CN104542389A - 一种非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，它通过将斑马鱼置于含50～200μM的棕榈酸或100～400μM的油酸的高脂培养液中进行培育，并根据最终斑马鱼的肝脏脂滴度大小来判断非酒精性脂肪肝斑马鱼的构建是否成功。本案在国内首次采用斑马鱼来构建非酒精性脂肪肝模型，成本低且成熟周期短，可以有效降低病理学和药物筛选成本；此外，斑马鱼模型还可用于构建高通量药物筛选平台，进一步提高生物医药研发效率；本案的成果将为临床非酒精性脂肪肝的发生病理学提供参考，而形成的斑马鱼模型也将提供给各科研机构及制药公司，成为非酒精性脂肪肝病理研究、新型治疗手段开发以及药物高通量筛选的有力工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种疾病模式动物的构建方法，具体涉及一种非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法。
背景技术
非酒精性脂肪肝是一种无过量饮酒史，以脂肪变性和脂质堆积为特征的临床病症。除直接引起肝硬化及肝癌外，该疾病的发展还间接导致了2型糖尿病和动脉粥样硬化的发生。随着肥胖及相关代谢综合症的流行，非酒精性脂肪肝已成为全球慢性肝病的重要病因及生物医学的重要研究对象。在西方发达国家，非酒精性脂肪肝发病率往往在24％-42％之间，而在我国，成人发病率已达到15％以上，甚至儿童也有2.1％的几率患病。在此情况下，关于其病理过程研究及新型治疗手段的研制工作就显得至关重要。
无论病理研究，还是药物疗效评价均需要合适的动物模型来进行，目前科研上主要的模式动物为通过高脂饲料喂养、毒性损伤及基因突变等方式构建基于大/小鼠的非酒精性脂肪肝模型，这些模型与人类极为相似，适于疾病机制和药物干预研究。但是大/小鼠模型的构建一般需要2-3月，维护成本较高，对饲料和药物的消耗量较大，非常不适用于高通量实验，进而其应用受到了限制。特别是采用四氯化碳腹腔注射等毒性损伤下的大/小鼠模型，除上述缺点外，还会因为毒性的影响引发动物的死亡率上升，从而造模成功率下降。
目前，斑马鱼已成为国际上疾病研究的主要模式生物之一，并被成功应用于新药筛选中。这首先是因为斑马鱼遗传背景清晰，与人类基因相似度高达87％，器官病变过程又与人类极为接近。另一方面，斑马鱼胚胎发育是全透明的，加上适当的色素抑制处理，可以清晰地观察病变过程。更重要的是，和老鼠等其他实验动物相比，斑马鱼体型小、实验周期短，且维护费用低廉，非常适合于高通量实验。我国关于斑马鱼的研究开始较晚，到21世纪初才正式开始，但发展迅速，已成立了国家斑马鱼模式动物中心等多个资源库，业务涉及疾病研究和新药筛选等多个学科领域。
然而目前，用斑马鱼进行非酒精性脂肪肝的研究工作仍较少，国内戴文聪等人(2013)采用2％乙醇处理受精后5天的斑马鱼32h后建立了急性酒精性脂肪肝模型，非酒精性脂肪肝模型则未见报道。在国外，通过基因变异或沉默的方法，研究者采用斑马鱼模型验证了多种基因变异(foie gras，ducttrip，hi559，red moon及skt11，见Amnon Schlegel，2012)与非酒精性脂肪肝的关系，但这些方法操作复杂，成本较高，且目前尚未成为稳定的商品出售。就化学物诱导而言，仅有Amali等人(2006)采用硫代乙酰胺处理受精后5天的斑马鱼，发现其在10天后即可明显表现出脂质损伤症状。然而化学物处理因其具有的明显的生物毒性，会导致斑马鱼死亡，从而降低建模成功率，且对于操作者本身也具有危害。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明的目的是提供一种成本低、成熟周期短的非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法。
为实现本发明目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)在无光照条件下，将性成熟的斑马鱼按雌雄比＝1∶2的比例放入交配鱼缸内；10小时后将所述交配鱼缸置于光照条件下0.5小时，进行受精产卵；
步骤2)将步骤1)得到的受精卵以30个/孔的密度分布于孔板中，在所述孔板的每个孔中加入3～4mL培养液，28℃恒温，以每天14小时光照/10小时黑暗的条件培养4dpf后，移去所述孔板中的培养液；
步骤3)将所述孔板中的受精卵随机分为正常组与高脂处理组，向所述高脂处理组的每个孔中加入3～4mL高脂培养液，密封，28℃恒温，以每天14小时光照/10小时黑暗的条件培养2～3天；所述高脂培养液含50～200μM的棕榈酸或100～400μM的油酸；
步骤4)将步骤3)得到的正常组与高脂处理组斑马鱼置于染色皿中，加入4wt％多聚甲醛在4℃下反应10～14小时，PBS缓冲液洗涤2～3次，随后依次采用0wt％、30wt％、60wt％、90wt％和100wt％的丙二醇水溶液在室温下各脱水10min，加入1wt％的油红染色液，在28℃下染色10～12小时，随后依次采用100wt％、90wt％、60wt％、30wt％和0wt％的丙二醇的乙醇溶液在室温下各脱色10min；
步骤5)采用显微镜观察高脂处理组斑马鱼的肝脏脂肪变性情况，并与正常组对比，若高脂处理组斑马鱼的肝脏脂滴度≥3，则判定为非酒精性脂肪肝。
优选的是，所述的非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，当所述高脂培养液含50～200μM的棕榈酸时，向所述高脂培养液中加入牛血清白蛋白直至其含量达到4wt％。
优选的是，所述的非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，当所述高脂培养液含100～400μM的油酸时，向所述高脂培养液中加入DMSO直至其含量达到0.1wt％。
优选的是，所述的非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，所述高脂培养液含200μM的棕榈酸或400μM的油酸。
优选的是，所述的非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，当所述高脂培养液含50～200μM的棕榈酸时，培养时间为3天。
优选的是，所述的非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，当所述高脂培养液含100～400μM的油酸时，培养时间为2天。
本发明的有益效果是：
1)本案在国内首次采用斑马鱼来构建非酒精性脂肪肝模型，成本低且成熟周期短，可以有效降低病理学和药物筛选成本；此外，斑马鱼模型还可用于构建高通量药物筛选平台，进一步提高生物医药研发效率。
2)本案的成果将为临床非酒精性脂肪肝的发生病理学提供参考，而形成的斑马鱼模型也将提供给各科研机构及制药公司，成为非酒精性脂肪肝病理研究、新型治疗手段开发以及药物高通量筛选的有力工具，降低药物开发成本，拓展分子生物医学的研究手段，推动我国模式动物产业及非酒精性脂肪肝医疗事业的发展。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
一种非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)在无光照条件下，将性成熟的斑马鱼按雌雄比＝1∶2的比例放入交配鱼缸内；10小时后将交配鱼缸置于光照条件下0.5小时，进行受精产卵；
步骤2)将步骤1)得到的受精卵以30个/孔的密度分布于孔板中，在孔板的每个孔中加入3～4mL培养液，28℃恒温，以每天14小时光照/10小时黑暗的条件培养4dpf后，移去孔板中的培养液；
步骤3)将所述孔板中的受精卵随机分为正常组与高脂处理组，向所述高脂处理组的每个孔中加入3～4mL高脂培养液，密封，28℃恒温，以每天14小时光照/10小时黑暗的条件培养2～3天；高脂培养液含50～200μM的棕榈酸或100～400μM的油酸；
步骤4)将步骤3)得到的正常组与高脂处理组斑马鱼置于染色皿中，加入4wt％多聚甲醛在4℃下反应10～14小时，PBS缓冲液洗涤2～3次，随后依次采用0wt％、30wt％、60wt％、90wt％和100wt％的丙二醇水溶液在室温下各脱水10min，加入1wt％的油红染色液，在28℃下染色10～12小时，随后依次采用100wt％、90wt％、60wt％、30wt％和0wt％的丙二醇的乙醇溶液在室温下各脱色10min；
步骤5)采用显微镜观察高脂处理组斑马鱼的肝脏脂肪变性情况，并与正常组样品对比，若高脂处理组斑马鱼的肝脏脂滴度≥3，则判定为非酒精性脂肪肝。
其中，肝脏脂滴度的计算方法如下：随机收集显微镜拍摄记录的十幅图，以Image-pro-plus软件判断细胞中脂滴的富集程度(将10％计为1，20％计为2，以此类推)，算取十幅图的平均值作为肝脏脂滴度。
当高脂培养液含50～200μM的棕榈酸时，向高脂培养液中加入助溶的牛血清白蛋白直至其含量达到4wt％。当高脂培养液含100～400μM的油酸时，向高脂培养液中加入助溶的DMSO直至其含量达到0.1wt％。在加入助溶剂的情况下，棕榈酸与油酸可发挥更佳的效果。在生物培育领域，对培养液成分及其含量、助溶剂成分及其含量、培养时间都应严格限制，较优选的选择是，高脂培养液含200μM的棕榈酸或400μM的油酸。当高脂培养液含棕榈酸时，培养时间最优选为3天。当高脂培养液含油酸时，培养时间最优选为2天。
当高脂培养液含棕榈酸时，若棕榈酸的浓度小于50μM，则导致斑马鱼的肝脏脂滴度＜3，非酒精性脂肪肝构建失败；若棕榈酸的浓度大于200μM，则导致棕榈酸过饱和析出，影响了斑马鱼脂肪肝的构建。当高脂培养液含棕榈酸时，其培养时间若不足3天，则导致斑马鱼的肝脏脂滴度＜3，若超过3天，则增加斑马鱼的致死几率，间接增加了生产成本。
当高脂培养液含油酸时，若油酸的浓度小于100μM，则导致斑马鱼的肝脏脂滴度＜3，非酒精性脂肪肝构建失败；若油酸的浓度大于400μM，则有明显的致死现象发生，影响了斑马鱼的存活率。当高脂培养液含油酸时，其培养时间若不足2天，则导致斑马鱼的肝脏脂滴度＜3，若超过2天，则增加斑马鱼的致死几率，间接增加了生产成本。
本案还可以通过以下方法来进一步验证制备得到的斑马鱼是否有非酒精性脂肪肝：在斑马鱼中下腔静脉取血，试剂盒检测甘油三酯及β-羟丁酸的含量；上述经丙二醇水溶液脱水后的斑马鱼，采用1μg/mL的尼罗红溶液染色，28℃下染色1小时，荧光显微镜观察斑马鱼血管中的血脂荧光强度。通过这些指标与空白实验的对比，确定斑马鱼脂肪堆积的情况，并确认斑马鱼脂肪肝病症的形成。
下面列出上述制备方法中关键参数对非酒精性脂肪肝斑马鱼构建的影响：
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (6)
1.一种非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)在无光照条件下，将性成熟的斑马鱼按雌雄比＝1∶2的比例放入交配鱼缸内；10小时后将所述交配鱼缸置于光照条件下0.5小时，进行受精产卵；
步骤2)将步骤1)得到的受精卵以30个/孔的密度分布于孔板中，在所述孔板的每个孔中加入3～4mL培养液，28℃恒温，以每天14小时光照/10小时黑暗的条件培养4dpf后，移去所述孔板中的培养液；
步骤3)将孔板中的受精卵随机分为正常组与高脂处理组，向所述高脂处理组的每个孔中加入3～4mL高脂培养液，密封，28℃恒温，以每天14小时光照/10小时黑暗的条件培养2～3天；所述高脂培养液含50～200μM的棕榈酸或100～400μM的油酸；
步骤4)将步骤3)得到的正常组与高脂处理组斑马鱼置于染色皿中，加入4wt％多聚甲醛在4℃下反应10～14小时，PBS缓冲液洗涤2～3次，随后依次采用0wt％、30wt％、60wt％、90wt％和100wt％的丙二醇水溶液在室温下各脱水10min，加入1wt％的油红染色液，在28℃下染色10～12小时，随后依次采用100wt％、90wt％、60wt％、30wt％和0wt％的丙二醇的乙醇溶液在室温下各脱色10min；
步骤5)采用显微镜观察高脂处理组斑马鱼的肝脏脂肪变性情况，并与正常组对比，若高脂处理组斑马鱼的肝脏脂滴度≥3，则判定为非酒精性脂肪肝。
2.根据权利要求1所述的非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，其特征在于，当所述高脂培养液含50～200μM的棕榈酸时，向所述高脂培养液中加入牛血清白蛋白直至其含量达到4wt％。
3.根据权利要求1所述的非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，其特征在于，当所述高脂培养液含100～400μM的油酸时，向所述高脂培养液中加入DMSO直至其含量达到0.1wt％。
4.根据权利要求1所述的非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，其特征在于，所述高脂培养液含200μM的棕榈酸或400μM的油酸。
5.根据权利要求1所述的非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，其特征在于，当所述高脂培养液含50～200μM的棕榈酸时，培养时间为3天。
6.根据权利要求1所述的非酒精性脂肪肝斑马鱼的制备方法，其特征在于，当所述高脂培养液含100～400μM的油酸时，培养时间为2天。
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