JP2002179577A - 抗腫瘍物質及び抗腫瘍剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 新規な抗腫瘍物質、特に抗腫瘍効果が高くし
かも毒性の少ない抗腫瘍物質及び当該抗腫瘍物質を用い
た抗腫瘍剤を提供する。 【構成】 本発明に係る抗腫瘍物質は、単糖類又は二
糖類と脂肪酸との糖エステルであって、ミコール酸、特
に炭素数５０以下の低級ミコール酸、さらに望ましくは
炭素数３０〜４０のミコール酸と、グルコース、マンノ
ースなどの単糖類又はトレハロースなど二糖類との糖エ
ステルからなり、当該糖エステルを用いて注射剤やクリ
ーム剤等に製剤化して本発明に係る抗腫瘍剤を得る。上
記糖エステルは、例えば、ロドコッカス属に属する菌、
特にロドコッカス菌を培養することによって得ることが
でき、培養された菌体中から抽出される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規な抗腫瘍物質、
特に抗腫瘍効果が高くしかも毒性の少ない抗腫瘍物質及
び当該抗腫瘍物質を用いた抗腫瘍剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、癌の治療には外科的療法や薬物療
法、放射線療法をレーザー療法などと組み合わせた集中
的療法が行われているが、治療に伴う苦痛、転移を考慮
すると、薬物療法に対する期待が大きく、これまでに数
多くの抗腫瘍剤が開発され使用されている。

【０００３】しかしながら、これまでの抗腫瘍剤は、単
独では十分な効果を発揮出来ないものや強い副作用のた
めに長期の使用が出来ないものが多く、多剤併用療法が
一般的であった。従って、抗腫瘍効果が高くしかも毒性
が少なく長期の使用が可能な抗腫瘍剤の開発が望まれて
いた。

【０００４】一方、本発明者らは、ロドコッカス属の菌
から抽出分離された糖エステル、特にミコール酸との糖
エステルが皮膚保湿効果に有効であることを見い出し、
特許出願（特開平９−２５５５４９号公報参照）してい
るが、この糖エステルが抗腫瘍効果を発揮することにつ
いては知られてはいない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明者らは
上記目的を解決すべく鋭意研究した結果、上記単糖類又
は二糖類と脂肪酸との糖エステルが、腫瘍壊死因子（以
下「ＴＮＦ」と称する。）産生能やＮＫ細胞を活性化さ
せるという抗腫瘍効果を有することを見い出し、本発明
を完成するに至った。

【０００６】ここで、ＴＮＦは、１９７５年にオールド
(L.J.Old)等によって、ウサギやマウスなどの動物をＢ
ＣＧや嫌気性コリネバクテリア(C.parvum)などの一次刺
激剤で感作し、さらにリポポリサッカライド（以下「Ｌ
ＰＳ」と記す。）などの二次刺激剤を投与すると血清中
に産生され、腫瘍細胞に出血性壊死を引き起こす因子
（物質）として発見された(Carswell E.A. et.al.,Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,72,3666(1975))。このＴＮＦ
は、マクロファージから産生される腫瘍傷害性因子で、
その抗腫瘍活性は１９７５年の発見以来、多くの研究に
よって確認されている(Gresser Ｉ,et al.,Int.Cancer.
38,771(1986)；Regenass U,et al.,Int.J.Cancer.39,26
6(1987)；Marquet RL et al.,Int.J.Cancer.40,550(198
7)など）。

【０００７】また、ＮＫ細胞は腫瘍細胞に対して極めて
早期の防御ラインを示すリンパ球個体群であって、免疫
適合宿主又は免疫抑制された宿主における原始腫瘍又は
転移性腫瘍の発生防止のため抗原非特異的抗腫瘍免疫に
関与している。従ってＮＫ細胞は、癌又は感染症の治療
の免疫アプローチのために有効なエフェクター細胞の個
体群を作成し、この点でＮＫ細胞の活性化が抗腫瘍免疫
に重要であると考えられる。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明に係る抗腫瘍物質
は、単糖類又は二糖類と脂肪酸との糖エステルからなる
ことを特徴としている。

【０００９】本発明において、上記脂肪酸としてはミコ
ール酸が好適に用いられ、さらに炭素数が３０〜４０の
ミコール酸であることが好ましい。

【００１０】また、本発明に係る抗腫瘍物質は、上記本
発明に係る糖エステルを含む抗酸菌より抽出された菌体
抽出物からなることを特徴としている。

【００１１】本発明に係る抗腫瘍剤は、上記本発明に係
る抗腫瘍物質を含有することを特徴としている。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明の抗腫瘍物質は、単糖類又
は二糖類と脂肪酸との糖エステルからなることを特徴と
している。当該糖エステルは、脂肪酸のカルボン酸残基
と糖のアルコール残基とがエステル結合したものであっ
て、脂肪酸１分子あるいは２分子以上の脂肪酸が糖にエ
ステル結合したものである。

【００１３】上記脂肪酸としては、主として、例えばコ
リネバクテリウム属、ノカルジア属又はミコバクテリウ
ム属、ロドコッカス属に代表される各種の抗酸菌が産生
する脂肪酸が挙げられ、特に、その中でも、次の式１で
示されるミコール酸が好適である。

【００１４】

【式１】

【００１５】ここにおいて、式１中、ＲｍおよびＲｎは
それぞれアルキル残基を示すが、ＲｍおよびＲｎは、い
ずれも直鎖状又は分岐状のいずれであっても良い。また
Ｒｍ、Ｒｎはそれぞれ不飽和結合、望ましくは２重結合
を有しているものがよく、通常のアルキル残基よりも広
い概念である。

【００１６】また、本発明におけるミコール酸はその総
炭素数が３０〜４０であるものが好ましく、総炭素数が
５０を越えると毒性が増強される恐れがある。

【００１７】また、当該ミコール酸とエステル結合する
糖としては、グルコース、マンノース、フルクトースな
どの単糖類、あるいは、スクロース、トレハロースをは
じめとする各種の二糖類が挙げられる。これらの糖は、
アルドース、ケトースのいずれでもよく、また、鎖状あ
るいは環状構造のいずれの構造をしていてもよい。従っ
て、本発明に係る糖エステルとしては、例えば、トレハ
ロース−６，６′−ジミコレート、トレハロース−６−
モノミコレート、グルコース−６−モノミコレート、マ
ンノース−６−ミコレート、フルクトース−６−ミコレ
ートが挙げられる。

【００１８】本発明に係る糖エステル、主としてミコー
ル酸糖エステルは上記抗酸菌、例えば、ロドコッカス属
に属する菌、特にロドコッカス菌を培養することによっ
て得ることができる。当該化合物は主として菌体中に生
成されるので、培養された菌体から抽出することによっ
て得ることができる。

【００１９】その際の培養方法としては、従来から用い
られている公知の合成培地及び天然培地を用いることが
でき、特にロドコッカス属に属する微生物の培養に用い
られる培地であれば、すべての培地が使用できる。

【００２０】例えば生育炭素源としては、グルコース、
フルクトース、マンノースなどの単糖類を用いることが
できる。また窒素源としては、例えば硝酸カリウム、硝
酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
等の無機窒素化合物、ペプトン、肉エキス、コーンステ
ィーブリカー等の有機窒素化合物が利用できる。また無
機塩としてナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛、
マグネシウム、マンガン、リン酸等を、さらに成長因子
として、各種ビタミン、アミノ酸類又はそれらを豊富に
含む酵母エキスを適宜加えることにしてもよい。

【００２１】培地のｐＨは５〜９、特に７〜７．５が至
適範囲であり、培養温度は１０〜４０℃、特に３０〜４
０℃が適している。培養は液体培養又は固体培養で好気
的条件下に行うことが好ましい。培養時間は、通常３〜
１４日程度とするのが適当である。

【００２２】このようにして得られる菌体から、本発明
のミコール酸糖エステルを得るには、菌体成分を採取す
る通常の方法を用いればよい。例えば、培養液を遠心分
離して集菌したのち、有機溶媒を加えて溶媒抽出する。
例えば、有機溶媒としてはクロロホルムとメタノールの
混液や、クロロホルムとメタノール・アセトンの混液な
ど、クロロホルムなどの疎水性溶媒やメタノールやアセ
トンなどの親水性溶媒とを単独あるいは混合したものを
用いるとよい。

【００２３】次に抽出した菌体成分をシリカゲルやモレ
キュラシーブなどに吸着させ、その後、先に述べたよう
な溶媒で溶出して、さらに精製を加える。そして、溶媒
に対する溶解度差やイオン結合力の差などを利用し、そ
れぞれ単独の方法で又は２つ以上の方法を適当に組み合
わせて、さらには同様の操作を数回繰り返すことによ
り、ミコール酸糖エステルを、炭素数が異なるミコール
酸糖エステルの混合物ではあるが、ほぼ純粋な物質とし
て分離精製することができる。

【００２４】こうして精製されたミコール酸糖エステル
はそのまま、あるいは適当な溶媒で希釈したり、さらに
適当な賦形剤と混合することにより、抗腫瘍物質として
用いることができ、慣用の製剤化手段によって任意の形
態に製剤化することができる。本発明に係る抗腫瘍剤で
ある具体的な製剤としては、例えば錠剤やカプセル剤、
散剤、リポソーム、液剤等の各種経口剤、リポソーム、
乳濁注射剤、生理食塩水などを使用した懸濁性注射剤等
の注射剤等が例示される。また皮膚外用剤として各種の
軟膏剤、クリーム剤等が例示され、内服外用を問わず各
種の製剤にして提供できるものである。

【００２５】また、ミコール酸糖エステルは、菌体から
上述した方法により抽出し、純粋なものにまで精製する
必要もなく、また各種ミコール酸糖エステルの混合物と
して用いることとしてもよい。さらに、毒性が発揮され
ない程度に粗精製した菌体抽出物として用いてもよい。
もちろん合成によってもミコール酸糖エステルを得るこ
とができ、合成した場合には純度の高いミコール酸糖エ
ステルを得ることができる。

【００２６】このようにして得られる本発明に係る抗腫
瘍剤は、１日１回から数回に分けて適用することがで
き、その投与量は症状に応じて適宜増減することができ
る。また、抗腫瘍剤中の濃度としても、適宜その使用目
的、症状などに応じて適宜増減できるものである。さら
に、本発明の抗腫瘍剤には、本発明の抗腫瘍物質のみな
らず、マイトマイシンＣやナイトロジェンマスタードそ
の他の抗腫瘍物質を配合したり、あるいは他の抗腫瘍剤
を併用してもよいのは言うまでもない。

【００２７】

【実施例】以下に本発明の実施例について具体的に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 （実施例１） 〔菌体の培養〕ロドコッカス菌(Rhodococcus sp.4306)
を１白金耳採り、ｐＨ７．５に調整した以下に示す組成
の培養用ＰＹＧ（Ｍ、Ｆ）培地２００ｍｌに植菌し、３
７℃で５〜７日間振とう培養法によって前培養した。こ
の前培養菌液１０〜５０ｍl(前培養菌液の菌体濃度によ
り液量を適宜調整する。)を同じ組成のＰＹＧ（Ｍ、
Ｆ）培地１．５lに加え、３７℃で５〜７日間本培養し
た。 〔ＰＹＧ（Ｍ、Ｆ）培地の組成〕 ・ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬製） ０．５w/w％ ・ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ製） ０．５w/w％ ・糖(Ｄ（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ、和光純薬製) １w/w％ ただし、糖にはＤ（＋）−グルコース以外にも 、Ｄ
（＋）−マンノース、Ｄ（−）−フルクトースを用いる
こともできる。

【００２８】〔ミコール酸糖エステルの抽出精製〕上記
で得られた培養菌液を７５００ｒｐｍで３０分間遠心分
離し、菌体を集菌した。次に集菌された菌体を、クロロ
ホルムとメタノールの混液(容量比で２：１)を加え、超
音波ホモジナイザーにて１５分間超音波処理を行った。
この処理した溶液を分液ロートに移し、水を加えて２層
に分離させ有機溶媒層を分取する。そして、分取した溶
媒をエバポレーターにて濃縮し、脂質成分を得た。

【００２９】さらに、この脂質成分を薄層クロマトグラ
フィーにより展開して分離精製した。つまり、脂質成分
を少量のクロロホルムなどの適当な溶媒に溶かし、シリ
カゲルからなる分取用薄層板(UNIPLATE SILICA GEL G M
ERCK社製)上にスポットした。そして、クロロホルムと
メタノール、アセトン、酢酸（容量比９０：１０：６：
１）にて展開した。次に、この薄層板上で分離された各
脂質部分を掻き取り、掻き取ったシリカゲルを、それぞ
れガラスカラムに充填して、クロロホルムとメタノール
の混液で溶出し、各脂質が薄層クロマトグラム上で、単
一スポットになるまで繰り返し行う。最後に、エバポレ
ータで溶媒を留去して、トレハロース−６，６′−ジミ
コレート、トレハロース−６−モノミコレート、グルコ
ース−６−モノミコレート、マンノース−６−ミコレー
ト、フルクトース−６−ミコレートを得た。これらの詳
細な構造については、上記特開平９−２５５５４９号公
報を参照されたい。

【００３０】次にこうして得られたミコール酸糖エステ
ルのうち、トレハロースー６，６´−ジミコレート（以
下ＴＤＭと称する。）につき、ＴＮＦ産性、腫瘍特異的
キラー活性、ＮＫ活性を指標としてその抗腫瘍効果を確
認した。

【００３１】（ＴＮＦ産性）雌性マウス（４〜６週齢）
の腹腔内に１０w/v％プロテオースペプトン液を２ｍｌ
投与し、４日後にマウスの腹腔内を冷したリン酸緩衝化
生理食塩水で洗浄し、腹腔液を採取した。この腹腔液を
１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、腹腔細胞を得
た。この得られた腹腔細胞を５％仔ウシ血清含有の培地
（ＲＰＭＩ培地）に、１×１０⁶cells／mlとなるように
播種し、ＴＤＭを１μｇ／ｍｌそして１０μｇ／ｍｌの
濃度となるようにそれぞれ添加し、２４時間培養した。
その後、培養上清中のＴＮＦ産生量をＥＬＩＳＡ法を用
いて測定を行った。その結果を図１に示す。

【００３２】（腫瘍特異的キラー活性）Ｐ−８１５細胞
を２×１０⁶DBAマウスの右胸部に皮内接種し、７日後に
生着増殖した腫瘤を外科的に排除した。さらに７日後に
マウス脾臓を摘出して、単細胞浮遊液とし、マイトマイ
シンＣ溶液中で処理したＰ−８１５細胞とともに１０％
ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ中で培養した。培養５日後、回収し
た生細胞をエフェクター細胞として腫瘍特異的キラー活
性を測定した。腫瘍特異的キラー活性の測定には ⁵¹Ｃｒ
で標識したＰ−８１５細胞を標的細胞としてエフェクタ
ー／ターゲット比(E/T ratio)が１００、５０、２５と
なるようにしてそれぞれ４時間培養後、標的細胞の傷害
性をガンマーカウンターで測定した。Specific lysis
（％）は常法により下記計算式により算出した。なおＴ
ＤＭはＰ−８１５細胞を皮内接種した同日に尾静脈によ
り投与した。その結果を表１に示す。 Specific lysis（％）＝｛ＴＤＭ投与時の測定値／ＴＤ
Ｍ非投与時の測定値｝×１００

【００３３】

【表１】

【００３４】（ＮＫ活性）ＴＤＭ（１ｍｇ／匹）をマウ
ス尾静脈内に投与し、６日後にマウス脾臓を摘出して、
単細胞浮遊液とし、⁵¹Ｃｒで標識したＹＡＣ−１細胞を
標的細胞としてエフェクター／ターゲット比(E/T rati
o)が１００、５０、２５となるようにしてそれぞれ４時
間培養後、標的細胞の傷害性をガンマーカウンターで測
定した。Specific lysis（％）は腫瘍特異的キラー活性
を測定した場合と同様にしてＮＫ活性を算出した。その
結果を表２に示す。

【００３５】

【表２】

【００３６】図１及び表１並びに表２から分かるよう
に、実施例におけるＴＤＭは良好にＴＮＦ産性を誘導さ
せるだけでなく、腫瘍特異的キラー活性、ＮＫ活性を著
しく向上させることが確認された。

【００３７】次に上記ＴＤＭを使用して各種抗腫瘍剤を
製造したところ、良好に製剤化することができた。 （製剤例１）下記処方よりなる軟膏剤を常法に従って製
造した。 ＴＤＭ １ｇ 白色ワセリン ９ｇ ポリエチレングリコール４００ ７５ｇ ポリエチレングリコール４０００ １５ｇ 全量 １００ｇ

【００３８】（製剤例２）下記処方によりなるリポソー
ムの懸濁性注射剤を常法に従って製造した。 ＴＤＭ ３００ｍｇ 卵黄フォスファチジルコリン ７２０ｍｇ 生理食塩水 適 量 全 量 ５ｍｌ

【００３９】（製剤例３）下記処方によりなる非水性溶
剤を用いた注射剤を常法に従って製造した。 ＴＤＭ １００ｍｇ オリーブ油 適 量 全 量 １ｍｌ

【００４０】（製剤例４）下記処方によりなる乳濁性注
射剤を常法に従って製造した。 ＴＤＭ ３００ｍｇ オリーブ油 １００ｍｇ ｄｌ−α−トコフェロール ５０ｍｇ ポリソルベート８０ ８０ｍｇ セスキオレイン酸ソルビタン ６０ｍｇ 精製水 適 量 全 量 ５ｍｌ

【００４１】（製剤例５）下記処方によりなる錠剤を常
法に従って製造した １０錠中 ＴＤＭ ２ｇ 乳糖 ８ｇ ステアリン酸マグネシウム ０．１ｇ

【００４２】（製剤例６）下記処方よりなるクリーム剤
を常法に従って製造した。 ＴＤＭ １ｇ セタノール ３ｇ ステアリン酸 ４ｇ 流動パラフィン ２０ｇ 濃グリセリン ５ｇ 自己乳化型モノステアリン酸グリセリン ５ｇ ショ糖脂肪酸エステル ３ｇ パラオキシ安息香酸ブチル ０.２ｇ 精製水 ５８.８ｇ 全量 １００ｇ

【００４３】

【発明の効果】本発明によれば、ＴＮＦ産生能やＮＫ細
胞を著しく活性化させ、抗腫瘍効果の高い新規な抗腫瘍
物質及び抗腫瘍剤を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＴＤＭによるＴＮＦ産性能を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 南野 美紀 大阪府大阪市西区西本町２丁目６番11号 株式会社クラブコスメチックス内 (72)発明者 加藤 敬香 大阪府大阪市西区西本町２丁目６番11号 株式会社クラブコスメチックス内 Ｆターム(参考） 4C057 BB02 BB03 4C086 AA01 AA02 EA03 MA01 MA04 NA14 ZB26 4C087 AA01 AA02 BC16 BC17 BC29 BC72 CA14 MA01 NA14 ZB26

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 単糖類又は二糖類と脂肪酸との糖エステ
   ルからなることを特徴とする抗腫瘍物質。
2. 【請求項２】 前記脂肪酸がミコール酸であることを特
   徴とする請求項１記載の抗腫瘍物質。
3. 【請求項３】 前記脂肪酸の炭素数が３０〜４０である
   ことを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記載の抗
   腫瘍物質。
4. 【請求項４】 請求項１、２又は３のいずれかに記載の
   糖エステルを含む抗酸菌より抽出された菌体抽出物から
   なることを特徴とする抗腫瘍物質。
5. 【請求項５】 請求項１、２、３又は４のいずれかに記
   載の抗腫瘍物質を含有することを特徴とする抗腫瘍剤。