CN109985059A - 石斛多糖在制备癌症化疗后生殖损伤恢复药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了石斛多糖在制备癌症化疗后生殖损伤恢复药物中的应用。本发明的石斛多糖治疗效果明显，副作用小，可有效减轻铂类抗癌药物对生殖系统造成的损伤，不仅使小鼠精子数量显著回升，精子质量也有所提高，并有效提高小鼠睾丸组织的抗氧化性，在小鼠睾丸组织中，SOD、GPx、GSH、CAT水平明显上升、MDA水平明显下降。本发明的石斛多糖原料来源广泛，提取纯化方法简单，所制得的石斛多糖含糖量高，适合大规模的生产与推广，在制备癌症化疗后生殖损伤恢复药物和临床应用中具有良好的前景。

Description

石斛多糖在制备癌症化疗后生殖损伤恢复药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及石斛多糖在制备癌症化疗后生殖损伤恢复药物中的应用。

背景技术

在现今社会，癌症发病率和死亡率逐年增加。2012年我国癌症确诊人数达到358.62万人，有218.66万人死于各种癌症。2015年，癌症确诊人数上涨到了429.2万，而死亡人数则上升到了284.1万人，并且低龄化的趋势日益突出。我国导致死亡率高发的前十位恶性肿瘤分别是胃癌、肝癌、食管癌、大肠癌、白血病与淋巴癌、宫颈癌、鼻咽癌、乳腺癌，这些癌症对我国人口健康和国民经济发展产生了重大威胁。目前的癌症治疗主要是手术切除和放化疗治疗，顺铂类化疗药物是临床的首选药物之一，对于多种癌症有着明显的治愈作用。顺铂主要通过在DNA之内或DNA之间产生交联物从而破坏细胞内的DNA，以及诱导机体产生大量的ROS。ROS中的羟基自由基可对胸腺嘧啶的5,6-双键进行加成，形成胸腺嘧啶自由基，自由基从DNA的戊糖夺取了氢原子，使之在C4位置形成具有未配对电子的自由基，此自由基又在β-位置发生链的断裂，而O₂ ^-也能分解以鸟苷酸为代表的核苷酸，达到杀伤肿瘤组织的目的。但是顺铂类化疗药物在治疗过程中组织特异性不强，缺乏选择性，临床使用会损伤癌组织外的多种组织，尤其是会对男性、女性生殖系统的功能性造成损伤。对于男性而言，环境、生理和遗传因素变化都会影响精子生殖功能。像所有其他活细胞一样，精子发生、精细胞的生存需要氧气，正常生理情况下，天然氧代谢产物-活性氧(ROS)作为重要的细胞信号传导分子对精子的正常功能有重要作用，然而氧化还原反应不平衡所导致的氧化应激反应也会产生过量的ROS，对精子质量和功能具有潜在的毒性作用。由于精子膜不饱和脂肪酸PUFA含量很高，精子是过量ROS的来源，而其细胞质中的抗氧化酶浓度极低，不能对环绕精子顶体和精子尾的细胞膜进行保护。精子对过量ROS水平引起的损伤极敏感，可引起精子DNA损伤。并且各种精液成分，如生精细胞、精液白细胞也是ROS的来源，也会影响精液对生殖功能的保护作用，可导致肿瘤和不育。临床上发现25～40％的男性不育患者的ROS水平较高，说明ROS水平的异常增高是导致男性不育的重要因素。由于癌症患者的低龄化，处于生育期的男女性有强烈的生育需求，而化疗药物对生殖器官的伤害又很突出，临床上必须要防止其化疗引起的生殖功能受损。顺铂类化疗药物用于男性患者后，由于顺铂类药物在人体内代谢，也会诱导产生大量的ROS，包括在生殖器官产生过量ROS，有可能在精子数量减少甚至是无精子、精子功能障碍等多方面的导致生殖损伤发生，影响了男性的生育能力，导致生殖功能低下甚至不孕不育。因此，在使用顺铂类化疗药物进行癌症的治疗时，保护男性的生殖功能不受损伤，及促进癌后受损功能恢复有广泛的临床需求。

癌症治疗和癌后康复过程中，应提高其机体免疫力，同时进行生殖系统的损伤修复，除了建议和要求患者补充蛋白质等膳食营养成分，也可以采用药物或保健品来增强免疫力并加快癌症康复。但是在药物中，尤其是一些化学合成药物本身也有一定的毒副作用，而人体在癌症治疗和康复过程中机体本身免疫力和整体生理功能低下，此时使用化学合成药物更容易加剧机体损伤，并不利于癌症的治疗和康复。而白蛋白、丙种球蛋白和细胞因子等免疫调节剂虽然效果比较好，但是白蛋白等来源于血液，其来源极有限，高昂的价格限制了此类药品的使用。在癌后康复中可以使用包括动植物来源的天然生物活性物质来增强患者的免疫功能等，以促进癌后康复，天然产物类因其活性物质结构新颖、疗效高、不良反应少等优点，是近年来药物和保健品研发的重要领域和发展方向，可以广泛应用于癌症辅助治疗。

动植物等天然产物类药物在我国有悠久的使用历史，但在天然产物药物中因其药物成分众多，导致具体作用机制不明确，从而成为影响其使用的主要问题，也成为影响其走向世界的主要障碍。此外，天然药物提取、分离和加工有一定困难，步骤繁琐，产量低下，成本高昂，都是天然产物药物在走向市场时所必须面对的问题。以传统中药为主要成分的生精胶囊、五子衍宗丸等是临床上生殖系统恢复的常用药物，然而其作用的机理还完全不清楚。目前国际上的生殖损伤和生殖障碍的治疗与康复研究，主要是采用睾酮等性激素类药物，其使用会带来各种毒副反应。使用天然提取物来进行生殖功能的调控和障碍治疗，没有或毒副作用很小，而且药物来源丰富，因此受到国内外研究的特别关注。天然产物主要以动植物来源居多，其余部分则来源于菌类或者矿物等等，其中，植物性天然产物及常见的动植物食品是研究的热点，如辣木、黄精、番茄、香菇、甲壳质(龟类)、海藻等等，其成分涵盖酚类，萜类，蛋白类，多肽，脂类，糖类等类型，但是由于药物价格、药物提纯难度、药物含量、治疗效果、缺乏毒副作用研究等，一些生殖损伤修复药物只能停留在实验阶段，难以进行产业化应用。

根据目前的研究结果表明，一些植物多糖有多种药用作用，包括抗氧化、抗辐射、免疫调节与抗肿瘤、降血糖血脂等药效，而另外一些植物多糖具有很好的抗病毒、杀菌等生物学活性，说明植物多糖有多种生物活性，是发现新药物的良好来源，也是筛选鉴定先导药物分子的原材料。现有研究发现不同来源的植物多糖的药用作用和作用机理不完全相同，需要对每一种多糖的生物活性和药用功能分别进行研究。兰科植物石斛是我国的珍稀药用植物，中医记载石斛具有明目、降血糖等药效，但是迄今为止对其研究和应用还停留在传统经验水平，其药用成分研究、功能和作用机理研究还很少。近年来不孕不育高发是世界性的问题，中国的不孕不育高发近十年已攀升到西方国家的水平(占生育期人口的20％)，其中癌症放化疗引起的生殖损伤也日益突出，而石斛及其多糖与生殖功能的相互作用关系，及对生殖损伤预防和修复等是否具有作用还几乎是空白。此外对石斛及其组分癌症放化疗引起的生殖功能损伤的预防和治疗也缺少研究报道。

发明内容

本发明的目的在预防癌症患者放化疗引起的生殖功能损伤及其康复，克服现有技术难以预防和治疗癌症放化疗所致的生殖功能损伤的的缺点与不足，提供石斛多糖在制备癌症化疗后生殖损伤预防和恢复药物中的应用。本发明基于石斛多糖其对雄性生殖功能损伤的作用和机制的研究成果，首次将石斛多糖用于预防和治疗放化疗导致的男性生殖损伤，效果显著，在临床上具有很好的应用前景。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

石斛多糖在制备预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物中的应用。

所述的癌症化疗为使用化疗药物治疗癌症。

所述的生殖损伤为男性在使用化疗药物治疗癌症后造成的生殖损伤。

所述的预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的表现包括如下方面：精子数量明显增加，提高精子质量即增加精子运动性、提高精子存活率、精子顶体反应率增加、精子核成熟率增加，也明显促使精子畸形率下降；可以提高睾丸组织中酶促和非酶抗氧化防御能力，促使SOD、GPx、GSH、CAT水平明显上升，可以有效清除活性氧等自由基，明显降低MDA水平，减轻自由基产生和氧化应激对生殖功能的损失。

所述的化疗药物优选为铂类抗癌药物。

所述的铂类抗癌药物包括顺铂、卡铂、奈达铂、环铂、奥沙利铂、洛铂、乐铂、舒铂、赛特铂、奥马铂、异丙铂或庚铂等铂类化合物或铂类化合物的配合物。

所述的使用化疗药物治疗癌症包括单独使用所述的铂类抗癌药物进行化疗或所述的铂类抗癌药物与其他抗癌药物联合用药进行化疗。

所述的预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物包括可接受的辅料。

所述的预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物还包含其他起配伍协同作用的有效成分。

所述的预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物可以为各种剂型，如片剂、颗粒剂、胶囊、粉剂、滴丸、缓释剂、口服液、注射剂等。

所述的石斛多糖优选为从铁皮石斛中提取得到的石斛多糖。

所述的石斛多糖中多糖含量优选为至少70％；进一步优选为至少79％。

所述的石斛多糖优选通过包括如下步骤的制备方法制备得到：

(1)铁皮石斛鲜条干燥粉碎后得到铁皮石斛干粉，加水，水浴加热浸提，得到粗多糖浸提液；

(2)将步骤(1)得到的浸提液冷冻凝固后在冻干机中离心，除去浸提液中的水分，离心后收集产物，用少量水溶解，得到浓缩液；

(3)在步骤(2)中得到的浓缩液中加入无水乙醇，沉淀；用无水乙醇洗涤沉淀，室温干燥，即得所述的石斛多糖。

步骤(1)中所述的铁皮石斛干粉与水的料液比优选按质量体积比1:30配比。

步骤(1)中所述的水优选为去离子水、蒸馏水或超纯水。

步骤(1)中所述的水浴的温度优选为90℃。

步骤(1)中所述的浸提的次数优选为至少3次，每次浸提的时间优选为120分钟以上，并持续搅拌。

步骤(2)中所述的冷冻凝固的温度优选为-20℃。

步骤(2)中所述的离心的温度优选为-60℃；离心的转速优选为10000r/min，离心的时间优选为6小时。离心的目的是对浸提液中的液体成分进行浓缩。

步骤(3)中所述的浓缩液的用量优选按所述的浓缩液与所述的无水乙醇的体积比1:4配比。

步骤(3)中所述的沉淀的时间优选为24h。

步骤(3)中所述的离心的条件优选为4000g离心10min。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明的石斛多糖可显著减轻铂类药物化疗造成的生殖损伤

本发明研究发现，对雄性小鼠连续注射顺铂建立生殖损伤模型，顺铂注射后的小鼠无论其精子数量还是质量上都出现了明显的下降，表现出典型的毒性反应。而使用石斛多糖灌胃处理后，由顺铂所造成的生殖功能损伤程度得到明显的减轻，精子数量增加、精子质量提高，精子功能得到恢复，石斛多糖使顺铂导致的病理损伤变化也得到明显改善；其对顺铂引起的睾丸组织中的氧化自由基产生增加有明显的抑制作用，MDA水平则有明显下降，抗氧化酶SOD、GPx、GSH、CAT水平有明显上升，由此说明，本发明的石斛多糖能有效增加小鼠睾丸组织的抗氧化能力，减轻顺铂对小鼠睾丸组织的毒理影响，对化疗所致的生殖功能损伤有很好的预防和治疗作用，因此可有效针对因使用顺铂所产生的男性生殖损伤进行恢复的癌症后康复治疗。

2.本发明的原料来源广泛，制备方法简单易行

本研究选用石斛多糖作为生殖损伤治疗药物，其原材料铁皮石斛种植方法成熟、原料容易获得，可便于进行大规模生产；原材料中目标产物的含量丰度高、提取纯化方法简单、便于处理，提取物中多糖产率高，使得石斛多糖的原材料生产成本可以较低；本发明的石斛多糖治疗效果明显，无毒副作用，适合大规模的生产与应用推广。

附图说明

图1是苯酚-硫酸法测定石斛多糖含量的标准曲线结果图。

图2是效果实施例中使用顺铂腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠精子数量变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，e为顺铂组，f为顺铂-石斛多糖组。

图3是效果实施例中使用顺铂腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠精子畸形率变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，e为顺铂组，f为顺铂-石斛多糖组。

图4是效果实施例中使用顺铂腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠精子活力变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，e为顺铂组，f为顺铂-石斛多糖组。

图5是效果实施例中使用顺铂腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天，后小鼠精子核成熟度变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，e为顺铂组，f为顺铂-石斛多糖组。

图6是效果实施例中使用顺铂腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠精子顶体反应率变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，e为顺铂组，f为顺铂-石斛多糖组。

图7是效果实施例中使用顺铂腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠精子存活率变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，e为顺铂组，f为顺铂-石斛多糖组。

图8是效果实施例中使用顺铂腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠睾丸组织CAT水平变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，e为顺铂组，f为顺铂-石斛多糖组。

图9是效果实施例中使用顺铂腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠睾丸组织GSH水平变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，e为顺铂组，f为顺铂-石斛多糖组。

图10是效果实施例中使用顺铂腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠睾丸组织GPx水平变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，e为顺铂组，f为顺铂-石斛多糖组。

图11是效果实施例中使用顺铂腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠睾丸组织MDA水平变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，e为顺铂组，f为顺铂-石斛多糖组。

图12是效果实施例中使用顺铂腹腔注射或石斛多糖灌胃处理后7天和14天后，小鼠睾丸组织SOD水平变化统计分析图；其中，左图为处理7天，右图为处理14天；a为空白对照组，b为石斛多糖组，e为顺铂组，f为顺铂-石斛多糖组。

以上附图中，其中，“*”表示与相同处理时间的空白对照组相比有显著差异(P<0.05)，“**”表示与相同处理时间的空白对照组相比有极显著差异(P<0.01)，“#”表示与相同处理时间的顺铂组相比有显著差异(P<0.05)，“##”表示与相同处理时间的顺铂组相比有极显著差异(P<0.01)。

图13是效果实施例的小鼠精子畸形率监测中，小鼠精子(正常精子和畸形精子)经伊红染液染色后的光学显微镜照片示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1石斛多糖的提取与检测

1.石斛多糖的提取

取铁皮石斛(铁皮石斛种植于广东省农业科学院作物所实验基地，经过品种鉴定为铁皮石斛，鲜条取样后烘干、粉碎得到铁皮石斛干粉)4g，按照1:30(m/V)的料液比加入蒸馏水，充分溶解后，90℃水浴浸提三次，每次120分钟，将浸提液分装至7mL离心管中，在-20℃冰箱中冷冻凝固后在冻干机中以

10000r/min离心6小时，对管中液体成分进行浓缩以浓缩提取液。将浓缩后产物使用1～2mL蒸馏水溶解并收集，之后加入4倍体积的无水乙醇，沉淀24h，4000g离心10min，去上清，取沉淀，沉淀以无水乙醇洗涤两次，室温干燥后得到1.74g石斛多糖粉末。

2.石斛多糖的检测

(1)检测所需溶液的配制

称取无水葡萄糖100mg，将其置于干燥的100mL容量瓶中，加入蒸馏水溶解，并使用滴管滴加蒸馏水至刻度，即可得葡萄糖标准溶液。取80％(w/v)苯酚，加入蒸馏水并将其稀释至终浓度为5％(w/v)，稀释苯酚需要现配现用。

(2)苯酚-硫酸法绘制标准曲线

取玻璃试管6支，分别加入20、40、60、80、100、120μL葡萄糖标准溶液，补蒸馏水至2mL，之后再加入5％(w/v)苯酚1mL，浓硫酸5mL，摇匀后90℃水浴加热15分钟，在490nm下检测吸光度。标准曲线图如图1所示。

(3)石斛多糖提取物中多糖含量的测定

取2mg本实施例制得的石斛多糖粉末置于试管中，补蒸馏水至2mL，再加入5％(w/v)苯酚1mL，浓硫酸5mL，摇匀后90℃水浴加热15分钟，在490nm下检测吸光度。

经计算，本实施例制得的石斛多糖粉末中多糖含量为79.26％。

实施例2模型小鼠的精子与睾丸相关参数的变化

顺铂注射液为江苏豪森药业股份有限公司生产，规格：6mL：30mg，国药准字：H20040813。

1.溶液的配制

(1)石斛多糖溶液的配制：取实施例1制得的石斛多糖粉末，将其溶解于蒸馏水中，配置成100mg/mL的石斛多糖溶液。

(2)HTF液(人输卵管培养液)的配制

按表1的配方配制得到HTF液。

表1HTF液配方

2.动物试验

(1)空白对照组(实验第0天起，腹腔注射生理盐水，次日(24小时后)每日灌胃生理盐水，连续灌胃7天或14天。)

(2)石斛多糖组(实验第0天起，腹腔注射生理盐水，次日(24小时后)每日灌胃石斛多糖，连续灌胃7天或14天。)

(3)顺铂组(本实验中顺铂仅进行单次注射，实验第0天腹腔单次注射12.5mg/kg顺铂，次日(24小时后)每日灌胃生理盐水，连续灌胃7天或14天。)

(4)顺铂-石斛多糖组(使用上述顺铂注射液进行腹腔注射，本实验中顺铂仅进行单次注射，顺铂注射方式为实验第0天腹腔单次注射12.5mg/kg，建立顺铂损伤模型。第一次注射后24小时即连续给小鼠灌胃200mg/kg石斛多糖溶液7天或14天。)

实验动物：每组使用六周龄雄性昆明小鼠6只，重复2次。

3.小鼠精子数量和功能检测

(1)小鼠精子数量检测

取小鼠附睾尾，置于放有1mL 0.9％生理盐水的35mm培养皿中，在解剖镜下用细针挑破曲细精管，并将精子挤出，之后将附睾尾丢弃。将培养皿置于37℃，5％CO₂的培养箱中，孵育5min，取2μL精子悬液，加入0.9％生理盐水将其稀释至10μL，取5μL于血球计数板中，静置5min，之后进行精子计数。

表2小鼠精子数量的变化

其中，“*”表示与相同处理时间的空白对照组相比有显著差异(P<0.05)，“**”表示与相同处理时间的空白对照组相比有极显著差异(P<0.01)，“#”表示与相同处理时间的顺铂组相比有显著差异(P<0.05)，“##”表示与相同处理时间的顺铂组相比有极显著差异(P<0.01)；下同。

实验结果发现，与空白对照(生理盐水)相比，石斛多糖灌胃7、14天对小鼠精子数量并无显著影响。而顺铂处理导致的生殖损伤模型小鼠的精子数量均出现极显著下降，注射后14天后较7天后有一定增加，说明随着时间的延长，机体对低剂量的顺铂注射所致的小鼠精子数量下降有轻微的自然恢复作用，但是依然远远低于正常小鼠的精子数量。使用石斛多糖对顺铂模型小鼠进行灌胃处理7天或14天后，小鼠精子数量都显著回升，其中灌胃7天后精子数量比未灌胃石斛多糖的顺铂7天处理小鼠精子高136.9％，灌胃14天后精子数量比未灌胃石斛多糖的顺铂14天处理小鼠精子高162.7％，表明石斛多糖7天即可有效治疗顺铂所致的小鼠精子数量的毒性作用，而且灌胃14天较7天精子数量高34.4％，石斛多糖对顺铂化疗所致的小鼠精子数量下降的恢复作用具有典型的时间效应(图2和表2)。

(2)小鼠精子畸形率监测

将培养皿置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行孵育，取80μL已孵育5min的精子于EP管中，加入20μL 1％伊红染液，混匀，静置15min，之后取50μL在洁净的载玻片上均匀涂片，待其风干后，用中性树脂封片，之后在光学显微镜下观察500个精子的形态，记录畸形精子的数量并计算精子的畸形百分率。计算精子畸形时，有头无尾，有尾无头，与其他精子重叠的精子以及与碎片重叠的精子均不计入(如图13所示)。

表3小鼠精子畸形率的变化

实验结果发现，与空白对照(生理盐水)相比，石斛多糖灌胃7、14天对小鼠精子畸形率无明显影响。在顺铂生殖损伤模型中，顺铂注射后7天或14天小鼠精子畸形率均上升了4.7倍和4.54倍，但是注射顺铂7天与14天的差异不明显，不能发生自然恢复；使用石斛多糖对顺铂模型小鼠进行处理后，7天与14天组的精子畸形率均出现明显下降，其中灌胃石斛多糖7天比未灌胃石斛多糖的顺铂7天处理小鼠精子畸形率下降近30％，灌胃石斛多糖14天的小鼠精子畸形率只有未灌胃石斛多糖的顺铂14天处理小鼠精子畸形率的50％，灌胃石斛多糖7天即可有效降低因使用顺铂所导致的小鼠精子畸形发生，降低精子畸形率的效果具有明显的时间效应，灌胃14天对精子畸形率(降低了50％)的降低效果好于7天灌胃(降低了30％)(图3和表3)。

(3)小鼠精子活力检测

小鼠以脱颈椎法处死后，迅速取其附睾尾，置于盛有1mL 0.9％生理盐水的35mm培养皿中，将其置于解剖显微镜下，使用解剖针将附睾尾中的曲细精管扎破，使用小镊子对扎破后的附睾尾进行挤压，使精子流出，当大部分精子流出附睾尾后，将附睾尾去除。精子悬液置于37℃，5％CO₂的培养箱内孵育5min。

取上述精子悬液10μL于血球计数板中，在光学显微镜下观察200个精子，精子分级标准参照《世界卫生组织人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》。精子标准可以被分为4级：1级：精子活动性良好，运动时呈快速直线运动；2级：精子运动性一般，运动时做直线或非直线运动；3级：精子运动能力差，呈徘徊状或转圈运动，几乎无前进性；4级：精子没有运动能力。精子活力计算依照以下公式：精子活力(％)＝(1级+2级+3级)/(1级+2级+3级+4级)*100％。

表4小鼠精子活力的变化

石斛多糖灌胃7、14天对小鼠精子活力无明显影响。注射顺铂7天或14天后，小鼠精子活力均仅有正常组的三分之二，但注射顺铂7天与14天后两者无显著差异；而使用石斛多糖对顺铂模型小鼠灌胃7天或14天后，精子活力均明显回升，其中灌胃石斛多糖7天后，小鼠精子活力上升了16％，灌胃14天后则有19％的上升，灌胃14天较7天精子活力高7％，石斛多糖对顺铂生殖损伤模型小鼠的精子活力有明显恢复作用，并且其恢复作用具有时间效应(图4和表4)。

(4)小鼠精子核成熟度检测

取小鼠附睾尾，置于2mL HTF液中，HTF需要在实验前一天置于35mm培养皿中孵育过夜。取下附睾尾后在解剖显微镜下用针头挑破曲细精管，将精子挤出，之后将附睾尾丢弃。培养皿放置于培养箱中孵育5min，取孵育后的精子悬液于血球计数板上计数，并根据计数结果将精子悬液稀释至1×10⁶个精子/mL。取10μL稀释后的精子在载玻片上均匀涂片，风干后于3％戊二醛固定液中固定30min，双蒸水冲洗载玻片，待其风干后，使用5％苯胺蓝染液对其进行染色，染色时间5min，流水冲洗载玻片后风干，之后用中性树胶进行封片，在油镜下观察200个精子头部，计算头部不着蓝色或者着淡蓝色精子的百分率。有头无尾或有尾无头，与其他精子或者碎片重叠的精子不进行计数。

表5小鼠精子核成熟度的变化

石斛多糖灌胃7天、14天对小鼠精子核成熟度无明显变化。在顺铂生殖损伤模型中，精子核成熟度均出现极显著的下降，与空白对照组相比，注射顺铂7天与14天分别导致核成熟度下降15.5％与11.6％，其自然恢复能力很低；而使用石斛多糖对顺铂生殖损伤模型小鼠进行7天或14天的处理后，精子核成熟度分别上升5％与7％，石斛多糖可以使顺铂生殖损伤模型小鼠的精子核成熟度有效增加，减轻顺铂对小鼠精子核成熟的损伤(图5和表5)。

(5)小鼠精子顶体反应检测

取小鼠附睾尾于盛有2mL HTF液的35mm培养皿中，解剖显微镜下用针头挑破曲细精管，将精子挤出，丢弃附睾尾。取精子悬液在细胞计数板上进行计数，根据计数结果将精子密度稀释至1×10⁶个精子/mL，之后取1mL稀释后的精子置于37℃，5％CO₂的培养箱中，孵育1h使精子获能，获能后加入10μL 1mg/mL的孕酮溶液，混匀，继续放入培养箱中孵育30min，用以诱导精子发生顶体反应。30min后，将精子悬液放入离心机中，2000r/min 10min离心，离心产物去上清，再用HTF液洗涤两次，之后加入HTF液制成精子悬液，取其中10μL于载玻片上均匀涂片，风干，将载玻片放入95％乙醇溶液中进行固定，固定时间30min，固定后自然晾干。之后放入考马斯亮蓝R-250中进行15min染色，染色后流水冲洗载玻片，最后晾干，于光学显微镜下观察500个精子，精子头部染深蓝色的精子为未发生顶体反应的精子，染浅蓝色的精子为发生顶体反应的精子，记录发生顶体反应的精子数量，计算顶体反应率。

表6小鼠精子顶体反应率的变化

石斛多糖灌胃7、14天对小鼠精子顶体反应率无明显影响。在顺铂生殖损伤模型中，精子顶体反应率均出现明显下降，同空白对照组相比，注射顺铂7天和14天后小鼠精子顶体反应率分别下降了16.7％与12.8％，有轻微的自然恢复。使用石斛多糖对顺铂模型小鼠进行7天或14天的处理后，精子顶体反应率与相同处理时间的顺铂组相比均有6％～7％的提高。证明石斛多糖可以在顺铂生殖损伤模型中有效提高小鼠精子顶体反应率，减轻顺铂对小鼠精子顶体反应的损伤(图6和表6)。

(6)小鼠精子存活率检测

取10μL小鼠精子悬液于EP管中，加入10μL 0.15％伊红染液，迅速混匀，取10μL于载玻片上，均匀推片后在光学显微镜下观察200个精子，记录精子的着色状况。精子头部着红色时为死亡精子，精子头部不着色或着浅红色时为活精子，计数后计算活精子百分率。

表7小鼠精子存活率的变化(7天)

从图7和表7可见，石斛多糖灌胃7天或14天后，小鼠精子存活率无显著变化。同空白对照组相比，注射顺铂7天或14天后的精子存活率均下降近四成，且注射顺铂7天与14天的差异不显著。使用石斛多糖对顺铂模型小鼠进行7天或14天的处理后，精子存活率均有明显提高，灌胃石斛多糖7天后的精子存活率比未灌胃石斛多糖的顺铂7天处理小鼠精子存活率高19.5％，且石斛多糖灌胃14天较7天精子存活率高11.9％，证明石斛多糖可以在顺铂生殖损伤模型中有效提升小鼠精子存活率。灌胃14天后的精子存活率比未灌胃石斛多糖的顺铂14天处理小鼠精子存活率高28.4％，且对精子存活率的提高具有明显的时间效应。

4.试验动物睾丸组织氧化水平指标检测

本发明研究发现，正常小鼠灌胃石斛多糖也会使睾丸组织SOD、GPx、GSH、CAT水平有一定上升，证明石斛多糖灌胃增加了睾丸组织的抗氧化能力。在顺铂生殖损伤模型中，石斛多糖灌胃后睾丸组织SOD、GPx、GSH、CAT水平与顺铂处理的小鼠相比有明显上升，同时使MDA发生显著下降，证明石斛多糖可以通过提高抗氧化酶水平和减少MDA自由基的产生两种方式增强其抗氧化能力、有效减轻顺铂造成的睾丸组织的氧化损伤。

(1)过氧化氢酶(CAT)酶促反应水平检测

CAT在机体内可以有效分解H₂O₂，而当反应过程中加入醋酸重铬酸钾时，反应会迅速停止，醋酸重铬酸钾与H₂O₂反应会产生铬酸醋酸钾，铬酸醋酸钾在570～610nm会产生吸收峰，此时测定铬酸醋酸钾即可得知剩余H₂O₂的量。

实验试剂：0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)、5％重铬酸钾溶液(用0.01mol/L磷酸盐缓冲液配制)、重铬酸钾-冰醋酸混合液(5％重铬酸钾溶液：冰醋酸＝1:3)、0.2mol/L H₂O₂溶液。

表8CAT水平检测试验方法

注：空白组负责调零，测定时于570nm处进行测定，冷却后3小时内吸光度变化不大，未冷却时吸光度不稳定。

其中，酶促反应K＝(2.3/60)/lg(试剂空白管A值/样品管A值)。

表9睾丸组织CAT酶促反应水平的变化

同空白对照相比，石斛多糖灌胃处理可以使睾丸组织CAT有一定的升高，但无显著差异。在顺铂生殖损伤模型中，顺铂注射后7天或14天后睾丸组织CAT水平下降50％以上，但是7天和14天两者差异不明显。在顺铂生殖损伤模型中使用石斛多糖进行7天或14天的处理后，睾丸组织CAT水平有明显回升，其中灌胃石斛多糖7天后，小鼠睾丸组织CAT水平相较顺铂7天组而言提高了25.3％，灌胃14天后相较于相同处理时间的顺铂组而言则有35.3％的提高，石斛多糖可以有效增加小鼠睾丸组织的抗氧化性，减轻顺铂对小鼠睾丸组织CAT水平的不良影响。石斛多糖14天灌胃组较7天灌胃组提高了11.9％，灌胃石斛多糖对小鼠睾丸组织CAT水平的恢复作用有明显的时间效应(图8和表9)。

(2)谷胱甘肽(GSH)水平检测

GSH采取Beutler改良法进行检测，DTNB可以被巯基还原并最终生成黄色的2-硝基-5-巯基苯甲酸，并在412nm处有最大吸收峰。

实验试剂：5％TCA、0.1mol/L磷酸盐缓冲液，pH8.0、1％柠檬酸钠，1mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)、0.04％DTNB显色液。

表10GSH标准曲线绘制方法(412nm)

注：0～5均为绘制标准曲线所用组。每组混匀后5分钟内在412nm进行比色，0组调零，以GSH的量为x轴，412nm处吸光度为y轴进行绘制，得出回归曲线，并求出回归方程。

表11组织中GSH含量检测

注：测定前先使用空白组进行调零，之后在412nm进行比色，比色后结果代入到GSH标准曲线中，经过计算得出组织中GSH含量。

表12睾丸组织GSH水平的变化

从图9和表12可见，对正常小鼠灌胃石斛多糖可以使正常小鼠睾丸GSH水平有所上升，但是无显著差异。注射顺铂7天或14天后睾丸组织GSH水平下降了约2/3。而使用石斛多糖对顺铂生殖损伤模型小鼠进行7天或14天的处理后，睾丸组织GSH水平相较于相同处理时间的顺铂组而言均有将近一倍的提高，且石斛多糖灌胃14天比石斛多糖灌胃7天而提高了15.9％，说明灌胃石斛多糖对小鼠睾丸组织GSH水平的恢复作用有明显的时间效应，有效减轻顺铂对小鼠睾丸组织GSH水平的损伤。

(3)谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)水平检测

GPx同样采取DTNB显色法进行检测，谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)可以催化谷胱甘肽(GSH)与过氧化物进行反应，消耗GSH的同时抵抗机体内的氧化反应，GSH上的巯基可以与DTNB进行反应，生成5-硫代,2-硝基苯甲酸阴离子，该阴离子显黄色，在422nm处有最大吸收峰。

实验试剂：0.61mol/L三氯醋酸(TCA)溶液、磷酸盐缓冲液(pH7.0，4℃保存)、1.0mmol/L GSH溶液、1.25mmol/L H₂O₂溶液、0.32mol/L Na₂HPO₄溶液、4mol/L NaOH溶液、0.04％DTNB显色液(用1％柠檬酸钠配制，4℃可保存一个月)。

表13GSH标准曲线绘制(422nm)

注：0～5均为绘制标准曲线所用组。各组混匀后5分钟内进行比色，使用0组进行调零。绘制标准曲线时，以GSH的量为x轴，422nm处吸光度为y轴进行绘制，得出回归曲线，并求出回归方程。

表14睾丸组织GPx水平检测

反应11min后，于422nm进行比色。将422nmGSH标准曲线斜率记为A，组织内GPx活性为：

组织GPx活力(U)＝(非酶管OD-样品管OD)*A*5/3(min)*样品中蛋白量(mg)

表15睾丸组织GPx水平的变化

石斛多糖灌胃7、14天会使正常小鼠睾丸组织内的GPx水平有一定升高。在顺铂生殖损伤模型中睾丸组织GPx水平明显下降，其中，顺铂7天组同空白对照组相比下降了70％，顺铂14天组同空白对照组相比下降了55％，机体对低剂量的顺铂注射所致的GPx下降有一定的自然恢复作用，但是依然远远低于正常水平。而使用石斛多糖对顺铂生殖损伤模型小鼠进行7天或14天的灌胃后，与相同处理时间的顺铂组相比，石斛多糖灌胃7天和14天，睾丸组织GPx分别提高了100％和40％，且灌胃14天与灌胃7天相比，睾丸组织GPx水平有16.7％的上升，石斛多糖可以有效减轻顺铂对小鼠睾丸组织GPx水平的损伤，其对GPx水平的恢复作用具有明显的时间效应(图10和表15)。

(4)丙二醛(MDA)水平检测

MDA采用比色法进行检测，其显色原理为丙二醛在高温下可以与TBA产生粉红色物质，粉红色物质在532nm下有最大吸收峰。

实验试剂：0.8％的TBA水溶液、10μmol/mL的四乙氧基丙烷水溶液、8.1％SDS溶液、20％醋酸缓冲液(pH3.5)、正丁醇吡啶混合液(15:1V/V)、双蒸水。

表16MDA标准曲线绘制以及实验方法

注：0～5均为绘制标准曲线所用组，所有组别离心后取上层液体，于532nm处进行吸光度测定。测定结果中，0号管为空白对照，绘制标准曲线时，以四乙氧基丙烷的量为x轴，532nm处吸光度为y轴进行绘制，得出回归曲线，并求出回归方程，将组织样品吸光度代入回归方程中进行计算，最终得出组织样品的MDA含量。

表17睾丸组织MDA水平的变化

灌胃石斛多糖会导致小鼠睾丸组织MDA水平有一定的提高。在顺铂生殖损伤模型中，睾丸组织MDA水平极显著上升，7天和14天组分别增加1.3倍和1.1倍。用石斛多糖对顺铂生殖损伤模型小鼠进行7天或14天期的处理后，睾丸组织MDA水平显著下降，与相同处理时间的顺铂组相比，石斛多糖灌胃7天和14天后分别使MDA水平下降了25％和11.4％，而且14天灌胃处理后MDA也低于7天组MDA水平，石斛多糖可以在顺铂生殖损伤模型中有效降低小鼠睾丸组织的MDA水平，其对MDA的降低作用存在明显的时间效应(图11和表17)。

(5)超氧化物歧化酶(SOD)水平检测

取新鲜睾丸组织，对其进行充分研磨，加入0.9％的生理盐水将其稀释为质量分数10％的组织匀浆，4℃、10000r/min，离心15min，取上清，按南京建成SOD水平检测试剂盒(羟胺法)说明书指示，测定小鼠睾丸组织的SOD水平。其检测原理活性氧的最终氧化产物为亚硝酸盐，亚硝酸盐在对氨基苯磺酸与甲萘胺的作用下显紫红色，550nm处有最大吸收峰。

表18SOD水平检测

注：a值的确定由百分比抑制率决定，45％～50％为最佳抑制率，进行检测应以此为准。

SOD活力(U/mgprot)＝(对照OD-测定OD)÷对照OD÷50％*反应液总体积(mL)÷取样量(mL)÷待测样本蛋白浓度(mgprot/mL)

表19睾丸SOD水平的变化

与空白对照组相比，石斛多糖灌胃7天和14天，小鼠睾丸组织SOD有一定的提高，但无显著差异。顺铂处理则导致睾丸组织SOD水平发生极显著的下降，与相同时间的空白对照组相比，顺铂7天组下降了63.6％，顺铂14天组则下降了57.5％。而使用石斛多糖对顺铂生殖损伤模型小鼠进行7天与14天的处理后，睾丸组织SOD水平均有明显提高，与同期的顺铂组相比，石斛多糖灌胃7天和14天组SOD水平分别上升了53.2％和78.4％，而且灌胃14天较灌胃7天高33.2％，石斛多糖可对SOD水平的提高作用的存在明显的时间效应，可有效抑制顺铂引起的小鼠睾丸组织SOD水平的下降(图12和表19)。

由此可见，本发明中用石斛多糖处理顺铂导致的生殖损伤雄鼠，石斛多糖可以显著提高睾丸组织中的抗氧化酶自身活性(SOD、GPx、GSH、CAT水平)，恢复和维持组织的氧化还原的平衡，降低MDA，清除过量的ROS，降低和减弱ROS对精细胞或睾丸等组织的毒性作用，实现癌症患者采用顺铂化疗引起的雄性生殖功能损伤的保护作用，具有很好的临床应用价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.石斛多糖在制备预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物中的应用，其特征在于：

所述的生殖损伤为男性在使用化疗药物治疗癌症后造成的生殖损伤。

3.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物中的应用，其特征在于，所述的预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的表现包括如下方面：

精子数量明显增加，提高精子质量即增加精子运动性、提高精子存活率、精子顶体反应率增加、精子核成熟率增加，也明显促使精子畸形率下降；可以提高睾丸组织中酶促和非酶抗氧化防御能力，促使SOD、GPx、GSH、CAT水平明显上升，可以有效清除活性氧等自由基，明显降低MDA 水平，减轻自由基产生和氧化应激对生殖功能的损失。

4.根据权利要求2所述的石斛多糖在制备预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物中的应用，其特征在于：

所述的化疗药物为铂类抗癌药物。

5.根据权利要求2所述的石斛多糖在制备预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物中的应用，其特征在于：

所述的使用化疗药物治疗癌症包括单独使用铂类抗癌药物进行化疗或所述的铂类抗癌药物与其他抗癌药物联合用药进行化疗。

6.根据权利要求4或5所述的石斛多糖在制备预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物中的应用，其特征在于：

所述的铂类抗癌药物包括顺铂、卡铂、奈达铂、环铂、奥沙利铂、洛铂、乐铂、舒铂、赛特铂、奥马铂、异丙铂或庚铂在内的铂类化合物或铂类化合物的配合物。

7.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物中的应用，其特征在于：

所述的预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物包括可接受的辅料。

8.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物中的应用，其特征在于：

所述的预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物还包含其他起配伍协同作用的有效成分。

9.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物中的应用，其特征在于：

所述的预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊、粉剂、滴丸、缓释剂、口服液、注射剂。

10.根据权利要求1所述的石斛多糖在制备预防或治疗癌症化疗后生殖损伤的药物中的应用，其特征在于，所述的石斛多糖通过如下制备方法制备得到：

(1)铁皮石斛鲜条干燥粉碎后得到铁皮石斛干粉，加水，水浴加热浸提，得到粗多糖浸提液；

(2)将步骤(1)得到的浸提液冷冻凝固后在冻干机中离心，除去浸提液中的水分，离心后收集产物，用少量水溶解，得到浓缩液；

(3)在步骤(2)中得到的浓缩液中加入无水乙醇，沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀，室温干燥，即得所述的石斛多糖。