CN106361757A

CN106361757A - 抗肿瘤剂

Info

Publication number: CN106361757A
Application number: CN201610647433.5A
Authority: CN
Inventors: 岩元正孝
Original assignee: Kakui Co Ltd
Current assignee: Kakui Co Ltd
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2013-08-26
Publication date: 2017-02-01
Also published as: EP2889035A1; US20140221640A1; EP2889035A4; US20160184335A1; WO2014030250A1; WO2014030763A1; CN103764152A

Abstract

本发明的目的在于提供一种具有优异的抗肿瘤活性、另外安全性高、副作用小的抗肿瘤剂。本发明的抗肿瘤剂的特征在于，以纤维二糖作为有效成分。

Description

抗肿瘤剂

(本申请是2013年8月26日递交的发明名称为“抗肿瘤剂”的申请201380002486.6的分案申请)

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤剂。

背景技术

目前，为了开发适于癌症的治疗及症状减轻的治疗方法，一直在进行大量研究。作为癌症的治疗方法，适宜地使用化学疗法、放射线疗法及外科疗法所谓的三大疗法。放射线疗法具有作为急性反应及晚期反应的副作用，放射线对正常细胞与癌细胞同时给予损伤，因此，有可能引起疲倦感、食欲不振、红斑等皮肤障碍、来自消化器官的出血、白细胞等的减少、脱发等多种多样的问题。另外，外科疗法在精神、体力上对患者的负担大，有可能因手术而引起后遗症或并发症。另外，也存在如下问题：在外科上难以切除的部位产生癌症的情况下不能适用。

另一方面，在化学疗法的领域，作为对癌细胞有效的抗肿瘤剂发现了抗生素、代谢拮抗物、烷基化剂、激素剂等。但是，这些抗肿瘤剂不仅攻击癌细胞，而且对正常细胞也起作用，因此，引起呕吐、恶心、食欲不振、脱发等副作用，产生使患者的QOL显著降低的问题。因此，期望安全性更高、副作用小的新型的抗肿瘤剂的开发。

作为抗肿瘤剂，在(专利文献1)中公开有一种抗肿瘤剂，其以在低聚木糖分子中具有糖醛酸残基的酸性低聚木糖和荷叶离褶伞(Lyophyllum decastes)提取物作为有效成分。另外，在(专利文献2)中公开有一种由单糖或双糖和脂肪酸的糖酯构成的抗肿瘤物质。这些抗肿瘤剂的抗肿瘤效果不充分，还存在改良的余地。

但是，在(专利文献3)中公开有一种以纤维二糖等的纤维低聚糖作为有效成分的肠内细菌活化剂。根据该发明，纤维低聚糖使肠内的有用细菌选择性地增加，可以抑制有害细菌的增加。但是，关于纤维二糖等的纤维低聚糖的抗肿瘤活性，目前没有进行研究。

另外，在(专利文献4)中公开有一种含有纤维二糖的药品对于癌细胞的杀细胞作用。但是，如后所述，(专利文献4)中使用的物质是作为来自植物的提取物的含杂质的纤维二糖，该内容也可以由该(专利文献4)中记载的NMR数据得知。另外，在与(专利文献4)中记载的癌细胞的生存率有关的试验中显示该提取物具有杀细胞作用，由此可知，该提取物为含杂质的纤维二糖。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2008-208093号公报

专利文献2：日本特开2002-179577号公报

专利文献3：日本特开2007-330177号公报

专利文献4：国际公开第2011/110190号

发明内容

发明所要解决的课题

本发明的目的在于，鉴于上述现有的状况，提供一种具有优异的抗肿瘤活性、另外安全性高、副作用小的抗肿瘤剂。

用于解决课题的技术方案

为了解决上述课题，本发明人等进行了潜心研究，结果发现：作为低聚糖的一种的纤维二糖抑制由致癌性物质诱发的癌症的产生，完成了本发明。即，本发明的要点如下所述。

(1)一种抗肿瘤剂，该抗肿瘤剂以纤维二糖作为有效成分。

(2)一种药品，该药品含有上述(1)所述的抗肿瘤剂。

(3)一种食品，该食品含有上述(1)所述的抗肿瘤剂。

发明效果

根据本发明，可以得到具有优异的抗肿瘤活性、且安全性高的抗肿瘤剂以及利用其的药品以及食品。

附图说明

图1是表示实施例中的各组的体重推移的坐标图。

图2是表示实施例中的各组的肿瘤产生个体数推移的坐标图。

图3是表示实施例中的各组的推定肿瘤体积推移的坐标图。

图4是表示实施例中的各组的肿瘤湿重的坐标图。

图5是参考例中的试验物质(纤维二糖)的¹³C NMR光谱。

图6是参考例中的试验物质(纤维二糖)的¹H NMR光谱。

图7是参考例中的试验物质(纤维二糖)的红外吸收光谱。

图8是表示相对于HeLa的试验物质(纤维二糖)的杀细胞活性的坐标图。

图9是表示相对于HaCaT的试验物质(纤维二糖)的杀细胞活性的坐标图。

图10是表示相对于Hep-G2的试验物质(纤维二糖)的杀细胞活性的坐标图。

图11是表示相对于地塞米松浓度的生存率的变化的坐标图。

具体实施方式

下面，对本发明进行详细说明。

本发明的抗肿瘤剂的特征在于，以纤维二糖作为有效成分。纤维二糖为由β1,4键连接的2个葡萄糖分子的二糖，化学式为C₁₂H₂₂O₁₁。纤维二糖可以通过用纤维素酶分解纤维素类物质的方法、使葡萄糖的单糖或其衍生物缩合或糖转移的方法、由蔗糖合成的方法等适当地制造。

作为利用纤维素酶分解的纤维素类物质，植物性及动物性的任一种均可以适用。具体而言，可以使用来自棉花、木材、竹、洋麻、小麦、水稻、细菌纤维素等中含有的天然物的纤维质物质、或使这些物质溶解于溶剂后并再生的再生纤维素、或实施这些化学处理并制成纤维素衍生物的物质等。这些纤维素类物质可以使用任一种，也可以并用2种以上。特别是没有经过溶解或化学处理的天然的纤维素类物质，由于在得到的纤维二糖中不含有对人体有害的溶剂或化学物质而优选。

作为纤维素酶，只要具有对于纤维素的分解活性就可以适用。作为纤维素酶酶源，可列举：纤维素酶产生菌体本身、将纤维素酶产生菌分泌的酶精制成的物质、或将精制酶与赋形剂、稳定化剂等添加剂同时进行了制剂化的物质等。对制剂中的添加剂的种类没有特别限制，其剂型可以为粉末、颗粒、液体等任一种。

作为纤维素酶的酶分解方法，可以列举例如使纤维素类物质悬浮于水性介质中、在其悬浮液中添加纤维素酶、一边搅拌或振荡、一边加热而进行糖化反应的方法等。从纤维二糖的产率等观点出发，此时的悬浮方法、搅拌方法、纤维素类物质及纤维素酶的添加方法及添加顺序、这些物质的浓度等反应条件可以适当地设定。另外，就反应液的pH以及温度等条件而言，只要是不使纤维素酶失活的条件即可，具体而言，在常压下进行反应时，温度可以设定为5～95℃，pH可以设定为1～11的范围。

作为优选的实例，本发明中的纤维二糖可以将棉花(脱脂棉)进行酶分解而得到。与以木质类作为原料的方法相比，该方法在工艺时间非常短的方面是有利的。根据HPLC测定确认：由棉花的酶分解得到的生成物含有大约75％的纤维二糖、22％的葡萄糖及3％的纤维三糖。

制造的纤维二糖可以根据需要实施酶除去、脱盐、脱色等精制处理。精制方法可以没有特别限制地使用公知的方法，可以列举例如色谱处理、精密过滤、超滤、逆浸透膜过滤等过滤处理、晶析处理、利用离子交换树脂的处理、活性炭处理等，可以单独进行这些处理的任一种，或组合多种处理而进行。

如上得到的纤维二糖对于乳腺癌等各种癌症抑制肿瘤的产生，或具有抑制肿瘤的生长的抗肿瘤活性，可以作为药品利用。将纤维二糖的抗肿瘤剂用作药品时，其形态没有特别限制，可以根据给药方法或适用的肿瘤的种类、形状及存在部位等条件，从药片、胶囊、散剂、颗粒剂、功能性饮料(ドリンク剤)等各种形态中适当地选择。即，可以将纤维二糖的抗肿瘤剂直接用作药品，或者可以根据需要与载体、稀释剂或赋形剂等通常的添加物组合而做成药品。

本发明的抗肿瘤剂的摄取或给药量为治疗上有效的量，由于肿瘤的种类等不能一概而论，体重60kg的成人的情况，作为每天的上述纤维二糖的量，通常为240mg以上，优选2400mg以上。给药量的上限没有特别限定，但优选设定为低于4800mg。另外，本发明的抗肿瘤剂也可以与公知的抗肿瘤剂或其它治疗剂并用。

而且，一般在食品中含有与本发明相关的纤维二糖的抗肿瘤剂，可以作为具有抗肿瘤活性的功能性食品进行利用。另外，可以将纤维二糖使用明胶等进行胶囊化，将该胶囊用作保健食品、或混合于饮料、糕点、口香糖、糖果等中。

【实施例】

下面，基于实施例，对本发明进一步详细地进行说明。但是，仅例示以下的实施例，本发明并不受这些实施例的任何限定。

(实施例)

1.试验目的

使用大鼠DMBA诱发乳腺癌模型研究纤维二糖的抗肿瘤作用。

2.适用的基准

本试验准用以下的法律、基准及指南。

·与动物的爱护以及管理有关的法律[法律第105号、昭和48年10月1日(平成23年8月30日最终改正：法律第105号)]

·与实验动物的饲养及保管以及痛苦的减轻有关的基准(环境省告示第88号、平成18年4月28日)

·与动物的杀处置方法有关的指南[总理府告示第40号、平成7年7月4日(平成19年11月12日一部分改正：环境省告示第105号)]

予以说明，本试验是得到试验实施设施内的动物实验委员会规定的动物实验计划书的审议、承认后实施的。

3.试验的概要

使用大鼠DMBA诱发乳腺癌模型研究纤维二糖的抗肿瘤作用。具体而言，将7周龄的雌性大鼠以体重为指标分组后，以20mg/mL/只将7,12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)进行强制经口给药。而且，以4mg/kg/日及40mg/kg/日的两种剂量，从分组日的第二天起1天1次连续12周强制经口给药试验物质。

其结果，在低剂量以及高剂量组中，均与对照组相比，肿瘤的产生时期慢，对于肿瘤重量，高剂量组与对照组相比差异不显著，但显示了较低的值。由此暗示：对于由作为致癌性物质的DMBA诱发的乳腺癌，作为试验物质的纤维二糖抑制其产生。

4.试验材料及器材

(1)试验物质及介质

a)试验物质

名称：纤维二糖

性状：粉末

保存条件：低温保存

使用上的注意事项：由于吸湿性高，所以使用后密闭并注意湿气。

b)蒸馏水

名称：注射用水

保存条件：室温

制造商：大冢制药工场(株)

使用上的注意事项：没有特别。

c)CMC

名称：羧甲基纤维素钠

保存条件：室温

制造商：关东化学(株)

使用上的注意事项：没有特别。

(2)使用试剂

作为致癌剂，使用以下的试剂。

a)DMBA

名称：7,12-二甲基苯并[a]蒽

保存条件：室温

制造商：SIGMA

使用上的注意事项：为了避免吸入以及附着于皮肤，戴上口罩、安全眼镜以及手套。

b)芝麻油

名称：芝麻油

保存条件：室温

制造商：SIGMA

使用上的注意事项：没有特别。

(3)使用动物

6周龄的大鼠、Crl：CD(SD)(SPF)、由日本查尔斯河(株)在2012年3月28日购入52只雌性(发注数：50只)。

对动物在进货日利用耳穿孔法进行个体识别，从进货至分组日进行驯化。每天进行一般状态观察，选择在一般状态以及体重推移上没有看到异常的动物进行使用。在各笼中，在分组前附加记入试验编号、性别及个体识别编号(耳穿孔编号)的卡片，在分组后追记组及动物编号。

(4)饲育方法

通过驯化饲育及实验期间，在温度22±3℃、湿度50±20％、照明12小时(8：00～20：00)、换气次数13～17次/小时的环境下、分别地收容在设置于不锈钢制可动饲草架(1790W×470D×1650H、mm)的不锈钢制金属网2连笼的1区域(255W×185D×200H、mm)中。饲料是使用不锈钢制固体饲料给饵器自由地供给固体饲料CRF-1(东方酵母工业(株))。水是利用聚砜制给水器(先管不锈钢制)自由地供给自来水。

5.试验方法

(1)分组

选择在检疫、驯化期间的一般状态观察中没有看到异常的动物，以体重为指标，利用分层连续随机化法、基于下述组构成表(表1)进行分组。对于残余动物，在分组实施日从试验组排除，利用乙醚的过量麻醉使其安乐死并处置。

【表1】

组构成表

a)给药介质

(2)监视动物的设定

为了监视饲育环境，按个体识别编号小的顺序选定分组后的残余动物中的在检疫、驯化期间没有看到异常的3只动物，设定为监视动物。监视动物在与试验组相同的动物室饲育至试验组的最终剖检日。

(3)致癌剂的给药

a)致癌剂的制备

使用电子精密天平(電子上皿天秤)Sartorius Laboratory(赛多利斯(株))称量需要量的DMBA。将称量的DMBA放入装有芝麻油的烧杯中，使用强力磁力搅拌器(小池精密机器制作所)搅拌至完全溶解。溶解后，移至量筒，填充至20mg/mL的浓度。在制备时，为了避免吸入以及附着于皮肤，戴上口罩、安全眼镜以及手套，进行化学危害对策。使用时制备。给药后的残余致癌剂作为医疗废弃物进行处理。

b)致癌剂的给药

对分组后的每个动物给药致癌剂。即，使用经口探针(一次性经口探针，(有)Fuchigami器械)和注射筒(一次性注射器，泰尔茂(株))，以1mL/只的给药量进行强制经口给药。在给药时，为了避免吸入以及附着于皮肤，戴上口罩、安全眼镜以及手套。

(4)试验物质的给药

a)试验物质给药液的制备

介质的制备是使用电子精密天平Sartorius Laboratory(赛多利斯(株))称量需要量的CMC。称量的CMC是一边使用强力磁力搅拌器(小池精密机器制作所)搅拌放入烧杯中的蒸馏水，一边一点一点地加入的。移至量筒，填充至0.5％(W/V)。制备的介质是在冷藏下保存并使用，包含制备日以9天为限度。

接着，使用电子分析天平Sartorius Analytic(赛多利斯(株))称量需要量的试验物质。使称量的试验物质溶解于介质，移至量筒，填充至0.8mg/mL及8.0mg/mL的浓度。使用时制备。给药后的残余的试验物质给药液用大量的自来水稀释而废弃。

b)试验物质的给药

从分组日的第二天开始给药(设定为第1天)。1天1次连续12周进行强制经口给药。

在给药时，使用经口探针(一次经口探针，(有)Fuchigami器械)和注射筒(一次注射器，泰尔茂(株))，按照组构成表以5mL/kg/日进行强制经口给药。给药液量是由在离给药时最近的日期测定的体重值算出的。

(5)一般状态观察以及体重测定

致癌剂的给药后，每天进行一般状态观察。以1周1次的比例进行体重测定。

(6)试验物质给药期间的推定肿瘤体积的算出

确认肿瘤的产生时，测定产生的肿瘤的个数，以1周1次的比例算出各肿瘤的推定肿瘤体积(mm³)。另外，各肿瘤的推定肿瘤体积(mm³)是进行肿瘤附近的剃毛，使用游标卡尺测定肿瘤径(长径a以及短径b，mm)之后，按照下述式算出，求出各肿瘤的推定肿瘤体积的总和。

各肿瘤的推定肿瘤体积(mm³)＝0.5×a×b²

(7)粪便采取

在给药期间结束日进行粪便采取。在采取日的上午，将动物从2连笼个体分别移至繁殖笼。放置1小时，回收每动物在繁殖笼排泄的粪便，以设定为－80℃的深度冷冻进行保存。

(8)解剖

在给药期间结束日的第二天进行解剖。在乙醚的麻醉下开腹，从腹大动脉放血，使其安乐死。其后，全部摘出各个体的肿瘤，使用电子天平TX323L((株)岛津制作所)测定湿重。对湿重测定后的肿瘤进行废弃。

(9)统计处理

就得到的数值(体重、推定肿瘤体积以及解剖时摘出的肿瘤重量)而言，在各组中算出平均值以及标准误差。

就各组间的显著差异而言，利用Bartlett法进行等分散性的检验，等分散的情况，进一步进行一元配置分散分析，显著的情况，利用Tukey法进行平均值的比较。不等分散的情况，进行Kruskal-Wallis的H检验，显著的情况，利用Tukey法进行平均顺序的比较。关于Bartlett法、一元配置分散分析以及Kruskal-Wallis的H检验，将显著水平设定为危险率5％，关于Tukey法，将显著水平设定为危险率5％及1％。

6.试验结果

(1)一般状态以及体重推移

图1表示各组的体重推移。对照组是经过试验期间而增加。低剂量组和高剂量组显示了与对照组几乎同样的推移。在各组间没有看到显著差异。

另外，关于一般状态，在对照组中，在第8天看到1只死亡(动物编号：007)。在低剂量组中，在第4天看到1只死亡(动物编号：106)。在高剂量组中，在第76天看到1只死亡(动物编号：209)。

(2)肿瘤产生个体数推移

图2表示各组的肿瘤产生个体数推移。对照组在第35天看到了肿瘤的产生的个体数为1只，其后，产生个体增加，在第84天为10只。低剂量组在至第42天没有看到肿瘤的产生，在第49天看到了肿瘤的产生的个体数为4只，其后，产生个体增加，在第84天为11只。高剂量组在至第42天没有看到肿瘤的产生，在第49天看到了肿瘤的产生的个体数为2只，其后，产生个体增加，在第84天为11只。

(3)推定肿瘤体积推移

图3表示各组的推定肿瘤体积推移。对照组从第35天(5周后)确认有肿瘤的产生，其后，确认新的肿瘤产生，每个肿瘤体积也显示了增加。低剂量组从第49天(7周后)确认有肿瘤的产生，其后，确认新的肿瘤产生，每个肿瘤体积显示了增加，在第42天的时候，与对照组相比，为显著低的值。高剂量组从第49天(7周后)确认有肿瘤的产生，其后，确认新的肿瘤产生，每个肿瘤体积显示了增加，在第42以及第49天与对照组相比，为显著低的值。

(4)肿瘤湿重

图4表示各组的肿瘤湿重。低剂量组是与对照组几乎同样的湿重。高剂量组与对照组相比不显著，但显示了低的值。

7.考察以及总括

在低剂量以及高剂量组中，均与对照组相比，肿瘤的产生时期慢，对于肿瘤重量，高剂量组与对照组相比不显著，但显示了低的值。由此暗示：对于由作为致癌性物质的DMBA诱发的乳腺癌，作为试验物质的纤维二糖抑制其产生。

(参考例1)

对纤维二糖的¹³C NMR、¹H NMR以及IR进行测定。图5～7表示得到的NMR光谱以及红外吸收光谱。

由图6和上述(专利文献4)的图4的NMR图表的比较得知：在两图表中确认有纤维二糖特有的峰值，但是在图4的NMR图表中，进一步在其他的位置上确认有峰值。由该结果得知：图5～7所示的物质为高纯度的纤维二糖，与此相对，(专利文献4)中记载的物质为含杂质的纤维二糖。

(参考例2)

使用纤维二糖，用以下的方法进行与细胞生存率有关的试验。

＜对于试验物质(纤维二糖)的细胞生存性的作用探讨试验＞

探讨了对于各种细胞系的试验物质(纤维二糖)的选择性杀细胞活性的有无。

1.试验材料

(1)试验物质

名称：纤维二糖

保管方法：冷藏、暗处、除湿

(2)使用细胞

细胞种类：HeLa(来自人子宫颈癌的细胞株)、HaCaT(来自人的永生化角质细胞)以及Hep-G2(来自人肝癌的细胞株)

(3)使用的培养基

培养基名：HeLa专用培养基、HaCaT专用培养基以及Hep-G2专用培养基

(4)使用的试剂(XTT分析用)

试剂名：细胞增殖试剂盒(XTT)

制造商名：Cosmo Bio(株)

商品目录No.：20-300-1000

2.试验方法

(细胞的解冻、继代)

(1)将HeLa、HaCaT及Hep-G2进行解冻，在各种专用培养基上进行培养。

(2)进行2～3次细胞继代。

(3)在试验中使用恢复了增殖性的细胞。

(细胞培养以及XTT分析)

(1)在2张96孔板的每一个上以1×10⁴细胞/100μL/孔分别播种24孔的HeLa、HaCaT以及Hep-G2。

(2)在CO₂培养箱内培养24小时。

(3)以0(对照)、0.001、0.01、0.1、1及10mg/mL的6阶段的浓度添加试验物质(N＝4)。

(4)添加后，在CO₂培养箱中培养3小时。

(5)培养后，对细胞进行照片拍摄。

(6)照片拍摄后，除去1张96孔板上含有培养了各种细胞的试验物质的培养基，在通常的培养基上交换。

(7)添加XTT试剂50μL。

(8)添加后，在CO₂培养箱中培养3小时。

(9)测定450～500nm的吸光度(ref.：630～690nm)。

(细胞增殖试剂盒(XTT)的性能确认)

(1)在1张96孔板上以1×10⁴细胞/100μL/孔分别播种16孔HeLa。

(2)在CO₂培养箱内培养24小时。

(3)以0(对照)、10、100及500μM的3阶段的浓度添加地塞米松(N＝4)。

(4)添加后，在CO₂培养箱培养3小时。

(5)添加XTT试剂50μL。

(6)添加后，在CO₂培养箱培养3小时。

(7)测定450～500nm的吸光度(ref.：630～690nm)。

3.试验结果

图8～10表示对HeLa、HaCaT以及Hep-G2的XTT分析的结果。由图8～10得知：HeLa以及HaCaT在试验物质10mg/mL的浓度中，生存率与对照相比，几乎没有看到变化。另外，Hep-G2在试验物质的高浓度组中，看到最大约15％的生存率的减少。另外，作为使用试剂盒的性能确认，采用HeLa，使用作为细胞凋亡诱导剂的地塞米松进行分析。图11表示其结果。在地塞米松500μM中看到约40％的生存率的降低，由此确认：在试剂盒的性能上没有问题。

另外，根据显微镜照片，关于HeLa、HaCaT以及Hep-G2，在试验物质的任一种浓度中，与添加前相比，没有看到死细胞的增加、细胞的形态变化等的影响。

图8～10表示作为本发明的目的物质的高纯度的纤维二糖对癌细胞不具有杀细胞作用。另一方面，在(专利文献4)的图9中，显示有化合物对癌细胞具有杀细胞作用。由此判明：(专利文献4)中记载的化合物为含杂质的纤维二糖，对癌细胞具有杀细胞作用的成分为纤维二糖以外的成分。即，在(专利文献4)中，没有公开与纤维二糖的抗肿瘤作用有关的技术思想。予以说明，如图8～10所示，高纯度的纤维二糖直接对癌细胞不具有杀细胞作用的内容与上述的实施例中所证明的纤维二糖抑制由致癌性物质诱发的癌症的产生的内容不矛盾。即，可以认为，在本发明中，纤维二糖不是直接作用于细胞，而是作用于生物体的免疫系统，通过提高免疫，结果显示了抗肿瘤作用。

将本说明书中引用的全部出版物、专利以及专利申请直接作为参考收入本说明书中。

Claims

1.纤维二糖在用于抑制乳腺癌的肿瘤产生和/或肿瘤生长的药品的制造中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于：

所述药品对癌细胞不具有杀细胞作用。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于：

所述纤维二糖是通过纤维素类物质的分解而获得的。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于：

所述纤维二糖是通过棉花的酶分解而获得的。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于：

所述乳腺癌是由7,12-二甲基苯并[a]蒽诱发的。