CN109985058A - 石斛多糖在制备防治砷中毒致生殖损伤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了石斛多糖在制备预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物中的应用。所述的石斛多糖对砷暴露致雄鼠生殖损伤的治疗效果明显，可以使精子数量、活力显著提高，且精子顶体反应发生率明显提高，精子畸形率显著降低；同时睾丸组织中SOD活性、GPx活性、CAT活性和GSH含量也显著提高，MDA含量也显著下降；且几乎没有毒副作用，对正常生长和生理状态也无任何不良影响。本发明的石斛多糖原料来源广泛，提取纯化方法简单，所制得的石斛多糖含糖量高，适合大规模的生产与推广，在制备预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物和临床应用中具有良好的前景。

Description

石斛多糖在制备防治砷中毒致生殖损伤药物中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及石斛多糖在制备预防和/或治疗砷中毒致 生殖损伤药物中的应用。
背景技术
砷是一种存在于自然界的类金属元素，主要以三氧化二砷(As2O3)、二硫 化二砷(雄黄)、三硫化二砷(雌黄)、硫砷化铁化合物形式存在。对于人类来说， 砷是存在于环境中的有毒物质和致癌物。长期暴露在含砷高的环境中，可以引起 急、慢性砷中毒、致畸、致突变和致癌作用，损伤人体心脏、肝脏、肾脏、皮肤、 生殖系统等多个器官和组织。2003年，世界卫生组织称，全世界有1亿多人面临 高浓度砷暴露的危险。世界卫生组织确定了饮用水中砷的允许含量为10μg/L， 全球约有4100万人因饮用砷含量超过这一标准的地下水而暴露于砷。砷中毒不 仅造成人类全身性伤害，而且对人类生殖器官的毒副作用尤其突出。在动物模型 中的研究发现，砷暴露影响生殖器官的生长，对雄性生殖系统的影响包括损害生育能力、抑制精子发生、睾丸萎缩等生殖损伤。早前报道还表明，砷暴露可导致 精子数量和活力的显著下降，以及精子畸形率的显著升高。但是，砷暴露是否影 响精子顶体反应发生率等功能性参数，进而影响其受精能力，这一方面还没有被 研究。
像所有其他活细胞一样，精子发生、精细胞的生存及其功能需要氧气，正常 生理情况下，天然氧代谢产物-活性氧(ROS)作为重要的细胞信号传导分子对精 子正常功能有重要作用。由于精子膜中不饱和脂肪酸PUFA含量很高，精子是过 量的ROS的来源。此外精子细胞质中的抗氧化酶浓度极低，精子对过量ROS水 平引起的损伤极敏感，不能对环绕精子顶体和精子尾的细胞膜进行保护，并可引 起精子DNA损伤。同时各种精液成分，如生精细胞、精液白细胞也是ROS的来 源，影响精液对生殖功能的保护作用。临床上发现25～40％的男性不育患者的 ROS水平较高。如何清除或者中和精子发生过程中精液中过量的ROS，是预防 和治疗生殖损伤的有效新策略之一，值得深入研究。针对氧化应激对生殖系统损 伤的特殊作用机制，目前鲜见相关预防和治疗的药物研究报道，因此，获得防治 生殖损伤的新药物具有十分重要的应用价值。
砷暴露可引起严重的雄性生殖损伤，导致雄性生殖能力下降，但其机制并不 完全清楚。现有研究表明砷中毒与其引起的氧化应激有关，而氧化应激是由于氧 化与抗氧化状态的不平衡所导致的。砷暴露引起的生殖损伤的主要特征是睾丸谷 胱甘肽(GSH)含量减少与丙二醛(MDA)含量的增加，以及超氧化物歧化酶 (SOD)活性降低。同时，也有报道称抗氧化药物和抗炎症药物可以有效的改善 由砷暴露引起的生殖损伤。但是，直接利用各种天然提取物(产物)来治疗由砷 暴露引起的生殖损伤的报道却少之又少，石斛及其提取物在此领域的研究和应用 还是空白。
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科石斛属植物，具有较强的抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、增强机体免疫力等药理活性，其药用价值与其 最主要的药用成分多糖类有关。有研究报道，水溶性铁皮石斛多糖可以与金属离 子螯合，降低其对机体的损伤。霍山石斛多糖能有效的降低肝脏中MDA的含量， 增高SOD、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性。但是， 目前还没有铁皮石斛多糖用于砷暴露引起的生殖损伤的预防和治疗研究和应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术难以治疗由砷暴露引起的生殖损伤的缺点 与不足，提供石斛多糖在制备预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
石斛多糖在制备预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物中的应用。
所述的生殖损伤为由砷暴露引起的生殖损伤；进一步指男性或雄性的生殖损 伤。
所述的预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物可以使精子数量、活力显著提 高，且精子顶体反应发生率明显提高，精子畸形率显著降低；同时睾丸组织中SOD 活性、GPx活性、CAT活性和GSH含量也显著提高，MDA含量也显著下降。
所述的预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物包括可接受的辅料。
所述的预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物还包含其他起配伍协同作用的 有效成分。
所述的预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物可以为各种剂型，如片剂、颗粒 剂、胶囊、粉剂、滴丸、缓释剂、口服液、注射剂等。
所述的石斛多糖中总多糖含量优选为至少70％；进一步优选为至少79％。
所述的石斛优选为铁皮石斛。
所述的石斛多糖优选通过水提醇沉法获得。
所述的水体醇沉法具体包括如下步骤：
加水溶解石斛粉末，水浴加热浸提，过滤后取滤液；将滤液浓缩后得到浓缩 液，加入乙醇进行醇沉，取沉淀，洗涤干燥后即得所述的石斛多糖。
所述的浓缩优选为通过冷冻干燥进行浓缩。
所述的水浴的温度优选为90℃。
所述的浸提的具体操作优选为浸提至少90min，期间每隔30min搅拌一次。
所述的乙醇优选为浓度为80％(v/v)以上的乙醇；进一步优选为无水乙醇。
所述的乙醇的用量优选按浓缩液与乙醇的体积比为1:4配比。
所述的醇沉的温度优选为4℃；醇沉的时间优选为12h。
所述的洗涤优选采用浓度为80％(v/v)的乙醇洗涤；洗涤的次数优选为2～ 3次。
所述的干燥优选为在40℃下烘干。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1.铁皮石斛多糖可有效的治疗由砷暴露引起的雄性小鼠生殖损伤
本发明发现，与对照相比，除了砷暴露引起雄鼠的精子数量、活力显著下降 外；砷暴露也可以导致精子的顶体反应发生率显著下降，引起精子畸形率显著升 高；同时睾丸组织中MDA含量也显著升高，抗氧化酶SOD活性、GPx活性、 CAT活性和GSH水平的显著下降。但是，给予砷暴露小鼠铁皮石斛多糖灌胃处 理后，不仅小鼠精子数量、活力显著提高，而且精子顶体反应发生率也明显提高， 精子畸形率显著降低；同时睾丸组织中SOD活性、GPx活性、CAT活性和GSH 含量也显著提高，MDA含量也显著下降。这说明铁皮石斛多糖可有效的治疗由 砷暴露引起的雄性小鼠生殖损伤。铁皮石斛对砷引起的生殖损伤的预防和治疗作 用呈现时间效应，即随着石斛多糖处理时间延长，其对砷暴露引起的生殖损失的 预防和治疗效果更明显，砷暴露引起的雄性生殖毒性的保护作用与石斛多糖可以 抑制砷暴露后雄性生殖器官的氧化应激，增加其抗氧化能力有关。
2.铁皮石斛多糖的原料来源广，制备方法简单易行
本发明选用铁皮石斛多糖作为砷暴露致雄性小鼠生殖损伤的治疗药物，其原 材料铁皮石斛种植技术相对成熟，可进行大规模的商业化种植；原材料中目标产 物含量高，提纯方法简单易行，制备铁皮石斛多糖的成本低。铁皮石斛多糖对砷 暴露致雄鼠生殖损伤的治疗效果明显，几乎没有毒副作用；并且铁皮石斛多糖对 雄鼠的正常生长和生理状态也无任何不良影响，所以可以进行大规模的生产和推 广。
附图说明
图1是实施例3中经过不同处理、不同处理时间小鼠精子数量统计分析图。
图2是实施例3中经过不同处理、不同处理时间小鼠精子活力统计分析图。
图3是实施例4中经过不同处理、不同处理时间小鼠精子畸形率统计分析图。
图4是实施例4中经过不同处理、不同处理时间小鼠精子顶体反应发生率统 计分析图。
图5是实施例5中经过不同处理、不同处理时间小鼠睾丸组织中SOD活性 统计分析图。
图6是实施例5中经过不同处理、不同处理时间小鼠睾丸组织中MDA含量 统计分析图。
图7是实施例6中经过不同处理、不同处理时间小鼠睾丸组织中CAT活性 统计分析图。
图8是实施例6中经过不同处理、不同处理时间小鼠睾丸组织中GPx活性统 计分析图。
图9是实施例7中经过不同处理、不同处理时间小鼠睾丸组织中GSH含量 统计分析图。
以上附图中，“*”表示与相同处理时间的对照组相比有显著差异(P<0.05)； “#”表示与相同处理时间的砷暴露组相比有显著差异(P<0.05)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。
实施例1铁皮石斛多糖的提取
1.石斛多糖的提取
称取4g的铁皮石斛粉末(购买于广东省农科院作物研究所)，加入10倍体 积的蒸馏水，充分溶解后，在90℃水浴锅中水浴100min，期间每隔30min搅拌 一次，纱布过滤得到滤液。重复上述过程3次，合并滤液，用冷冻干燥机浓缩后， 加入4倍体积的无水乙醇，4℃醇沉12h后并离心得沉淀，再用80％乙醇清洗沉 淀2～3次，40℃烘干得铁皮石斛粗多糖粉末。
2.多糖含量测定
称取无水葡萄糖100mg，将其置于干燥的100mL容量瓶中，加入蒸馏水溶 解，并使用滴管滴加蒸馏水至刻度，即可得葡萄糖标准溶液。取80％(w/v)苯酚， 加入蒸馏水并将其稀释至终浓度为5％(w/v)，稀释苯酚需要现配现用。取玻璃试 管6支，分别加入20、40、60、80、100、120μL葡萄糖标准溶液，补蒸馏水至 2mL，之后再加入5％(w/v)苯酚1mL，浓硫酸5mL，摇匀后90℃水浴加热15分 钟，在490nm下检测吸光度，绘制标准曲线。
取2mg步骤1制得的铁皮石斛粗多糖粉末置于试管中，补蒸馏水至2mL， 再加入5％(w/v)苯酚1mL，浓硫酸5mL，摇匀后90℃水浴加热15分钟，在490nm 下检测吸光度。用苯酚-硫酸法检测铁皮石斛粗多糖粉末中总多糖含量为79.93％。
实施例2动物实验
1.溶液的配制
(1)As2O3溶液的配制
称取As2O3粉末200mg于50mL烧杯中，加入2mL 2.5mol/L NaOH溶液使 其完全溶解，转移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，摇匀，即得 As2O3溶液。
(2)铁皮石斛多糖溶液的配制
称取625.55mg实施例1制得的铁皮石斛粗多糖粉末于50mL烧杯中，加入 20mL蒸馏水使其完全溶解，转移至50mL容量瓶中，用用蒸馏水定容至50mL， 摇匀，即得10mg/mL的铁皮石斛粗多糖溶液。
(3)HTF溶液(人输卵管培养液)的配制
按照表1的配方配制HTF溶液。
表1 HTF溶液配方
pH值调至7.2～7.4，配好的HTF溶液必须在37℃、5％CO2培养箱中进行 平衡，之后用0.22μm的滤器进行过滤，4℃保存最多2周。
2.动物实验
从广东省实验动物中心购买5周龄、健康雄性昆明小鼠，体重25±2g，适应 饲养1周后开始实验。
(1)对照组(Control组)
从第1天(D0)开始，每天灌胃蒸馏水，在D7、D14、D24、D42天处死小鼠。
(2)铁皮石斛多糖组(DOP组)
从第1天(D0)开始，每天灌胃200mg/kg的铁皮石斛多糖溶液，在D7、 D14、D24、D42天处死小鼠。
(3)砷暴露组(As组)
从第1天(D0)开始，每天灌胃10mg/kg的As2O3溶液，持续7天；从第8 (D7)天开始，每天灌胃蒸馏水；在D7、D14、D24、D42处死小鼠。
(4)砷+铁皮石斛多糖组(As+DOP组)
从第1天(D0)开始，每天上午灌胃200mg/kg的铁皮石斛多糖溶液，下午 灌胃10mg/kg的As2O3溶液；从第8(D7)天开始，每天只灌胃200mg/kg的铁 皮石斛多糖溶液；在D7、D14、D24、D42天处死小鼠。
每组5只小鼠，重复2次。各组小鼠按照国家实验动物饲养标准进行饲养， 室温22～24℃，室内湿度40％～70％，光照时间为12h/d。各组小鼠自由采食。 所有的动物实验都是在实验动物伦理委员会拟定的原则下进行的。所有小鼠最后 一次给药24h后，经颈椎脱臼处死。
实施例3小鼠精子数量和活力的检测
1.精子数量的检测
实验周期结束后，颈椎脱臼处死雄鼠，解剖并迅速剪取附睾尾，制成精子悬 液，取10μL精子悬液吸入红细胞计数板中，按红细胞计数法，计数5个小方格 内精子数，计算出每毫升精子悬液中的精子数量。
表2 DOP对小鼠精子数量的影响(单位：×106个/mL)
数据为n＝10。“*”表示与相同处理时间的空白对照组相比有显著差异(P<0.05)；“#” 表示与相同处理时间的砷暴露组相比有显著差异(P<0.05)。
结果如表2和图1所示，与同时期对照小鼠相比，DOP单独处理小鼠的精子 数量无明显变化(P＞0.05)，而砷暴露小鼠的精子数量却显著下降(P<0.05)； 但是，与同时期砷暴露组相比，DOP和砷联合处理小鼠的精子数量得到显著提高 (P<0.05)，却依然未恢复到正常水平。
结果表明，DOP单独处理不会对小鼠精子数量造成影响，而砷暴露7天会导 致小鼠精子数量极显著减少。砷暴露结束后，随着自然恢复时间的增长，小鼠精 子数量会有一定的增加，但是依然远远低于正常小鼠的精子数量。在砷暴露的基 础上给予DOP处理后发现，DOP可有效的提高由砷暴露引起的精子数量的降低， 并且随着DOP处理时间越长，小鼠精子数量的增加越明显，并且远高于砷暴露 小鼠自然恢复时的精子数量，对生殖损伤后小鼠精子数量增加有明显的促进作 用。
2.精子活力的检测
精子悬液在37℃、5％CO2培养箱内孵育5min后，取8μL精子悬液滴在载 玻片上，轻轻盖上盖玻片，在光学显微镜下观察运动。依据谷翊群等(谷翊群,陈 振文,卢文红,等.世界卫生组织人类精液检查与处理实验手册(第五版)[M]. 北京：人民卫生出版社,2011.)报道的方法将精子活力分为三级：向前运动(PR)： 精子主动地呈直线运动或在较大的范围内运动(不考虑运动速度)；非向前运动 (NP)：精子非向前运动，如精子在较小的范围内运动，精子尾部动力几乎不能 使头部移动或仅有尾部在摆动；完全不动型(IM)：精子完全不动。根据如下公 式计算出精子活力：
表3 DOP对小鼠精子活力的影响(单位：％)
数据为n＝10。“*”表示与相同处理时间的空白对照组相比有显著差异(P<0.05)；“#” 表示与相同处理时间的砷暴露组相比有显著差异(P<0.05)。
结果如图2和表3所示，与同时期对照小鼠相比，DOP单独处理小鼠的精子 活力无显著变化(P＞0.05)，而砷暴露小鼠的精子活力却显著下降(P<0.05)。 但是，与同时期砷暴露小鼠相比，砷和DOP联合处理小鼠的精子活力得到显著 提高(P<0.05)，却依然没有恢复到正常水平。
这一结果表明，DOP单独处理不会对小鼠精子活力造成影响；而砷暴露7 天后会导致小鼠精子活力显著下降，砷暴露停止后，随着自然恢复时间的增长， 小鼠精子活力有所增加，但是却依然远远低于正常水平；在砷暴露的基础上给予 DOP处理后发现，DOP可以有效的提高砷暴露小鼠精子活力，并且具有时间效 应，随着DOP处理时间的增长，小鼠精子活力也逐渐增加，其数值越来越接近 正常值，几乎完全恢复到正常水平。
实施例4小鼠精子畸形率和顶体反应发生率的检测
1.精子畸形率的检测
颈椎脱臼处死雄鼠，解剖并迅速剪取附睾尾制成精子悬液，将精子悬液放置 于37℃、5％CO2培养箱内孵育5min。取80μL孵育后的的精子悬液加入EP管 中，再加入20uL 1％伊红溶液充分混匀；静置染色15min左右，取50μL精子 染色混匀液于洁净载玻片上均匀推片，常温自然干燥后，用中性树胶进行封片； 于显微镜下随机观察200个着色精子的形态，计算200个精子中畸形精子的百分 率。参照黄幸纾等报道(黄幸纾,陈星若.环境化学物致突变、致畸、致癌试验 方法[M].杭州：浙江科学技术出版社,1985.)的分类标准，将精子形态分为正常 形态、无钩、香蕉型、胖头、无定形、双头、双尾、尾折叠等；无尾精子、头部 重叠或精子整个与另一个精子重叠的均不计数。
表4 DOP对小鼠精子畸形率的影响(单位：％)
数据为n＝10。“*”表示与相同处理时间的空白对照组相比有显著差异(P<0.05)；“#” 表示与相同处理时间的砷暴露组相比有显著差异(P<0.05)。
结果如图3和表4所示，与同时期对照小鼠相比，DOP单独处理小鼠精子畸 形率无显著变化(P＞0.05)。然而，与同时期空白对照小鼠相比，砷暴露小鼠 的精子畸形率却显著上升(P<0.05)。但是，与同时期砷暴露小鼠相比，砷和 DOP联合处理小鼠的精子畸形率显著下降(P<0.05)，但是并未恢复到正常水平。
这些数据表明，DOP单独处理不会对小鼠的精子畸形率造成影响；而砷暴露 7天会导致小鼠精子畸形率显著增高，但是砷暴露停止后，随着自然恢复时间的 增长，精子畸形率会有所降低。同时，在砷暴露的基础上给予DOP处理后，DOP 可有效降低由砷暴露引起的精子畸形率的增加，随着DOP处理时间的增长，精 子畸形率的下降越明显，趋向于正常水平。
2.精子顶体反应发生率的检测
参考陆海一等(陆海一,陆金春,胡毓安,王咏梅,黄宇烽.考马斯亮蓝染色 法检测人精子形态和顶体反应[J].中华男科学,2002,3:204-206.)报道的方法并 加以改进，简述如下：取1×106精子稀释至1mL，放入37℃、5％CO2培养箱中 孵育1h使精子获能。获能后在精子稀释液中加入10uL浓度为1mg/mL孕酮溶 液混匀，使稀释液中孕酮最终浓度为10μg/mL，继续放入37℃5％CO2培养箱 中孵育30min，诱导精子发生顶体反应。诱导后，将精子悬液于离心机中离心10 min(2000r/min)，去上清并用HTF溶液洗涤沉淀2次，适量HTF溶液制成精子悬液。取10uL精子液于载玻片上涂片，自然晾干后放入95％乙醇溶液中固定 30min，室温自然凉干。自然晾干后，用考马斯亮蓝G250染液染色15min，流 水冲洗，自然晾干后镜检。计算200个精子中顶体反应发生的百分率。
表5 DOP对小鼠精子顶体反应发生率的影响(单位：％)
数据为n＝10。“*”表示与相同处理时间的空白对照组相比有显著差异(P<0.05)；“#” 表示与相同处理时间的砷暴露组相比有显著差异(P<0.05)。
结果如图4和表5所示，与同时期对照小鼠相比，DOP单独处理小鼠精子顶 体反应发生率无显著变化(P＞0.05)；而砷暴露小鼠的精子顶体反应发生率却 显著下降(P<0.05)。但是，与同时期砷暴露小鼠相比，砷和DOP联合处理小 鼠的精子顶体反应发生率得到显著提高(P<0.05)，却依然没有恢复到正常水平。
这些数据表明，DOP单独处理不会对小鼠精子顶体反应发生率带来不良影 响，但是砷暴露7天却会导致小鼠精子顶体反应发生率显著降低，而砷暴露停止 后，精子顶体反应发生率会随着时间的增长而有所恢复。然而，在砷暴露的基础 上给予DOP处理后发现，DOP可有效恢复砷暴露对小鼠精子顶体反应发生率造 成的负面作用；随着DOP处理时间的增长，精子顶体反应发生率的增加越明显， 逐步趋向于正常水平。
实施例5小鼠睾丸组织中SOD活性和MDA含量的检测
1.SOD活性的检测
采用SOD检测试剂盒(购自Sigma)进行SOD活性检测，WST-1即2-(4- 碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯基)-2氢-四唑盐，二钠盐，可以和 黄嘌呤氧化酶催化产生的O2 ·-反应，生成水溶性的甲囋染料，而该反应可以被SOD 抑制，故可以通过对WST-1产物的比色分析计算SOD的酶活性。具体操作按表 6进行。
表6 SOD活性测定步骤(单位：mL)
混匀试剂，37℃孵育20min，450nm处检测吸光度。
表7 DOP对SOD活性的影响(单位：U/mg prot)
数据为n＝10。“*”表示与相同处理时间的空白对照组相比有显著差异(P<0.05)；“#” 表示与相同处理时间的砷暴露组相比有显著差异(P<0.05)。
结果如图5和表7所示，与同时期对照小鼠相比，DOP单独处理小鼠睾丸组 织中的SOD活性无显著变化(P＞0.05)；而砷暴露小鼠睾丸组织中的SOD活 性却显著降低(P<0.05)。与同时期砷暴露小鼠相比，砷和DOP联合处理后小 鼠睾丸组织中的SOD活性得到显著提高(P<0.05)，但依然未恢复到正常水平。
这些数据表明，DOP单独处理不会对小鼠睾丸组织中的SOD活性造成不利 影响；但是砷暴露7天却会导致小鼠睾丸组织中的SOD活性显著降低，在砷暴 露停止后，随着自然恢复时间的增加，SOD活性也会有所增加，但是却依然远远 低于正常水平。而对砷暴露小鼠给予DOP进行治疗后发现，DOP可有效增加由 砷暴露引起的睾丸组织中SOD活性的降低；并且随着DOP处理时间的增长，SOD 活性增加越明显，越趋向于正常值。
2.MDA含量的检测
过氧化脂质物降解产物中的MDA在高温下可与硫代巴比妥酸(TBA)反应 生成粉红色物质，该物质在532nm处有最大吸收峰，可用分光光度法进行定量 检测。具体步骤如表8所示。
表8 MDA含量的检测步骤(单位：mL)
离心后取各试管的上层液体在532nm处检测吸光度，并以管1为空白对照。 以四乙氧基丙烷含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方 程。将样品管的吸光度代入回归方程，求得样品中的MDA含量。
表9 DOP对MDA含量的影响(单位：nmol/mg prot)
数据为n＝10。“*”表示与相同处理时间的空白对照组相比有显著差异(P<0.05)；“#” 表示与相同处理时间的砷暴露组相比有显著差异(P<0.05)。
结果如图6和表9所示，与同时期对照小鼠相比，DOP单独处理小鼠睾丸组 织中MDA含量无显著变化(P＞0.05)；而As组小鼠睾丸组织中MDA含量却 显著增加(P<0.05)。但是，与同时期砷暴露小鼠相比，砷和DOP联合处理小 鼠睾丸组织中的MDA含量显著减少(P<0.05)，却依然未恢复到正常水平。
这些数据表明，DOP单独处理不会对小鼠睾丸组织中的MDA含量造成影响； 但是，砷暴露7天会导致小鼠睾丸组织中的MDA含量显著增加，当砷暴露停止 后，随着自然恢复时间的增长，MDA含量也有所减少，但依然远远低于正常水 平。当砷和DOP联合处理小鼠时，DOP可有效减少由砷暴露引起的睾丸组织中 MDA含量的增加；并且随着DOP处理时间的增长，MDA含量会越来越低，越 来越接近正常值。
实施例6睾丸组织中CAT活性和GPx活性的检测
1.CAT活性的检测
CAT分解H2O2的反应可通过加入醋酸重铬酸钾而迅速终止，剩余的H2O2与醋酸重铬酸钾在加热情况下反应生成铬酸醋酸钾，在波长570～610nm处进行 比色测定，测定重铬酸钾的生成量，即可计算参与反应的H2O2的量。因CAT分 解H2O2的过程遵循一级反应规律，所以可以通过计算K值来确定CAT活性。具 体操作步骤如表10所示。
表10 CAT活性检测步骤(单位：mL)
以样品空白管为空白对照，在570nm处测定吸光度。冷却后的反应液在3h 内吸光度变化不大，但为冷却至室温前吸光度不稳定。
表11 DOP对CAT活性的影响(单位：K/g prot)
数据为n＝10。“*”表示与相同处理时间的空白对照组相比有显著差异(P<0.05)；“#” 表示与相同处理时间的砷暴露组相比有显著差异(P<0.05)。
结果如图7和表11所示，与同时期对照小鼠相比，DOP单独处理小鼠睾丸 组织中的CAT活性无显著变化(P＞0.05)；而As组小鼠睾丸组织中CAT活性 却显著降低(P<0.05)。但是，与同时期砷暴露小鼠相比，砷和DOP联合处理 的小鼠睾丸组织中的CAT活性得到显著提高(P<0.05)。
这些数据表明，DOP单独处理不会影响小鼠睾丸组织中的CAT活性；而砷 暴露会导致小鼠睾丸组织中的CAT活性显著降低，砷暴露停止后，CAT活性会 随着自然恢复时间的增长有所提高，但却依然远远低于正常水平。对砷暴露小鼠 给予DOP处理后发现，DOP可有效提高由砷暴露小鼠睾丸组织中CAT活性的降 低；DOP处理时间越长，CAT活性越高，越接近正常水平。
2.GPx活性的检测
Se-GPx可催化以GSH为还原剂的过氧化物还原反应，而GSH可与5,5’-二 硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应生成黄色的5-硫代-2-硝基苯甲酸阴离子， 通过计算该离子的浓度即可计算出GSH的减少量，进而求得GPx活性。
(1)GSH标准曲线的测定按表12进行。
表12 GSH标准曲线的绘制步骤(单位：mL)
在422nm处检测各管的吸光度，以管1为空白对照。以GSH的浓度为横坐 标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程。
(2)GPx活性检测步骤见表13。
表13 GPx活性检测步骤(单位：mL)
反应11min后，于422nm处检测吸光度。
表14 DOP对GPx活性的影响(单位：U/mg prot)
数据为n＝10。“*”表示与相同处理时间的空白对照组相比有显著差异(P<0.05)；“#” 表示与相同处理时间的砷暴露组相比有显著差异(P<0.05)。
结果如图8和表14所示，与同时期对照小鼠相比，DOP单独处理小鼠睾丸 组织中GPx活性无明显变化(P＞0.05)；而砷暴露小鼠睾丸组织中GPx活性却 显著降低(P<0.05)。但是，与同时期砷暴露小鼠相比，砷和DOP联合处理小 鼠睾丸组织中GPx活性得到显著提高(P<0.05)，却依然没有恢复到正常水平。
结果实验表明，DOP单独处理不会引起小鼠睾丸组织中GPx活性的显著变 化；而砷暴露7天却会导致小鼠睾丸组织中GPx活性显著降低，砷暴露停止后， 随着自然恢复时间的增长，GPx活性会有所提高，但是依然远远低于正常水平。 在砷暴露的基础上给予DOP处理后发现，DOP可有效提高由砷暴露小鼠睾丸组 织中GPx活性的降低，DOP处理时间越长，GPx活性越高，越接近正常水平。
实施例7睾丸组织中GSH含量的检测
DTNB室温下能被GSH还原，产生等克分子2-硝基-5-巯基苯甲酸。硝基巯 基苯甲酸阴离子呈黄色，在412nm处有吸收峰，故可用此方法来检测GSH。按 表15来绘制GSH标准曲线。
表15 GSH标准曲线的绘制步骤(单位：mL)
将反应液混匀，在412nm处测定各管的吸光度，5min内完成。以管1为空 白对照，以GSH的含量为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线，得回归方 程。
睾丸组织中的GSH含量按表16进行检测。
表16 GSH含量检测(单位：mL)
将反应液混匀，在412nm处测定各管的吸光度，5min内完成。以空白管调 零，将样品管的吸光度代入回归方程，求得睾丸组织中GSH含量。
表17 DOP对GSH含量的影响(单位：μg/mg prot)
数据为n＝10。“*”表示与相同处理时间的空白对照组相比有显著差异(P<0.05)；“#” 表示与相同处理时间的砷暴露组相比有显著差异(P<0.05)。
结果如图9和表17所示，与同时期对照小鼠相比，DOP单独处理小鼠睾丸 组织中GSH含量无明显变化(P＞0.05)；而砷暴露小鼠睾丸组织中GSH含量 显著减少(P<0.05)。但是，与同时期砷暴露小鼠相比，砷和DOP联合处理小 鼠睾丸组织中GSH含量得到显著增加(P<0.05)，却依然未恢复至正常水平。
这些数据表明，DOP单独处理不会对小鼠睾丸组织中GSH含量造成影响； 但是砷暴露7天会引起小鼠睾丸组织中GSH含量显著减少，砷暴露停止后，GSH 含量会随着自然恢复时间的增长而有所增加，数值却依然远远低于正常值。而对 砷暴露小鼠给予DOP处理后发现，DOP可有效增加由砷暴露小鼠睾丸组织中 GSH含量的减少，DOP处理时间越长，GSH含量越高，越接近正常水平。
由此可见，本发明的石斛多糖可有效清除或者中和精子发生过程中精液中过 量的ROS，将ROS引起的生殖毒性作用最小化；并提出了对生殖损伤(尤其是 砷中毒致生殖损伤)进行预防和治疗的有效新策略，具有重要的临床应用前景。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.石斛多糖在制备预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物中的应用，其特征在于：
所述的生殖损伤指男性或雄性的生殖系统损伤。
3.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物中的应用，其特征在于：
所述的预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物可以使精子数量、活力显著提高，且精子顶体反应发生率明显提高，精子畸形率显著降低；同时睾丸组织中SOD活性、GPx活性、CAT活性和GSH含量也显著提高，MDA含量也显著下降。
4.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物中的应用，其特征在于：
所述的预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物包括可接受的辅料。
5.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物中的应用，其特征在于：
所述的预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物还包含其他起配伍协同作用的有效成分。
6.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物中的应用，其特征在于：
所述的预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊、粉剂、滴丸、缓释剂、口服液、注射剂。
7.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物中的应用，其特征在于：
所述的石斛多糖中总多糖含量为至少70％。
8.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物中的应用，其特征在于：
所述的石斛为铁皮石斛。
9.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物中的应用，其特征在于，所述的石斛多糖通过如下制备方法制备得到：
加水溶解石斛粉末，水浴加热浸提，过滤后取滤液；将滤液浓缩后得到浓缩液，加入乙醇进行醇沉，取沉淀，洗涤干燥后即得所述的石斛多糖。
10.根据权利要求9所述的石斛多糖在制备预防和/或治疗砷中毒致生殖损伤药物中的应用，其特征在于：
所述的浓缩为通过冷冻干燥进行浓缩；
所述的水浴的温度为90℃；
所述的浸提的具体操作为浸提至少90min，期间每隔30min搅拌一次；
所述的乙醇为浓度为80％(v/v)以上的乙醇；
所述的乙醇的用量按浓缩液与乙醇的体积比为1:4配比；
所述的醇沉的温度为4℃；醇沉的时间为12h。
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