CN107929269B - 一种利用斑马鱼幼鱼制备肝纤维化动物模型的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用斑马鱼幼鱼制备肝纤维化动物模型的方法，其采用斑马鱼幼鱼为模型动物，选用二乙基亚硝胺和乙醇作为造模药物。本发明采用的斑马鱼的基因组与人类基因组相似，并呈现出与人类十分相似的生理学特征，可以很好地研究各种人类疾病，而且造模周期短，成本低，操作简单，所得模型可适用于各种药物的高通量筛选。

Description

一种利用斑马鱼幼鱼制备肝纤维化动物模型的方法
技术领域
本发明涉及动物模型领域，特别是一种利用斑马鱼幼鱼制备肝纤维化动物模型的方法。
背景技术
肝纤维化是几乎所有慢性肝病发展的共同病理环节并具有可逆性，为了进一步研究肝纤维化的发病机制以及高内涵地筛选出防治肝纤维化的有效药物，选择和制作与人类肝纤维化相似的动物模型具有重要的意义。
目前，已稳定建立的肝纤维化模型的制作方法有四氯化碳造模法、乙醇造模法、免疫造模法和胆管结扎法等，其优缺点各异，皆运用小鼠或大鼠作为实验动物，造模时长5天至13周不等。
现有技术的缺陷与不足：
1.大部分肝纤维化模型运用大鼠或小鼠作为实验动物，造模周期大多为4至13周不等，耗时长；
2.胆管结扎法的造模周期虽只有五天，但死亡率高、成本高，且对技术有一定要求；
3.小鼠、大鼠作为实验动物，首先成本高，难以大规模饲养并进行高通量药物筛选，且现有造模方法皆需灌胃、腹腔注射、皮下注射等操作，操作复杂。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种利用斑马鱼幼鱼制备肝纤维化动物模型的方法，其具有快速、高通量、高内涵、成本低等优点。
本发明的目的是这样实现：一种利用斑马鱼幼鱼制备肝纤维化动物模型的方法，其特征在于：采用斑马鱼幼鱼为模型动物，选用二乙基亚硝胺和乙醇作为造模药物，制备药物性肝纤维化斑马鱼模型。
所述的斑马鱼幼鱼选用45-65小时龄健康AB品系野生型斑马鱼。
所述的斑马鱼幼鱼孵育方法：按Westerfield方法对斑马鱼成鱼进行养殖，光照周期维持L:D＝14h:10h，温度维持在28.5℃，雌雄成鱼自然交配，收集受精卵于盛有幼鱼孵化液的平皿中；置于恒温孵箱中28.5℃孵育45-65小时。
所述的幼鱼孵化液是于斑马鱼规范养殖系统水中加入0.8-1.2/10000体积的亚甲基蓝。
造模时，将所述斑马鱼幼鱼置于养殖系统水中，造模药物直接添加于养殖系统水中，处理2-12天，即可制备药物性肝纤维化斑马鱼模型。
在所述斑马鱼幼鱼的养殖系统水中，添加二乙基亚硝胺至浓度为3-30mg/L，添加乙醇至体积百分比为0.5-4％。
在用二乙基亚硝胺和乙醇混合液处理前，在所述斑马鱼幼鱼的养殖系统水中，添加乙醇至体积百分比为0.5-4％，对斑马鱼预处理12-36小时。
本发明的有益效果如下：
(1)斑马鱼的基因组与人类基因组相似度高达87％，且其具有与哺乳动物相似的心血管、造血、神经及代谢系统，大量高度一致的活性代谢产物，并呈现出与人类十分相似的生理学特征，可以很好地研究各种人类疾病。
(2)本发明的造模周期短且成本低，幼鱼造模周期仅需2-12天，可快速制备肝纤维化模型，有利于日后进行高通量的药物筛选。
(3)本发明制作的新型斑马鱼幼鱼肝纤维化模型具有啮齿动物诱发的肝纤维化模型无法比拟的优势，可适用于各种药物的高通量筛选。
(4)进一步的，本发明采用45-65小时龄斑马鱼幼鱼为实验动物，能较容易获得大量实验动物，有利于进行各种实验，一对成年斑马鱼7-10天可产一次卵，一尾雌鱼可产100-300枚，可以拥有较大的样本量；采用45-65小时龄斑马鱼幼鱼为实验动物，可从斑马鱼成鱼交配获得，一对斑马鱼成鱼价格为160元左右，且所需二乙基亚硝胺的量小于5微升、无水乙醇用量小于4毫升，用量极少，成本低；45-65小时龄斑马鱼通体透明，便于直接观察肝脏形态及染色情况，且可活体实时观察药物的药效，是高通量药物筛选的新选择，且相比经典小鼠模型具有操作简单、用时少的优势。
(5)进一步的，本发明采用直接浸泡给药的造模方法，相比经典小鼠模型需要胆管结扎、灌胃、腹腔注射等操，本实验具有操作简单的优势，且能减少造模动物个体摄入不足或摄入不均的忧虑。
附图说明
图1、图2分别是本发明实施例1空白组、模型组HE病理染色结果；
图3、图4分别是本发明实施例2空白组、模型组HE病理染色结果；
图5、图6分别是本发明实施例3空白组、模型组HE病理染色结果；
图7、图8分别是本发明实施例4空白组、模型组HE病理染色结果；
图9、图10分别是本发明实施例5空白组、模型组HE病理染色结果。
具体实施方式
本发明是一种利用斑马鱼幼鱼制备肝纤维化动物模型的方法，其采用斑马鱼幼鱼为模型动物，选用二乙基亚硝胺和乙醇作为造模药物，制备药物性肝纤维化斑马鱼模型。
优选的，斑马鱼幼鱼选用45-65小时龄健康AB品系野生型斑马鱼。具体孵育方法为：按Westerfield方法对斑马鱼成鱼进行养殖，光照周期维持L(光照):D(黑暗)＝14h:10h，温度维持在28.5℃，雌雄成鱼自然交配，收集受精卵于盛有幼鱼孵化液的平皿中；置于恒温孵箱中28.5℃孵育45-65小时。优选的，幼鱼孵化液是于斑马鱼规范养殖系统水中加入0.8-1.2/10000体积的亚甲基蓝。
造模时，将所述斑马鱼幼鱼置于养殖系统水中，造模药物直接添加于养殖系统水中。优选的，在斑马鱼幼鱼的养殖系统水中，添加二乙基亚硝胺至浓度为3-30mg/L，添加乙醇至体积百分比为0.5-4％，处理2-12天，即可制备药物性肝纤维化斑马鱼模型。更优选的，在用二乙基亚硝胺和乙醇混合液处理前，在所述斑马鱼幼鱼的养殖系统水中，添加乙醇至体积百分比为0.5-4％，对斑马鱼预处理12-36小时。
本发明斑马鱼幼鱼肝纤维化模型造模操作简单，选用二乙基亚硝胺(DEN)为造模药物，直接往系统水加入DEN即可进行造模。
斑马鱼作为新兴的模式生物，因其具有与人类高度相似的基因组，相似度达87％，且其具有与哺乳动物相似的心血管、造血、神经及代谢等系统，大量一致的活性代谢产物，并且呈现出大量与人类十分相似的生理学特征，越来越多地运用于各种人类疾病模型的制作。
二乙基甲硝胺：二乙基甲硝胺是一种具有水溶性、理化性质稳定的具有细胞毒性的致癌剂，其具有明显的肝脏亲和性。二乙基甲硝胺经微粒体转化后，可引起核酸和蛋白质等大分子甲基化，导致肝细胞坏死，刺激肝内细胞外基质的合成与分泌，从而促进肝纤维化的形成。
乙醇：肝脏是乙醇代谢、降解的主要器官，长期或过量给予乙醇可增加肝细胞膜的通透性导致细胞膜缺损，增加肝细胞细胞膜的磷脂、脂质氧化产物及电荷量，在线粒体中激活caspase-9和-3，诱导细胞的凋亡。
以下通过具体例子对本发明做进一步阐述，但本发明并不限于此特定例子。
实施例1
实验动物的准备：
野生型AB品系斑马鱼成鱼：野生型AB品系斑马鱼成鱼由南方医科大学广东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选重点实验室提供。
选取56小时龄健康AB品系野生型斑马鱼：按Westerfield方法对野生型AB品系斑马鱼成鱼进行养殖。光照周期维持L:D＝14h:10h,温度维持在28.5℃。雌雄成鱼自然交配，收集受精卵于盛有幼鱼孵化液的平皿中，置于恒温孵箱中28.5℃孵育56小时。
实验试剂的准备：
幼鱼孵化液：于斑马鱼规范养殖系统水中加入1/10000体积的亚甲基蓝。
1.5％乙醇溶液：3mL 100％乙醇溶于197mL斑马鱼规范养殖系统水。
15mg/L二乙基亚硝胺+1.5％乙醇溶液：3mL 100％乙醇溶液、3.16μL二乙基亚硝胺(美国sigma，0.95g/mL)溶于197mL斑马鱼规范养殖系统水。
具体造模方法：
选用56小时龄健康AB品系野生型斑马鱼，先给予1.5％乙醇溶液处理24小时，后给予15mg/L二乙基亚硝胺+1.5％乙醇溶液处理4天，即可制备药物性肝纤维化斑马鱼模型。空白组和模型组的HE病理染色结果分别如图1、图2所示，结果显示造模成功:病理HE染色结果显示，对照组斑马鱼肝脏组织结构正常，肝细胞排列整齐(如图1所示)；15mg/L DEN处理组(图2)可见肝脏组织结构紊乱，肝脏细胞可见大量空泡，肝细胞变性坏死、局部融合坏死，疑似纤维结节形成。
实施例2
实验动物的准备：
野生型AB品系斑马鱼成鱼：野生型AB品系斑马鱼成鱼由南方医科大学广东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选重点实验室提供。
选取56小时龄健康AB品系野生型斑马鱼：按Westerfield方法对野生型AB品系斑马鱼成鱼进行养殖。光照周期维持L:D＝14h:10h,温度维持在28.5℃。雌雄成鱼自然交配，收集受精卵于盛有幼鱼孵化液的平皿中，置于恒温孵箱中28.5℃孵育56小时。
实验试剂的准备：
幼鱼孵化液：于斑马鱼规范养殖系统水中加入1/10000体积的亚甲基蓝。
2％乙醇溶液：4mL 100％乙醇溶于197mL斑马鱼规范养殖系统水。
5mg/L二乙基亚硝胺+2％乙醇溶液：4mL 100％乙醇溶液、1.04μL二乙基亚硝胺(美国sigma，0.95g/mL)溶于197mL斑马鱼规范养殖系统水。
具体造模方法：
选用56小时龄健康AB品系野生型斑马鱼，先给予2％乙醇溶液处理24小时，后给予5mg/L二乙基亚硝胺+1.5％乙醇溶液处理7天，即可制备药物性肝纤维化斑马鱼模型。空白组和模型组的HE病理染色结果分别如图3、图4所示，结果显示造模成功。
实施例3
实验动物的准备：
野生型AB品系斑马鱼成鱼：野生型AB品系斑马鱼成鱼由南方医科大学广东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选重点实验室提供。
选取56小时龄健康AB品系野生型斑马鱼：按Westerfield方法对野生型AB品系斑马鱼成鱼进行养殖。光照周期维持L:D＝14h:10h,温度维持在28.5℃。雌雄成鱼自然交配，收集受精卵于盛有幼鱼孵化液的平皿中，置于恒温孵箱中28.5℃孵育56小时。
实验试剂的准备：
幼鱼孵化液：于斑马鱼规范养殖系统水中加入1/10000体积的亚甲基蓝。
1.5％乙醇溶液：3mL 100％乙醇溶于197mL斑马鱼规范养殖系统水。
20mg/L二乙基亚硝胺+1.5％乙醇溶液：3mL 100％乙醇溶液、4.21μL二乙基亚硝胺(美国sigma，0.95g/mL)溶于197mL斑马鱼规范养殖系统水。
具体造模方法：
选用56小时龄健康AB品系野生型斑马鱼，先给予2％乙醇溶液处理24小时，后给予20mg/L二乙基亚硝胺+1.5％乙醇溶液处理4天，即可制备药物性肝纤维化斑马鱼模型。空白组和模型组的HE病理染色结果分别如图5、图6所示，结果显示造模成功。
实施例4
实验动物的准备：
野生型AB品系斑马鱼成鱼：野生型AB品系斑马鱼成鱼由南方医科大学广东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选重点实验室提供。
选取56小时龄健康AB品系野生型斑马鱼：按Westerfield方法对野生型AB品系斑马鱼成鱼进行养殖。光照周期维持L:D＝14h:10h,温度维持在28.5℃。雌雄成鱼自然交配，收集受精卵于盛有幼鱼孵化液的平皿中，置于恒温孵箱中28.5℃孵育56小时。
实验试剂的准备：
幼鱼孵化液：于斑马鱼规范养殖系统水中加入1/10000体积的亚甲基蓝。
2％乙醇溶液：4mL 100％乙醇溶于197mL斑马鱼规范养殖系统水。
10mg/L二乙基亚硝胺+2％乙醇溶液：4mL 100％乙醇溶液、2.11μL二乙基亚硝胺(美国sigma，0.95g/mL)溶于197mL斑马鱼规范养殖系统水。
具体造模方法：
选用56小时龄健康AB品系野生型斑马鱼，先给予2％乙醇溶液处理24小时，后给予10mg/L二乙基亚硝胺+2％乙醇溶液处理4天，即可制备药物性肝纤维化斑马鱼模型。空白组和模型组的HE病理染色结果分别如图7、图8所示，结果显示造模成功。
实施例5
实验动物的准备：
野生型AB品系斑马鱼成鱼：野生型AB品系斑马鱼成鱼由南方医科大学广东省人类疾病斑马鱼模型与药物筛选重点实验室提供。
选取56小时龄健康AB品系野生型斑马鱼：按Westerfield方法对野生型AB品系斑马鱼成鱼进行养殖。光照周期维持L:D＝14h:10h,温度维持在28.5℃。雌雄成鱼自然交配，收集受精卵于盛有幼鱼孵化液的平皿中，置于恒温孵箱中28.5℃孵育56小时。
实验试剂的准备：
幼鱼孵化液：于斑马鱼规范养殖系统水中加入1/10000体积的亚甲基蓝。
1.5％乙醇溶液：3mL 100％乙醇溶于197mL斑马鱼规范养殖系统水。
10mg/L二乙基亚硝胺+1.5％乙醇溶液：3mL 100％乙醇溶液、2.11μL二乙基亚硝胺(美国sigma，0.95g/mL)溶于197mL斑马鱼规范养殖系统水。
具体造模方法：
选用56小时龄健康AB品系野生型斑马鱼，先给予1.5％乙醇溶液处理24小时，后给予10mg/L二乙基亚硝胺+1.5％乙醇溶液处理7天，即可制备药物性肝纤维化斑马鱼模型。空白组和模型组的HE病理染色结果分别如图9、图10所示，结果显示造模成功。

Claims (3)

1.一种利用斑马鱼幼鱼制备肝纤维化动物模型的方法，其特征在于：采用斑马鱼幼鱼为模型动物，所述的斑马鱼幼鱼选用45-65小时龄健康AB品系野生型斑马鱼；选用二乙基亚硝胺和乙醇作为造模药物，制备药物性肝纤维化斑马鱼模型，造模时，将所述斑马鱼幼鱼置于养殖系统水中，造模药物直接添加于养殖系统水中，其中添加二乙基亚硝胺至浓度为3-30mg/L，添加乙醇至体积百分比为0.5-4％，处理3-10天；在用二乙基亚硝胺和乙醇混合液处理前，在所述斑马鱼幼鱼的养殖系统水中，添加乙醇至体积百分比为0.5-4％，对斑马鱼幼鱼预处理12-36小时。
2.根据权利要求1所述的利用斑马鱼幼鱼制备肝纤维化动物模型的方法，其特征在于：所述的斑马鱼幼鱼孵育方法：按Westerfield方法对斑马鱼成鱼进行养殖，光照周期维持L:D＝14h:10h，温度维持在28.5℃，雌雄成鱼自然交配，收集受精卵于盛有幼鱼孵化液的平皿中；置于恒温孵箱中28.5℃孵育45-65小时。
3.根据权利要求2所述的利用斑马鱼幼鱼制备肝纤维化动物模型的方法，其特征在于：所述的幼鱼孵化液是于斑马鱼规范养殖系统水中加入0.8-1.2/10000体积的亚甲基蓝。
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