CN104521828A - 一种三代虫纯种人工感染系统的建立方法 - Google Patents
一种三代虫纯种人工感染系统的建立方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104521828A CN104521828A CN201410794499.8A CN201410794499A CN104521828A CN 104521828 A CN104521828 A CN 104521828A CN 201410794499 A CN201410794499 A CN 201410794499A CN 104521828 A CN104521828 A CN 104521828A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gyrodactylus
- goldfish
- purebred
- building
- artificial infection
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241001523601 Gyrodactylus Species 0.000 title claims abstract description 124
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 241000252229 Carassius auratus Species 0.000 claims abstract description 62
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 claims abstract description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 18
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims description 14
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims description 12
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 9
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 claims description 9
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 6
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 5
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 claims description 4
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 claims description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 3
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002386 leaching Methods 0.000 claims description 3
- 238000011022 operating instruction Methods 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 238000012797 qualification Methods 0.000 claims description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 3
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 3
- 230000006806 disease prevention Effects 0.000 abstract description 2
- 241000030470 Gyrodactylus kobayashii Species 0.000 abstract 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 241000869417 Trematodes Species 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- -1 mebendasol Chemical compound 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241001262815 Dactylogyrus Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000242594 Platyhelminthes Species 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 101150024923 da gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- PADMMUFPGNGRGI-UHFFFAOYSA-N dunnite Chemical class [NH4+].[O-]C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O PADMMUFPGNGRGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229960001952 metrifonate Drugs 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 229940080817 rotenone Drugs 0.000 description 1
- JUVIOZPCNVVQFO-UHFFFAOYSA-N rotenone Natural products O1C2=C3CC(C(C)=C)OC3=CC=C2C(=O)C2C1COC1=C2C=C(OC)C(OC)=C1 JUVIOZPCNVVQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- NFACJZMKEDPNKN-UHFFFAOYSA-N trichlorfon Chemical compound COP(=O)(OC)C(O)C(Cl)(Cl)Cl NFACJZMKEDPNKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K61/00—Culture of aquatic animals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于水产病害防治领域，涉及一种三代虫纯种人工感染系统的建立方法，具体涉及一种寄生于金鱼鳃及体表的小林三代虫纯种人工感染系统的建立方法。该方法包括1）获取健康无虫金鱼；2）在健康无虫金鱼上进行三代虫的人工感染；3）三代虫人工感染后维持。本发明提供了一种以金鱼为宿主建立一种可为药物筛选、新鱼药研制等提供动物模型的三代虫纯种人工感染系统的建立方法。
Description
技术领域
本发明属于水产病害防治领域，涉及一种三代虫纯种人工感染系统的建立方法，具体涉及一种寄生于金鱼上的小林三代虫纯种人工感染系统的建立方法。
背景技术
素有寄生虫界“果蝇”之称的三代虫(Gyrodactylus)隶属于扁形动物门、单殖吸虫纲、三代虫目、三代虫科，是一类常见的鱼类体外寄生虫，一般寄生于海水和淡水鱼类的鳃、体表及鳍条。自三代虫被发现以来，三代虫便因其独特的繁殖方式及很强的宿主特异性而受到人们的普遍关注，早期更作为发育生物学的胚胎发育研究的经典模型。自20世纪70年代以来，国外有关三代虫的研究蓬勃发展，涉及到三代虫的形态分类、生长发育、种系发生、种群动态、宿主免疫等各个方面。然而，国内在这方面的研究却较少，主要原因之一就是三代虫在鱼体上种类繁多，不易鉴定；另外，更重要的是缺少一种三代虫的室内实验模型，即纯种人工感染系统，这个人工感染系统的建立，不仅为三代虫的基础理论研究提供实验平台，也将会为三代虫病防治药物的研究提供十分有用的动物模型。
近年来，随着鱼类养殖密度不断提高和养殖环境的恶化，单殖吸虫(主要为指环虫和三代虫)引起的疾病越来越严重，给渔业生产造成了巨大的经济损失。目前，单殖吸虫病常用的防治药物有福尔马林、鱼藤酮、甲苯咪唑、敌百虫等化学药物，然而，由于这些药物长期、频繁的使用，导致单殖吸虫抗药性的产生，严重影响药效，使得三代虫病和指环虫病防治的难度加大。为了保障水产养殖业的健康发展，筛选、研制新的鱼药显得非常必要。然而，由于缺少一种单殖吸虫纯种人工感染系统，评价鱼药的药效是很难完成的。
总的来说，建立一种纯种三代虫的人工感染系统无论是对三代虫的生物学的研究还是对单殖吸虫病害的防控都具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是以金鱼为宿主建立一种可为药物筛选、新鱼药研制提供动物模型的三代虫纯种人工感染系统的建立方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术手段：
一种三代虫纯种人工感染系统的建立方法，其特征在于：所述三代虫纯种人工感染系统的建立方法包括以下步骤：
1)健康无虫金鱼的获取：
1.1)将购买的金鱼暂养在盛有曝气自来水的水族箱中5-8天；
1.2)将经过步骤1.1)后的金鱼用100mg/L的福尔马林溶液浸泡12h，连续浸泡3次，每次间隔为2天；
1.3)浸泡结束后，将金鱼在曝气自来水中继续养殖，所述养殖时间不低于1周；
1.4)随机选取多尾金鱼，用50mg/L的MS-222溶液麻醉后，在体视显微镜下观察鱼类的鳃、体表以及鳍条，确认无三代虫，得到健康无虫金鱼；
2)三代虫的人工感染：
2.1)从已经感染三代虫的金鱼尾鳍上选取1条三代虫；
2.2)将步骤2.1)所选取的三代虫置于经步骤1.4)麻醉后的健康无虫金鱼的尾鳍上；
2.3)待三代虫附着鳍条之后，将该金鱼养殖在一个隔离的且盛有曝气自来水的玻璃缸中；
2.4)养殖时间不低于12h后，将步骤2.3)中金鱼再次用50mg/L的MS-222溶液麻醉，置于体视显微镜下观察金鱼的鳍条是否有三代虫，若有，则进行步骤2.5)；若无，则返回执行步骤2.1)至步骤2.4)直至三代虫感染成功后进行步骤2.5)；
2.5)将感染成功后的金鱼与步骤1.4)中数量相同的健康金鱼混养，一周后，从混养的金鱼中随机选取一尾，小心取下其鳍条上的三代虫进行形态学鉴定以及分子鉴定，若经形态学鉴定以及分子鉴定后确认均是同一种三代虫，则将感染三代虫的金鱼与健康无虫金鱼按照1:4的比例混养，以得到更多的感染同一种三代虫的金鱼；若经形态学鉴定以及分子鉴定后确认不是同一种三代虫，则舍弃已感染三代虫的所有金鱼。
作为优选，本发明提供的三代虫纯种人工感染系统的建立方法在步骤2)之后还包括：
3)三代虫人工感染后的维持：
将感染三代虫的金鱼养于盛有曝气自来水的水族箱中，控制水温在20±1℃；保持水族箱中的水质清新，每天投喂1％鱼体重的商业颗粒饲料，定期投放定量的健康无虫金鱼。
作为优选，本发明所提供的三代虫纯种人工感染系统的建立方法在步骤2.5)中形态学鉴定的具体实现方式是：
加一滴清水到载玻片上，从鱼体上剥离一个完整的三代虫体置于水滴中，轻轻地盖上盖玻片，用滤纸在盖玻片边缘缓慢吸水，直到清水基本吸干为止；加上一滴APG(饱和的苦味酸铵溶液和甘油按照1:1的比例混合)溶液到盖玻片边缘，直到浸满盖玻片与载玻片之间的空隙；处理好的装片置于显微成像系统显微镜下观察拍照并测量虫体的分类学特征，并依据形态学特征和测量值与已公开的三代虫物种进行比较，进行种类鉴定。
作为优选，本发明所提供的三代虫纯种人工感染系统的建立方法在步骤2.5)中分子鉴定的具体实现方式是：
随机选取一条三代虫，参照细胞/组织基因组DNA提取试剂盒的方法提取三代虫的基因组DNA，之后进行目的片段的特异性扩增，扩增的三代虫基因片段主要包括部分18S rDNA、ITS1、5.8S rDNA、ITS-2和部分28S rDNA序列。PCR扩增的引物如下：上游引物BD1：5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3′，下游引物BD2：5′-TATGCTTAA(G/A)TTCAGCGGGT-3′。PCR扩增体系包括三代虫基因组DNA 20ng，20mM的引物各1μL，2.5mM的dNTPs溶液4μL，含20mM MgCl2的10×PCR缓冲液5μL，1.2U的ex Taq聚合酶(TaKaRa，Ex Taq)，最后用灭菌的去离子水定容到50μL。PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃后延伸10min。获得的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳分离，然后在凝胶成像系统下切割目的条带，并用DNA纯回收试剂盒(百泰克，北京)回收目的DNA片段。将纯化回收的DNA片段参照PMD-18T Vector试剂盒(Takara，大连)的操作说明进行连接。5μL连接反应体系包括：2.5μL solutionⅠ，2.0μL模板DNA，0.5μL T-Vector，于4℃连接12h以上。连接产物转化至DH5a感受态细胞后筛选得到的阳性克隆菌液送基因测序公司进行测序，测序获得的三代虫DNA序列在GeneBank上进行Blast比对，以确定三代虫的种类。
作为优选，本发明所提供的三代虫纯种人工感染系统的建立方法中所采用的三代虫是小林三代虫。
本发明的优点是：
本发明提供了一种三代虫纯种人工感染系统的建立方法，该方法通过健康金鱼的获得、三代虫的人工感染、三代虫感染系统的维持等步骤在实验室条件下建立一种三代虫纯种人工感染系统。三代虫纯种人工感染系统不仅为三代虫的病害防控研究提供动物模型，而且为三代虫生物学及其寄生虫与宿主相互作用的研究也提供了实验平台。本发明建立的三代虫纯种人工感染系统对有关三代虫的研究具有重大意义。
附图说明
图1是小林三代虫的锚钩、边缘小钩和腹联结片的测量部位示意图；
其中：
图1A是小林三代虫的锚钩；
图1B是小林三代虫的边缘小钩的示意图；
图1C是小林三代虫的腹联结片示意图。
具体实施方式
实施例1小林三代虫纯种人工感染系统建立的方法，该方法由以下步骤构成：
1)健康无虫金鱼的获得方法：将购自花鸟鱼虫市场的金鱼暂养在盛有曝气自来水的水族箱中，1周后，用100mg/L的福尔马林溶液浸泡12h，连续浸泡3次，每次间隔为2天。浸泡结束后，将金鱼在曝气自来水中养殖1周。随机选取10尾金鱼用50mg/L的MS-222溶液麻醉后，在体视显微镜下观察鱼类的鳃、体表和鳍条，确认无三代虫后，用于下面的感染实验。
2)小林三代虫的人工感染方法：从感染三代虫的金鱼尾鳍上选取1条疑似小林三代虫的三代虫，放在麻醉的健康无虫金鱼尾鳍上，待三代虫附着鳍条之后，将该金鱼放在一个隔离的、盛有1L曝气自来水的玻璃缸中。感染12h后，再次麻醉金鱼，置于体视显微镜下观察，如果未感染，重复以上步骤，直至感染成功(感染成功的标准是在显微镜下可以看到金鱼尾鳍有三代虫)。感染成功后与1条健康无虫金鱼混养。一周后，从鱼体上随机选取2条三代虫分别进行形态学鉴定和分子鉴定，若两者鉴定都是小林三代虫，则将感染小林三代虫的金鱼与健康无虫金鱼按照1:4的比例混养，以得到更多的感染小林三代虫的金鱼。
3)小林三代虫人工感染系统的维持方法：将感染小林三代虫的金鱼养于盛有曝气自来水的水族箱中，控制水温在20±1℃，保持水质清新，每天投喂1％鱼体重的商业颗粒饲料，定期投放一定数量的健康无虫金鱼，以弥补由于鱼类免疫造成三代虫的死亡和培养过程中鱼类的死亡，达到长年保种的目的。
4)小林三代虫形态学鉴定方法：加一滴清水到载玻片上，从鱼体上剥离一个完整虫体置于水滴中，轻轻地盖上盖玻片，用一张滤纸在盖玻片边缘缓慢吸水，直到水基本吸干为止；加上一滴APG溶液(饱和的苦味酸铵溶液和甘油按照1:1的比例混合)到盖玻片边缘，直到浸满盖玻片与载玻片之间的空隙；处理好的装片置于蔡司显微成像系统(ZeissAxioplan2imaging and Axiophot2，German)显微镜下观察拍照并测量虫体的分类学特征。小林三代虫后吸器的锚钩、边缘小钩和腹联结片的形态特征、测量部位及其大小见附图1。如果虫体后吸器的形态特征和测量大小与附图1相符，则可初步判定为小林三代虫。图1A是锚钩的示意图，其中，a是全长(55.2μm～65.7μm)，b是钩柄长(40.3μm～48.2μm)，c是钩尖长(25.2μm～29.9μm)，d是基部长(15.9μm～22.5μm)。图1B是边缘小钩的示意图，其中，a是全长(24.3μm～28.7μm)，b是镰部长(5.1μm～6.2μm)，c是柄部长(19.1μm～23.6μm)。图1C是腹联结片示意图，其中，a是联结片长(21.6μm～25.2μm)，b是突起间长(17.3μm～21.8μm)，c是基部宽度(6.6μm～10.2μm)，d是中间宽度(5.1μm～7.3μm)，e是膜长(14.1μm～16.3μm)，f是中间总宽度(19.2μm～23.6μm)，g是基部总宽度(21.4μm～37.3μm)。
5)小林三代虫分子鉴定方法：随机选取一条三代虫，参照细胞/组织基因组DNA提取试剂盒的方法提取三代虫的基因组DNA，之后进行目的片段的特异性扩增。PCR扩增的引物如下：上游引物BD1：5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3′，下游引物BD2：5′-TATGCTTAA(G/A)TTCAGCGGGT-3′。PCR扩增体系包括三代虫基因组DNA 20ng，20mM的引物各1μL，2.5mM的dNTPs溶液4.0μL，含20mM MgCl2的10×PCR缓冲液5μL，1.2U的ex Taq聚合酶(TaKaRa，ExTaq)，最后用灭菌的去离子水定容到50μL。PCR扩增反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃后延伸10min。获得的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳分离，然后在ZF-258全自动凝胶成像系统(上海)下切割目的条带，并用DNA纯回收试剂盒(百泰克，北京)回收目的DNA片段。将纯化回收的DNA片段参照PMD-18T Vector试剂盒(Takara，大连)的操作说明进行连接。5μL连接反应体系包括：2.5μLsolution Ⅰ，2.0μL模板DNA，0.5μL T-Vector，于4℃连接12h以上。连接产物转化至DH5a感受态细胞后筛选得到的阳性克隆菌液送华大基因测序公司进行测序，测序获得的三代虫DNA序列在GenBank上进行Blast比对，序列相似性在99％以上者，判定虫体为小林三代虫。小林三代虫的序列参见表1。
表1小林三代虫核糖体DNA内转录间隔区序列
Claims (5)
1.一种三代虫纯种人工感染系统的建立方法，其特征在于：所述三代虫纯种人工感染系统的建立方法包括以下步骤：
1）健康无虫金鱼的获取：
1.1）将购买的金鱼暂养在盛有曝气自来水的水族箱中5-8天；
1.2）将经过步骤1.1）后的金鱼用100 mg/L的福尔马林溶液浸泡12 h，连续浸泡3次，每次间隔为2天；
1.3）浸泡结束后，将金鱼在曝气自来水中继续养殖，所述养殖时间不低于1周；
1.4）随机选取多尾金鱼，用50 mg/L的MS-222溶液麻醉后，在体视显微镜下观察鱼类的鳃、体表以及鳍条，确认无三代虫，得到健康无虫金鱼；
2）三代虫的人工感染：
2.1）从已经感染三代虫的金鱼尾鳍上选取1条三代虫；
2.2）将步骤2.1）所选取的三代虫置于经步骤1.4）麻醉后的健康无虫金鱼的尾鳍上；
2.3）待三代虫附着鳍条之后，将该金鱼养殖在一个隔离的且盛有曝气自来水的玻璃缸中；
2.4）养殖时间不低于12 h后，将步骤2.3）中金鱼再次用50 mg/L的MS-222溶液麻醉，置于体视显微镜下观察金鱼的鳍条是否有三代虫，若有，则进行步骤2.5）；若无，则返回执行步骤2.1）至步骤2.4）直至三代虫感染成功后进行步骤2.5）；
2.5）将感染成功后的金鱼与步骤1.4）中数量相同的健康金鱼混养，一周后，从混养的金鱼中随机选取一尾，选取其尾鳍上三代虫进行形态学鉴定以及分子鉴定，若经形态学鉴定以及分子鉴定后确认均是同一种三代虫，则将感染三代虫的金鱼与健康无虫金鱼按照1:4的比例混养，以得到更多的感染同一种三代虫的金鱼；若经形态学鉴定以及分子鉴定后确认不是同一种三代虫，则舍弃已感染三代虫的所有金鱼。
2.根据权利要求1所述的三代虫纯种人工感染系统的建立方法，其特征在于：所述步骤2）之后还包括：
3）三代虫人工感染后维持：
将感染三代虫的金鱼养于盛有曝气自来水的水族箱中，控制水温在20 ℃±1 ℃；保持水族箱中的水质清新，每天投喂1%鱼体重的商业颗粒饲料，定期投放定量的健康无虫金鱼。
3.根据权利要求1或2所述的三代虫纯种感染系统的建立方法，其特征在于：所述步骤2.5）中形态学鉴定的具体实现方式是：
加一滴清水到载玻片上，从鱼体上剥离一个完整的三代虫体置于水滴中，轻轻地盖上盖玻片，用滤纸在盖玻片边缘缓慢吸水，直到清水基本吸干为止；加上一滴APG溶液到盖玻片边缘，直到浸满盖玻片与载玻片之间的空隙；处理好的装片置于显微成像系统显微镜下观察拍照并测量虫体的分类学特征，并依据形态学特征和测量值与已公开的三代虫物种进行比较，进行种类鉴定。
4.根据权利要求3所述的三代虫纯种人工感染系统的建立方法，其特征在于：所述步骤2.5）中分子鉴定的具体实现方式是：
随机选取一条三代虫，参照细胞/组织基因组DNA提取试剂盒的方法提取三代虫的基因组DNA，之后进行目的片段的特异性扩增，扩增的三代虫基因片段主要包括部分18S rDNA、ITS1、5.8S rDNA、ITS-2和部分28S rDNA序列；
PCR扩增的引物如下：上游引物BD1：5′- GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3′，下游引物BD2：5′- TATGCTTAA (G/A)TTCAGCGGGT-3′；PCR扩增体系包括三代虫基因组DNA 20 ng，20 mM的引物各1 μL，2.5 mM的dNTPs溶液4 μL，含20 mM MgCl2的10 × PCR缓冲液5 μL，1.2 U的 ex Taq聚合酶，最后用灭菌的去离子水定容到50 μL；
PCR扩增反应条件为：94 °C 预变性5 min；94 °C变性30 s，53 °C退火30 s，72 °C延伸90 s，35个循环；72 °C后延伸10 min；
获得的PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳分离，然后在凝胶成像系统下切割目的条带，并用DNA纯回收试剂盒回收目的DNA片段；将纯化回收的DNA片段参照PMD-18T Vector试剂盒的操作说明进行连接；5 μL连接反应体系包括：2.5 μL solutionⅠ，2.0 μL模板DNA，0.5 μL T-Vector，于4 °C连接12 h以上；连接产物转化至DH5a感受态细胞后筛选得到的阳性克隆菌液送基因测序公司进行测序，测序获得的三代虫DNA序列在GeneBank上进行Blast比对，以确定三代虫的种类。
5.根据权利要求4所述的三代虫纯种人工感染系统的建立方法，其特征在于：所述三代虫是小林三代虫。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410794499.8A CN104521828A (zh) | 2014-12-18 | 2014-12-18 | 一种三代虫纯种人工感染系统的建立方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410794499.8A CN104521828A (zh) | 2014-12-18 | 2014-12-18 | 一种三代虫纯种人工感染系统的建立方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104521828A true CN104521828A (zh) | 2015-04-22 |
Family
ID=52837612
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410794499.8A Pending CN104521828A (zh) | 2014-12-18 | 2014-12-18 | 一种三代虫纯种人工感染系统的建立方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104521828A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109055573A (zh) * | 2018-09-17 | 2018-12-21 | 皖南医学院 | 一种基于多重pcr技术快速鉴定常见储藏物粉螨的方法 |
| CN109855940A (zh) * | 2019-02-15 | 2019-06-07 | 四川农业大学 | 一种土壤线虫的玻片制备方法 |
| CN113349161A (zh) * | 2021-05-13 | 2021-09-07 | 浙江师范大学 | 多子小瓜虫的传代保种培养保种方法 |
-
2014
- 2014-12-18 CN CN201410794499.8A patent/CN104521828A/zh active Pending
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| H.Y. LUO等: "Molecular variation of Bothriocephalus acheilognathi Yamaguti, 1934 (Cestoda: Pseudophyllidea) in different fish host species based on ITS rDNA sequences", 《SYSTEMATIC PARASITOLOGY》 * |
| TRACEY ANNE KING等: "Experimental infections with the tropical monogenean, Gyrodactylus bullatarudis: Potential invader or experimental fluke?", 《PARASITOLOGY INTERNATIONAL》 * |
| 李冉冉: "金鱼寄生三代虫的形态学及分子鉴定", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
| 李冉冉等: "金鱼三代虫病的诊断与防治", 《科学养鱼》 * |
| 李冉冉等: "金鱼寄生三代虫的形态学及基于rDNA ITS序列的分子鉴定", 《水生生物学报》 * |
| 王春田: "《基础医学实验动物操作基本技能》", 30 September 2009 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109055573A (zh) * | 2018-09-17 | 2018-12-21 | 皖南医学院 | 一种基于多重pcr技术快速鉴定常见储藏物粉螨的方法 |
| CN109055573B (zh) * | 2018-09-17 | 2021-12-14 | 皖南医学院 | 一种基于多重pcr技术快速鉴定常见储藏物粉螨的方法 |
| CN109855940A (zh) * | 2019-02-15 | 2019-06-07 | 四川农业大学 | 一种土壤线虫的玻片制备方法 |
| CN113349161A (zh) * | 2021-05-13 | 2021-09-07 | 浙江师范大学 | 多子小瓜虫的传代保种培养保种方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Mass mortality caused by Cyprinid Herpesvirus 2 (CyHV-2) in Prussian carp (Carassius gibelio) in China | |
| Kempter et al. | Horizontal transmission of koi herpes virus (KHV) from potential vector species to common carp | |
| CN1940063A (zh) | 一种伪狂犬病gEˉ/gIˉ基因缺失毒株、含有该毒株的灭活疫苗及应用 | |
| CN107779439A (zh) | 新的葡萄球菌噬菌体及其组合物、制备方法和应用 | |
| CN102077797A (zh) | 一种通过罗非鱼控制对虾病害的生物防控方法 | |
| CN104521828A (zh) | 一种三代虫纯种人工感染系统的建立方法 | |
| Wigby et al. | The effect of mating on immunity can be masked by experimental piercing in female Drosophila melanogaster | |
| Chong et al. | Fish disease management | |
| Cowan et al. | Herpesvirus in a captive Australian Krefft's river turtle (E mydura macquarii krefftii). | |
| Wang et al. | CRISPR/Cas9 microinjection of transgenic embryos enhances the dual-gene integration efficiency of antimicrobial peptide genes for bacterial resistance in channel catfish, Ictalurus punctatus | |
| Saraiva et al. | Exophiala angulospora infection in hatchery‐reared lumpfish (Cyclopterus lumpus) broodstock | |
| CN105505881A (zh) | 一种猪伪狂犬病毒的抑制细胞系 | |
| Bang Jensen et al. | Common carp (Cyprinus carpio) and goldfish (Carassius auratus) were not susceptible to challenge with ranavirus under certain conditions | |
| Shufang et al. | Biological Characteristics and Pathogenicities of Shewanella algae and Shewanella abalone from Babylonia. | |
| Sørensen et al. | Ichthyodinium identified in the eggs of European eel (Anguilla anguilla) spawned in captivity | |
| Mukwabi et al. | Temperature and ph influence on bacterial pathogens infecting farmed Nile tilapia in aquaculture systems in Bungoma County, Kenya | |
| CN106387314A (zh) | 脆弱拟杆菌在动物养殖中的应用 | |
| CN103598124B (zh) | 一种生态防治鱼类流行性溃疡综合症的方法 | |
| CN111066700B (zh) | 红景天苷联合异烟肼延长海分枝杆菌斑马鱼模型生存时间的应用 | |
| Donbæk et al. | Early mortality in tilapia fingerlings on Lake Kariba in Zambia | |
| Borzym et al. | Experimental infection with epizootic haematopoietic necrosis virus (EHNV) of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum) and European perch (Perca fluviatilis L.) | |
| US20070218036A1 (en) | Method For The Prevention Of Infection With Nodavirus And Method For The Treatment Thereof | |
| CN115119781B (zh) | 一种纤毛虫病的生物防治方法 | |
| CN112080477B (zh) | 鸭呼肠孤病毒及其抗原抗体复合物的制备方法和应用 | |
| CN102703392A (zh) | 整合O型口蹄疫病毒shRNA转基因克隆猪的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150422 |