CN104152404A - 提高胚胎耐热性的培养液及其使用方法 - Google Patents

Abstract

根据现有技术在解决胚胎耐热性方面的难题，本发明提供了一种提高胚胎耐热性的培养液。培养液以常规培养液为基质，所述常规培养液为用于胚胎培养的培养液。所述培养液中还包括黄芩苷和谷氨酰胺；所述黄芩苷的浓度为2.0-10.0μg/mL，所述谷氨酰胺的浓度为1.17-1.75mg/ml。通过在胚胎培养液中添加适当浓度的黄芩苷和谷氨酰胺制备得到耐热培养液，不仅降低了经济成本、配制方法简单，而且大幅度提高了胚胎在热应激时的发育率和囊胚孵出率。此外，黄芩苷和谷氨酰胺之间存在协同作用，都可以调节HSP70的表达。因此，与单独的黄芩苷或者谷氨酰胺相比，本发明制备的耐热培养液的效果突出，产生了意想不到的技术效果。

Description

提高胚胎耐热性的培养液及其使用方法

技术领域

本发明属于胚胎工程与发育生物学领域，具体涉及一种胚胎的培养液，尤其涉及一种提高早期胚胎耐热性的培养液及使用方法。

背景技术

随着全球变暖，温度升高，高温对人类和动物的影响越发明显，夏季高温以及某些热性(使体温升高的)疾病，都会使动物产生热应激，导致孕畜胚胎死亡，导致其繁殖力降低甚至不孕，给畜牧业生产造成极大的经济损失。

传统的培养液是模拟胚胎在输卵管中发育时的环境配制的，其主要成分包括：水、离子、能量物质、氨基酸、维生素、核酸前体、蛋白质、生长因子激素、缓冲系统及气体，适用于正常温度下的胚胎培养。胚胎正常的培养温度为：牛胚胎38-39℃、小鼠胚胎37℃。在正常培养温度下牛胚胎发育至囊胚的百分率是30.4±1.11，孵出率是4.32±3.48；小鼠胚胎发育至囊胚的百分率是81.35±1.07，孵出率是61.88±0.72。但热应激条件下，用传统的培养液培养胚胎，其发育率会随着培养温度升高而显著降低。这是因为，当温度升高时，培养液中的某些成分会发生变化，从而影响胚胎的生长；另外，当培养的温度升高时，胚胎本身代谢与正常温度不同，对营养成分的需求也会增加。

目前，提高小鼠胚胎耐热性的培养液有TCZB，其优点是可以提高小鼠早期胚胎在41℃热应激条件下的发育率。用TCZB培养液培养的小鼠胚胎，其囊胚发育率及孵出率(81.3±4.5和76.5±7.6)显著高于CZB对照组(80.2±5.4和73.4±6.2)，说明TCZB提高了小鼠胚胎的热耐受性。但是，TCZB培养液并不能提高39℃培养小鼠胚胎发育至囊胚率及囊胚孵出率。此外，TCZB培养液需要利用原核表达法得到TAT蛋白和小鼠Hsp70的串联表达体——Tat-Hsp70。然而，这种方法操作复杂，对技术的要求很高，成功率低，不具有普遍适用性。

黄芩苷(Baicalin)是从黄芩根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，具有显著的生物活性(抑菌、利尿、抗炎、抗变态及解痉作用)和较强的抗癌反应等生理效能，其安胎、解热作用显著。黄芩苷的提取方法和药物用途已经公知。发明专利申请200810167545.6公开了“黄芩苷的一种抗中暑用途”，该申请给出了黄芩苷在制备增强人或动物对抗经典型热损伤能力的药物和制剂方面的应用。黄芩苷在经口给药的条件下，可降低高温环境下导致血液的炎症反应，能够明显延长大鼠进入热仓后中暑发生时间，并推迟大鼠在热环境中的死亡时间。

早期胚胎培养应用的是细胞增殖和分化的原理，其发育对环境条件极为严格。选择添加到胚胎培养液中的中药成分首选不能对胚胎有毒性作用；其次还要能穿过胚胎屏障——胚胎的透明带包被。因此，用于动物体上的中药有很大一部分不能用于胚胎培养或者即使可以用于胚胎培养液也难以产生相同的功效。例如：川芎嗪分子质量小，水溶性和脂溶性强，文献报道川芎嗪具有调节HSP70表达的作用，但是川芎嗪用在胚胎培养液中可阻滞胚胎发育，不利于胚胎进一步发育，并且可导致小鼠胚胎心肌畸形。黄芪多糖由己糖醛酸、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸等组成，具有调节HSP70表达的作用；但黄芪多糖试验组的胚胎发育率比对照组还低，其对胚胎的作用还有待于进一步的深入探讨。小檗碱具备清热解毒的功效，其作用实质是对细菌和病毒等致病原的抑制或杀灭作用；小檗碱能明显的促进胚胎2-细胞发育及细胞增值，但没有研究表明其能HSP70的表达具有调节作用。

此外，妊娠禁忌药物也有很多，主要包括两大类：第一，具有毒性的药物，服用后可直接对胎儿造成毒害，甚至死胎，如斑蝥、蜈蚣、全蝎、半夏、南星、附子等；第二，不具有毒性、但药性猛烈或药性下行滑利而易损胎元的药物，这类药主要是指大辛大热、行气化瘀及攻逐利水类中药，如青皮、槟榔、细辛、桃仁、沉香等70余种。基于上述种种因素，目前有关中药及其有效成分运用于胚胎体外培养的研究很少。关于黄芩苷，其药理作用更是集中在细胞、组织和活体上，在胚胎体外培养上只有其抗氧化作用的相关文献(孙玉成，2006，中国兽医学报)。该研究发现，黄芩苷的抗氧化作用可以减少自由基对小鼠胚胎体外发育的损伤。

谷氨酰胺(Gln)是动物血液中最丰富的特殊游离氨基酸之一。近年来，越来越多的研究发现，谷氨酰胺除了能维持机体酸碱平衡并为组织和细胞的物质和能量代谢提供原料外，还可以诱导动物的热休克反应，提高小鼠胚胎HSP70的表达，并且可促进胚胎发育，提高囊胚孵出率。目前，用于胚胎培养液的谷氨酰胺浓度一般为1mmol/L，这是由于谷氨酰胺作为胚胎可吸收的氨基酸是早期胚胎细胞功能的重要调节者，通过调节胚胎能量产生方式来促进培养过程中胚胎的发育，克服胚胎发育阻滞。对于胚胎的耐热，则没有明显的效果。

发明内容

根据现有技术在解决胚胎耐热性方面的难题，本发明提供了一种提高胚胎耐热性的培养液。该培养液不仅可以提高高温条件下培养胚胎的发育率，而且为生产中预防因热应激造成的妊娠动物早期胚胎死亡提供解决思路。

本发明采用的技术方案：

提高胚胎耐热性的培养液，所述培养液以常规培养液为基质，所述常规培养液为用于胚胎培养的培养液。所述培养液中还包括黄芩苷和谷氨酰胺；所述黄芩苷的浓度为2.0-10.0μg/mL，所述谷氨酰胺的浓度为1.17-1.75mg/ml。黄芩苷和谷氨酰胺均可以在胚胎上调节HSP70的表达，发挥其胚胎的抗热作用。此外，黄芩苷和谷氨酰胺在调节HSP70的表达方面具有协同作用，大大提高了单独用其中一种组分所产生的耐热效果。所述黄芩苷由中药固体制剂制造技术国家工程研究中心提供，纯度为99％，所述谷氨酰胺购自sigma公司。所述常规培养液为常用于胚胎培养的培养液，本发明中选用人工合成输卵管液(synthetic oviduct fluid,SOF)作为牛胚胎培养液、CZB作为小鼠胚胎培养液。所述牛胚胎由奶牛卵母细胞体外成熟培养、体外受精获得，所述的小鼠胚胎来自昆明系小鼠输卵管冲取的胚胎。

所述提高胚胎耐热性的培养液的配制方法，包括以下几个步骤：①准确称取2.0-10.0mg黄芩苷，将其溶于10mL常规培养液；②取1ml步骤①得到的溶液，采用常规培养液定容至100ml；③向步骤②得到的培养液中加入1.17-1.75mg的谷氨酰胺，搅拌均匀，经0.22μm滤器过滤除菌，即得到提高胚胎耐热性的培养液；4℃温度条件下储存，备用。

所述提高牛胚胎耐热性的培养液的使用方法，包括以下几个步骤：(1)预平衡：根据牛发育早期胚胎数量的多少，在60mm培养皿中，将耐热培养液做成60μL的培养微滴(8个/培养皿)，覆盖矿物油以防止液滴的挥发，然后置于含5％CO₂饱和湿度、温度条件为41℃的CO₂培养箱中平衡不少于2小时，使培养液的氧含量、二氧化碳含量和温度接近胚胎在体内的液体坏境；否则胚胎在离体环境不容易养活。(2)胚胎移入：取耐热培养液200μL于1.5ml离心管中，将牛胚胎移入其中，震荡45s去除颗粒细胞；(3)胚胎培养：将步骤(2)得到的胚胎采用耐热培养液充分洗涤2次，然后移入步骤(1)得到的培养微滴中，每个培养微滴移入25个早期胚胎；并将培养微滴置于含5％CO₂饱和湿度、温度条件为41℃的CO₂培养箱中培养，每隔48小时半量更换培养液。

所述的提高小鼠胚胎耐热性的培养液的使用方法，包括以下几个步骤：(1)预平衡：将耐热培养液制作成多个体积为60μL的培养微滴，覆盖矿物油以防止液滴的挥发，然后置于含5％CO₂饱和湿度、温度条件为39℃的CO₂培养箱中平衡不少于4小时，使培养液的氧含量、二氧化碳含量和温度接近胚胎在体内的液体坏境；(2)胚胎移入：取耐热培养液200μL于离心管中，将小鼠胚胎移入其中，震荡去除颗粒细胞；(3)胚胎培养：将步骤②得到的胚胎采用耐热培养液充分洗涤，然后移入步骤①得到的培养微滴中；并将培养微滴置于含5％CO₂饱和湿度、温度条件为39℃的CO₂培养箱中培养，待胚胎发育至4细胞时移入含有1％葡萄糖的耐热培养液中，每24h换液一次，直至胚胎发育至囊胚期。

现已证明，多种体外培养的细胞和胚胎受热后均能产生热休克蛋白70(HSP70)，HSP70是一种非常重要的非特异性细胞保护蛋白，尤其对体外培养的细胞均有显著的抗热保护作用，而黄芩苷通过在胚胎上调节HSP70的表达，发挥其胚胎的抗热作用。此外，黄芩苷和谷氨酰胺都可以调节HSP70的表达，而且具有协同作用。研究发现，在胚胎培养液中添加适当比例的黄芩苷和谷氨酰胺能够在一定程度上对抗热环境损伤，提高胚胎耐热性。单独添加黄芩苷(8μg/mL)在39℃时小鼠胚胎囊胚率和孵出率是65.12％和53.73％，单独添加谷氨酰胺(10mmol/L)在39℃时小鼠胚胎囊胚率和孵出率是67.26％和54.41％。

本发明的有益效果：

(1)本发明通过在胚胎培养液中添加适当浓度的黄芩苷和谷氨酰胺制备得到耐热培养液，不仅大大降低了经济成本、配制方法简单，而且大幅度提高了胚胎在热应激时的发育率和囊胚孵出率；

(2)本发明采用的黄芩苷和谷氨酰胺之间存在协同作用，都可以调节HSP70的表达。因此，与单独的黄芩苷或者谷氨酰胺相比，本发明制备的耐热培养液的效果突出，产生了意想不到的技术效果。

附图说明

图1是实施例1中Western Blot方法检测的牛胚胎中HSP70蛋白的表达；

图2是实施例1中牛胚胎的HSP70蛋白相对表达量统计结果；

图3是实施例4中Western Blot方法检测的小鼠胚胎中HSP70蛋白的表达；

图4是实施例4中小鼠胚胎的HSP70蛋白相对表达量统计结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1：牛胚胎的耐热培养实验

(1)制备适用于牛胚胎的耐热培养液

表1 牛胚胎常规SOF培养液组成成分

成分	mg/100ml
		NaCl	629
KCl	53
		CaCl2·2H2O	25
MgCl2·6H2O	10
		KH2PO4	16
NaHCO3	211
		乳酸钠	60ul
丙酮酸钠	3.6
		葡萄糖	2.7
phenol red	0.02ml
		PVA	1mg/ml

以上试剂均购自于sigma公司。

首先制备100ml常规SOF培养液(详见表1)。量取90ml超纯水至灭菌烧杯中，准确称量表1中的各种成分，加入到含超纯水的烧杯中，得到常规SOF培养液。每加入一种成分后都用磁力搅拌器搅动、摇匀，直至完全溶解后，再加入下一种物质。

准确称取黄芩苷8mg，先用10mL的常规SOF培养液溶解，取1ml该溶液于容量瓶中，再加入常规SOF培养液，定容至100ml，然后向培养液中加入146mg的谷氨酰胺，轻微搅拌均匀，经0.22μm滤器过滤除菌，得到牛胚胎的耐热培养液。在4℃下储存，备用。

(2)制作培养微滴

于培养前2h，根据受精卵数量的多少，在60mm培养皿中，用上述牛胚胎的耐热培养液做成60μL的耐热培养微滴，覆盖矿物油后分别置于40℃、41℃、42℃含5％CO₂饱和湿度CO₂培养箱中平衡。

(3)奶牛卵母细胞体外受精及培养

从屠宰场获取奶牛卵巢，用手术刀刺破卵巢表面及其内部卵泡，以此获取奶牛卵母细胞，用成熟培养液在38.5℃含5％CO₂饱和湿度CO₂培养箱中培养22h，获得成熟的牛卵母细胞。所述成熟培养液以常规培养液为基质，所述基质中还含有100IU/mL的青链霉素及体积百分含量15％的血清，所述常规培养液为DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium，购自gibco公司)。

牛卵母细胞体外受精方法如下：将牛卵母细胞培养成熟后，与精子一同放入受精培养液中，在38.5℃含5％CO₂饱和湿度CO₂培养箱中培养18h，使精卵结合(受精)，以此获得牛早期胚胎。所述受精培养液为含10mg/mL肝素的BO液(引用王亚光主编的《山羊胚胎工程》)。

(4)奶牛胚胎培养

受精结束后，将受精卵移入含有200μL培养液的1.5mL离心管中，震荡40s，以去除颗粒细胞。受精卵用常规SOF胚胎培养液充分洗涤3次后进行培养，将受精卵移入已平衡2h以上、且覆盖矿物油的60μL耐热胚胎培养微滴中进行培养。每个微滴中移入25枚胚胎，将培养皿分别置于40℃、41℃和42℃含5％CO₂饱和湿度CO₂培养箱中培养，每隔48h半量更换培养液。受精后48h，统计卵裂率并吸弃未分裂的卵母细胞。继续培养至8d，定期观察早期胚胎发育情况，记录胚胎卵裂率、桑葚胚率、囊胚率和孵化囊胚率。

(5)将体外发育至囊胚的牛胚胎每组200枚，提取胚胎总蛋白，Western Blot方法检测牛胚胎中HSP70蛋白表达量。

(6)结果

用常规SOF培养液在不同温度下培养胚胎，其各阶段发育率会随着温度的升高而降低，但差异不显著。使用本发明培养液在40℃和41℃培养的牛早期胚胎，其卵裂率和孵化囊胚率显著高于42℃条件下培养的牛早期胚胎。

在40℃的培养条件下，用常规SOF培养液和本发明培养液培养牛早期胚胎的卵裂率分别为73.33％和77.33％，桑椹胚发育率分别60.00％和63.79％，囊胚发育率分别27.27％和27.27％、孵化囊胚发育率分别为3.64％和13.79％。由此可见，用本发明的耐热胚胎培养液培养的牛早期胚胎的孵化囊胚率显著高于用常规SOF培养液培养的牛早期胚胎。

41℃培养条件下，用常规SOF培养液和本发明培养液培养牛早期胚胎的卵裂率分别为68.00％和84.00％，桑椹胚发育率分别52.94％和61.90％，囊胚发育率分别29.41％和34.92％、孵化囊胚发育率分别为1.96％和15.87％。由此可见，用本发明的耐热胚胎培养液培养的牛早期胚胎的卵裂率和孵化囊胚率显著高于用常规SOF培养液培养的牛早期胚胎。

在42℃培养条件下，用常规SOF培养液和本发明培养液培养牛早期胚胎的卵裂率分别为68.00％和76.00％，桑椹胚发育率分别49.02％和63.16％，囊胚发育率分别23.53％和31.58％、孵化囊胚发育率分别为0.00％和5.26％。用本发明培养液培养的牛早期胚胎的孵化囊胚率显著高于用常规SOF培养液培养的牛早期胚胎(表2)。

与相同培养温度条件下使用常规SOF培养液相比，本发明培养液可显著升高HSP70蛋白表达量，且在41℃时表达量最高(图1，图2)。Ⅰ：40℃常规SOF培养液组；Ⅱ：40℃本发明培养液组；Ⅲ：41℃常规SOF培养液组；Ⅳ：41℃本发明培养液组；Ⅴ：42℃常规SOF培养液组；Ⅵ：42℃本发培养液组。

因此，本发明培养液及其使用方法比常规SOF培养液显著提高牛早期胚胎的耐热性，且在41℃培养条件下效果最好。

实施例2：

与实施例1不同的，制备适用于牛胚胎的耐热培养液时，黄芩苷的用量为2mg，谷氨酰胺的用量为117mg。

实施例3：

与实施例1不同的，制备适用于牛胚胎的耐热培养液时，黄芩苷的用量为10mg，谷氨酰胺的用量为175mg。

表2 本发明培养液在不同温度下对牛早期胚胎发育率的影响

注：卵裂率＝分裂胚胎数/总受精卵×100％；桑葚胚率＝桑葚胚数/分裂胚胎数×100％；囊胚率＝囊胚数/分裂胚胎数×100％；孵化囊胚率＝孵化囊胚数/分裂胚胎数×100％；表中相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同字母表示差异显著(P<0.05)。

实施例4：小鼠胚胎的耐热培养实验

(1)制备适用于小鼠胚胎的耐热培养液

表3 小鼠胚胎常规CZB培养液组成成分

注：NaCl、KCl、KH₂PO₄、MgSO₄、NaHCO₃、CaCl₂·2H₂O、乳酸钠、丙酮酸钠、EDTA、谷氨酰胺、葡萄糖均购自sigma公司；BSA、青链霉素混合液购自Solarbio公司。

首先制备100ml常规CZB培养液(详见表3)，量取90ml超纯水至灭菌烧杯中。准确称量表3中各种成分，加入到含超纯水的烧杯中，得到常规CZB培养液。每加入一种成分后都用磁力搅拌器搅动、摇匀，直至完全溶解，再加入下一种物质。每加完一种成分后立即将烧杯口盖严，以减少液体与空气接触时间，避免使配制溶液的pH值升高。加牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)时，将BSA放在培养液表面，使二者其缓慢、逐渐混合，避免摇晃培养液，防止产生气泡，使蛋白质变性。待BSA完全溶解后定容，测pH值。

准确称取黄芩苷8mg，先用10mL的常规CZB培养液溶解。取1ml该溶液用常规CZB培养液定容至100ml，然后加入146mg的谷氨酰胺，轻微搅拌均匀。经0.22μm滤器过滤除菌，得到小鼠胚胎的耐热培养液。分装后在4℃下保存备用，长时间不用保存在-20℃条件下。

(2)制作培养微滴

培养前24h，在60mm培养皿中，用上述小鼠胚胎的耐热培养液制备60μL的培养微滴，覆盖矿物油后分别置于39℃、40℃、41℃含5％CO₂的CO₂培养箱中平衡。

(3)小鼠胚胎培养

用人工注射激素方法使小鼠超数排卵，首先腹腔注射PMSG(10IU/只)，48h后注射相同剂量的hCG，然后合笼，第二天检查阴栓。见栓小鼠当天晚上杀死后，迅速剖开腹腔，找到其子宫和卵巢。

用镊子挑起子宫和卵巢，剔除周围的系膜与脂肪，在靠近卵巢部位的子宫体处剪断，放入预先准备好的Hepes-CZB液滴中。在体视显微镜下找到输卵管壶腹部，用1ml注射器针头挑破管壶腹部输卵管，可见胚胎成团或单个跑出。如胚胎带有颗粒细胞，则首先把胚胎用吸胚管转移至透明质酸酶中消化，消化后再放Hepes-CZB液滴中清洗4～5次。将已平衡好的胚胎耐热培养液取出，把清洗好的胚胎用吸胚管转移至胚胎耐热培养液中，每个培养滴放置约25枚胚胎。将培养皿分别置于39℃、40℃、41℃含5％CO₂饱和湿度CO₂培养箱中培养，在胚胎发育至4细胞时移入含有葡萄糖的培养液中，每24h换液一次，记录胚胎桑葚胚率、囊胚率和孵化囊胚率。

(4)将体外发育至囊胚的小鼠胚胎每组200枚，提取胚胎总蛋白，Western Blot方法检测小鼠胚胎中HSP70蛋白表达量。

(5)结果

用常规CZB培养液在不同温度下培养小鼠早期胚胎，各阶段发育率会随着温度的升高而降低，其孵化囊胚率差异显著。使用本发明培养液在不同温度下培养早期胚胎在39℃和40℃培养小鼠胚胎的桑椹胚发育率和囊胚率显著高于41℃培养条件下培养的胚胎(表4)。

在39℃培养条件下，采用常规CZB培养液和本发明培养液的小鼠早期胚胎桑椹胚发育率分别为80.00％和90.67％，囊胚发育率分别为61.30％和78.67％，孵化囊胚发育率分别为50.67％和62.67％。由此可见，用本发明培养液培养的小鼠早期胚胎的桑椹胚、囊胚和孵化囊胚发育率均显著高于用常规培养液培养的小鼠早期胚胎。

在40℃培养条件下，采用常规CZB培养液和本发明培养液的小鼠早期胚胎桑椹胚发育率分别为70.67％和84.00％，囊胚发育率分别为61.33％和78.67％，孵化囊胚发育率分别为41.33％和57.33％。由此可见，用本发明培养液培养的小鼠早期胚胎的桑椹胚、囊胚和孵化囊胚发育率均显著高于用常规CZB培养液培养的小鼠早期胚胎。

在41℃培养条件下，采用常规CZB培养液和本发明培养液的小鼠早期胚胎桑椹胚发育率分别为68.00％和70.67％，囊胚发育率分别为54.67％和65.33％，孵化囊胚发育率分别为34.67％和49.33％。由此可见，使用本发明培养液培养的小鼠胚胎各阶段发育率均高于常规CZB培养液，但差异不显著。

与相同温度下使用常规CZB培养液相比，本发明培养液可显著增加HSP70蛋白表达量，且在39℃时表达量最高(图3，图4)。Ⅰ：39℃常规CZB培养液组；Ⅱ：39℃本发明培养液组；Ⅲ：40℃常规CZB培养液组；Ⅳ：40℃本发明培养液组；Ⅴ：41℃常规CZB培养液组；Ⅵ：41℃本发培养液组。

因此，本发明培养液及其使用方法比常规CZB培养液显著提高小鼠早期胚胎的耐热性，且在39℃条件下培养下效果最好。

实施例5：

与实施例4不同的，制备适用于小鼠胚胎的耐热培养液时，黄芩苷的用量为4mg，谷氨酰胺的用量为135mg。

实施例6：

与实施例4不同的，制备适用于小鼠胚胎的耐热培养液时，黄芩苷的用量为6mg，谷氨酰胺的用量为150mg。

表4 本发明培养液在不同温度下对小鼠附植前胚胎发育率的影响

注：桑葚胚率＝桑葚胚数/培养胚胎数×100％；囊胚率＝囊胚数/培养胚胎数×100％；孵化囊胚率＝孵化囊胚数/培养胚胎数×100％；表中相同字母表示差异不显著(P>0.05)；不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Claims (7)

1.提高胚胎耐热性的培养液，所述耐热培养液以常规培养液为基质，所述常规培养液为用于胚胎培养的培养液，其特征在于：所述耐热培养液中还包括黄芩苷和谷氨酰胺；所述黄芩苷的浓度为2.0-10.0μg/mL，所述谷氨酰胺的浓度为1.17-1.75mg/ml。

2.根据权利要求1所述的提高胚胎耐热性的培养液，其特征在于：所述胚胎为牛胚胎或小鼠胚胎；所述牛胚胎由奶牛卵母细胞体外成熟培养、体外受精获得，所述小鼠胚胎由昆明系小鼠输卵管冲取获得；所述牛胚胎的常规培养液为人工合成输卵管液(SOF培养液)，所述小鼠胚胎的常规培养液为CZB培养液。

3.根据权利要求1所述的提高胚胎耐热性的培养液的配制方法，其特征在于：包括以下几个步骤：①准确称取2.0-10.0mg黄芩苷，将其溶于10mL常规培养液；②取1ml步骤①得到的溶液，采用常规培养液定容至100ml；③向步骤②得到的培养液中加入1.17-1.75mg的谷氨酰胺，搅拌均匀，经0.22μm滤器过滤除菌，即得到提高胚胎耐热性的培养液；4℃温度条件下储存，备用。

4.根据权利要求1所述的提高胚胎耐热性的培养液的使用方法，其特征在于：包括以下几个步骤：

①预平衡：将耐热培养液制作成多个体积为60μL的培养微滴，覆盖矿物油，然后置于含5％CO₂饱和湿度、温度条件为41℃的CO₂培养箱中平衡不少于2小时，使耐热培养液的氧含量、二氧化碳含量和温度接近胚胎在体内的液体坏境；

②胚胎移入：取常规SOF培养液200μL于离心管中，将牛胚胎移入其中，震荡去除颗粒细胞；

③胚胎培养：将步骤②得到的胚胎采用常规SOF培养液充分洗涤，然后移入步骤①得到的耐热培养微滴中；并将耐热培养微滴置于含5％CO₂饱和湿度、温度条件为41℃的CO₂培养箱中培养，每隔48小时半量更换培养液。

5.根据权利要求4所述的提高胚胎耐热性的培养液的使用方法，其特征在于：所述牛胚胎由奶牛卵母细胞体外成熟培养、体外受精获得。

6.根据权利要求1所述的提高胚胎耐热性的培养液的使用方法，其特征在于：包括以下几个步骤：

①预平衡：将耐热培养液制作成多个体积为60μL的培养微滴，覆盖矿物油，然后置于含5％CO₂饱和湿度、温度条件为39℃的CO₂培养箱中平衡不少于4小时，使培养液的氧含量、二氧化碳含量和温度接近胚胎在体内的液体坏境；

②胚胎移入：将小鼠胚胎移入含透明质酸酶的Hepes-CZB培养液中去除颗粒细胞；

③胚胎培养：将步骤②得到的胚胎采用Hepes-CZB培养液充分洗涤，然后移入步骤①得到的耐热培养微滴中；并将耐热培养微滴置于含5％CO₂饱和湿度、温度条件为39℃的CO₂培养箱中培养，待胚胎发育至4细胞时移入含有1％葡萄糖的耐热培养液中，每24h换液一次，直至胚胎发育至囊胚期。

7.根据权利要求6所述的提高胚胎耐热性的培养液的使用方法，其特征在于：所述小鼠胚胎由昆明系小鼠输卵管冲取获得。