WO2005102369A1

WO2005102369A1 - 細菌細胞壁骨格成分を含有する製剤

Info

Publication number: WO2005102369A1
Application number: PCT/JP2005/007523
Authority: WO
Inventors: Takehiko Nomura
Original assignee: Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.
Priority date: 2004-04-22
Filing date: 2005-04-20
Publication date: 2005-11-03
Also published as: EP1741438A1; EP1741438A4; JP5041279B2; US20080032384A1; JPWO2005102369A1; CA2564180A1

Abstract

　本発明により、細菌細胞壁骨格成分、油及び界面活性剤を含有する凍結乾燥製剤であって、抗酸化剤を含有することを特徴とする製剤、例えば、抗酸化剤としてトコフェロール類を含有し、リン酸塩かららなる緩衝剤を配合することによって、当該凍結乾燥製剤を復水して得られる水中油型エマルションのｐＨがｐＨ５．５～８．５に調節されるＢＣＧ－ＣＷＳ及び油を含有する水中油型エマルション製剤及びその凍結乾燥製剤等が提供される。

Description

明細書

細菌細胞壁骨格成分を含有する製剤

技術分野

[0001] 本発明は、安定性に富む、細菌細胞壁骨格成分〔以下、細菌 CWSと称する場合がある。また、細胞壁骨格成分 (Cell Wall Skeleton)を、 CWSと略する場合がある〕を有効成分として含有する医薬組成物、詳しくは凍結乾燥製剤に関する。

背景技術

[0002] 細菌細胞壁骨格成分 (細菌 CWS)は、免疫賦活作用を有し、例えば動物モデルを用いた実験的腫瘍系、およびヒト癌の免疫療法において抗腫瘍活性を示すことが知られている。更に、上記の細菌細胞壁骨格成分を油成分中に分散、乳化させ、水中油型エマルシヨン製剤として投与した場合、免疫賦活作用による抗腫瘍効果などが著しく高まることが知られて、る。

[0003] 例えば Bacille Calmette- Guerin菌（BCG菌）の細胞壁骨格成分（以下、 BCG- CWS と略する場合がある）を含む水中油型エマルシヨンを用いた癌免疫療法では、ヒトの癌治療におヽて優れた成績が得られたことが報告されてヽる (非特許文献 1及び 2を参照)。

前記水中油型エマルシヨン製剤は、細菌- CWSを油中に分散したペースト状の組成物に、界面活性剤を含む水をカ卩えてエマルシヨンィ匕することにより調製することができる（非特許文献 3、 4及び 5を参照)。しかし、一般に細菌- CWSを含有する水中油型エマルシヨン製剤は不安定であり、現在、臨床現場では、使用時に少量の水中油型エマルシヨン製剤を用時調製している。しかし、常に一定の製剤を手作業で調製することは難しぐまた用時調製では事実上医薬品としての実用化は不可能である。そこで、水中油型エマルシヨン製剤を凍結乾燥して凍結乾燥製剤とし、使用時に分散溶媒を加えて水中油型エマルシヨン製剤を再調製させる方法が検討され、いくつ力の凍結乾燥製剤に関する報告がなされた (特許文献 1及び 2を参照)。

細菌— CWSを含む凍結乾燥製剤を医薬品として供給するためには、（1)医薬品として求められる長期保存安定性を有すること、（2)凍結乾燥製剤に注射用蒸留水等の分散溶媒を添加して得られるエマルシヨン力凍結乾燥前の水中油型エマルシヨンと実質的に同等であること等が重要である。し力しながら、これまでに知られていた凍結乾燥製剤は、高温条件等の苛酷な条件下で有効成分である細菌 CWSの含量が低下する現象が認められるなどの問題点があった。

以上のことから、更に保存安定性が優れた細菌— CWSの凍結乾燥製剤が求められていた。

一方、トコフエロール等の抗酸化剤は、酸化を受けやすい物質を含む薬剤や化粧品の液剤を安定ィ匕する目的等で汎用されている。し力しながら、細菌- CWSの分解を抑制する作用につヽては全く知られて、なかった。

特許文献 1：国際公開パンフレット第 00Z3724号

特許文献 2：国際公開パンフレット第 2004Z012751号

非特許文献 1 :A. Hayashi et al., Pro. Japan Acad., 70, Ser. B 205-209 (1994) 非特許文献 2 : A. Hayashi et al., Pro. Japan Acad., 74, Ser. B 20550-55(1998) 非特許文献 3 :J.Nat.CancerInst.48,831- 835(1972)

非特許文献 4 :J.Bacteriol,92,869- 879(1966)

非特許文献 5： Gann,69,619-626(1978)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0004] 本発明が解決しょうとする課題は、優れた保存安定性を示す、細菌細胞壁骨格成分を有効成分として含有する医薬組成物、詳しくは凍結乾燥製剤を提供すること〖こある。

課題を解決するための手段

[0005] 本発明者らは、細菌 CWS及び油を含有する凍結乾燥製剤を医薬品として開発すべく鋭意検討を行って!/、た。

前記凍結乾燥製剤は、前述の特許文献 1及び 2に記載された方法を用いて調製することができることがわ力つている。すなわち、（1)有機溶媒を用いて細菌一 CWS及びスクヮラン等の油との混合油状物を調製し、（2)界面活性剤としてポリソルベート類を配合し、（3)賦形剤としてマン-トールを配合し、（4)(前記 3)を水中で乳化させることによって、均一性に富む水中油型エマルシヨンを製造することができ、当該水中油型ェマルシヨンを凍結乾燥させることによって凍結乾燥製剤を得ることができる。

ところが、当該凍結乾燥製剤について、医薬品として要求される長期保存安定性を調べたところ、細菌— CWSの構造が一部分解し、構成成分の一種であるミコール酸が遊離することが判明した。また、長期間保存安定性試験に供した凍結乾燥製剤に水を添カ卩して再懸濁（すなわち復水）して得られる水中油型エマルシヨンの pHが酸性側に変化していることがわ力つた。これらの知見から、細菌一 CWSを有効成分として含有する医薬組成物を医薬品として開発するためには、保存安定性を改良する必要があることが判明した。

そこで、本発明者らは、鋭意検討を行った結果、抗酸化剤を添加することによって、細菌 CWSを含有する凍結乾燥製剤の安定性が著しく向上することを見出した。更に、中間体となる水中油型エマルシヨンを調製する際に緩衝剤を配合し、当該エマルシヨンの溶液中の pHを pH5. 5〜8. 5に調整することによって、凍結乾燥製剤の安定性が相乗的に向上することを見出した。すなわち、抗酸化剤を配合することにより、好ましくは加えて緩衝剤を配合することにより、凍結乾燥製剤の長期保存安定性は飛躍的に向上することを見出した。

本発明は、上記の知見をもとに、完成するに至ったものである。

即ち本発明は、

〔1〕細菌細胞壁骨格成分、油及び界面活性剤を含有する水中油型エマルシヨンの凍結乾燥製剤であって、更に抗酸化剤を含有することを特徴とする、凍結乾燥製剤；〔2〕界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、〔1〕に記載の凍結乾燥製剤；

〔3〕抗酸化剤がトコフロールである、〔1〕又は〔2〕に記載の凍結乾燥製剤；〔4〕更に、緩衝剤を含有し、当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が 0.5 mgZml〜l mg/mlである水中油型エマルシヨンの pH力 p H5. 5〜8. 5に調節されることを特徴とする、〔1〕〜〔3〕のいずれかに記載の凍結乾燥製剤；

〔5〕緩衝剤カ^ン酸塩である、〔4〕に記載の凍結乾燥製剤；〔6〕当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が 0.5 mgZml〜l mg/mlである水中油型エマルシヨンにおける緩衝剤の濃度力約 10〜2 OmMとなるべく調製されていることを特徴とする、〔5〕に記載の凍結乾燥製剤；〔7〕更に、賦形剤としてマン-トールを含有することを特徴とする、〔1〕〜〔6〕のいずれかに記載の凍結乾燥製剤；

〔8〕細菌細胞壁骨格成分が、ゥシ型結核菌 Badlle Calmette-Guerin細胞壁骨格成分である、〔1〕〜〔7〕の、ずれかに記載の凍結乾燥製剤；

〔9〕以下の（ 1)及び (2)の特徴を有する〔 1〕〜〔8〕の、ずれかに記載の凍結乾燥製剤：

(1) 80°C下で 30日間保存した場合、ミコール酸の遊離量が約 2%以内であり、

(2) 80°C下で 30日間保存した後に、当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が 0.5 mgZml〜l mg/mlである水中油型エマルシヨンの p H値が、保存前の pHと実質的に同等である；

〔10〕〔1〕〜〔9〕のいずれか〖こ記載の凍結乾燥製剤に水性溶媒を添加して得られる、水中油型エマノレション製剤；

〔11〕細菌細胞壁骨格成分、油及び界面活性剤を含有する水中油型エマルシヨンであって、更に抗酸化剤を含有することを特徴とする、水中油型エマルシヨン；〔12〕界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、〔11〕に記載の水中油型エマルシヨン；

〔13〕抗酸化剤がトコフエロールである、〔11〕又は〔12〕に記載の水中油型ェマルシヨン；

〔14〕更に、緩衝剤を含有し、 pHが、 pH5. 5〜8. 5に調節されていることを特徴とする、〔11〕〜〔13〕のいずれかに記載の水中油型エマルシヨン；

〔15〕緩衝剤がリン酸塩である、〔14〕に記載の水中油型エマルシヨン；

〔16〕緩衝剤の濃度が約 10〜20mMとなるべく調製されていることを特徴とする、〔

14〕又は〔15〕に記載の水中油型エマルシヨン；

〔17〕更に、賦形剤としてマン-トールを含有することを特徴とする、〔11〕〜〔16〕のいずれかに記載の水中油型エマルシヨン；〔18〕細菌細胞壁骨格成分が、ゥシ型結核菌 Bacille Calmette-Guerin細胞壁骨格成分である、〔11〕〜〔17〕のいずれかに記載の水中油型エマルシヨン；

〔19〕〔11〕〜〔18〕のいずれかに記載の水中油型エマルシヨンを凍結乾燥させて得られる、凍結乾燥製剤；

〔20〕細菌細胞壁骨格成分、油及び界面活性剤を含有する凍結乾燥製剤に、抗酸ィ匕剤からなる安定化剤を配合することによって、前記凍結乾燥製剤中の細菌細胞壁骨格成分に長期保存安定性を与えることを特徴とする、前記凍結乾燥製剤の安定ィ匕方法；

〔21〕更に緩衝剤を配合して、当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が 0.5 mgZml〜l mg/mlである水中油型エマルシヨンの pHが p

H5. 5〜8. 5に調整されることを特徴とする〔20〕に記載の方法；

〔22〕細菌細胞壁骨格成分、油及び界面活性剤を含有する凍結乾燥製剤中の細菌細胞壁骨格成分の分解抑制方法であって、抗酸化剤を配合することを特徴とする方法；

〔23〕細菌細胞壁骨格成分力 ¾CG-CWSであり、油がスクヮランであり、界面活性剤力 Sポリソルベート 80であり、抗酸化剤がトコフエロールである、〔20〕〜〔22〕のいずれかに記載の方法；

〔24〕トコフエロールを有効成分として含有する、細菌細胞壁骨格成分、スクヮラン及び界面活性剤を含有する水中油型エマルシヨン又はその凍結乾燥製剤の安定ィ匕促進剤；

〔25〕更に、細菌細胞壁骨格成分の濃度が 0.5 mgZml〜l mg/mlである凍結乾燥前の水中油型エマルシヨン、及び当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が 0.5 mgZml〜l mg/mlである水中油型エマルシヨンの pH力 5. 5〜8. 5に調整されるべく緩衝剤が配合されていることを特徴とする、〔24〕に記載の安定化促進剤；

〔26〕緩衝剤カ^ン酸塩である、〔25〕に記載の安定化促進剤；

等に関する。

発明の効果 [0008] 本発明により、優れた長期保存安定性を有する、細菌 CWSを有効成分として含有する凍結乾燥製剤を提供することが可能となった。当該凍結乾燥製剤は、癌免疫療法剤として有用である。

発明を実施するための最良の形態

[0009] 本明細書において、「細菌細胞壁骨格成分」（本明細書において、細菌 CWSと略する場合がある）とは、微生物由来の細胞壁骨格成分 (Cell Wall Skeleton; CWS)を含む任意の菌体由来成分を表し、ヒト型結核菌の死菌等の、微生物の菌体そのもの、及びある程度単離された細胞壁骨格成分を共に含む概念である。 CWSの由来微生物としては、グラム陽性棹菌のミコバクテリゥム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバタテリゥム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌などが挙げられる。「ミコバクテリゥム属細菌」とは、抗酸菌であるミコパクテリゥム属の細菌を表し、具体的には、結核菌群糸田菌の Mycobacterium tuberculosis (結核菌)、 Mycobacterium bovis [ゥシ型結核菌、 BCG (カノレメット'ゲラン菌； Bacille Calmette- Guerin)を含む]、 Myco bacterium africanum (アフリカ菌)、 Mycobacterium microti (ネス型結核菌)力 Sあり、この他、 Mycobacterium leprae (ライ菌）、非結核性抗酸菌群である Mycobacterium kansasu、 Mycobacterium avium ^ Mycobacterium phlei等力 ²¹挙げりれ。中でも好ましいものとして、ミコバタテリゥム属ゥシ型結核菌の一種である BCG菌およびノカルディァ族細菌の一種であるノカルディア'ルブラを挙げることができる。

「細胞壁骨格成分 (CWS)」とは、細菌の菌体を物理的に粉砕した後、ヌクレアーゼによる除核酸、プロテアーゼによる除蛋白、有機溶媒での洗浄による脱脂などの精製工程を経て、不溶性残渣として得られるものを表し、その製法は公知である (J. Nat. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974)；)。

なお、本発明において、水中油型エマルシヨンに含まれる細菌 CWSの濃度は、エマルシヨンとして 0.01〜10mg/mlになるように使用される。好ましくは、 0.1mg/ml〜 2mg/ml、さらに好ましくは 0.2mg/ml〜lmg/ml、さらに好ましくは 0.5mg/ml〜lmg/mlである。

[0010] 本発明の「油」としては、 Immunology 第 27卷、第 311〜329項（1974年）に記載されているような鉱物油、動植物油が挙げられる。鉱物油としては、例えば、流動バラフイン（ドレコール 6VR、モレスコバイオレス U- 6、モレスコバイオレス U- 8等）、バイオ一ル (Bayol F)等が挙げられる。植物油としては、例えば大豆油、シンセラン 4、ォレイン酸ェチル、落花生油、椿油、ゴマ油、 AD-65 (落花生油とァラセルとアルミニウムモノステアレートの混合物）等が挙げられる。動物油としては、例えば、スクヮラン、スクヮレンのようなテルぺノイド誘導体が挙げられる。また、これら、動植物油、鉱物油の中力も選ばれる複数の油の混合物を挙げることができる。好ましいものとしては、スクヮランあるいは例えば、大豆油、ォレイン酸ェチルもしくはォレイン酸などの植物油（またはそれに由来する油）とスクヮランとの混合物、例えば、ドレコール 6VR、各種流動パラフィンなどの鉱物油とスクヮランの混合物が挙げられる。

より好ましくは、スクヮラン、ドレコール 6VR、スクヮランと大豆油の混合物、スクヮランとォレイン酸ェチルの混合物、またはスクヮランとドレコール 6VRの混合物を挙げることができる。更により好ましくはスクヮランが挙げられる。

油の濃度は、後述する細菌 CWSと油のペースト（混合油状物）の粘度が約 0.7poise (25°C)以下、好ましくは約 0.2〜約 0.6poise (25°C)、更に好ましくは約 0.28〜 0.55poise (25°C)となるように適宜調整される。複数の油との混合物を使用する場合、それぞれの油を適当な組成比で混合して使用できるが、細菌 CWSとの混合時の粘度が約 0.2〜0.7poise (25°C)の粘度になるような組成比とする。

例えば、油としてスクヮランを用いた場合、約 0.35〜0.55poise (25°C)、更に好ましくは約 0.39〜0.51 ₀136 (25° の粘度を有する細菌ーじ\^含有ぺーストが好適でぁる。具体的には、細菌 CWS約 0.66gに対して、スクヮラン約 6.6g〜35.2g、好ましくは約 8.4g〜35.2gの糸且成が挙げられる。

前述のペーストは、以下の 1)及び 2)：

1)細菌 CWS及び油を、分散補助溶媒としての有機溶媒中で混合攪拌する工程；

2)前記 1)の有機溶媒を留去する工程；

により調製することができる。用いられる有機溶媒としては、ヘプタン、トルエン等の炭化水素系溶媒、 5〜20%のエタノール等のアルコール系溶媒を含むヘプタン等の炭化水素系溶媒、 1, 2—ジクロ口エタン、クロ口ホルム等のハロゲンィ匕炭化水素系溶媒等が挙げられる。前記ペーストの調製方法および、前記工程（1)で用いられる有機溶媒については、国際公開パンフレット第 2004/012751号を参照することができる。

[0011] 本発明で使用可能な「界面活性剤」としては、医薬品製剤に使用される界面活性剤であれば特に制限されるものではない。例えばリン脂質、非イオン性界面活性剤などを挙げることができる。リン脂質としては、ホスファチジルァミン、ホスファチジルエタノールァミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフインゴミエリンまたはレシチン等を挙げることができる。また、水素添加されたリン脂質も使用することができる。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等が挙げられる。当該ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート 20)、同モノパルミテート（ポリソルべート 40)、同モノステアレート（ポリソルベート 60)、または同モノォレート（ポリソルベート 80)等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビタンモノラウレート（ Span20)、同モノノレミネート（Span40)、同モノステアレート（Span60)、同モノォレート（Span80)等を挙げることができる。

好ましい界面活性剤としては、卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、ポリソルベート 80、ポリソルベート 20、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 60 (HC 0— 60)、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 50 (HCO— 50)、ポリオキシエチレン（16 0)ポリオキシプロピレン（30)グリコール（プル口ニック F68)を挙げることができる。より好ましくはポリソルベート 80、ポリソルベート 40、ポリソルベート 60等のポリオキシェチレンソルビタン脂肪酸エステル (ポリソルベート類）が挙げられ、特に好ましい界面活性剤としてポリソルベート 80を挙げることができる。

界面活性剤の濃度は、水中油型エマルシヨンにおいて 0. 01〜10%w/wの範囲が適当であり、 0.01〜3%w/wが好ましぐ 0.05%〜l%w/wが更に好ましい。これら界面活性剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。

[0012] 本発明におヽて、「抗酸化剤」とは、自動酸化の連鎖反応を抑制するラジカル阻害機能、又は過酸化物を非ラジカル分解して不活性化する過酸化物分解機能を有する化合物を表し、医薬品製剤に使用できる抗酸化剤であれば特に制限されるものでは無い。具体的には、トコフエロール類、ブチルヒドロキシトルエン（以下、 BHTという ) ,ブチルヒドロキシァ二ソール（以下、 BHAという）、ノルジヒドログアヤレチン、没食子酸プロピル、ビタミン Cの脂肪酸エステル又はソルビン酸等を例示することができる。抗酸化剤として、好ましくはトコフエロール類を例示することができる。

トコフエロール類としては、 α—トコフェローノレ、 j8—トコフェローノレ、 γ—トコフエ口ール、 δ トコフエロール、又はこれらの中力任意に選択される、 2〜4種類のトコ口フエロールの混合物等が例示できる。具体的には、 α—トコフエロール（商品名： Εミツタス 80、 Εミックス 70L等）が挙げられる。

[0013] 本発明における、これらの抗酸化剤の配合量は、原薬の酸化分解を十分に防止するためには、組成物全体に対して 0. 0001重量％以上が好ましぐ同 0. 001重量％以上がさらに好ましい。配合上限は特に限定されるものではないが、概ね組成物全体に対して 10. 0重量％以下の範囲内で配合される。抗酸化剤の濃度は、好ましくは、水中油型エマルシヨンにおいて 0. 00001%〜10%w/wの範囲であり、更に好ましくは 0. 0001%〜5%w/wである。抗酸化剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。

抗酸化剤は、水中油型エマルシヨンの製造工程における任意の工程で添加すればよいが、好ましくは、細菌— CWSと油の混合油状物 (ペースト）を製造する際に、あらカじめ油に溶解させて用いることができる。

[0014] 「賦形剤」とは、上記エマルシヨンのエマルシヨンとしての安定性または凍結乾燥製剤としての安定性を維持 ·向上する目的で使用される成分である。本発明で使用可能な賦形剤としては、単糖類、糖アルコール、多糖類、アミノ酸、タンパク質、ゥレア、または無機塩などが挙げられる。単糖類および二糖類としては、グルコース、フルクトース、スクロース、ラタトース、トレハロース等が挙げられる。糖アルコールとしては、マン-トール、ソルビトール等が挙げられる。多糖類としては、デキストラン、でんぷん、マルトデキストリン、セルロース、ポリビュルピロリドン、またはアルギン酸ナトリウム等が好ましいものとして挙げられる。アミノ酸としては、ァラニン、グリシン、プロリン等の中性アミノ酸が好ましぐより好ましい中性アミノ酸としてはグリシンを挙げることができる。タンパク質としては、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン等が好ましいものとして挙げられる。無機塩としては、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、塩ィ匕カルシウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。

好ましい賦形剤としては、単糖類、または糖アルコールが挙げられ、特に好ましい賦形剤としてはマン-トールが挙げられる。

これら賦形剤は、 1種類に限らず、適宜、数種類組み合わせて使用することができる。

賦形剤の濃度は、水中油型エマルシヨンにおいて 0.1%〜20%w/wの範囲が適当であり、 0.1〜10%w/wが好ましい。賦形剤の好適な濃度は、賦形剤の種類によって異なるが、製造スケールや各含有成分の含有量に応じて、適宜調整することができる。グリシン等のアミノ酸の場合、 2.25% (300mM)〜11.25% (1500mM)、好ましくは約 6.75% ( 900mM)である。マン-トールの場合、水中油型エマルシヨンにおける濃度は、好ましくは 1〜10%、さらに好ましくは 1〜8%、より好ましくは約 3〜6%である。マン-トールを賦形剤として用いることにより、等張と同程度の濃度で用いることができるので、より生体に負担の少な!/、安定な製剤を調製することができる。

前記賦形剤として挙げられた物質は、必要に応じて等張化剤として用いてもよい。これら賦形剤もしくは等張化剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。通常は、前記賦形剤が等張化剤を兼ねているが、前記賦形剤とは異なる物質を等張化剤として選択してもよい。等張化剤の濃度は、他の成分の含有量に応じて適宜設定されるが、通常 0.1%〜30%W/W、好ましくは 1%〜10%W/Wの範囲が適当である。

本明細書における「緩衝剤」として、具体的には、グリシン、ァラニン、アルギニン、グルタミン、システィン、セリン、トレオニン、ノリン、ヒスチジン、フエ-ルァラニン、メチォニン、ァスパラギン酸、グルタミン酸、 ε -アミノカプロン酸、リジン、ロイシンなどのァミノ酸またはその塩酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩、ニコチン酸アミド、ァミノ安息香酸などの両性電解質またはそのナトリウム塩などの塩、クェン酸、リン酸、乳酸、酢酸、ホウ酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、グリコール酸、シユウ酸、マロン酸、コハク酸、ダルタル酸、アジピン酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、安息香酸、サリチル酸、フタル酸、酒石酸などの弱酸のナトリウム塩、カリウム塩などの塩、上記弱酸の塩と、弱酸、塩酸、硫酸などの強酸との組み合わせ、トリス緩衝液などが挙げられる。例えば、リン酸緩緩衝液としては、 5mM〜50mMのリン酸二水素ナトリウムおよびリン酸水素ニナトリウム力もなる緩衝液が挙げられ、通常はリン酸二水素ナトリウムおよびリン酸水素ニナトリウムの比率を 1 : 2. 3 (重量比）で溶解し、適宜 pHを塩酸等の酸、又は水酸ィ匕ナトリウム等の塩基で微調整してもよい。トリス緩衝液としては、 5mM 〜50mMのトリス溶液からなる緩衝液が挙げられ、適宜 pHを 0. 1N〜4Nの塩酸等で微調整することができる。クェン酸緩衝液としては、 5mM〜50mMのクェン酸溶液カゝらなる緩衝液が挙げられ、適宜 pHを 0. 1N〜4Nの塩酸等で微調整することができる。緩衝液として、好ましくはリン酸緩衝液が挙げられる。

[0016] 本発明における、これらの緩衝剤の配合量は、十分な緩衝能を発揮するために十分な量であれば特に限定は無いが、好ましくは、 5〜20mM、更に好ましくは、 10〜 20mMである。

賦形剤としてアミノ酸などの緩衝作用を有する物質を用いる場合には、適宜緩衝剤の添加量を調整する。

[0017] 本発明の凍結乾燥製剤は、長期保存安定性に優れており、以下の性質有する。すなわち、

(2) 80°C下で 30日間保存した後に、当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が 0.5mg/ml〜lmg/mlである水中油型エマルシヨンの pH 値が、保存前の pHと実質的に同等である。

更に好ましくは、前記（1)において、ミコール酸の遊離量は、約 1%以内である。また前記 (2)において、「実質的に同等」とは、保存前後で、凍結乾燥製剤を復水して得られる水中油型エマルシヨンの pHの差が 0. 8以内、好ましくは 0. 5以内であることを表す。

[0018] 本発明の凍結乾燥製剤を、水性溶媒で再懸濁 (復水)することによって、水中油型エマルシヨン製剤を提供することができる。当該水中油型エマルシヨン製剤もまた、本発明に含まれる。

本発明における凍結乾燥製剤を再懸濁するために使用される水性溶媒は、ェマルシヨン粒子の分散媒体となるものであり、注射用蒸留水、生理食塩水、または緩衝液等が挙げられるが、注射可能な水性溶媒であれば特に限定されない。ここで凍結乾燥製剤を再懸濁するために用いられる水性溶媒が生理食塩水や緩衝液などの無機塩を含む水性溶媒の場合、当該水性製剤の組成については、再懸濁後の水中油型エマルシヨン製剤の安定性等を考慮して、適宜選択すればよい。また、再懸濁後の水中油型エマルシヨン製剤における無機塩 (緩衝剤ゃ賦形剤として添加された無機塩)の濃度は、ヒトに投与される場合に等張液となるように調整されることが好ましい。

[0019] また、本発明の凍結乾燥製剤を調製するための製造中間体である、細菌— CWS、油、界面活性剤及び抗酸化剤を含む水中油型エマルシヨンも、本発明の範疇である当該「水中油型エマルシヨン」は、更に、賦形剤、緩衝剤等を含有することができる。すなわち当該水中油型エマルシヨンは、好ましくはマン-トール等の賦形剤を含みかつ、更に緩衝剤を配合されて pHが 5. 5〜8. 5に調整されている。

当該水中油型エマルシヨンは、上記国際公開第 2004Z012751号パンフレットに記載された、以下の製造方法で得られることを特徴とする。すなわち、

1)細菌 CWS及び油を、分散補助溶媒としての有機溶媒中で混合攪拌する工程、

2) 1)の有機溶媒を留去して、細菌 CWS含有ペーストを調製する工程、及び

3)得られた細菌 CWS及び油からなるペースト (混合油状物)及び界面活性剤を水中で乳化する工程

により製造することができる。前述のとおり、抗酸化剤は上記 1)または 3)の工程で配合させることができるが、好ましくは、 1)の工程で配合させる。また、上記 3)の工程において、好ましくは、賦形剤を配合することができる。

[0020] 前記で用いられる有機溶媒としては、トルエン、ヘプタン、ヘプタンエタノール混合溶媒等が挙げられる。細菌 CWS含有ペーストの調製方法については、国際公開第 OOZ3724号パンフレット、国際公開第 2004Z012751号パンフレットに記載されている。

製造中間体としての水中油型エマルシヨン及び、本発明の凍結乾燥製剤を復水して得られる水中油型エマルシヨン製剤の組成としては、前記細菌 CWS含有ペーストを含み、かつ、 0.1%〜20%、好ましくは 1%〜 10%の賦形剤、 0.01%〜10%、好ましくは 0.01%〜3%の界面活性剤、 0.001%〜10%、好ましくは 0.001%〜0.1%の抗酸化剤を含むことを特徴とする。

具体的には 2Lあたり、 0.67〜3.35_§の細菌ーじ\^3ぉょび0.1〜10%\¥/^、好ましくは 0.4〜8%w/w、更に好ましくは 0.6〜5%のスクヮランを含み、かつ、 1%〜10%W/Wの安定化剤、 0.01%〜3%w/wの界面活性剤、および 0.001%〜0.1%w/wの抗酸化剤を含むことを特徴とする。

前記水性溶媒としては、水、生理食塩水、または、緩衝液等が挙げられる。

前記「緩衝液」とは、水中油型エマルシヨン製剤 (凍結乾燥製剤を水で再懸濁させることにより得られるエマルシヨンを含む。）の pHを一定に保つ目的で用いられる、緩衝剤を含む水溶液を表す。本発明で使用可能な緩衝液としては特に制限されるものは無、が、医薬品製剤に使用される緩衝液であれば好ま、。

本発明の水中油型エマルシヨン製剤は、緩衝剤によって pH5. 5〜8. 5、好ましくは pH6. 0〜7. 0に調整されることが好ましい。

[0021] 前述の水中油型エマルシヨンを凍結乾燥することによって、凍結乾燥製剤を製造することができる。すなわち、本発明の凍結乾燥製剤は、水中油型エマルシヨンを凍結乾燥し、最後に通常はバイアル内部を窒素置換し、打栓を行うことにより得ることができる。水中油型エマルシヨンを凍結乾燥する際、凍結乾燥温度、および時間等は特に限定されず、例えば、国際公開パンフレット第 00/3724号、国際公開パンフレット第 2004/012751号などに記載された方法を挙げることができる。

[0022] 本発明の水中油型エマルシヨン製剤は、注射など非経口で投与される。投与形態は、治療目的などにより異なり、特に制限されるものではない。通常用いられる投与形態として例えば、注射剤として皮膚より投与すること等ができる。エマルシヨン中の細菌— CWSの量は通常 0.1〜1.0mg/ml、好ましくは 0.5〜1.0mg/mlの濃度である。本発明の凍結乾燥製剤は、適量の水性溶媒、例えば水、生理食塩水、緩衝液にて本発明水中油型エマルシヨンに再懸濁して用いる。凍結乾燥製剤を再懸濁して生体に投与する場合の水中油型エマルシヨンにおける各成分の濃度は、凍結乾燥前の、製造中間体としての水中油型エマルシヨンにおける各成分の濃度と異なっていてもよい。水性溶媒の適量とは、凍結乾燥前の液量の好ましくは 0.5〜4倍の範囲であればよい。

投与量、投与回数は対象とする疾患、患者の症状、年齢、体重、性別等によって異なるが、例えば、成人に対して週 1回もしくは 4週 1回の投与で 1回あたり 10〜250 /z g の範囲、好ましくは 25〜200 μ gの範囲を投与することができる。

本発明の凍結乾燥製剤及びこれを復水した水中油型エマルシヨン製剤は、癌治療薬または予防薬、詳しくは免疫療法剤として有用である。対象となる癌の種類に特に限定はないが、肺癌、胃癌、肝臓癌、脾臓癌、大腸癌、子宮癌、乳癌、急性骨髄性白血病、舌癌、咽頭癌、卵巣癌、脳腫瘍等が挙げられる。ここで癌治療剤には、癌転移抑制剤としての態様も含まれる。

又は本発明の凍結乾燥製剤及びこれを復水した水中油型エマルシヨン製剤は、他の免疫療法剤、具体的には各種癌抗原を有効成分とする癌ワクチンと供に用いることがでさる。

[0023] 以下の実施例において、本発明を詳細に説明する力もとより本発明はこれに限定されるものではない。

実施例 1

[0024] lmgZmLトコフエロール（Eミックス 80又は Eミックス 70L) ZlO%エタノール Z9 0%ヘプタン溶液を調製し、その 60mLとスクヮラン 105. 6gを充分混合する（混合物 Aとする)。

細胞壁骨格成分として BCG— CWS2770mgを用いて、混合物 A70. 4gおよび 10 %エタノール Z90%ヘプタン溶液 400mLの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素あるいは空気気流下 70°Cに加熱しエタノール Zヘプタンを留去した。ついで、 0. 02wZw%ポリソルベート 80Zl0mMリン酸緩衝液 888. 6gを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化を行い、さら〖こ、 36. 7gの 10w Zw%ポリソルベート 80水溶液を添力卩し本乳化を行った。最後に、 1. 5gの lOwZw %ポリソルベート 80溶液を添加混合し、ポリソルベート 80最終濃度を 0. lwZw%に調整し、水中油型エマルシヨンを得た。その後、 6. 7wZw%マン-トール Zl . 2w Zw%ポリソルべート 80水溶液 3000gを添カ卩し、 4000gの最終製剤を得た。この水中油型エマルシヨン製剤をバイアルに 2mLずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機 (DFM— 13A— S特、 UL VAC社製)を用いて行った。

実施例 2

[0025] lmgZmLトコフエロール（Eミックス 80又は Eミックス 70L) ZlO%エタノール Z90 %ヘプタン溶液を調製し、その 40mLとスクヮラン 70. 4gを充分混合する（混合物 Bとする)。

細胞壁骨格成分として BCG— CWS1358mgを用いて、混合物 B35. 2gおよび 10 %エタノール Z90%ヘプタン溶液 200mLの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素あるいは空気気流下 70°Cに加熱しエタノール Zヘプタンを留去した。ついで、 0. 02wZw%ポリソルベート 80Zl0mMリン酸緩衝液 444. 3gを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化を行い、さらに、 18. 4gの 10w Zw%ポリソルベート 80水溶液を添力卩し本乳化を行った。最後に、 0. 76gの 10wZ w%ポリソルベート 80溶液を添加混合し、ポリソルベート 80最終濃度を 0. lw/w% に調整し、水中油型エマルシヨンを得た。その後、 6. 7wZw%マン-トール Zl. 2 wZw%ポリソルベート 80水溶液 1500gを添カ卩し、 2000gの最終製剤を得た。

この水中油型エマルシヨン製剤をバイアルに 0. 5mL又は lmLずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機 (DFM— 05 A— S特、 ULVAC社製）を用 V、て行つた。

実施例 3

[0026] (安定性試験）

実施例 2、 5及び 6に記載の抗酸化剤もしくは緩衝剤を含む凍結乾燥製剤、国際公開パンフレット第 2004/012751号実施例 14に記載された方法で調製された抗酸ィ匕剤を含まない凍結乾燥製剤 (比較例 1)の保存安定性を評価した。すなわち、各凍結乾燥製剤を組函に入れ、 80°Cに維持した気相インキュベーター内にて保存した。 1 週間後に製剤を取り出し、遊離ミコール酸量および注射用蒸留水で再懸濁した後の pHを測定した。

結果を表 1に示した。 [0027] [表 1]

※ ヶ月のデータを記載。

表 1に示すように、比較例 1の製剤は 80°Cで 1週間保存した結果、遊離ミコール酸量が著しく増加し、 pHも大きく低下した。一方、実施例 5及び 6の凍結乾燥製剤では、遊離ミコール酸量及び pHの低下が共に抑制されることがわ力つた。更に、抗酸ィ匕剤と緩衝剤を共に含む実施例 1および 2の本発明の凍結乾燥製剤では、遊離ミコール酸量、 _PHともにほとんど変化することなぐ長期保存安定性が著しく向上することがわかった。（ここで、遊離ミコール酸量は、 BCG— CWS全量あたりの比率を表し、国際公開第 2004/012751号パンフレットに記載の方法を用いて測定した。）実施例 4

[0028] 実施例 1と同様の方法で (ただしトコフエロールを含まな、エタノールヘプタン混合溶媒を用いた) 5mM、 10mM、 20mM、 lOOmMのリン酸緩衝液を含む凍結乾燥製剤を調製し、実施例 3と同様の方法で、保存安定性を試験した。 pHを測定した結果を

[0029] [表 2]

処方 pH 遊離ミコル酸 (%)

試験削 80°C 1週間 80°C 1ケ月試験リ 80°C 1週間注射用蒸留水 6. 5 3. 5 3. 7 0. 2 19. 7

5mMリン酸緩衝液 6. 7 5. 3 6. 0 0. 1 2. 0

10mMリン酸緩衝液 6. 8 6. 0 6. 5 < 0. 1 1 . 8

20mMリン酸緩衝液 6. 7 6. 1 6. 6 < 0. 1 1 . 8 l OOmMリン酸緩衝液 6. 8 6. 3 < 0. 1 2. 1 また、凍結乾燥製剤を水に再懸濁させて得られる水中油型エマルシヨン製剤にお

Vヽて、 80°C 1週間保存後における凍乾ケーキの性状を表 3に示した。

[表 3]

表中の数値は、保存本数を表し、各 30本のうち、変化を示したバイアルの本数を力ゥントしたものである。

表 2の結果から、 10mM以上のリン酸緩衝液を用いることにより、 pHの変化が抑制され、遊離ミコール酸量も抑制された、保存安定性が優れた凍結乾燥製剤が得られることがわ力ゝる。

一方、表 3に示すように、 lOOmMリン酸緩衝液カゝら製造した凍結乾燥製剤は、強制劣化保存 (80°C1週間）後における凍結乾燥ケーキの性状がシュリンクあるいは瓶の上部に浮上するバイアルが出現した。すなわち、高濃度のリン酸緩衝液で調製した凍結乾燥製剤は、強制劣化保存条件で、形態変化を起した。尚、ここでシュリンクとは、凍結乾燥中に凍結状態にある水の一部が融解することにより生ずるような、凍結乾燥ケーキが縮んだ状態を表す。

上記の結果より、凍結乾燥製剤の安定性を維持する為には、低いリン酸濃度が好ましいことがわかる。以上の結果から、 10mM〜20mMのリン酸緩衝液が好適であることがわかる。

実施例 5

(240gスケール製剤）

lmgZmLトコフエロール（Eミックス 80又は Eミックス 70L) ZlO%エタノール Z90 %ヘプタン溶液を調製し、その 40mLとスクヮラン 16gを充分混合する（混合物 Bとする)。

細胞壁骨格成分として BCG— CWS : 163mgを用いて、混合物 B4. 2gおよび 10% エタノール Z90%ヘプタン溶液 20mLの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素あるいは空気気流下 70°Cに加熱しエタノール Zヘプタンを留去した。ついで、 0. 02wZw%ポリソルベート 80Z5. 7%マン-トール水溶液 212gを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化を行い、さらに、 1. 74gの 10w/w %ポリソルベート 80水溶液を添力卩し本乳化を行った。最後に、 21. 8gの 10wZw% ポリソルベート 80溶液を添加混合し、ポリソルベート 80最終濃度を lwZw%に調整し、 240gの水中油型エマルシヨン (最終製剤）を得た。

この水中油型エマルシヨン製剤をバイアルに 2mLずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機 (DFM 05A— S特、 UL VAC社製)を用いて行った。

実施例 6

[0032] (240gスケールの比較例製剤）

実施例 5と同様の方法で、トコフロールを添加せずに凍結乾燥製剤を製造した。産業上の利用可能性

[0033] 本発明の細菌 CWSを有効成分として含有する凍結乾燥製剤は、優れた長期保存安定性を有する癌免疫療法剤として有用である。

Claims

請求の範囲

[I] 細菌細胞壁骨格成分、油及び界面活性剤を含有する水中油型エマルシヨンの凍結乾燥製剤であって、更に抗酸化剤を含有することを特徴とする、凍結乾燥製剤。

[2] 界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、請求項 1に記載の凍結乾燥製剤。

[3] 抗酸化剤がトコフエロールである、請求項 1又は 2に記載の凍結乾燥製剤。

[4] 更に、緩衝剤を含有し、当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が 0.5 mgZml〜l mg/mlである水中油型エマルシヨンの pHが、 pH5. 5 〜8. 5に調節されることを特徴とする、請求項 1〜3のいずれかに記載の凍結乾燥製剤。

[5] 緩衝剤がリン酸塩である、請求項 4に記載の凍結乾燥製剤。

[6] 当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が 0.5 mgZ ml〜l mg/mlである水中油型エマルシヨンにおける緩衝剤の濃度力約 10〜20mM になるべく調製されていることを特徴とする、請求項 5に記載の凍結乾燥製剤。

[7] 更に、賦形剤としてマン-トールを含有することを特徴とする、請求項 1〜6のいずれかに記載の凍結乾燥製剤。

[8] 細菌細胞壁骨格成分が、ゥシ型結核菌 Badlle Calmette-Guerin細胞壁骨格成分である、請求項 1〜7のいずれかに記載の凍結乾燥製剤。

[9] 以下の（1)及び (2)の特徴を有する請求項 1〜8のいずれかに記載の凍結乾燥製剤

(2) 80°C下で 30日間保存した後に、当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が 0.5 mgZml〜l mg/mlである水中油型エマルシヨンの p H値が、保存前の pHと実質的に同等である。

[10] 請求項 1〜9のいずれかに記載の凍結乾燥製剤に水性溶媒を添加して得られる、水中油型エマルシヨン製剤。

[II] 細菌細胞壁骨格成分、油及び界面活性剤を含有する水中油型エマルシヨンであつて、更に抗酸化剤を含有することを特徴とする、水中油型エマルシヨン。

[12] 界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、請求項 11に記載の水中油型エマルシヨン。

[13] 抗酸化剤がトコフエロールである、請求項 11又は 12に記載の水中油型エマルシヨン

[14] 更に、緩衝剤を含有し、 pHが、 pH5. 5〜8. 5に調節されていることを特徴とする、請求項 11〜13のいずれかに記載の水中油型エマルシヨン。

[15] 緩衝剤がリン酸塩である、請求項 14に記載の水中油型エマルシヨン；

[16] 緩衝剤の濃度が約 10〜20mMとなるべく調製されていることを特徴とする、請求項 1

4又は 15に記載の水中油型エマルシヨン。

[17] 更に、賦形剤としてマン-トールを含有することを特徴とする、請求項 11〜16のいずれかに記載の水中油型エマルシヨン。

[18] 細菌細胞壁骨格成分が、ゥシ型結核菌 Badlle Calmette-Guerin細胞壁骨格成分である、請求項 11〜17のいずれかに記載の水中油型エマルシヨン。

[19] 請求項 11〜18のいずれかに記載の水中油型エマルシヨンを凍結乾燥させて得られる、凍結乾燥製剤。

[20] 細菌細胞壁骨格成分、油及び界面活性剤を含有する凍結乾燥製剤に、抗酸化剤からなる安定化剤を配合することによって、前記凍結乾燥製剤中の細菌細胞壁骨格成分に長期保存安定性を与えることを特徴とする、前記凍結乾燥製剤の安定ィ匕方法。

[21] 更に緩衝剤を配合して、当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が 0.5 mgZml〜l mg/mlである水中油型エマルシヨンの pH力 ¾H5. 5 〜8. 5に調整されることを特徴とする請求項 20に記載の方法。

[22] 細菌細胞壁骨格成分、油及び界面活性剤を含有する凍結乾燥製剤中の細菌細胞壁骨格成分の分解抑制方法であって、抗酸化剤を配合することを特徴とする方法。

[23] 細菌細胞壁骨格成分が BCG-CWSであり、油がスクヮランであり、界面活性剤がポリソルベート 80であり、抗酸化剤がトコフエロールである、請求項 20〜22のいずれかに記載の方法。

[24] トコフエロールを有効成分として含有する、細菌細胞壁骨格成分、スクヮラン及び界面活性剤を含有する水中油型エマルシヨン又はその凍結乾燥製剤の安定ィ匕促進剤

[25] 更に、細菌細胞壁骨格成分の濃度が 0.5 mgZml〜l mg/mlである凍結乾燥前の水中油型エマルシヨン、及び当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が 0.5 mgZml〜l mg/mlである水中油型エマルシヨンの pH力 5. 5〜 8. 5に調整されるべく緩衝剤が配合されていることを特徴とする、請求項 24に記載の安定化促進剤。

[26] 緩衝剤がリン酸塩である、請求項 25に記載の安定化促進剤。