

1.一种雷公藤多苷肝损伤动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：用雷公藤多苷溶液处理斑马鱼，得到雷公藤多苷肝损伤动物模型。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的斑马鱼为野生型AB品系斑马鱼。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的斑马鱼为3日龄斑马鱼。

4.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的雷公藤多苷溶液为浓度383μg/mL的雷公藤多苷溶液。

5.权利要求1所述的构建方法构建得到的雷公藤多苷肝损伤动物模型在筛选保肝药物或雷公藤多苷解毒药物中的应用。