CN109985060A - 石斛多糖在制备预防或恢复化疗后生殖损伤的药物中应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了石斛多糖在制备预防或恢复使用氮芥类抗癌药物化疗后生殖损伤的药物中应用。本发明将石斛多糖用于预防和治疗放化疗导致的男性生殖损伤，治疗效果明显，副作用小，可有效减轻氮芥类抗癌药物对生殖系统造成的损伤，不仅使小鼠精子数量显著回升，精子质量也有所提高，并有效提高小鼠睾丸组织的抗氧化性，在小鼠睾丸组织中，SOD、GPx、GSH、CAT水平明显上升、MDA水平明显下降。本发明的石斛多糖原料来源广泛，提取纯化方法简单，所制得的石斛多糖含糖量高，适合大规模的生产与推广，在制备癌症化疗后生殖损伤恢复药物中具有良好的应用前景。

Description

石斛多糖在制备预防或恢复化疗后生殖损伤的药物中应用

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，特别涉及石斛多糖在制备预防或恢复使用氮芥类抗癌药物化疗后生殖损伤的药物中应用。

背景技术

在现今社会，癌症发病率逐年增加，2012年我国癌症确诊人数达到358.62万人，有218.66万人死于各种癌症；到2015年，癌症确诊人数上涨到了429.2万，而死亡人数则上升到了284.1万人。我国导致死亡的前十位恶性肿瘤分别是胃癌、肝癌、食管癌、大肠癌、白血病与淋巴癌、宫颈癌、鼻咽癌、乳腺癌，这些癌症高发对我国人口健康和国民经济发展产生了重大威胁。环磷酰胺是临床上治疗癌症的一线药物，广泛用于治疗癌症以及多种免疫系统疾病，对多种癌症有较好的治疗效果。但是环磷酰胺治疗过程中对细胞无选择性，其靶向的组织缺乏特异性，其临床使用会损伤癌组织之外的多种组织，尤其是对人体组织中快速分裂的细胞(如生精细胞等)的毒性作用更明显，因此在使用时易造成生殖系统的严重功能性损伤。现有研究表明，环磷酰胺在代谢过程中会产生磷酰胺氮芥与丙烯醛等强氧化物，其在体内代谢时会产生大量的ROS，ROS中的羟基自由基可对胸腺嘧啶的5,6-双键进行加成，形成胸腺嘧啶自由基，自由基从DNA的戊糖夺取了氢原子，使之在C4位置形成具有未配对电子的自由基，此自由基又在β-位置发生链的断裂，最后，O₂ ^-也能分解以鸟苷酸为代表的核苷酸，达到抑制肿瘤组织生长的作用。在ROS与化学损伤的共同作用下，使精子功能也严重受损，导致少精子甚至是无精子的情况发生。对于男性而言，环境、生理和遗传因素变化都会影响精子生殖功能。像所有其他活细胞一样，精细胞的生存需要氧气，正常生理情况下，天然氧代谢产物-活性氧(ROS)作为重要的细胞信号传导分子对精子正常功能有重要作用。而氧化还原反应不平衡所导致的氧化应激反应会产生过量的ROS，对精子质量和功能具有潜在的毒性作用。由于精子膜不饱和脂肪酸PUFA含量很高，而其细胞质中的抗氧化酶浓度极低，不能对环绕精子顶体和精子尾的细胞膜进行保护。精子是过量ROS的来源，精子对过量ROS水平引起的损伤极敏感，可引起精子DNA损伤。并且各种精液成分，如生精细胞、精液白细胞也是ROS的来源，影响精液对生殖功能的保护作用，可导致肿瘤和不育，临床上已发现25～40％的男性不育患者的ROS水平较高。近年来包括阴茎癌、睾丸癌等生殖器官癌症也逐步低龄化和高发，环磷酰胺的生殖毒性作用限制了临床上使用环磷酰胺治疗生殖系统肿瘤，同时也限制了环磷酰胺用于其他癌症的治疗。在癌症放化疗中为了对生育期男性的生殖功能进行保护，癌症患者用环磷酰胺化疗前后需要使用药物等医学干预手段，以保护男性生殖功能不受到损伤或促进受损的男性生殖系统的功能较好的恢复。由于环磷酰胺等化疗药物也会对免疫系统产生抑制，治疗癌症时会导致人体免疫力显著下降并导致病人全身性机能虚弱。如果使用激素或化学合成药物保护其生殖功能常伴随各种毒副作用，同样癌症康复期使用上述合成药物也容易导致机体多个器官和组织损伤，从而加重对病人生殖功能的损伤继而影响生育，因此，患者在癌症化疗期及癌后恢复时期使用没有或低毒副作用的天然产物药物有可能为预防化疗导致的雄性生殖功能损伤及康复治疗提供新策略，获得更好的效果。

植物类天然产物因其活性物质结构新颖、疗效高、不良反应低或少，因此成为可以广泛应用于癌症辅助治疗和癌后康复，也成为癌症后生殖系统恢复的主要药物来源，如以传统中药为主要成分的生精胶囊、五子衍宗丸等都应用于寡精症和无精症等先天性生殖功能低下患者或癌症后生殖功能的康复治疗。很多天然产物药物成分复杂，具体作用机制不明确，使得其难以通过药物审批以及应用于临床治疗。此外，天然药物提取、分离和加工有一定困难，步骤繁琐，产量低下，成本高也制约了其应用。目前，已有许多针对癌症康复治疗的药物研究，所使用的药材来源各不相同，主要以动植物来源居多，其余部分则来源于菌类或者矿物等等，其中，中药以及常见的动植物食品是研究的热门，如辣木、黄精、番茄、香菇、甲壳质(龟类)、海藻等等，这些天然产物类药物涵盖酚类，萜类，蛋白类，多肽，脂类，糖类等等，但是由于原材料成本、药物提纯难度、药物含量、治疗效果、毒副作用等种种影响，许多天然产物药物对生殖损伤作用的研究还只能停留在实验阶段。

动植物多糖是一种天然大分子，近年来研究表明，一些多糖具有抗氧化、抗辐射、免疫调节与抗肿瘤、降血糖血脂以及抗病毒等多种生物学活性及药理作用。某些多糖分子具有很强的抗氧化能力，可以直接作用于ROS本身、作用于抗氧化酶、络合ROS形成所必须的金属离子以及促进SOD从细胞表面释放，阻碍ROS作用，通过清除自由基产生而具有抗癌等多种生物活性。现有研究发现不同来源的植物多糖的药用作用和作用机理不完全相同，其药物作用不同主要取决于多糖的单糖组成、交联度，有无侧链、分子量等，其药用作用不能一概而论，需要对每一种多糖的生物活性和药用功能分别进行研究。我国有丰富的药用植物资源，其中(铁皮)石斛是我国的一种名贵传统中药和保健品，其主要的成分之一石斛多糖有重要的药用价值，可以提高免疫力，具有抗疲劳能力、抗癌能力、抗病毒和抑菌能力，并且能降低血糖与抑制肿瘤增殖，对石斛多糖的药用价值探索和发现有很好的临床意义，也有巨大的经济效益。

中国的不孕不育高发近十年已攀升到西方国家的水平(占生育期人口的20％)，其中癌症放化疗引起的生殖损伤也日益突出，而石斛及其多糖与生殖功能的相互作用关系，及对生殖损伤预防和修复等是否具有作用还几乎是空白，尤其是对放化疗引起的生殖功能损伤的预防和康复治疗作用目前未见报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术对临床上放化疗中保护患者其雄性生殖功能，预防和治疗生殖功能损伤的缺点与不足，提供石斛多糖在制备预防癌症患者放化疗引起的生殖功能损伤或促进癌症患者的生殖功能康复的药物中的应用。本发明首次研究石斛多糖对雄性生殖功能损伤的作用和机制，并基于该最新研究成果，将石斛多糖用于预防和治疗放化疗导致的男性生殖损伤在临床上具有很好的效果与前景。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

石斛多糖在制备预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的药物中的应用。本发明将石斛多糖用于预防和治疗放化疗导致的生殖损伤，临床上具有很好的作用。

所述的生殖损伤为男性在使用氮芥类抗癌药物治疗癌症后造成的生殖损伤。

所述的预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的表现包括如下方面：使精子数量明显增加，提高精子质量即增加精子运动性，提高精子存活率、精子顶体反应率、精子核成熟率，明显降低精子畸形率；可以提高睾丸组织中酶促和非酶抗氧化防御能力，使SOD、GPx、GSH、CAT水平明显上升，有效清除活性氧等自由基，明显降低MDA水平，减轻自由基产生和氧化应激对生殖功能的损伤。

所述的氮芥类抗癌药物优选为脂肪氮芥、芳香氮芥、氨基酸氮芥、甾体氮芥以及杂环氮芥等药物或其衍生物；进一步优选为环磷酰胺类药物及其衍生物。

所述的氮芥类抗癌药物化疗包括单独使用所述的氮芥类抗癌药物进行化疗或所述的氮芥类抗癌药物与其他抗癌药物联合用药进行化疗。

所述的预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的药物还包括可接受的辅料。

所述的预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的药物还包含其他起配伍协同作用的有效成分。

所述的预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的药物可以为各种剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊、粉剂、滴丸、缓释剂、口服液、注射剂等。

所述的石斛多糖优选为从铁皮石斛中提取得到的石斛多糖。

所述的石斛多糖中多糖含量优选为至少70％；进一步优选为至少79％。

所述的石斛多糖优选通过包括如下步骤的制备方法制备得到：

(1)铁皮石斛鲜条干燥粉碎后得到铁皮石斛干粉，加入水，水浴加热浸提，得到粗多糖浸提液；

(2)将步骤(1)得到的浸提液冷冻凝固后在冻干机中离心，除去浸提液中的水分，离心后收集产物，用少量水溶解，得到浓缩液；

(3)在步骤(2)中得到的浓缩液中加入无水乙醇，沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀，室温干燥，即得所述的石斛多糖。

步骤(1)中所述的铁皮石斛干粉与水的料液比优选按质量体积比1:30配比。

步骤(1)中所述的水优选为去离子水、蒸馏水或超纯水。

步骤(1)中所述的水浴的温度优选为90℃。

步骤(1)中所述的浸提的次数优选为至少3次，每次浸提的时间优选为120分钟以上，并持续搅拌。

步骤(2)中所述的冷冻凝固的温度优选为-20℃。

步骤(2)中所述的离心的温度优选为-60℃；离心的转速优选为10000r/min，离心的时间优选为6小时。离心的目的是对浸提液中的液体成分进行浓缩。

步骤(3)中所述的浓缩液的用量优选按所述的浓缩液与所述的无水乙醇的体积比1:4配比。

步骤(3)中所述的沉淀的时间优选为24h。

步骤(3)中所述的离心的条件优选为4000g离心10min。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明的石斛多糖可显著减轻和预防化疗药物造成的生殖损伤

本发明研究发现，使用石斛多糖对腹腔注射环磷酰胺导致的生殖损伤模型小鼠进行灌胃处理，能预防和治疗其生殖功能损伤，促进生殖功能恢复。环磷酰胺注射后所导致小鼠精子数量和精子质量都出现了明显的下降和劣变，表现出典型的生殖毒性反应，而石斛多糖灌胃处理后，由环磷酰胺所造成的生殖功能损伤程度得到了明显的减轻，促使精子数量显著回升，精子质量和功能都有所恢复，且环磷酰胺化疗引起的病理损伤变化也出现明显缓解，多糖对化疗药物环磷酰胺引起的睾丸组织中的氧化自由基产生有明显的抑制和清除作用，多糖处理使MDA水平明显下降，SOD、GPx、GSH、CAT等抗氧化酶水平有明显上升。由此可见，本发明的石斛多糖可以有效增加小鼠睾丸组织的抗氧化性，可以预防和治疗环磷酰胺对小鼠睾丸组织的生殖毒理作用，对生殖功能损伤有很好的预防和治疗作用。

2.本发明的原料来源广泛，制备方法简单易行

本研究选用石斛多糖作为生殖损伤治疗药物，其原材料铁皮石斛种植方法成熟、原料容易获得，可便于进行大规模生产；原材料中目标产物的含量丰度高、提取纯化方法简单、便于处理，提取物中多糖产率高，使得石斛多糖的原材料生产成本可以较低；本发明的石斛多糖治疗效果明显，无毒副作用，适合大规模的生产与应用推广。

附图说明

图1是苯酚-硫酸法测定石斛多糖含量的标准曲线结果图。

图2是效果实施例中使用环磷酰胺腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠精子数量变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，c为环磷酰胺组，d为环磷酰胺-石斛多糖组。

图3是效果实施例中使用环磷酰胺腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠精子畸形率变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，c为环磷酰胺组，d为环磷酰胺-石斛多糖组。

图4是效果实施例中使用环磷酰胺腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠精子活力变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，c为环磷酰胺组，d为环磷酰胺-石斛多糖组。

图5是效果实施例中使用环磷酰胺腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠精子核成熟度变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，c为环磷酰胺组，d为环磷酰胺-石斛多糖组。

图6是效果实施例中使用环磷酰胺腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠精子顶体反应率变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，c为环磷酰胺组，d为环磷酰胺-石斛多糖组。

图7是效果实施例中使用环磷酰胺腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠精子存活率变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，c为环磷酰胺组，d为环磷酰胺-石斛多糖组。

图8是效果实施例中使用环磷酰胺腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠睾丸组织CAT水平变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，c为环磷酰胺组，d为环磷酰胺-石斛多糖组。

图9是效果实施例中使用环磷酰胺腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠睾丸组织GSH水平统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，c为环磷酰胺组，d为环磷酰胺-石斛多糖组。

图10是效果实施例中使用环磷酰胺腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠睾丸组织GPx水平变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，c为环磷酰胺组，d为环磷酰胺-石斛多糖组。

图11是效果实施例中使用环磷酰胺腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠睾丸组织MDA水平变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，c为环磷酰胺组，d为环磷酰胺-石斛多糖组。

图12是效果实施例中使用环磷酰胺腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠睾丸组织SOD水平变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，c为环磷酰胺组，d为环磷酰胺-石斛多糖组。

以上附图中，其中，“*”表示与处理相同时间的空白对照组相比有显著差异(P<0.05)，“**”表示与相同处理时间的空白对照组相比有极显著差异(P<0.01)，“#”表示与相同处理时间的环磷酰胺组相比有显著差异(P<0.05)，“##”表示与相同处理时间的环磷酰胺组相比有极显著差异(P<0.01)。

图13是效果实施例的小鼠精子存活率检测中，小鼠精子悬液经伊红染液染色后的光学显微镜照片示意图；箭头所指分别为死精子(对应实际照片中精子头部着红色)和活精子(对应实际照片中精子头部不着色或着浅红色)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1石斛多糖的提取与检测

1.石斛多糖的提取

取铁皮石斛(铁皮石斛种植于广东省农业科学院作物所实验基地，经过品种鉴定为铁皮石斛，鲜条取样后烘干、粉碎得到铁皮石斛干粉)4g，按照1:30(m/V)的料液比加入蒸馏水，充分溶解后，90℃水浴浸提三次，每次120分钟，将浸提液分装至7mL离心管中，在-20℃冰箱中冷冻凝固后在冻干机中以10000r/min离心6小时，对管中液体成分进行浓缩以浓缩提取液。将浓缩后产物使用1～2mL蒸馏水溶解并收集，之后加入4倍体积的无水乙醇，沉淀24h，4000g离心10min，去上清，取沉淀，沉淀以无水乙醇洗涤两次，室温干燥后得到1.74g石斛多糖粉末。

2.石斛多糖的检测

(1)检测所需溶液的配制

称取无水葡萄糖100mg，将其置于干燥的100mL容量瓶中，加入蒸馏水溶解，并使用滴管滴加蒸馏水至刻度，即可得葡萄糖标准溶液。取80％(w/v)苯酚，加入蒸馏水并将其稀释至终浓度为5％(w/v)，稀释苯酚需要现配现用。

(2)苯酚-硫酸法绘制标准曲线

取玻璃试管6支，分别加入20、40、60、80、100、120μL葡萄糖标准溶液，补蒸馏水至2mL，之后再加入5％(w/v)苯酚1mL，浓硫酸5mL，摇匀后90℃水浴加热15分钟，在490nm下检测吸光度。标准曲线图如图1所示。

(3)石斛提取物中多糖含量的测定

取2mg本实施例制得的石斛多糖粉末置于试管中，补蒸馏水至2mL，再加入5％(w/v)苯酚1mL，浓硫酸5mL，摇匀后90℃水浴加热15分钟，在490nm下检测吸光度。

经计算，本实施例制得的石斛多糖粉末中多糖含量为79.26％。

实施例2模型小鼠的精子与睾丸相关参数的变化

环磷酰胺注射液为山西普德药业股份有限公司生产，规格：0.2g环磷酰胺/支，国药准字：H20040813。

1.溶液的配制

(1)石斛多糖溶液的配制：取实施例1制得的石斛多糖粉末，将其溶解于蒸馏水中，配置成100mg/mL的石斛多糖溶液。

(2)环磷酰胺注射液的配置：取注射用环磷酰胺一支，加入10mL生理盐水，配置成20mg/mL的环磷酰胺注射液。

(3)HTF液(人输卵管培养液)的配制:按表1的配方配制得到HTF液。

表1 HTF液配方

2.动物试验

(1)空白对照组(实验第0天起，腹腔注射生理盐水，次日(24小时后)每日灌胃生理盐水，连续灌胃7或14天。)

(2)石斛多糖组(实验第0天起，腹腔注射生理盐水，次日起每日灌胃石斛多糖，连续7或14天。)

(3)环磷酰胺组(实验第0天腹腔注射200mg/kg环磷酰胺，环磷酰胺注射周期为每7天注射一次(7天组为单剂量，14天组为双剂量)，24小时后每日灌胃生理盐水7或14天。)

(4)环磷酰胺-石斛多糖组(使用上述环磷酰胺注射液进行腹腔注射(环磷酰胺注射方式分为7天单剂量组和14天组双剂量组)，建立环磷酰胺损伤模型，7天单剂量组或14天组双剂量组均在第一次注射环磷酰胺后24小时即连续给小鼠灌胃200mg/kg石斛多糖溶液7或14天。)

实验动物：每组使用六周龄雄性昆明小鼠6只，重复2次。

3.小鼠精子影响监测

(1)小鼠精子数量检测

取小鼠附睾尾，置于放有1mL 0.9％生理盐水的35mm培养皿中，在解剖镜下用细针挑破曲细精管，并将精子挤出，之后将附睾尾丢弃。之后将培养皿置于37℃，5％CO₂的培养箱中，孵育5min，取2μL精子悬液，加入0.9％生理盐水将其稀释至10μL，取5μL于血球计数板中，静置5min，之后进行精子计数。

表2小鼠精子数量的变化

其中，“*”表示与相同处理时间的空白对照组相比有显著差异(P<0.05)，“**”表示与相同处理时间的空白对照组相比有极显著差异(P<0.01)，“#”表示与相同处理时间的环磷酰胺组相比有显著差异(P<0.05)，“##”表示与相同处理时间的环磷酰胺组相比有极显著差异(P<0.01)；下同。

从图2和表2结果可见，石斛多糖组小鼠灌胃石斛多糖7、14天后对小鼠精子数量并没有明显影响。在环磷酰胺损伤模型中，单剂量和双剂量环磷酰胺注射均导致小鼠精子数量有显著的下降，而且两次注射后精子数量的下降明显高于单剂量注射，其中，环磷酰胺单次注射后，小鼠精子数量仅为空白对照组的27％，环磷酰胺两次注射后精子数量下降到空白对照的23.3％。环磷酰胺对精子下降的作用存在剂量效应，与一次注射后比，两次注射后小鼠精子数量下降了11.4％。经石斛多糖处理7天与14天后，小鼠精子数量明显提高，灌胃石斛多糖7天组与未灌胃石斛多糖的环磷酰胺7天组相比，精子数量升高了169.9％，灌胃石斛多糖14天组与未灌胃石斛多糖的环磷酰胺14天组相比，精子数量升高了168.3％，表明石斛多糖对环磷酰胺单剂量和多剂量注射所致的小鼠精子数量的毒性作用都有很有效的治疗效果。

(2)小鼠精子畸形率监测

将培养皿置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行孵育，取80μL已孵育5min的精子于EP管中，加入20μL 1％伊红染液，混匀，静置15min，之后取50μL在洁净的载玻片上均匀涂片，待其风干后，用中性树脂封片，之后在光学显微镜下观察500个精子的形态，记录畸形精子的数量并计算精子的畸形百分率。计算精子畸形时，有头无尾，有尾无头，与其他精子重叠的精子以及与碎片重叠的精子均不计入。

表3小鼠精子畸形率的变化

实验结果发现(图3和表3)，与空白对照(生理盐水)相比，石斛多糖灌胃7、14天都对小鼠精子畸形率无明显影响。而注射环磷酰胺7、14天后，精子畸形率都发生显著上升，注射7天单剂量环磷酰胺后，精子畸形率上升了364.2％，14天双剂量注射后精子畸形率更是上升了424.5％，有典型的剂量效应。使用石斛多糖对环磷酰胺模型小鼠进行处理后，7、14天组精子畸形率都显著下降，7天单剂量环磷酰胺组的降幅达到了60.6％，14天双剂量环磷酰胺组的降幅也有52％，说明石斛多糖可以有效降低因使用环磷酰胺不同使用剂量所导致的小鼠精子畸形发生。

(3)小鼠精子活力检测

小鼠以脱颈椎法处死后，迅速取其附睾尾，置于盛有1mL 0.9％生理盐水的35mm培养皿中，将其置于解剖显微镜下，使用解剖针将附睾尾中的曲细精管扎破，使用小镊子对扎破后的附睾尾进行挤压，使精子流出，当大部分精子流出附睾尾后，将附睾尾去除。精子悬液置于37℃，5％CO₂的培养箱内孵育5min。

取上述精子悬液10μL于血球计数板中，在光学显微镜下观察200个精子，精子分级标准参照《世界卫生组织人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》。精子标准可以被分为4级：1级：精子活动性良好，运动时呈快速直线运动；2级：精子运动性一般，运动时做直线或非直线运动；3级：精子运动能力差，呈徘徊状或转圈运动，几乎无前进性；4级：精子没有运动能力。精子活力计算依照以下公式：精子活力(％)＝(1级+2级+3级)/(1级+2级+3级+4级)*100％。

表4小鼠精子活力的变化

结果如图4和表4所示，石斛多糖灌胃7、14天对小鼠精子活力无明显不良影响。而注射环磷酰胺7、14天后，小鼠精子活力均明显下降，14天双剂量注射组小鼠精子数量更低，对生殖功能的损伤更严重，其精子活力下降了17.1％，存在剂量效应；使用石斛多糖对环磷酰胺模型小鼠进行7天、14天的处理后，两组小鼠的精子活力都有明显上升，以14天环磷酰胺双剂量组为例，灌胃石斛多糖与未灌胃石斛多糖的环磷酰胺模型小鼠相比，精子活力上升11％，充分说明石斛多糖可以在环磷酰胺生殖损伤模型中有效增加小鼠精子活力。

(4)小鼠精子核成熟度检测

取小鼠附睾尾，置于2mL HTF液中，HTF需要在实验前一天置于35mm培养皿中孵育过夜。取下附睾尾后在解剖显微镜下用针头挑破曲细精管，将精子挤出，之后将附睾尾丢弃。培养皿放置于培养箱中孵育5min，取孵育后的精子悬液于血球计数板上计数，并根据计数结果将精子悬液稀释至1×10⁶个精子/mL。取10μL稀释后的精子在载玻片上均匀涂片，风干后于3％戊二醛固定液中固定30min，双蒸水冲洗载玻片，待其风干后，使用5％苯胺蓝染液对其进行染色，染色时间5min，流水冲洗载玻片后风干，之后用中性树胶进行封片，在油镜下观察200个精子头部，计算头部不着蓝色或者着淡蓝色精子的百分率。有头无尾或有尾无头，与其他精子或者碎片重叠的精子不进行计数。

表5小鼠精子核成熟度的变化

结果如图5和表5所示，石斛多糖灌胃7、14天对小鼠精子核成熟度无明显变化，而注射环磷酰胺7、14天后精子核成熟度发生了明显下降，但单剂量和双剂量注射组差异不显著；使用石斛多糖灌胃7、14天对环磷酰胺模型小鼠进行处理后，环磷酰胺单剂量和双剂量注射组小鼠精子核成熟度分别上升5.3％和7.4％，证明石斛多糖可以使环磷酰胺生殖损伤模型小鼠的精子核成熟度有效增加，减轻环磷酰胺对小鼠精子核成熟的损伤。

(5)小鼠精子顶体反应检测

取小鼠附睾尾于盛有2mL HTF液的35mm培养皿中，解剖显微镜下用针头挑破曲细精管，将精子挤出，丢弃附睾尾。取精子悬液在细胞计数板上进行计数，根据计数结果将精子密度稀释至1×10⁶个精子/mL，之后取1mL稀释后的精子置于37℃，5％CO₂的培养箱中，孵育1h使精子获能，获能后加入10μL 1mg/mL的孕酮溶液，混匀，继续放入培养箱中孵育30min，用以诱导精子发生顶体反应。30min后，将精子悬液放入离心机中，2000r/min 10min离心，离心产物去上清，再用HTF液洗涤两次，之后加入HTF液制成精子悬液，取其中10μL于载玻片上均匀涂片，风干，将载玻片放入95％乙醇溶液中进行固定，固定时间30min，固定后自然晾干。之后放入考马斯亮蓝R-250中进行15min染色，染色后流水冲洗载玻片，最后晾干，于光学显微镜下观察500个精子，精子头部染深蓝色的精子为未发生顶体反应的精子，染浅蓝色的精子为发生顶体反应的精子，记录发生顶体反应的精子数量，计算顶体反应率。

表6小鼠精子顶体反应率的变化

从图6和表6可见，与空白对照相比，灌胃石斛多糖7、14天对小鼠精子顶体反应率无明显影响，7天石斛多糖灌胃和14天灌胃两者也无显著差异。单次和两次注射环磷酰胺后精子顶体反应率都明显下降，后者低于前者，说明环磷酰胺对小鼠顶体反应率存在毒性与剂量效应。使用石斛多糖对环磷酰胺模型小鼠进行7、14天期的灌胃处理后，两组小鼠的精子顶体反应率都发生显著增高，7天环磷酰胺单剂量组与14天环磷酰胺双剂量组的精子顶体反应率分别提高了5.0％与7.2％，证明石斛多糖可以在环磷酰胺生殖损伤模型中有效提高小鼠精子顶体反应率，防止环磷酰胺对小鼠精子顶体反应率的毒性作用。

(6)小鼠精子存活率检测

取10μL小鼠精子悬液于EP管中，加入10μL 0.15％伊红染液，迅速混匀，取10μL于载玻片上，均匀推片后在光学显微镜下观察200个精子，记录精子的着色状况。精子头部着红色时为死亡精子，精子头部不着色或着浅红色时为活精子(如图13所示)，计数后计算活精子百分率。

表7小鼠精子存活率的变化(7天)

从图7和表7可见，石斛多糖灌胃7、14天对小鼠精子存活率无明显影响。而注射环磷酰胺7、14天后精子存活率都出现极明显的下降，同空白对照组相比，7天环磷酰胺单剂量组与14天环磷酰胺双剂量组分别下降了31％与35.3％，但7天组和14天组之间无明显差异。石斛多糖对环磷酰胺模型小鼠进行7、14天处理后，7天环磷酰胺单剂量组上升了26.4％，14天环磷酰胺双剂量则有20.4％的上升，说明了石斛多糖可以提高环磷酰胺生殖损伤模型小鼠的精子存活率，降低了其生殖毒性作用。

4.试验动物睾丸组织氧化水平指标检测

(1)过氧化氢酶(CAT)酶促反应水平检测

CAT在机体内可以有效分解H₂O₂，而当反应过程中加入醋酸重铬酸钾时，反应会迅速停止，醋酸重铬酸钾与H₂O₂反应会产生铬酸醋酸钾，铬酸醋酸钾在570～610nm会产生吸收峰，此时测定铬酸醋酸钾即可得知剩余H₂O₂的量。

实验试剂：0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)、5％重铬酸钾溶液(用0.01mol/L磷酸盐缓冲液配制)、重铬酸钾-冰醋酸混合液(5％重铬酸钾溶液：冰醋酸＝1:3)、0.2mol/LH₂O₂溶液。

表8CAT水平检测试验方法

注：空白组负责调零，测定时于570nm处进行测定，冷却后3小时内吸光度变化不大，未冷却时吸光度不稳定。

其中，酶促反应K＝(2.3/60)/lg(试剂空白管A值/样品管A值)。

表9睾丸组织CAT酶促反应水平的变化

从图8和表9可见，石斛多糖灌胃处理小鼠，可使其睾丸组织CAT水平有一定增高，但是7、14天无显著差异。而注射环磷酰胺7、14天后，睾丸组织CAT水平均出现明显下降，而且14天环磷酰胺双剂量组CAT水平下降更多，降幅达55.7％，环磷酰胺对睾丸组织CAT水平的抑制作用有剂量效应。对环磷酰胺模型小鼠进行石斛多糖灌胃7、14天后，睾丸组织CAT水平都有了明显上升，但14天组略低于7天组，此结果说明石斛多糖可以有效增加小鼠睾丸组织的抗氧化性，减轻环磷酰胺对小鼠睾丸组织抗氧化酶CAT抑制作用。

(2)谷胱甘肽(GSH)水平检测

GSH采取Beutler改良法进行检测，DTNB可以被巯基还原并最终生成黄色的2-硝基-5-巯基苯甲酸，并在412nm处有最大吸收峰。

实验试剂：5％TCA、0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH8.0、1％柠檬酸钠，1mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)、0.04％DTNB显色液。

表10GSH标准曲线绘制方法(412nm)

注：0～5均为绘制标准曲线所用组。每组混匀后5分钟内在412nm进行比色，0组调零，以GSH的量为x轴，412nm处吸光度为y轴进行绘制，得出回归曲线，并求出回归方程。

表11组织中GSH含量检测

注：测定前先使用空白组进行调零，之后在412nm进行比色，比色后结果代入到GSH标准曲线中，经过计算得出组织中GSH含量。

表12睾丸组织GSH水平的变化

从图9和表12可见，石斛多糖灌胃7、14天后，睾丸组织GSH水平比对照组都有一定升高，灌胃14天后睾丸组织GSH水平上升了17.3％。注射环磷酰胺7、14天后，睾丸组织GSH水平出现极显著的下降，降幅达60％左右；使用石斛多糖对环磷酰胺模型小鼠进行7、14天灌胃处理后，睾丸组织GSH水平有明显恢复，7天环磷酰胺单剂量组与14天环磷酰胺双剂量组分别增加了77.6％与103.8％，但7、14天组之间无显著差异。石斛多糖减轻环磷酰胺对小鼠睾丸组织GSH水平的抑制作用，可以有效提高小鼠睾丸组织抗氧化能力。

(3)谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)水平检测

GPx同样采取DTNB显色法进行检测，谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)可以催化谷胱甘肽(GSH)与过氧化物进行反应，消耗GSH的同时抵抗机体内的氧化反应，GSH上的巯基可以与DTNB进行反应，生成5-硫代,2-硝基苯甲酸阴离子，该阴离子显黄色，在422nm处有最大吸收峰。

实验试剂：0.61mol/L三氯醋酸(TCA)溶液、磷酸盐缓冲液(pH7.0，4℃保存)、1.0mmol/L GSH溶液、1.25mmol/L H₂O₂溶液、0.32mol/L Na₂HPO₄溶液、4mol/L NaOH溶液、0.04％DTNB显色液(用1％柠檬酸钠配制，4℃可保存一个月)。

表13GSH标准曲线绘制(422nm)

注：0～5均为绘制标准曲线所用组。各组混匀后5分钟内进行比色，使用0组进行调零。绘制标准曲线时，以GSH的量为x轴，422nm处吸光度为y轴进行绘制，得出回归曲线，并求出回归方程。

表14睾丸组织GPx水平检测

反应11min后，于422nm进行比色。将422nm GSH标准曲线斜率记为A，组织内GPx活性为：

组织GPx活力(U)＝(非酶管OD-样品管OD)*A*5/3(min)*样品中蛋白量(mg)

表15睾丸组织GPx水平的变化

从图10和表15可见，石斛多糖灌胃7、14天后，睾丸组织GSH水平比对照组都升高。注射环磷酰胺7、14天后，睾丸组织GSH水平出现极显著的下降，7天环磷酰胺单剂量组下降了47.9％，14天环磷酰胺双剂量组的下降了63.7％，14天环磷酰胺双剂量组与7天环磷酰胺单剂量组相比下降了33.4％，说明环磷酰胺对GPx水平的抑制存在明显的剂量效应。使用石斛多糖对环磷酰胺模型小鼠进行7、14天处理后，睾丸组织GSH水平明显恢复，7天环磷酰胺单剂量组与14天环磷酰胺双剂量组分别上升了41.6％与87.5％，而7、14天组之间无显著差异，证明了石斛多糖可以有效减轻环磷酰胺对小鼠睾丸组织GSH水平的抑制作用。

(4)丙二醛(MDA)水平检测

MDA采用比色法进行检测，其显色原理为丙二醛在高温下可以与TBA产生粉红色物质，粉红色物质在532nm下有最大吸收峰。

实验试剂：0.8％的TBA水溶液、10μmol/mL的四乙氧基丙烷水溶液、8.1％SDS溶液、20％醋酸缓冲液(pH 3.5)、正丁醇吡啶混合液(15:1V/V)、双蒸水。

表16 MDA标准曲线绘制以及实验方法

注：0～5均为绘制标准曲线所用组，所有组别离心后取上层液体，于532nm处进行吸光度测定。测定结果中，0号管为空白对照，绘制标准曲线时，以四乙氧基丙烷的量为x轴，532nm处吸光度为y轴进行绘制，得出回归曲线，并求出回归方程，将组织样品吸光度代入回归方程中进行计算，最终得出组织样品的MDA含量。

表17睾丸组织MDA水平的变化

从图11和表17可见，石斛多糖灌胃7、14天后，会导致小鼠睾丸组织MDA水平出现一定程度上升。注射环磷酰胺7、14天后，睾丸组织MDA水平出现极明显的增加，而且14天组明显高于7天组。用石斛多糖对环磷酰胺模型小鼠进行7、14天灌胃处理后，睾丸组织MDA水平发生了显著下降。环磷酰胺单次注射组石斛多糖灌胃后，MDA水平明显低于14天组，说明环磷酰胺处理剂量对MDA的增加有剂量效应。石斛多糖可以有效减少化疗引起的小鼠睾丸组织的氧化自由基的产生、提高其抗氧化能力，减轻环磷酰胺对小鼠睾丸组织毒性损伤。

(5)超氧化物歧化酶(SOD)水平检测

取新鲜睾丸组织，对其进行充分研磨，加入0.9％的生理盐水将其稀释为质量分数10％的组织匀浆，4℃、10000r/min，离心15min，取上清，按南京建成SOD水平检测试剂盒(羟胺法)说明书指示，测定小鼠睾丸组织的SOD水平。其检测原理活性氧的最终氧化产物为亚硝酸盐，亚硝酸盐在对氨基苯磺酸与甲萘胺的作用下显紫红色，550nm处有最大吸收峰。

表18 SOD水平检测

注：a值的确定由百分比抑制率决定，45％～50％为最佳抑制率，进行检测应以此为准。

SOD活力(U/mgprot)＝(对照OD-测定OD)÷对照OD÷50％*反应液总体积(mL)÷取样量(mL)÷待测样本蛋白浓度(mgprot/mL)

表19睾丸SOD水平的变化

从图12和表19可见，石斛多糖灌胃7、14天后，睾丸组织SOD水平有所提高，灌胃14天后，睾丸组织SOD水平上升了17.7％，而灌胃7、14天对SOD水平的提高无明显差异。注射环磷酰胺7、14天后，小鼠睾丸组织SOD水平均出现明显下降，分别下降达45％和55％，14天双剂量注射后，睾丸组织SOD下降远高于7天组，说明环磷酰胺对SOD水平的抑制具有典型的剂量效应。石斛多糖对环磷酰胺模型小鼠进行7、14天期的处理后，睾丸组织SOD水平明显上升，7天环磷酰胺单剂量组与14天环磷酰胺双剂量组分别上升了54％与39.5％，但是14天环磷酰胺两次注射组的SOD水平恢复低于单次注射组。上述结果表明石斛多糖可以降低环磷酰胺对小鼠睾丸组织SOD水平的抑制，有效增加小鼠睾丸组织的抗氧化性。

由此可见，本发明中用石斛多糖处理环磷酰胺导致的生殖损伤模型雄鼠，石斛多糖可以显著提高睾丸组织中的抗氧化酶自身活性(SOD、GPx、GSH、CAT水平)，恢复和维持组织的氧化还原的平衡，降低MDA，清除过量的ROS，降低和减弱ROS对精细胞或睾丸等组织的毒性作用，对癌症患者使用环磷酰胺化疗引起的雄性生殖功能损伤的保护和恢复有显著的作用，具有很好的临床应用价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.石斛多糖在制备预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的药物中的应用，其特征在于：

所述的生殖损伤为男性在使用氮芥类抗癌药物治疗癌症后造成的生殖损伤。

3.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的药物中的应用，其特征在于，所述的预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的表现包括如下方面：

使精子数量明显增加，提高精子质量即增加精子运动性，提高精子存活率、精子顶体反应率、精子核成熟率，明显降低精子畸形率；可以提高睾丸组织中酶促和非酶抗氧化防御能力，使SOD、GPx、GSH、CAT水平明显上升，有效清除活性氧等自由基，明显降低MDA水平，减轻自由基产生和氧化应激对生殖功能的损伤。

4.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的药物中的应用，其特征在于：

所述的氮芥类抗癌药物为脂肪氮芥、芳香氮芥、氨基酸氮芥、甾体氮芥以及杂环氮芥药物或其衍生物。

5.根据权利要求4所述的石斛多糖在制备预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的药物中的应用，其特征在于：

所述的氮芥类抗癌药物为环磷酰胺类药物及其衍生物。

6.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的药物中的应用，其特征在于：

所述的氮芥类抗癌药物化疗包括单独使用所述的氮芥类抗癌药物进行化疗或所述的氮芥类抗癌药物与其他抗癌药物联合用药进行化疗。

7.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的药物中的应用，其特征在于：

所述的预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的药物还包括可接受的辅料；

所述的预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的药物还包含其他起配伍协同作用的有效成分。

8.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的药物中的应用，其特征在于：

所述的预防或治疗氮芥类抗癌药物化疗后癌症患者生殖损伤的药物可以包括片剂、颗粒剂、胶囊、粉剂、滴丸、缓释剂、口服液、注射剂。

9.权利要求1～8任一项所述的石斛多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)铁皮石斛鲜条干燥粉碎后得到铁皮石斛干粉，加入水，水浴加热浸提，得到粗多糖浸提液；

(2)将步骤(1)得到的浸提液冷冻凝固后在冻干机中离心，除去浸提液中的水分，离心后收集产物，用少量水溶解，得到浓缩液；

(3)在步骤(2)中得到的浓缩液中加入无水乙醇，沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀，室温干燥，即得所述的石斛多糖。

10.根据权利要求9所述的石斛多糖的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的铁皮石斛干粉与水的料液比按质量体积比1:30配比；

步骤(1)中所述的水为去离子水、蒸馏水或超纯水；

步骤(1)中所述的水浴的温度为90℃；

步骤(3)中所述的浓缩液的用量按所述的浓缩液与所述的无水乙醇的体积比1:4配比。