JP6442703B2 - 細菌細胞壁骨格成分を含有する水中油型エマルション製剤 - Google Patents
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Description
また、ノカルジア・ルビア菌の細胞壁骨格成分(N−CWS)の水中油型エマルションにおいても同様の臨床研究が報告されている。(非特許文献3:日外会誌,第83回,第7号,1982,p635−648、非特許文献4:肺癌,28(3):p353〜36,1988)
本発明は、上記の知見をもとに、完成するに至ったものである。
[1] 細菌の細胞壁骨格成分(CWS)、水、油、界面活性剤を含有する、下記条件を満たす水中油型エマルション製剤:
(a)レクチンに対する反応性を示す、
(b)エマルション製剤のゼータ電位と、細菌の細胞壁骨格成分を含まない以外は同様にして作成されたビークル水中油型エマルションのゼータ電位の電位差が3〜14mVである。
[2] 上記細菌が、CWSに脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンを含むものである、[1]に記載の水中油型エマルション製剤。
[3] 上記細菌が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌からなる群から選択されるものである、[1]または[2]に記載の水中油型エマルション製剤。
[4] レクチンがコンカナバリンAである、[1]〜[3]のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
[5] 上記電位差が4〜12mVである、[1]〜[4]のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
[6] 上記細菌が、ミコバクテリウム属菌およびノカルジア属菌からなる群から選択されるものである、[1]〜[5]のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
[7] 上記細菌がBCG菌である、[6]に記載の水中油型エマルション製剤。
[8] 上記油がスクワラン、スクワレンまたはその混合物である、[1]〜[7]のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
[9] 上記界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、[1]〜[8]のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
[10] さらに抗酸化剤として、トコフェロール類、ジブチルヒドロキシトルエン(BHT)から選択される1以上の抗酸化剤を含有する、[1]〜[9]のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
[11] 上記抗酸化剤がジブチルヒドロキシトルエンである、[10]に記載の水中油型エマルション製剤。
[12] さらに緩衝剤として、リン酸バッファーまたはクエン酸バッファーを含有する、[1]〜[11]のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
[13] 上記緩衝剤がクエン酸バッファーである、[12]に記載の水中油型エマルション製剤。
[14] さらに単糖類、糖アルコール、多類糖、アミノ酸、タンパク質、ウレア、および無機塩からなる群から選択される一つ以上の賦形剤を含有する、[1]〜[13]のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
[15] 上記賦形剤がマンニトール、スクロースまたはトレハロースである、[14]に記載の水中油型エマルション製剤。
[16] 上記賦形剤がマンニトールである、[15]に記載の水中油型エマルション製剤。
[17] 細菌がBCG菌であり、油がスクワレンまたはスクワランであり、界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、さらに抗酸化剤としてジブチルヒドロキシトルエン、緩衝剤としてクエン酸バッファーを含有する、[1]〜[16]のいずれかに記載の製剤。
[18] 細菌がBCG菌であり、油がスクワレンであり、界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、緩衝剤としてクエン酸バッファーを含有する、[1]〜[16]のいずれかに記載の製剤。
[19] [14]〜[18]のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤の凍結乾燥製剤。
[20] [1]〜[19]のいずれかに記載のエマルション製剤または凍結乾燥製剤を含有する、ヒトを含む哺乳動物のための医薬組成物。
[21] 癌の治療のための、[20]記載の医薬組成物。
[22] 以下の工程を含む細菌CWSを含有する水中油型エマルション製剤の製造方法:
(i)下記の条件を満たす細菌CWS調製物を提供する、
a)細菌CWS調製物中の全非構成アミノ酸含量が0.8重量%以下(0〜0.8重量%)である
b)オーラミン染色によるCWS調製物の蛍光面積率が10%以下(0〜10%)である、
(ii)細菌CWS調製物、油、並びに有機溶媒を含む混合液を攪拌して細菌CWSを分散させる、
(iii)有機溶媒を留去する、
(iv)有機溶媒留去後の細菌CWSに、界面活性剤を含む水溶液を加えて乳化する。
[23] 上記CWS調製物の蛍光面積率が5%以下(0〜5%)である、[22]に記載の製造方法。
[24] 上記CWS調製物の蛍光面積率が2%以下(0〜2%)である、[22]または[23]に記載の製造方法。
[25] 上記CWS調製物(乾燥体)を生理食塩水中1mg/mLに分散させた場合の、分散の60分後のOD値(690nm)が分散直後のOD値と対比して0.4以上(0.4〜1.0)である、[22]〜[24]のいずれかに記載の製造方法。
[26] 上記60分後のOD値(690nm)が分散直後のOD値と対比して0.7以上(0.7〜1.0)である、[22]〜[25]のいずれかに記載の製造方法。
[27] 上記細菌CWS調製物が、さらに下記要件を満たす、[22]〜[26]のいずれかに記載の製造方法:
細菌CWS調製物の5〜20重量倍のスクワレン、1.5〜7重量倍のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルPS80を用いて、1mgCWS/mLとなるように作製された水中油型エマルションのゼータ電位と、細菌CWS調製物を用いない以外は同様にして作成されたビークル水中油型エマルションのゼータ電位の電位差が、3〜14mVである。
[28] 上記電位差が、4〜12mVである、[27]に記載の製造方法。
[29] 上記細菌CWS調製物が下記の条件を満たす、[22]〜[28]のいずれかに記載の製造方法:
TLR2と反応し、TLR4と反応しない。
[30] 上記細菌CWS調製物が、脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンの3層からなる、[22]〜[29]のいずれかに記載の製造方法。
[31] 上記細菌CWS調製物が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌からなる群から選択される細菌由来のものである、[22]〜[30]のいずれかに記載の製造方法。
[32] 上記細菌が、ミコバクテリウム属菌およびノカルジア属菌からなる群から選択されるものである、[31]に記載の製造方法。
[33] 上記細菌がBCG菌である、[32]に記載の製造方法。
[34] [22]〜[33]ののいずれかに記載の製造方法の工程(iv)において、さらに賦形剤を加えた上で乳化し、得られた水中油型エマルション製剤を凍結乾燥する工程を含む、細菌CWS水中油型エマルションの凍結乾燥製剤の製造方法。
[35] 上記凍結乾燥製剤が[19]に記載の製剤である、[34]に記載の凍結乾燥製剤の製造方法。
[36] 下記を満たす細菌の細胞壁骨格成分(CWS)調製物:
a)CWS調製物中の全非構成アミノ酸含量が0.8重量%以下(0〜0.8重量%)であり、かつ
b)オーラミン染色によるCWS調製物の蛍光面積率が10%以下(0〜10%)である。
[37] 上記CWS調製物の蛍光面積率が5%以下(0〜5%)である、[36]に記載のCWS調整物。
[38] 上記CWS調製物の蛍光面積率が2%以下(0〜2%)である、[37]に記載のCWS調整物。
[39] 上記CWS調製物(乾燥体)を生理食塩水中1mg/mLに分散させた場合の、分散の60分後のOD値(690nm)が分散直後のOD値と対比して0.4以上(0.4〜1.0)である、[36]〜[38]のいずれかに記載のCWS調整物。
[40] 上記60分後のOD値(690nm)が分散直後のOD値と対比して0.7以上(0.7〜1.0)である、[39]に記載のCWS調整物。
[41] さらに以下の条件を満たす、[36]〜[40]のいずれかに記載の細菌CWS調整物:
細菌CWS調製物の15重量倍のスクワレン、5重量倍のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルPS80を用いて、1mgCWS/mLとなるように作製した水中油型エマルションのゼータ電位と、細菌CWS調製物を含まない以外は同様にして作成されたビークル水中油型エマルションのゼータ電位の電位差が3〜14mVである。
[42] 上記細菌CWS調整物がレクチンに対して反応性を示すものである、[36]〜[41]のいずれかに記載の細菌CWS調製物。
[43] 上記レクチンが、コンカナバリンAである、[42]に記載の細菌CWS調製物。
[44] ハロゲン系有機溶媒を含有しない、[36]〜[43]のいずれかに記載の細菌CWS調製物。
[45] 界面活性剤を含有しない、[36]〜[44]のいずれかに記載の細菌CWS調製物。
[46] 上記細菌CWS調製物が、TLR2に反応し、TLR4に反応しない、[36]〜[45]のいずれかに記載の細菌CWS調製物。
[47] 上記細菌が、CWSに脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンを含むものである、[36]〜[46]のいずれかに記載の細菌CWS調製物。
[48] 上記細菌が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌からなる群から選択されるものである、[36]〜[47]のいずれかに記載の細菌CWS調製物。
[49] 上記細菌が、ミコバクテリウム属菌およびノカルジア属菌からなる群から選択されるものである、[48]に記載の細菌CWS調製物。
[50] 上記細菌が、BCG菌又はノカルジア菌である、[49]に記載の細菌CWS調製物。
[51] 上記細菌が、BCG菌である、[50]に記載の細菌CWS調製物。
[52] [36]〜[51]のいずれかに記載の細菌CWS調製物を含有する医薬組成物。
[53] 上記医薬組成物がエマルション製剤又は懸濁液製剤である、[52]に記載の医薬組成物。
[54] 上記懸濁液製剤が、水性懸濁液製剤である、[53]に記載の医薬組成物。
[55] 癌の治療のための、[52]〜[54]のいずれかに記載の医薬組成物。
[56] i)下記に特徴付けられる、細菌の精製菌体調製物を提供する工程:
a)ハロゲン系有機溶媒を含有しない、
b)PGLの含有量が、精製菌体調製物全量の0.4重量%以下(0〜0.4重量%)である、
ii)精製菌体調製物を破砕処理する工程、
iii)精製菌体破砕物の酵素処理を行う工程、および
iv)酵素処理後、洗浄する工程
を含む、細菌CWS調製物の製造方法。
[57] 精製菌体調製物のPGLとグリセロールモノミコール酸エステル(GroMM)の残存量が各々原料菌体の元の含有量の10重量%以下(0〜10重量%)である、[56]に記載の細菌CWS調製物の製造方法。
[58] 精製菌体調製物がTLR4に反応せず、TLR2に反応する、[56]または[57]に記載の細菌CWS調製物の製造方法。
[59] 上記細菌が、CWSに脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンを含むものである、[56]〜[58]のいずれかに記載の細菌CWS調製物の製造方法。
[60] 上記細菌が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌からなる群から選択されるものである、[56]〜[59]のいずれかに記載の細菌CWS調製物の製造方法。
[61] 上記細菌がミコバクテリウム属菌およびノカルジア属菌からなる群から選択されるものである、[60]に記載の細菌CWS調製物の製造方法。
[62] 上記細菌がBCG菌又はノカルジア菌である、[61]に記載の細菌CWS調製物の製造方法。
[63] 上記細菌がBCG菌である、[62]に記載の細菌CWS調製物の製造方法。
[64] 上記精製菌体調製物のCWS含量が35〜47重量%である、[56]〜[63]のいずれかに記載の細菌CWS調製物の製造方法。
[65] 精製菌体調製物が、上記精製菌体調製物の水性懸濁液を、公称濾過精度が1〜3μmのフィルターを用いて濾別した場合に、精製菌体調製物が濾取可能である、[56]〜[64]のいずれかに記載の細菌CWS調製物の製造方法。
[66] 上記酵素処理の酵素が蛋白質分解酵素である、[56]〜[65]のいずれかに記載の細菌CWS調製物の製造方法。
[67] 上記洗浄工程が、水又は水と親水性有機溶媒の混合溶媒で洗浄することを特徴とする、[56]〜[66]のいずれかに記載の細菌CWS調製物の製造方法。
[68] 界面活性剤を使用しないことを特徴とする、[56]〜[67]のいずれかに記載の細菌CWS調製物の製造方法。
[69] ハロゲン系有機溶媒を使用しないことを特徴とする、[56]〜[68]のいずれかに記載の細菌CWS調製物の製造方法。
[70] 実質的に細胞外付着成分を含まない、細菌の精製菌体調製物を提供する工程が、細菌の生菌あるいは死菌を、水と親水性有機溶媒の混合溶液中、還流下で加熱する工程を含む、[56]〜[69]のいずれかに記載の細菌CWS調製物の製造方法。
[71] 下記に特徴付けられる、細菌の精製菌体調製物:
a)ハロゲン系有機溶媒を含有しない、
b)PGLの含有量が、精製菌体調製物全量の0.4重量%以下(0〜0.4重量%)である。
[72] PGLとグリセロールモノミコール酸エステル(GroMM)の残存量が各々原料菌体の元の含有量の10重量%以下(0〜10重量%)である、[71]に記載の細菌の精製菌体調製物。
[73] TLR4に反応せず、TLR2に反応する、[71]〜[72]のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物。
[74] 上記細菌が、CWSに脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンを含むものである、[71]〜[73]のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物。
[75] 上記細菌が、ミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌からなる群から選択されるものである、[71]〜[74]のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物。
[76] 上記細菌がミコバクテリウム属菌およびノカルジア属菌からなる群から選択されるものである、[75]に記載の細菌の精製菌体調製物。
[77] 上記細菌がBCG菌又はノカルジア菌である、[76]に記載の細菌の精製菌体調製物。
[78] 上記細菌がBCG菌である、[76]に記載の細菌の精製菌体調製物。
[79] 上記精製菌体調製物のCWS含量が35〜47重量%である、[71]〜[78]のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物。
[80] 上記精製菌体調製物の水性懸濁液を、公称濾過精度が1〜3μmのフィルターを用いて濾別した場合に、精製菌体調製物が濾取可能である、[71]〜[79]のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物。
[81] 細菌の生菌あるいは死菌を、水と親水性有機溶媒の混合溶液中、還流下で加熱する工程を含む、細菌の精製菌体調製物の製造方法。
[82] 上記水と親水性有機溶媒の混合溶液中の水の含有量が10〜40重量%である、[81]に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
[83] 上記親水性有機溶媒として、メタノール、エタノール、1−プロパノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、アセトン、メチルエチルケトンから一つ以上が選択されることを特徴とする、[81]または[82]に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
[84] 上記親水性有機溶媒がメタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトンから一つ以上が選択されることを特徴とする、[83]に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
[85] 上記混合溶液から濾過処理にて精製菌体を分離することを特徴とする、[81]〜[84]のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
[86] 上記濾過処理を、公称濾過精度が0.45〜5μmであるフィルターを用いて行う、[85]に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
[87] 上記濾過処理が、圧迫濾過であることを特徴とする、[85]または[86]に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
[88] 上記精製菌体に存在する細胞外付着成分の含量を指標として精製の終点管理を行う、[81]〜[87]のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
[89] 上記指標として、PGL及び/又はGroMMの残存量をモニターすることを特徴とする、[88]に記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
[90] 上記終点管理が、PGLの残存量をモニターして、精製菌体中の残存量重量が0.4重量%以下(0〜0.4重量%)であることを確認することを特徴とする、[89記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
[91] 上記精製菌体調製物が、[71]〜[80]のいずれかに記載の精製菌体調製物である、[81]〜[90]のいずれかに記載の細菌の精製菌体調製物の製造方法。
本発明の「水中油型エマルション及びその凍結乾燥製剤」とは、本発明の細菌−CWSを用いて、例えば次のように製造できるものである。すなわち、(1)有機溶媒を用いて細菌−CWS及びスクワレン、スクワラン等の油との混合油状物(オイルペースト)を調製し、(2)界面活性剤としてポリソルベート類等を配合し、(3) 前記(2)を水中で乳化し乳化液を得る。(4)乳化液を賦形剤としてマンニトール等を配合した緩衝液で希釈し、希釈液とし、均一性に富む水中油型エマルションを製造することができ、(5)当該水中油型エマルションを凍結乾燥させることによって凍結乾燥製剤を得ることができる。
一方、公知な方法(特許文献3)で製造したBCG−CWSを用いた場合、水中油型エマルション作製に最少必要な油量が多く、その凍結乾燥製剤の保存安定性が低くかつ、保存安定性の再現性が低いことが分かった。これらのことから、BCG−CWSの形態及びその物性がエマルション及びその凍結乾燥製剤の保存安定性に大きく関与していることが分かった。
なお、前記のように、製造方法及び分析値が示され、純度あるいは不純物含量が明示されているBCG−CWS(特許文献3)を製造し検討した結果、水に対する分散性が非常に悪く水中油型エマルションへの変換効率が低く、そのエマルション、懸濁液及び水中油型エマルションの凍結乾燥製剤の安定性が低い、或いは再現性が無いことが分かった。そこで、水への分散性を中心としてBCG−CWSの形態に着目しその物性改良を指標として、製造方法を変えることによって水に対する分散性に優れたBCG−CWSを得ることができた。
本発明の「脂肪酸」とは、例えばマイコバクテリウム属由来のミコール酸やノカルジア属の有する脂肪酸を挙げることができる。好ましくはミコール酸を挙げることができる。
本発明の「糖鎖」とはマイコバクテリウム属またはノカルジア属のCWSなどに結合している糖鎖を言う。好ましくはアラビノガラクタンを挙げることができる。
1)レクチン(コンカナバリンA)との反応性
2)ゼータ電位
3)水中油型エマルションへの変換効率と水中油型エマルション及びその凍結乾燥製剤の安定性
が明らかに異なることが分かった。
1)レクチン(コンカナバリンA)との反応性:
レクチンに対し反応を示し凝集も確認されるが、公知BCG−CWSを用いたエマルションでは反応を示さない(図2)。
2)ゼータ電位:
ゼータ電位に関しては、BCG−CWSに対して重量比15倍量の油を用いた場合の水中油型エマルションでは強いゼータ電位(−15.2mV)を示し、一方特許文献3のBCG−CWSを用いたエマルションは、BCG−CWS非含有のビークルエマルション(−7.1mV)と同等のゼータ電位(―7.8mV)を示した。
エマルションの油量として、BCG−CWSに対して重量比3.8倍量を用いた場合、高いエマルションへの変換率(96%)を示し、一方で特許文献3のBCG−CWSを用いたエマルションは低い変換率(54%)であった(表5)。即ち、特許文献3のBCG−CWSを使用する場合、油量がBCG−CWSの3.8倍の場合には、エマルションを製造することができず、7倍以上の油量を用いた場合にのみ、エマルションが製造可能であることが示された。また、BCG−CWSの6倍の油量で製造した場合も、本発明BCG−CWSを用いた場合には98%のエマルションへの変換が認められたが、特許文献3のBCG−CWSを用いた場合には79%しか変換しなかった(表5)。この結果から、特許文献3のBCG−CWSの水中油型エマルションの作製には、7倍以上の油量が必須であることが示された。
エマルションの安定性は、特許文献3のBCG−CWSエマルションと比較して本発明のBCG−CWSエマルションの方が優れていた。例えば油量がBCG−CWSの重量比15倍量の室温3日保存時のエマルションからの含有BCG−CWSの減少量は、特許文献3のBCG−CWSエマルションでは24%減少し、本発明のBCG−CWSエマルションの場合では7%の減少であった(表7)。
以上の結果を支持する事実として、特許文献3のBCG−CWSを用いた安定な水中油型エマルションの凍結乾燥製剤として特許文献3に明示されている凍結乾燥製剤では油量がBCG−CWSの重量比18倍量のスクワランが用いられている。また、公知文献(Drug Discov. Ther., 2(3), 168−177(2008)、Drug Discov. Ther., 2(3), 178−187(2008))では公知のBCG−CWSを用いた水中油型エマルションの凍結乾燥製剤として、27倍量のスクワランが用いられている。
このように、本発明のBCG−CWSを用いたエマルションとしては、ビークルエマルションとのゼータ電位差が3〜14mVであり、好ましくは4〜12mVを挙げることができる。特に好ましくは、4〜11mVを挙げることができる。
なお、BCG−CWS及び油をそれぞれ蛍光化させたエマルションを観察したところ、蛍光が共局在しておりBCG−CWSがエマルション中の油粒子に封入されていることが確認されたが、ゼータ電位の相違及びレクチン(コンカナバリンA)との反応性を示すことは、エマルションの油粒子(油滴)の表面に糖鎖、即ちアラビノガラクタンが突出・露出した構造/形態を示している。即ち、本願の水中油型エマルションは、いままで知られているレクチンとの反応が陰性であることを特徴としている公知のエマルション(特許文献3)とは全く異なる新規な水中油型エマルションであることが確認できた(図3)。
1)免疫細胞に対するin vitro活性:
BCG−CWSの水中油型エマルションのinvitro活性については殆ど知られていないが、特許文献3のBCG−CWS及び本発明のBCG−CWSから作製した水中油型エマルションを用いて汎用の免疫細胞に対するin vitro活性について検討した。その結果、本発明のBCG−CWSから作製したエマルションは予想外に有意な活性を示した。即ち、特許文献3のBCG−CWSを用いたエマルションに比べ、Raw264.7細胞株では約16倍、TLR2遺伝子導入HEK細胞株では約22倍、BC−1細胞株では約6倍のin vitro活性を示した(図5、7、6)。
更に、エマルションを作製する前のBCG−CWS、油及び界面活性剤からなるオイルペースト(混合油状物)でそのin vitro活性を検討した。本発明のBCG−CWSから作製したオイルペーストは、Raw264.7細胞のin vitro活性を示すが、特許文献3のBCG−CWSから作製したオイルペーストは殆どその活性を示さなかった。本発明のBCG−CWSオイルペーストではオイル量が増大するにつれてその活性が低下した(図8)。この現象は、オイル量が増大するに従ってアラビノガラクタンの油滴表面への露出量の減少と相関していると考えられた(図9)。
BCG−CWSの水中油型エマルションの皮内投与後のBCG−CWSの挙動については、モルモットを用いた実験が知られている。即ち、その挙動は、公知のBCG−CWS水中油型エマルションでは皮内投与後3時間においてBCG−CWSの一部がリンパ節に移行することが報告されている。また、臨床効果に相当する薬効はリンパ節に移行したBCG−CWSが関与していることが示されている(Drug Discov. Ther., 2(3), 168−177(2008)、Drug Discov. Ther., 2(3), 178−187(2008))。そこで、簡単な評価系(試験例23)を構築しモルモットを用いて本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSの水中油型エマルションについて皮内投与後のBCG−CWSのリンパ節への移行性について検討した。その結果、1時間後にいずれのBCG−CWSもリンパ節に移行していることが認められた。また、そのBCG−CWSのリンパ節への移行量は本発明のBCG−CWSのエマルションの方が、特許文献3のBCG−CWSに比較して約2倍高いことが示された(表12)。
細菌−CWS、油、界面活性剤、賦形剤、緩衝剤、必要に応じて抗酸化剤が処方される。
本発明の「乳化」とは、分離している2つの液体をエマルションにすることを乳化という。乳化する作用をもつ物質を乳化剤といい、界面活性剤が使用される。即ち、エマルションとは、水と油のように互いに溶解しない液相の一方が他の一方に微細な液滴として分散したものであり(W.Clayton, Theory of emulsions, 4th ed., Blackstone, New York, 1943)、互いに溶解しない2つ以上の液相等からエマルションを形成する過程は乳化と称される(P.Becher, Emulsions:Theory and Pracice, Reinhold, New York, 1965)。
本発明の「水中油型エマルション凍結乾燥製剤」とは、上記水中油型エマルションを通常の方法で凍結乾燥したものである。
油の濃度は、具体的には、細菌−CWSに対し重量比にして、油が3〜30倍量の組成が挙げられる。
1)細菌−CWS及び油を、分散補助溶媒としての有機溶媒中で混合攪拌する工程;
2)上記1)の有機溶媒を留去する工程;
により調製することができる。用いられる有機溶媒としては、ヘキサン、ヘプタン、トルエン等の炭化水素系溶媒、5〜20%のエタノール等のアルコール系溶媒あるいはアセトン等のケトン系溶媒を含む上記炭化水素系溶媒が挙げられる。
ト80)等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビタンモノラウレート(Span20)、同モノパルミネート(Span40)、同モノステアレート(Span60)、同モノオレート(Span80)等を挙げることができる。 好ましい界面活性剤としては、卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、ポリソルベート80、ポリソルベート20、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60(HCO−60)、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油50(HCO−50)、ポリオキシエチレン(160)ポリオキシプロピレン(30)グリコール(プルロニックF68)を挙げることができる。より好ましくはポリソルベート80、ポリソルベート40、ポリソルベート60等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(ポリソルベート類)が挙げられ、さらに好ましくは、ポリソルベート20、ポリソルベート80及びその混合物が挙げられ、特に好ましい界面活性剤としてポリソルベート80を挙げることができる。
賦形剤としてアミノ酸などの緩衝作用を有する物質を用いる場合には、適宜緩衝剤の添加量を調整する。
なお、緩衝剤としてリン酸緩衝液が一般的に使用されているが、本発明の水中油型エマルションの場合には、処方成分の中で最も加水分解しやすいと考えられるポリソルベート80の安定性を指標として検討した結果、図12に示すように、リン酸緩衝液と比較してクエン酸緩衝液が明らかに安定性面及び緩衝能が優れていることが見出された。
本発明における凍結乾燥製剤を再懸濁するために使用される水性溶媒は、エマルション粒子の分散媒体となるものであり、注射用蒸留水、生理食塩水、または緩衝液等が挙げられるが、注射可能な水性溶媒であれば特に限定されない。ここで凍結乾燥製剤を再懸濁するために用いられる水性溶媒が生理食塩水や緩衝液などの無機塩を含む水性溶媒の場合、当該水性溶媒の組成については、再懸濁後の水中油型エマルション製剤の安定性等を考慮して、適宜選択すればよい。また、再懸濁後の水中油型エマルション製剤における無機塩(緩衝剤や賦形剤として添加された無機塩)の濃度は、ヒトに投与される場合に等張液となるように調整されることが好ましい。
前述の水中油型エマルションを凍結乾燥することによって、凍結乾燥製剤を製造することができる。すなわち、本発明の凍結乾燥製剤は、水中油型エマルションを凍結乾燥し、最後に通常はバイアル内部を窒素置換し、打栓を行うことにより得ることができる。水中油型エマルションを凍結乾燥する際、凍結乾燥温度、および時間等は特に限定されない。
本発明のエマルション凍結乾燥製剤の製造にあたっては例えば0.05〜4mL/バイアルまでの凍結乾燥が可能である。
投与量、投与回数は対象とする疾患、患者の疾患、症状、年齢、体重、性別等によって異なり、例えば、成人に対して週1回もしくは4週1回の投与で1回あたり細菌−CWS量として3〜200μgの範囲、好ましくは5〜120μgの範囲の投与を一例として挙げることができる。
本発明の「不純蛋白質」とは、細菌―CWSに含有される不純物に由来する蛋白質の総量のことをいう。不純物に由来する蛋白質の含量としては、細菌―CWS組成の1.0%以下であることが望ましい。より好ましくは、0.8%以下であることを挙げることができる。尚、本発明のBCG−CWSは特許文献3のBCG−CWSに比して高い純度を有している。
更に、本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSに関する1)抗体との反応、2)オーラミン染色、3)ゼータ電位等で多くの相違する知見が得られ、本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSの間には、BCG−CWSの形態・表面構造の相違が顕著であることが示された。
1)抗体との反応;
図18に示すように抗体との反応性が大きく異なっている。即ち、ウサギ抗BCG死菌IgG抗体との反応では、本発明のBCG−CWSは強い結合反応を示すが、特許文献3のBCG−CWSは結合反応を示さなかった。このように、抗BCG抗体を用いて、本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSの形態・表面構造の相違を明らかに判別できることが分かった。
本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSの形態・構造的相違は、図19、表3、の(a)と(b)で示されるオーラミン染色法の蛍光強度或いはその有無で評価することができる。オーラミン染色法は、細胞壁のミコール酸部分にオーラミンを付着させ染色する方法であるため、ミコール酸部分の密度が低下すると、洗浄処理で脱色され易くなる(顕微鏡 Vol.48,No.1, 51−56, (2013))。本法(試験例8)においても、本発明のBCG−CWSではオーラミン染色法で染色されないが(図19a)、特許文献3のBCG−CWSでは染色され、特許文献3のBCG−CWSのミコール酸による強い凝集、融合が認められた(図19b)。また、蛍光面積率で定量比較したところ、本発明のBCG−CWSは0.1%以下であるのに対し、特許文献3のBCG−CWSは80%以上を示した(表3)。即ち、特許文献3のBCG−CWSはオーラミン染色陽性であるのに対し本発明のBCG−CWSはオーラミン染色陰性であった。
この様に、本発明のBCG−CWSは、オーラミン染色の蛍光面積率として10%以下であり、好ましくは5%以下を挙げることができる。特に好ましくは、2%以下を挙げることができる。
更に、蛍光化コンカナバリンAを用いて、本発明と特許文献3のBCG−CWSの結合強度を比較したところ、本発明のBCG−CWSの方がコンカナバリンAと明らかに強く結合し、凝集を示した(試験例9)。
ゼータ電位について検討した結果、本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSを単純に水に分散した系でのゼータ電位を測定した場合には、特許文献3のBCG−CWSは凝集により測定できなかった。そこで、表面構造、形態に影響する可能性があるが、高圧破砕機を用いて粒度分布をそろえた上でゼータ電位を測定した。その結果、10%イソプロパノール水中、本発明のBCG−CWSは―22mVを示し、特許文献3のBCG−CWSはー30mVを示した(表4)。即ち、高圧破砕機による破砕後にも関わらず、本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSの表面構造が異なっていることが示された。
以上、本発明のBCG−CWSと、特許文献3のBCG−CWSのミコール酸の凝集を主眼に置いた形態を模式図に示すと、図14のように表わされる。本発明の「単一ピークの粒度分布」とは、細菌―CWSを生理食塩水又はn−ヘプタンに懸濁させた時のレーザー回折法で測定した時の粒度分布が単一なピークの粒度分布であることをいう。
更に、Raw264.7細胞を用いたin vitro活性評価においても、上記ゼータ電位差との相関がみられた。ゼータ電位差が大きい本発明のBCG−CWSの水中油型エマルションでは、TNF―αの誘導量が約1000pg/mL以上であるのに対し、電位差が殆どない特許文献3のBCG−CWSの水中油型エマルションは約300pg/mLであった(図15)。
即ち、この電位差の範囲(4〜11mV)のBCG−CWSであれば、レクチンと反応し、免疫細胞に対するin vitro活性を有する安定な水中油型エマルションが製造できる本発明のBCG−CWSである。
水への分散性が優れている本発明のBCG−CWSは水中油型エマルション、油中水型エマルションの製造に適すると共に、特許文献3のBCG−CWSでは製造が困難なBCG−CWS自身の懸濁液製剤の製造にも適したBCG−CWSである。
本発明のBCG−CWSは、特許文献3のBCG−CWSと比較して免疫細胞に対するin vitro活性が高く、例えば、図21に示されるようにマウス未成熟樹状細胞株(BC−1細胞)を用いたIL−12の誘導活性では、本発明のBCG−CWSは、特許文献3のBCG−CWSよりも約12.5倍の高い活性を示した。また、図22に示されるようにマウス樹状細胞株(JAWSII細胞)を用いたIL−12の誘導活性では、本発明のBCG−CWSは、特許文献3のBCG−CWSよりも、約3.2倍高いIL−12の誘導活性を示した。
また、Toll−Like Receptor(TLR)に対するアゴニスト活性については、TLR2についてはほぼ同等の活性を示し、TLR4に対してはいずれも活性を示さなかった(図24)
即ち、本発明の細菌―CWSを有効成分とする「医薬」とは、医薬(含動物薬)用途に使用される組成物のことを言い、例えば、抗癌剤、抗ウイルス剤、抗感染症薬、免疫賦活剤(アジュバント)、免疫機能調節剤等の用途に使用される。
本発明の医薬の剤形としては、公知の各種の剤形を使用することができる。例えば、各種エマルション製剤又は懸濁液製剤を挙げることができる。本発明の各種エマルション製剤又は懸濁液製剤としては、医薬用途に使用される細菌―CWSのエマルションや水性懸濁液のことを言い、例えばエマルションとしては、水中油型(o/w)エマルション、油中水型(w/o)エマルション、水中油中水型(w/o/w)エマルションなどが挙げられる。好ましくは水中油型エマルションを挙げることができる。例えば、公知の処方、製法で水中油型エマルションを製造した場合、本発明のBCG−CWSを用いることによって、特許文献3のBCG−CWSと対比して、BCG−CWSの含有率の高い水中油型エマルションが得られている。また、本発明のBCG−CWSを用いたエマルション製剤は、コンカナバリンAと反応しかつ免疫細胞に対し強いin vitroの活性を示す等、特許文献3のBCG−CWSを用いた水中油型エマルションとは異なったこれまでに無い特徴を持った水中油型エマルションを提供することができる。
更に、本発明のBCG−CWSは水への分散性に優れていることから、水への分散性の悪い特許文献3のBCG−CWSでは製造が困難なBCG−CWSの水性懸濁液の製造も必要に応じて可能である。例えば、膀胱癌の膀注療法への応用などが挙げることができる。また、腸管免疫に着目した錠剤あるいは腸溶剤のような経口固形剤としての応用を挙げることができる。
本発明の医薬組成物における細菌―CWSの含量は、注謝剤の場合は免疫応答を惹起するために、約1〜200μg/回の範囲にあり、好適には約5〜120μg/回の範囲を挙げることができる。また、本発明の医薬組成物は、適切な手段で投与することができ、それらには、注射、胸腔内投与、経口投与、鼻腔内投与、膀胱内投与等が含まれるが投与量含めそれらに限定されるものではない。好適な態様のひとつとして、皮内、皮下、胸腔内への注射を挙げることができる。
なお、本発明の第二の態様の用語で特に言及されておらず、本発明の第一の態様と共通する用語は、第一の態様の用語と同じ意味を表す。
本発明の「精製菌体の破砕」とは、乾燥精製菌体を使用することも可能であるが、通常はウェット精製菌体を用い水或いは水と親水性有機溶媒との混合溶液に懸濁し破砕する。破砕する手段には特に限定はないが、高圧破砕機、ビーズミル、超音波照射装置、ホモミキサーなどの破砕機を用いることが挙げられ、好ましくは高圧破砕機を用いることが挙げられる。高圧破砕機を用いる場合、20,000〜45,000psi好ましくは30,000〜45,000psiの圧力下に破砕することができ、その破砕物の粒度分布範囲は概ね0.1〜5.0μm、好ましくは0.1〜2.0μmである。なお、破砕工程においては発熱が起こるため、CWSの発熱による形態変化を回避するため、処理温度を4〜65℃の範囲で行うことが望ましい。より好ましくは4〜45℃の範囲を挙げることができる。破砕物は、必要に応じて1,000〜9,000×g、5〜30分間、好ましくは3,000〜8,000×g、5〜20分間の遠心分離によって、破砕が不十分な細胞片や破砕されていない細胞が除去された均一な上清が得られる。破砕後の液又は沈殿物(デブリス)除去後の上清を直接12,000〜20,000×g、好ましくは16,000〜20,000×gで遠心分離し、粗精製CWSが得られる。
本発明の「親水性有機溶媒」とは、水と混和する有機溶媒のことであり、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの低級アルコール、テトラヒドロフラン、アセトンであるが、1−プロパノール、ジオキサン、アセトニトリル、メチルエチルケトンを加えることができる。破砕処理、酵素処理、洗浄処理で用いる場合、好ましくは、メタノール、エタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフランなどを挙げることができ、より好ましくはイソプロパノールを挙げることができる。
水と親水性有機溶媒の混合溶液を用いる場合、親水性有機溶媒の含量としては、破砕処理においては0〜30容量%であり、好ましくは5〜15容量%を挙げることができ、酵素処理においては、0〜20容量%であり、好ましくは0〜10容量%を挙げることができる。洗浄処理においては、0〜30容量%又は70〜100容量%であり、好ましくは0〜30容量%を挙げることができる。
核酸分解酵素及び処理方法は特に限定はなく当業者に周知の酵素、処理方法を適宜用いることができる。核酸分解酵素としてDNase、RNaseを挙げることができる。好ましくは、DNaseを挙げることができる。具体的にはセラチア菌由来のエンドヌクレアーゼ(ベンゾナーゼ、Merck製)、ウシ膵臓由来2本鎖特異的エンドヌクレアーゼ(DNaseI、Roche製)などが挙げられ、好ましくはベンゾナーゼを挙げることができる。
核酸分解酵素処理温度、時間の範囲は酵素の種類に応じて適宜選択することが可能であるが、処理温度の範囲は20〜40℃が挙げられ、好ましくは20〜30℃が挙げられる。
蛋白質分解酵素及び処理方法は特に限定はなく当業者に周知の酵素、処理方法を適宜用いることができる。具体的にはプロナーゼ(Sigma−Aldrich)、パパイン、トリプシン、キモトリプシンなどを挙げることができる。好ましくは、プロナーゼ、パパインなどを挙げることができる。より好ましくはプロナーゼを挙げることができる。
蛋白質分解酵素処理温度、時間の範囲は酵素の種類に応じて適宜選択することが可能であるが、処理温度の範囲は、30〜45℃が挙げられ、好ましくは30〜40℃が挙げられる。
本発明の製造方法では、上記従来のBCG−CWSの製造方法における形態、物性変化の問題を克服するため、細胞外付着成分を除去した精製菌体を原料に用いた。このことにより、製造プロセス全体が効率化され、特に形態変化や物性変化が懸念される破砕後の水、親水性有機溶媒又はそれらの混合溶液中での処理時間・回数・温度が最小化し、また界面活性剤、ハロゲン系有機溶媒を一切使用しない新規な製造法となっている。それにより、界面活性剤とハロゲン系有機溶媒を含まない、高純度且つ、水への分散性に優れた各種エマルション、懸濁液、及びその凍結乾燥製剤の製造に適した物性を有するBCG−CWSを高収率に製造することに成功した。
なお、本発明の第三の態様の用語で特に言及されておらず、本発明の第一及び第二の態様と共通する用語は、第一及び第二の態様の用語と同じ意味を表す。
本発明の「細胞外付着成分」とは、抗酸菌の外脂質層に存在するか、あるいは内脂質層の細胞壁に付着する成分、例えば蛋白質等や遊離脂質、糖脂質、糖類、無機物等のことである(Microbiology Spectrum, 2(3), 1−19(2014)、Molecular Microbiology, 31(5), 1561−1572(1999))。細胞外付着成分として、例えば、抗酸菌の脂溶性物質としては、TDM、TMM(トレハロースモノミコレート)、GMM(グルコースモノミコレート)などの糖脂質、PIM(ホスファチジルイノシトールマンノシド)、PDIM、PGL、GroMM、ワックスD成分などの脂溶性の細胞外付着成分を挙げることができる。また、水溶性物質としては、MPB64(MycobacterialproteinfractionfromRmof 0.64inelectrophoresis)、MDP1(mycobacterial DNA−binding protein 1)等の蛋白質、LM(リポマンナン)、LAM(リポアラビノマンナン)等の水溶性の細胞外付着成分や、残存する培養液成分などを挙げることができる
このように、本発明の細菌の精製菌体又はその破砕物では、細胞外付着成分が除去されていることから、脂肪酸(例えばミコール酸)部分及び糖鎖(例えばアラビノガラクタン)部分が細胞表面に露出した精製菌体であることが特徴であり、精製菌体特有の物性や生物活性を示している。また、それに基づき、物性や生物活性が大きく向上、改善された前述の精製菌体に由来する破砕物、細菌―CWS、細菌―CWSエマルションの製造が可能となっている。
本発明の「終点管理」とは、精製菌体中に存在する除去効率の低い脂溶性成分、例えばPGL及び/又はGroMMの溶出量、又はその存在の有無に関して確認を行なうことであり、薄層クロマトグラフィー(TLC)や高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用して確認することである。洗浄の終点としては、例えばBCG死菌を使用し、HPLCでPGLを評価する場合、精製菌体を疎水性有機溶媒を用いて不純物を抽出し、その抽出液及びPGL標準品をHPLCで分析する。精製菌体中のPGL含量が0.5重量%(対乾燥精製菌体重量)以下に低減していれば洗浄工程の終点とする。好ましくは0.4重量%(対乾燥精製菌体重量)以下に低減していることが挙げられる。
本発明の「アルカリ加水分解」とは、例えば水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属の水酸化物を使用し、水溶液あるいはアルコール溶液として単独または混合して添加し、加水分解を行うことをいう。好ましいアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムを挙げることができる。より好ましくは、水酸化カリウムを挙げることができる。水溶液とアルコール溶液のアルカリ含量としては、適宜、目的に応じて選択することができ、例えば5〜15%(重量/容量)を挙げることができる。
本発明の「中和、酸性化」とは、アルカリ加水分解終了後、例えば塩酸、硫酸などの無機酸の水溶液でアルカリ溶液を中和し、酸性化することをいう。
(1)出発原料(BCG菌:M.bovis BCG Tokyo 172(ATCC35737))
上記BCG菌をソートン培地中37℃で初期定常期まで培地表面に菌膜として培養した。培養細胞を約30分間80℃に加熱することにより不活性化させ、遠心分離した。沈殿物として得られるBCG死菌を原料として、精製菌体を製造した。
(2)精製菌体製造
a)BCG死菌体1.19kg(ウェット、乾燥重量約240g)を66重量%テトラヒドロフラン水溶液5.78kg中、窒素雰囲気下、加熱還流、加圧熱濾過し、次いで60重量%テトラヒドロフラン水溶液で洗浄した。濾上物を60重量%テトラヒドロフラン水溶液中、窒素雰囲気下、加熱還流、加圧熱濾過し、PGL含量の減少を確認後、イソプロパノールで2回洗浄し濾上物480g(ウェット)を得た。濾上物にイソプロパノール水溶液を添加し3回洗浄し精製菌体475.3g(ウェット、乾燥重量約152g)を得た。CWS含量:45.5%(HPLC)、テトラヒドロフラン含量:0.04%(ガスクロマトグラフィー)、BCG死菌体中のPGL量(全体の約2重量%)に対するPGL残存量:9.3%(HPLC)、乾燥精製菌体中のPGL含量0.3%
c)培養菌体を直接約60分間60重量%テトラヒドロフラン水溶液中で加熱処理することにより不活化させ、同時に上記精製処理を進めることによって精製菌体を得ることができた。
本発明の精製菌体の精製度を確認するため、細胞外付着成分の残存量を以下の方法で評価した。
(1)PGL残存量の測定(高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による評価)
BCG死菌体(乾燥体)及び精製菌体(乾燥体)約30mgを秤量し、それぞれにクロロホルム2mLを正確に加え、超音波・攪拌機で十分に懸濁させた。精製水2mLを加え、攪拌し、遠心分離した。クロロホルム層を0.22μmフィルターで濾過し、濾液を下記条件で分析した。その結果、PGLの残存量は、9.3%であった(実施例1(2)−a))。
TLCによるPGL、GroMMの残存量の測定を行った。実施例1のBCG死菌体(ウェット)及び精製菌体(ウェット)をそれぞれ約20mg秤量し、脂溶性の高いPGLとGroMMを溶出させるためトルエン100μLを加えた。攪拌・超音波照射後、21,040×g、5分間遠心分離し、上清の薄層クロマトグラフを行った。展開溶媒はクロロホルム/アセトン(19:1、容積/容積)を使用し検出にはモリブデン酸アンモニウムセリウム溶液を用いた。その結果を図25aに示した。
図25a)−(a)に示される呈色の強度から、BCG精製菌体(実施例1(2)−b))には、PGLの残存はほとんど認められず、GroMMの残存が僅かに認められた。BCG死菌体のPGL含量は約2%(試験例2―2)であり、また,BCG死菌体のGroMMの含量は、図25a)−(b)に示されるように、PGLとほぼ同量であることが分かった。
そこで、BCG精製菌体のPGLとGroMMの残存量を算出することを行った。BCG精製菌体中のPGLとGroMMの含量は、図25a)−(a)で示されている。一方、BCG死菌体のPGLとGroMMの含量は、図25a)−(c)で示されているので、これと比較すると、圧倒的にBCG精製菌体中のPGLとGroMMの含量は低減している。
更に、定量のため、BCG死菌体の洗浄液のTLC添加量を1/10にした図25a)−(b)の結果と、図25a)−(a)のBCG精製菌体の洗浄液の結果を対比した。その結果、BCG精製菌体(図25a)−(a))では、BCG死菌体に含有されるPGL量とGroMM量の1/10量(図25a−(b))と比較すると、TLCの呈色の強度から、PGLの残存量が、図25a)−(c)の1/10以下であることが分かった。更に、GroMMの残存量は、図25a)−(c)の約1/10以下になっていることが分かった。
以上のことから、本発明のBCG精製菌体のPGLとGroMMの残存量は、原料のBCG死菌体の
それぞれの含量に対して10重量%以下に低減していることを確認した。
(1)方法
実施例1(2)−a)の精製菌体(乾燥体)を4mg秤量し、0.5M水酸化カリウム溶液1mL中65℃、3時間加熱を行った。また、標品のCWSを秤量して同様の操作を行い、それぞれの溶液中に遊離するミコール酸をADAM(9−Anthryldiazomethane、商標、フナコシ)試薬により蛍光標識し、HPLCにより分析した。HPLC条件:カラム温度:50℃、励起波長:365nm、測定波長:412nm、流速:約1.0mL/分、注入量:10μL、測定時間:60分、移動相:メタノール、トルエン(グラジエント)、カラム:野村化学製 Develosil C30−UG−3(3μm、4.6×150mm)
標品のCWSと対比し、本発明の精製菌体には、含量45.5%のCWSを含むことが示された。尚、実施例5で得たBCG−CWSを実施例6と同様に再精製しBCG−CWS標品とした。
(1)方法
試験例1(1)と同様にして、PGL標品を用いて測定した。但し、実施例1(2)の60容量%THF水溶液洗液からシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより単離精製したPGLを標品とした。
(2)結果
その結果BCG死菌体及び精製菌体中のPGL含量はそれぞれ2.0重量%、0.3重量%であった。
細胞外付着成分に対する本発明の水と親水性有機溶媒の混合溶液の洗浄効果を明らかにするため、特表2011−500540に記載される菌体の洗浄液として良く用いられるクロロホルム/メタノール混合溶媒(1:1、容積/容積)の洗浄効果と本発明の洗浄効果を比較することを行った。
(1)洗浄方法
a)公知のクロロホルム/メタノール洗浄
上記公知文献(特表2011−500540)に準じて、BCG死菌体10g(ウェット、乾燥体約2g)にクロロホルム/メタノール混合溶媒(1:1、容積/容積)50mLを加え、窒素雰囲気下、60分間攪拌した。懸濁液を吸引濾過し、濾上物をクロロホルム/メタノール混合溶媒(1:1、容積/容積)10mLで共洗い洗浄した。この操作までの洗浄液を濃縮し抽出物334mgを得た。
更に、洗浄後の死菌体にクロロホルム/メタノール混合溶媒(1:1、容積/容積)50mLを添加し、窒素雰囲気下、60分間攪拌した。懸濁液を吸引濾過し、濾上物をクロロホルム/メタノール混合溶媒(1:1、容積/容積)10mLで共洗い洗浄し、再洗浄液を得た。
BCG死菌体10g(ウェット、乾燥体約2g)に90容量%テトラヒドロフラン水50mLを加え、窒素雰囲気下、60分間加熱還流した。吸引濾過により濾上物と濾液に分離し、75容量%テトラヒドロフラン水10mLで共洗い洗浄し濾過した。この操作までの濾液を濃縮し抽出物415mgを得た。
この濾上物に75容量%テトラヒドロフラン水溶液50mLを添加し、窒素雰囲気下、60分間加熱還流した。吸引濾過により濾上物と濾液に分離し、75容量%テトラヒドロフラン水溶液10mLで共洗い洗浄し濾過し、再洗浄液を得た。
(2)洗浄効果の比較
抽出物量については、クロロホルム/メタノール混合溶媒(1:1、容積/容積)では334mgの不純物除去量であったが、テトラヒドロフラン水溶液では415mgであった。しかも、クロロホルム/メタノール混合溶媒では図25bに示されるように2回目の洗浄でも明らかに多くの不純物が検出されている。このように、テトラヒドロフラン水溶液の洗浄効果が高いことが示された。
a)評価サンプルの調製
加温減圧乾燥したBCG菌体(死菌)又は精製菌体をそれぞれホモジナイザーベッセルに5mg秤量し、生理食塩水約2mLを加えた。ポッターホモジナイザーを用いて1,200rpmで5分間ホモジナイズし、BCG菌体(死菌)又は精製菌体の懸濁液とした。
b)評価方法
上記懸濁液の評価サンプル50μLにローダミン標識コンカナバリンA溶液(ConA−Rho、フナコシ)2μLを添加し、穏やかに混合した後、共焦点レーザー走査型顕微鏡で観察した。
c)観察結果
図26に示すように、ConAの結合は、死菌の一部に見られたが、精製菌体の場合には、ほぼ全ての菌体にConAが結合することを確認した。死菌に比べ精製菌体の表面には、アラビノガラクタンを主とする糖鎖部分が顕著に露出していることが明らかになった。
(1)TNF−α産生量の測定
a)評価サンプルの調製
約4mgのBCG菌体(死菌)、精製菌体及び精製菌体破砕物(乾燥体)に約1mLの0.01重量%ポリソルベート80含有生理食塩水を加え、ポッターホモジナイザーで3,000rpm、5分間、室温で懸濁した。各懸濁液のCWS含量を測定し(試験例2と同様)、10%FBS含有DMEM培地で10μgCWS/mLに調製し評価サンプルとした。
b)測定方法
公知方法(Drug Discov.Ther., 5(3), 130−135(2011))に準じて、RAW264.7細胞(商標、ATCC No.TIB−71)を96wellマイクロプレートに5×10^4cells/wellで播種した。37℃、5%CO2、10%FBS含有DMEM培地で5時間培養して接着させた後、評価サンプルを添加し、20時間培養後、培養上清中のTNF−α濃度をサイトカインELISA法により測定した。
c)測定結果
図28aに示されるように、本発明の精製菌体は、原料であるBCG菌体(死菌)より、約1.3倍の高いTNF−αの誘導活性を示した。
更に、本発明の精製菌体の破砕物も、図28bに示されるように、本発明の精製菌体と同様の高いTNF−αの誘導活性を示した。
a)評価サンプルの調製
試験例4(1)−a)と同様にしてBCG菌体(死菌)、精製菌体及び精製菌体破砕物(乾燥体)を用いて10μg/mLの評価サンプルを調製した。
b)測定方法
公知方法(Cancer Sci., 99(7), 1435−1440(2008))に準じて、HEK−Blue−hTLR2細胞(商標、INVIVOGEN)を96wellマイクロプレートに5×10^4cells/wellで播種した。37℃、5%CO2、10%FBS含有DMEM培地で24時間培養して接着させた後、評価サンプルを添加し、24時間培養後、培養上清をQUANTI−Blue(商標、INVIVOGEN)と37℃、60分間反応させた後、マイクロプレートリーダーを用いて655nmの吸光度を測定した。
c)測定結果
図27aに示されるように、本発明の精製菌体は、原料であるBCG菌体(死菌)より、約1.6倍高いTLR2への活性を示した。
更に、本発明の精製菌体の破砕物も、図27bに示されるように、本発明の精製菌体の約0.7倍のTLR2への活性を示した。
a)評価サンプルの調製
試験例4(1)−a)と同様にしてBCG菌体(死菌)、精製菌体及び精製菌体破砕物(乾燥体)を用いて10μgCWS/mLの評価サンプルとした。また、対照検体のリポ多糖(Standard LPS from E.coli O111:B4、INVIVOGEN)は、10%FBS含有DMEM培地で1ng/mLに調製した。
b)測定方法
公知方法(Cancer Sci., 99(7), 1435−1440(2008))に準じて、HEK−Blue−hTLR4細胞(商標、INVIVOGEN)を96wellマイクロプレートに5×10^4cells/wellで播種した。37℃、5%CO2、10%FBS含有DMEM培地で24時間培養して接着させた後、評価サンプルを添加し、24時間培養後、培養上清をQUANTI−Blue(商標、INVIVOGEN)と37℃、60分間反応させた後、マイクロプレートリーダーを用いて655nmの吸光度を測定した。
c)測定結果
図27cに示されるように、本発明の精製菌体は、原料であるBCG菌体(死菌)と同様にTLR4に対する活性を示さなかった。
なお、本発明の精製菌体の破砕物も、図27dに示されるように、本発明の精製菌体と同様にTLR4に対する活性を示さなかった。
a)評価サンプルの調製
試験例4(1)−a)と同様にしてBCG菌体(死菌)、精製菌体及び精製菌体破砕物(乾燥体)を用いて200μgCWS/mLの評価サンプルを調製した。
b)測定方法
マウス樹状細胞株(JAWSII細胞)を96wellマイクロプレートに5×10^4cells/wellで播種した。37℃、5%CO2、20%FBS含有MEMα培地で4時間培養して接着させた後、評価サンプルを添加し、44時間培養後、培養上清中のIL−12濃度をサイトカインELISA法により測定した。
c)測定結果
図29に示されるように、本発明の精製菌体は、BCG菌体(死菌)よりも約4倍高いIL−12の誘導活性を示した。
ノカルジア・ルビア死菌体(JCM2156株)5g(ウェット)を順次65重量%テトラヒドロフラン水溶液25g、60重量%テトラヒドロフラン水溶液50gで60分間加熱還流後、90重量%アセトン水溶液で洗浄、熱濾過し精製菌体0.7g(乾燥)を得た。
(1)原料
実施例1と同様にして製造したBCG精製菌体を使用した。
(2)破砕物の製造
上記BCG精製菌体1.1g(乾燥体)を10容量%イソプロパノール水溶液40gに懸濁し、電動ホモジナイザー(Omni TH、Omni−international)で攪拌(20,000rpm、60℃、5分)した後、BERYU MINI(美粒)を用いて室温下、20,000psiで破砕した。破砕液の一部を凍結乾燥機(ALPHA 2−4、MARTIN CHRIST)を用いて凍結乾燥し、精製菌体破砕物の乾燥体50mgを得た。CWS含量:38.2%(HPLC)
(1)ミコール酸の製造
精製菌体(乾燥体)140gを10%(重量/容積)水酸化カリウム−50容量%イソプロパノール水溶液1.4L中で2時間加熱還流後、冷却下で水1.4L加え、さらに6M塩酸で酸性化した。n−ヘプタン2.1Lで2回抽出を行い、n−ヘプタン層を水1.4Lで2回洗浄した後、90容量%エタノール水溶液1.4Lで2回洗浄後、得られたn−ヘプタン層を減圧濃縮し、白色粉末のミコール酸14.6gを得た。
(2)ミコール酸の純度
上記ミコール酸の純度を確認するため、誘導体を作製しHPLCによる分析を行った。ミコール酸含量は98%と高純度であった。
HPLCの条件:誘導体化試薬:ADAM(商標、フナコシ)、カラム温度:50℃、励起波長:365nm、測定波長:412nm、流速:約1.0mL/分、注入量:10μL、測定時間:60分、移動相:メタノール、トルエン(グラジエント)、カラム:野村化学製Develosil C30−UG−3(3μm、4.6×150mm)
(1)原料
実施例1G精製菌体を使用した。
(2)CWSの製造
a)精製菌体の破砕
BCG精製菌体223.6g(ウェット、乾燥重量約71.6g)を10容量%イソプロパノール水溶液に懸濁し、高圧ホモジナイザーDeBEE2000(登録商標、BEEインターナショナル)を用いて35kpsiで破砕し、25℃下に6800×gで10分間遠心分離した。次いで、上清を25℃下に18000×gで60分間遠心分離し、粗精製CWSを176.7g(ウェット、乾燥重量約40.6g)を得た。
BCG精製菌体224.6g(ウェット、乾燥重量約71.9g)を同様に処理し粗精製CWS187.2g(ウェット、乾燥重量約46.6g)を得た。
b)蛋白質分解酵素処理
粗精製CWS271.2g(ウェット、乾燥重量約65g)を、10mMトリス塩酸緩衝液/イソプロパノール(95:5、容積/容積、pH8.0)混合液3.2kgに懸濁させた。プロナーゼ(Sigma−Aldrich)2gを10mMトリス塩酸緩衝液/イソプロパノール(95:5、容積/容積、pH8.0)混合液780gに溶かし、上記破砕品懸濁液に添加し、37℃で4時間反応した。反応液を室温下に18000×gで60分間遠心分離して沈殿物を得た。
c)洗浄処理
上記沈殿物を10倍重量の5容量%イソプロパノール水溶液に懸濁させ、室温下に遠心分離し、さらに20容量%イソプロパノール水溶液に懸濁させ40℃で30分間攪拌した後、遠心分離して沈殿物を得た。更に、イソプロパノールに懸濁後、遠心分離して沈殿物を得た。沈殿物を減圧乾燥し、白色粉末のBCG−CWS32.5gを得た。(死菌からのCWSへの収率18.8%;死菌から精製菌体への収率61.2%、精製菌体からCWSへの収率30.8%)
本発明のBCG−CWSの組成の分析結果を表1に示す。なお比較のために、特許文献3に従って製造したBCG−CWS(参考例2)組成の分析値と、特許文献3に記載されたBCG−CWSの文献値を併せて記載する。
本発明のBCG−CWSでは、これら特許文献3のBCG−CWSと比較し、不純物に由来する全非構成アミノ酸の含量が1.0%以下であった。上記表1に示されるように、公知のBCG−CWSでは不純物に由来する全非構成アミノ酸の含量が1.0%以下になることはなかったが、本発明によって初めて1.0%を切る高純度のBCG−CWSを取得できるようになった。このように、公知のBCG−CWSの製造方法と比較して、本発明のより簡易なBCG−CWSの製造方法において、BCG−CWSにおける純度の向上が得られたことは、細胞外付着成分の除去された精製菌体を使用したことがその大きな要因になっていると考えられる。
実施例5得たBCG−CWS100mgを20容量%イソプロパノール水溶液5mLに懸濁させ、40℃で30分間攪拌した後、室温下で遠心分離して沈殿物を得た。これを繰り返して、再精製BCG−CWSを99.5mg得た。得られた再精製BCG−CWSをMicro BCA Protein Assay Kit(商標、Thermo FisherScientific)を用いて、蛋白質含量の定量を行った。以下の表2に示されるように、再度精製を行うことによってさらに不純物に由来する蛋白質含量が減少した。
a)破砕処理
578gのBCG死菌(ウェット、乾燥重量約111g)を3Lの水に懸濁し、MiniDeBee(登録商標、BEEインターナショナル)を用いて35kpsiで破砕した。それらを25℃下に6,760×gで10分間遠心分離した。次いで、上清を25℃下に18,000×gで60分間遠心分離し沈殿を得た。
b)核酸分解酵素処理と蛋白質分解酵素処理
上記沈殿に、ベンゾナーゼ(Merck Ltd.)を加え25℃で17時間反応した。遠心分離で沈殿を回収し1重量%トライトンX−100水溶液で懸濁/遠心操作(沈殿回収)を5回繰り返し洗浄した後、プロナーゼ(Sigma−Aldrich)を加えて37℃で17時間反応した。25℃下に18000×gで20分間遠心分離して沈殿を集め、1重量%Triton X−100水溶液中に再懸濁させ、60℃で2時間撹拌し、遠心分離して沈殿を得た。
c)洗浄処理
遠心分離後の沈殿をエタノール、テトラヒドロフラン、クロロホルム/メタノール(2:1、容積/容積)、メタノールで順次洗浄した。残渣を乾燥し、乾燥BCG−CWS14gを得た。(死菌からの収率12.6%)
d)組成分析データ
乾燥BCG−CWSの組成は表1に示した。公知法(特許文献3)に従って製造されたBCG−CWSの組成は、表1に示されるように、文献値(特許文献3)とほぼ同一であることから、特許文献3のBCG−CWSを再現して製造できていることが確認できた。
(1)測定サンプル
A:本発明のBCG−CWS(実施例5のサンプル)
B:特許文献3のBCG−CWS(参考例2のサンプル)
(2)分散性の測定方法:
上記のBCG−CWSをそれぞれホモジナイザーベッセルに5mg秤量し、生理食塩水約2mLを加えた。スリーワンモーターを用いて1,200rpmで5分間ホモジナイズし懸濁液とした。この液を1mg/mLに調製し、1.5mLを3mL容プラスチックキュベットに添加した。分光光度計(U−5100、日立ハイテクサイエンス)を用いて吸光度(690nm)を60分間経時的に測定した。測定0分の吸光度を1とし、相対的な値(物性値)を算出した。
測定結果を図13に示す。本発明のBCG−CWS(A)を生理食塩水中に分散させた時のOD相対値(物性値)は、測定時間内(60分間)において大きな変化が認められなかった。分散開始から60分後でも、0.98のOD相対値(物性値)を示した。
一方、特許文献3のBCG−CWS(E)は、生理食塩水中に分散後、OD相対値(物性値)が速やかに低下を始め、60分後に0.22に低下し、BCG−CWSの沈降が認められた。
尚、本発明のBCG−CWS製造の小実験検討等の中でOD相対値(物性値)が0.9以上のBCG−CWS以外に、0.75、0.58、0.48を示すBCG−CWSも得られた。
以下、本発明BCG−CWSのOD相対値(物性値)が実施例5のサンプルを中心に0.9以上、0.75、0.58、0.48の各サンプルについて各々A、B、C、Dと表し参考例2のサンプルをEと表す。
本発明のBCG−CWS(実施例5)と特許文献3のBCG−CWS(参考例2)の抗BCG死菌抗体との結合性をサンドイッチ・ELISA法にて評価した。
(1)試剤
ウサギ(Japanese white)抗BCG死菌IgG抗体を作製し、使用した。
(2)方法
ウサギ抗BCG死菌IgG抗体をNunc−immuno plateII(商標、Nunc)に固層化した。上記のBCG−CWSとそれぞれ反応後、ビオチン標識した抗BCG死菌抗体を添加し、室温で60分間静置した。Streptavidin−HRP Conjugate(Vector Lab.)を添加し、室温で60分間静置した。発色試薬(Stabilized hydorogen peroxide, R&D)を加え、室温で反応後、1N硫酸を加え反応を停止した。マイクロプレートリーダーを用いて450nmの吸光度を測定した。
(3)結果
測定結果を図18に示す。本発明のBCG−CWSは抗BCG死菌抗体に反応性が高いが、特許文献3のBCG−CWSは抗BCG死菌抗体に反応性が非常に低かった。抗BCG抗体を1000ng/mL使用した場合に、本発明のBCG−CWSは結合反応を示した(OD450値:0.34)。また、上記抗BCG死菌抗体を500ng/mL使用した場合にも、本発明のBCG−CWSは結合反応を示した。しかし、特許文献3のBCG−CWSは、いずれの抗体添加量でも結合反応を示さなかった(OD450値:0.01)。このように、抗BCG死菌抗体を用いて、本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSのCWS表面構造が異なっていることが示された。
このように、抗体が認識するBCG−CWSの表面構造は、本発明のBCG−CWSの場合と、特許文献3のBCG−CWSの場合とでは大きく異なっていることを示している。
本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSの粒度分布を比較することを行った。
(1)方法
ポッター型ホモジナイザーを用いて生理食塩水、又は超音波発生装置を用いてn−ヘプタンに上記CWSをそれぞれ懸濁させ、粒度分布測定装置(SALD−2200、島津製作所)を用いて粒度分布を評価した。
a)生理食塩水中での懸濁:
BCG−CWSをホモジナイザーベッセルに約5mg秤量し、生理食塩水約2mLを加えた。1,200rpmで5分間ホモジナイズし懸濁液とした。
b)n−ヘプタン中での懸濁:
BCG−CWSを試験管に約5mg秤量し、n−ヘプタン約2mLを加えた。超音波発生装置により懸濁させた。
(2)結果
粒度測定の結果を図20に示す。本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSは生理食塩水中では共に単一のピークの粒度分布を示した(図20(a))。しかし、n−ヘプタン中では0.1〜100μmの範囲において、本発明のBCG−CWSは単一の粒子径ピークを示し、特許文献3のBCG−CWSは2つの粒子径ピークを示した(図20(b))。本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSは生理食塩水中とn−ヘプタン中での粒度分布挙動が大きく異なっていた。
本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSの形態的な相違をオーラミン染色法により比較した。
(1)評価サンプル
本発明のBCG−CWS:A、B、C、D
特許文献3のBCG−CWS:E
(サンプル名は試験例5に基づく)
(2)方法:
公知文献(顕微鏡,48(1), 51−56(2013))を参考に、BCG−CWS約5mgにオーラミン水溶液(0.15mg/mL)を500μL加え、ホモジナイザーで分散後、遮光条件下、10分間攪拌した。遠心分離(21,040×g、10分間)し、残渣に水500μLを加えホモジナイザーで分散後、遠心分離し、残渣に0.5容量%HCl・エタノール混液500μLを加え分散し、遠心分離した。前記操作を更に1回繰り返した。水500μLを加え分散後、遠心分離し、残渣に0.1重量%過マンガン酸カリウム水溶液500μLを加え分散させ、遠心分離した。残渣に水500μLを加え分散させ、遠心分離した。前記操作を更に1回繰り返した。沈殿にヘプタン/エタノール(9:1、容積/容積)混液100μLを加え分散させ、この懸濁液2μLをスライドガラスに滴下・風乾した後、蛍光顕微鏡(株式会社キーエンス、BZ−X710)を用いて観察(40倍拡大の視野、露光時間1/5秒)し、解析ソフト(BZ−X Analyzer)を用いて試料総面積当たりの蛍光面積の比率を算出した。
(3)結果:
上記測定サンプルの観察写真を図19(注1)に、蛍光面積率・判定の結果を表3に示す。オーラミン染色の結果、本発明のBCG−CWS(A)〜(D)では蛍光はほとんど観測されなかったが(蛍光面積の比率0.1%以下)、特許文献3のBCG−CWS(E)では、強い蛍光が観測され(蛍光面積の比率89.43%)、蛍光面積率10%以下である(A)〜(D)は陰性、10%以上であった(E)は陽性と判定した。
上記オーラミン染色の結果から、本発明のBCG−CWS(A)〜(D)では、ミコール酸部分の密度が低く、強い凝集又は融合していないことが示された。一方、特許文献3のBCG−CWS(B)では、ミコール酸部分の密度が高く、強く凝集又は融合していることが示された。更に、水への分散性(物性値)が0.4以上ではオーラミン染色が陰性を示すことが明らかとなった。
(注1:レーザー走査型共焦点顕微鏡(FV−1000、オリンパス)の100倍拡大の視野で観察)
(1)評価サンプル
本発明のBCG−CWS(A)
特許文献3のBCG−CWS(E)
(試験例5のサンプルを使用)
(2)方法
試験例5と同様にしてポッター型ホモジナイザーを用いて生理食塩水に上記(1)のBCG−CWSをそれぞれ懸濁させた。各評価サンプルの懸濁液50μLにローダミン標識コンカナバリンA溶液(フナコシ)2μLを添加し、軽くピペッティングし、スライドグラスに適量滴下し、風乾させ共焦点レーザー走査型顕微鏡で観察した。
(3)結果
蛍光化コンカナバリンAを用いて、本発明と特許文献3のBCG−CWSの結合強度を比較したところ、本発明のBCG−CWSの方がコンカナバリンAと明らかに強く結合し、凝集を示した。
(1)評価サンプル
本発明のBCG−CWS(A)
特許文献3のBCG−CWS(E)
(試験例5のサンプルを使用)
(2)方法
上記(1)のBCG−CWS50mgにイソプロパノール5mLを添加し5分間超音波照射し分散させた後、50mLとなるように蒸留水を添加した(イソプロパノール終濃度、10容量%)。高圧破砕機(BERYU−MINI、美粒)を用いて、20,000psiで破砕しサンプル分散液とした。各評価サンプル分散液50μLを10容量%イソプロパノール水溶液2mLに加え混合した後、ゼータサイザー(マルバーン、Nano−ZS)でゼータ電位を測定した。
(3)結果
表4に示すように、本発明のBCG−CWSは約―22mVのゼータ電位を示し、特許文献3のBCG−CWSは約―30mVのゼータ電位を示した。即ち、本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSの表面構造が異なっていることが示された。
本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSの形態的な相違に基づく、生物活性(TNF−αの産生量)への影響を比較した。
(1)評価サンプルの調製
約4mgの本発明のBCG−CWS及び特許文献3のBCG−CWSに約2mLの0.01重量%ポリソルベート80含有生理食塩水を加え、ポッター型ホモジナイザーで3,000rpm、5分間、室温で懸濁した。各懸濁液のCWS含量を測定し(試験例2と同様)、10%FBS含有DMEM培地で10μgCWS/mLに調製し評価サンプルとした。
(2)測定方法
試験例4(1)と同様の方法に準じて測定した。
(3)測定結果
図23に示されるように、本発明のBCG−CWSは、特許文献3のBCG−CWSより、約2.8倍の高いTNF−αの誘導活性を示した。
本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSの形態的な相違に基づく、生物活性(TLR2とTLR4)への影響を比較した。
(1)評価サンプルの調製
本発明のBCG−CWS或いは、特許文献3のBCG−CWSを用いて、試験例4(2)、(3)と同様にして評価サンプルを調製した。また、対照検体のリポ多糖(Standard LPS from E.coli O111:B4、INVIVOGEN)は1ng/mLに調製した。
(2)測定方法
試験例4(2)、(3)の方法に準じて測定した。
本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSは、いずれも図24―a)に示すようにTLR2に反応するが、図24―b)に示すようにTLR4には反応しなかった。
本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSの形態的な相違に基づく、生物活性(IL−12の産生量)への影響を比較した。
(1)評価サンプルの調製
本発明のBCG−CWS或いは、特許文献3のBCG−CWSを用いて、試験例4(4)と同様に実施した。但し、最終調製サンプル液は20%FBS含有MEMα培地で100ngCWS/mL(BC−1)、100μgCWS/mL(JAWSII)とした。
(2)IL−12の測定方法
a)マウス未成熟樹状細胞株(BC−1細胞)を用いた活性評価:
公知方法(J Leukoc Biol. 2002 Jan;71(1):125−32)に準じて実施した。BC−1細胞を96wellマイクロプレートに5×10^4cells/wellで播種した。37℃、5%CO2、20%FBS含有MEMα培地で5時間培養して接着させた後、評価サンプルを添加し、20時間培養後、培養上清中のIL−12濃度をサイトカインELISA法により測定した。
b)マウス樹状細胞株(JAWSII細胞)を用いた活性評価:
試験例4(4)の方法に準じて測定した。
(3)測定結果
a)BC−1細胞を用いた活性評価:
本発明のBCG−CWSは、図21に示されるように特許文献3のBCG−CWSと比較すると、コントロール(生理食塩水)をベースラインとして、約17倍のIL−12の誘導能を示した。
b)JAWSII細胞を用いた活性評価:
本発明のBCG−CWSは、図22に示されるように特許文献3のBCG−CWSと比較すると、約3.2倍のIL−12誘導能を示した。
本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSの間には、図14(a)又は(b)と図14(c)のような形態的相違が考えられている。そこで、図14(c)から図14(a)又は(b)に形態的、物性的な変換が可能か否かを検討した。
上記特許文献3のBCG−CWS10mgをn−ヘプタン1mLに懸濁し、90℃、5又は10時間加熱処理を行った。処理後懸濁液を室温下に18,000×gで60分間遠心分離して沈殿物を得た。得られた沈殿物を減圧乾燥し、試験例7の方法にて濁度測定を行った。
その結果を図16aに示す。この結果に示されるように、有機溶媒中加熱を行っても特許文献3のBCG−CWSには、分散性の改善は認められなかった。
特許文献3のBCG−CWS41mgを10容量%イソプロパノール水溶液20mLに懸濁し、BERYU MINI(美粒)を用いて20,000psiで再破砕処理を行った。破砕後懸濁液を室温下に18,000xgで60分間遠心分離して沈殿物を得た。沈殿物を減圧乾燥し、試験例5の方法に準じて濁度測定(OD相対値測定)を行った。
その結果を図17に示す。この結果に示されるように、再破砕処理においても特許文献3のBCG−CWSには、分散性の改善は認められなかった。
以上のことから、特許文献3のBCG−CWSのように、図14(c)のミコール酸部分が強く凝集又は融合した形態のBCG−CWSに変化すれば、図14(a)又は(b)の形態の本発明のBCG−CWSには戻らないことが明らかとなった。このことは、BCG−CWSにおける図14(a)又は(b)から図14(c)への形態的な変化とそれに伴う物性的な変化は、不可逆であることを示している。
本発明のBCG−CWSの製造方法は、界面活性剤を使用しないことを特徴にしている。一方、特許文献3のBCG−CWSの製造方法では界面活性剤を使用している(参考例2)。そこで、本発明のBCG−CWSの形態、物性に対する界面活性剤の影響を明確にするため、下記のように本発明のBCG−CWSを界面活性剤の非存在下BCG−CWS粉末の直接加熱或いは界面活性剤存在下水中で加熱してその物性変化を検討した。
a)評価サンプル
(1)本発明のBCG−CWS(A)
(2)特許文献3のBCG−CWS(E)
(3)本発明のBCG−CWS(A)10mgをマイクロチューブに加えアルミ製ヒートブロックで100℃、3時間加熱した。
その結果、図16bサンプルCの物性値は、特許文献3のBCG−CWSと同等の挙動を示し、物性値0.9以上だったものが大きく低下した。
(4)本発明のBCG−CWS(A)30mgに1重量%トライトンX−100水溶液2mLを加えホモジナイザーで懸濁後、60℃、60分間攪拌した。遠心分離後上清を除いた。この操作をもう一度行った。次いでエタノール2mLを加えホモジナイザーで懸濁し、遠心分離により上清を除いた。この操作をもう一度行った後減圧乾燥をした。
その結果、図16bサンプルDの物性値は、上記のサンプルCと同じ挙動を示し、物性値が大きく低下した。
これらの挙動は、BCG−CWSのミコール酸部分が不可逆的に強く凝集又は融合していることが示された。
(サンプル名は試験例5に基づく)
本発明では、図14に示すようなミコール酸部分の不可逆な形態変化を解明することが出来たことから、その知見に基づいて、界面活性剤の使用や高温処理をすることなくBCG−CWSを製造し、水への分散性に優れた各種エマルション・懸濁液製剤の製造に適した物性を有する細菌−CWSの製造が初めて可能となった。
本発明のBCG−CWSと特許文献3のBCG−CWSとの形態と物性の相違が、エマルションにどのような影響を及ぼすかを検討した。公知の水中油型エマルションの処方、製法(Proc.Japan Acad., 70,Ser.B, 205−209(1994)、特開2010−271322)に準じて、上記2つのBCG−CWSを用いた水中油型エマルションを製造した。
(1)方法
BCG−CWS360mgに、n−ヘプタン/エタノール(9:1、容積/容積)溶液約30mLとスクアレン(岸本特殊肝油工業製)5.4g(対BCG−CWS重量比15倍)、BHT(東京化成工業)1.5mgを加え、攪拌した後超音波照射により室温で分散した。その後、乾燥窒素気流下60℃に加熱し有機溶媒を留去した。ついで、0.02重量%ポリソルベート80水溶液135gを添加し、ホモミキサー(ラボ・リューション、PRIMIX社)を用いて60℃、7,000回転、5分間予備乳化を行った。更に、8.73gの10重量%ポリソルベート80水溶液を添加し、60℃、12,000回転、5分間本乳化を行い水中油型エマルション(乳化液A)を得た。乳化液の粒度分布を、粒度分布計(SALD−2200、島津製作所)で測定した。乳化液の一部をサンプリングし、試験例2に準じてBCG−CWS含量を測定した。
(2)結果
CWS含量91%(対仕込み重量パーセント、実濃度2.18mgCWS/mL)、スクワレン含量100%(対仕込み重量パーセント、実濃度36mg/mL)、メディアン系2.0μm、単一の粒度分布(図30)の外観均一な水中油型エマルション製剤が得られた。
(1)方法
実施例7と同様にして乳化を実施し水中油型エマルション乳化液を得た。乳化液に、等重量(53.5g)の6mg/mLポリソルベート80/90mg/mLマンニトール/20mMクエン酸バッファー(pH7.0)水溶液を添加混合し、ポリソルベート80最終濃度を6mg/mL、マンニトール最終濃度45mg/mLの水中油型エマルション(希釈液)を得た。希釈液を凍結乾燥用バイアル(Φ18.0×33.0mm、CS、不二硝子)に1mLずつ充填し、−80℃ディープフリーザーで凍結した後、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機(GAMMA2−16LSCplus、MARTIN CHRIST社製)を用いて行った。凍結乾燥再溶解液の粒度分布を、粒度分布計(SALD−2200、島津製作所)で測定した。再溶解液の一部をサンプリングし、試験例2に準じてBCG−CWS含量を測定した。
(2)結果
凍結乾燥製剤を再溶解した結果、再溶解液中BCG−CWS含量94%(対希釈液中含量、実濃度1.08mgCWS/mL)、スクワレン含量93%(対希釈液中含量、実濃度18.4mg/mL)、メディアン径2.3μm、単一ピークの粒度分布(図31)の外観均一な水中油型エマルションが得られた。
以下、実施例7、8と同様にBCG−CWSに対する油の重量比を変えてエマルション製造を行った。但し、乳化機は実施例3と同様電動ホモジナイザーを用いて小スケールで実施した。尚、その時の乳化条件は以下の通りである。
(1)方法
ガラス試験管に12mgのBCG−CWSとスクワレン適量に対し、約2mLの有機溶媒(ヘプタン或いはヘプタン/エタノール(9:1、容積/容積)混合溶媒)を添加し超音波照射により均一に懸濁した後、60℃で窒素気流下乾固しオイルペーストを作成した。そこにPS80をスクワレンの1/3量PS80含有の溶液を加え、乳化機で約10,000rpm、60℃、5分間乳化した乳化液を得た。そこに等容量のD(−)マンニトール/8mMリン酸緩衝液溶液(pH7.0)を添加し希釈液を得た。
希釈液の粒度分布を測定した。希釈液の一部をサンプリングし、試験例2に準じてBCG−CWS含量を測定した。尚、本発明のBCG−CWSはサンプルA(試験例5の表記で示した)、特許文献3のBCG−CWSサンプルEを用いた(試験例5の表記で示した)。
(2)結果
結果、下記の表5と図4に示した結果を得た。
更に、本発明のBCG−CWS及び、特許文献3のBCG−CWS各々の6倍量のスクワレンを用いたエマルションについては、1mL/バイアルで凍結乾燥製剤を作成し、その安定性を比較した。その結果を表6で示した。
(1)評価サンプルの調製
実施例7に準じてエマルション希釈液を作製した。但し、それぞれのエマルション製剤中のスクワレンとPS80の製造時最終量(仕込み重量)はBCG−CWS仕込み重量に対してそれぞれ15倍、5倍になる様にし、緩衝液はクエン酸緩衝液を用いた。
・本発明のBCG−CWSを用いたエマルション希釈液
・特許文献3のBCG−CWSを用いたエマルション希釈液
(1)で製造したエマルション希釈液を室温(22〜25℃)で3日保存し、サンプリング液中のBCG−CWS含量を試験例2に準じて測定した。
(3)結果
表7に示す結果が得られた。本発明のBCG−CWSから作成したエマルション希釈液は特許文献3のBCG−CWSから作成したエマルション希釈液よりも安定であった。
実施例7と同様にした製造した乳化液に、等重量(287.7g)の6mg/mLポリソルベート80/90mg/mLマンニトール/20mMクエン酸バッファー(pH7.0)水溶液を混合し、ポリソルベート80最終濃度を6mg/mL、マンニトール最終濃度45mg/mLの、575.4gの水中油型エマルション希釈液を得た。エマルション希釈液をピストンポンプ(DIGISPENSE3009、IVEK社製)を用いて凍結乾燥用バイアル(Φ18.0×33.0mm、CS、不二硝子)に0.1mLもしくは0.2mLずつ充填し、−80℃ディープフリーザー(MDF−U73V、SANYO社製)で凍結した後、凍結乾燥機(GAMMA2−16LSCplus、MARTIN CHRIST社製)で凍結乾燥を行って凍結乾燥製剤を得た。
(2)結果
凍結乾燥の結果、十分な形態を保った凍結乾燥ケーキの形成が確認された。また、下表8の通り、0.1、0.2mL/バイアル充填において、バイアル中のBCG−CWS含量はそれぞれ、108μgCWS/バイアル、203μgCWS/バイアルであり、バイアル中のスクアレン含量は、それぞれ1.58mgスクアレン/バイアル、3.02mgスクアレン/バイアルであった。本発明のBCG−CWSエマルションにより小容量充填の水中油型エマルション凍結乾燥製剤が製造できることが確認された。
本発明のBCG−CWSとそのエマルション製剤の場合、アラビノガラクタンがCWS表面、エマルション油粒子(油滴)表面に露出していることを、コンカナバリンAの結合、凝集反応で確認した。
(1)評価サンプルの調製
a)BCG−CWS:
・本発明のBCG−CWS(A:試験例5の表記)
・特許文献3のBCG−CWS(参考例2、E:試験例5の表記)
b)エマルション希釈液:
(1)a)のBCG−CWSを用いて、実施例7に準じて、次のエマルション製剤を作製した。
但し、スクワレン量、SP80量はBCG−CWS仕込み重量比としてそれぞれ15倍量、5倍量を用いた。また、クエン酸緩衝液(pH7.0)を用いた。
・本発明のBCG−CWSを用いたエマルション希釈液
・特許文献3のBCG−CWSを用いたエマルション希釈液
各評価サンプル50μLにローダミン標識コンカナバリンA溶液(フナコシ)2μLを添加し、軽くピペッティングした後、共焦点レーザー走査型顕微鏡で観察した。
(3)結果
図2に示される様に本発明のBCG−CWSの水中油型エマルション希釈液ではコンカナバリンA溶液によるローダミン呈色及び凝集反応が見られたが、特許文献3のBCG−CWSの水中油型エマルション希釈液では殆ど呈色及び凝集反応が見られなかった。このことから、本発明のBCG−CWS水中油型エマルション希釈液では、油滴表面にアラビノガラクタンが露出しているが、特許文献3のBCG−CWS水中油型エマルション希釈液では、アラビノガラクタンが油粒子(油滴)中に包埋され、油滴表面にアラビノガラクタンが殆ど露出していないことが示された。
(1)評価サンプルの調製
実施例7に準じて作製した、次のエマルション希釈液を使用した。但し、それぞれのエマルション製剤中のスクワレンとPS80の製造時最終量(仕込み重量)はCWS仕込み重量に対してそれぞれ15倍、5倍になるようにして作製した。
・本発明のBCG−CWS(A)を用いたエマルション希釈液
・特許文献3のBCG−CWS(E)を用いたエマルション希釈液
・ビークルエマルション希釈液
(2)測定方法
試験例10に準じてゼータ電位を測定した。
(3)結果
表9に示されるように、特許文献3のBCG−CWSを用いたエマルション希釈液のゼータ電位はビークルエマルション希釈液とほぼ同等であったのに対し、本発明のBCG−CWSを用いたエマルション希釈液は約2倍のマイナス電位を示した。従って、ゼータ電位差で本発明のBCG−CWSエマルションと特許文献3のBCG−CWSエマルションを明らかに区別することができることが判明した。
(1)評価サンプルの調製
実施例7に準じて作製した、次のBCG−CWS水中油型エマルション希釈液を使用した。但し、それぞれのBCG−CWS水中油型エマルション中のスクアレンとPS80量はBCG−CWS仕込み重量に対してそれぞれ15倍、5倍になるようにして作製した。また、クエン酸緩衝液(pH7.0)を使用した。
・本発明のBCG−CWSのサンプルA、B、C、Dを用いて製造したエマルション希釈液
・特許文献3のBCG−CWSのサンプルEを用いて製造したエマルション希釈液
・ビークルエマルション希釈液
(2)測定方法
試験例10に準じてゼータ電位を測定した。
(3)結果
得られたゼータ電位、各種BCG−CWSエマルション希釈液から得られたゼータ電位をビークルエマルション希釈液から得られたゼータ電位の差を算出した値をゼータ電位差として評価した。その結果は、表10に示す通りで、本発明BCG−CWSのエマルション希釈液は、特許文献3のBCG−CWSのエマルション希釈液に比して明らかにその電位差は大きかった。即ち、本発明のBCG−CWSのエマルション希釈液の電位差は6〜9mVが認められた。一方、特許文献3のエマルション希釈液ではその値は、1.0以下であった。
(1)評価サンプルの調製
実施例7に準じて、対BCG−CWS重量比7.5、15、22.5倍量のスクワレンを用いて作成したBCG−CWS水中油型エマルション希釈液、及びそれらのビークルエマルションを使用した。各々スクワレンの1/3重量のPS80量、クエン酸緩衝液(pH7.0)を使用した。
(2)測定方法
試験例10と同様にゼータ電位差を測定した。
(3)結果
結果を表11に示した。油量の増大に相関して、ゼータ電位差が低下した。
製剤中のBCG−CWSの存在状態を確認する為に下記の評価を行った。
(1)評価法
公知文献(Infect. Immun., 68(12), 6883−6890(2000))に準じてFITCラベル化した本願BCG−CWS及びナイルレッドを溶解させたスクワレンを用い、実施例7に準じて水中油型エマルションを作製した。対BCG−CWS重量比にして10倍量のスクワレン、その1/3量のPS80、リン酸緩衝液を用いた。得られたエマルション乳化液を蛍光顕微鏡で観察した。
(2)結果
BCG−CWS及びスクワレンの蛍光は共局在しており、エマルション乳化液の油滴内にBCG−CWSが存在していることが確認された。
BCG−CWS水中油型エマルション凍結乾燥製剤の安定性向上を目的として抗酸化剤の検討を実施した。
(1)評価サンプルの調製
実施例8に準じてエマルション凍結乾燥製剤を作製した。但し、それぞれのエマルション製剤中のスクワレンとPS80の製造時最終量(仕込み重量)はBCG−CWS仕込み重量比にしてそれぞれ6倍、2倍になるようにして作製した。凍結乾燥製剤を再溶解した後、各抗酸化剤(AからF)を10ppm添加した液を使用した。
A:未添加
B:DL−α−トコフェロール(V.E)
C:トコフェロール酢酸エステル(V.E E)
D:アスコルビン酸(V.C)
E:6−O−ステアロイル−L−アスコルビン酸(V.C E)
F:ジブチルヒドロキシトルエン(BHT)
(2)評価方法
各評価サンプルを60℃条件下静置保存し、試験開始時、2日経過後、4日経過後及び8日経過後の各時点でのpH、スクアレン含量、PS80分解の指標となるオレイン酸含量を測定した。
図11に示されるように以下のことが明らかとなった。
a)pH:水溶性抗酸化剤のV.Cは抗酸化剤未添加の場合よりもpHが低下し、BHTを除くその他脂溶性抗酸化剤も未添加とほぼ同等の挙動であった。BHTは開始時のpHを唯一保持した。
b)スクアレン含量:抗酸化剤未添加及びBHT以外の抗酸化剤において8日保存後のスクアレンの含量低下が認められ、BHTは開始時から変化が認められなかった。
c)オレイン酸:PS80は加水分解によりオレイン酸の含量が増加し、次にオレイン酸の過酸化反応のためオレイン酸含量が減少する傾向が認められPS80の分解指標となる。未添加、V.C及びV.C Eは過酸化反応まで急激に進んだと思われオレイン酸含量は低下しており、V.E、V.E Eは増加及び減少と反応が進んでいる。対してBHTは緩やかな増加傾向が認められ、このことは加水分解後の過酸化反応を抑制していることを示している。
以上の結果から、各種抗酸化剤の中でBHTが最も優れた抗酸化作用を示していることが示された。
BCG−CWS水中油型エマルションの安定性向上を目的として緩衝剤を検討した。
本発明の製剤への効果の比較を実施するために、PS80存在下、各種緩衝剤のpH保持能力を比較した。
(1)評価サンプルの調製
PS80を6mg/mLとなる様に下記各種バッファーに添加し、PS80溶液を得た。
A:緩衝剤未添加
B:リン酸緩衝液(pH7.0)
C:クエン酸緩衝液(pH7.0)
(2)評価方法
各評価サンプルを40℃、或いは60℃条件下静置し、試験開始時からそれぞれ約60、150日経過後までのpHを測定した。
図12に示す様に、緩衝剤添加なしの溶液ではリン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤を添加した溶液に比べてpH低下速度が速く、更にリン酸緩衝剤に比べてクエン酸緩衝剤のpH保持能力が高かった。
以上の結果から、本製剤の処方条件において各種緩衝剤の中でも汎用されているリン酸緩衝剤よりもクエン酸緩衝剤がより高いpH安定化能を示すことが明らかとなった。
(1)評価サンプルの調製
実施例7に準じて製造したエマルションを用いた。但し、BCG−CWS重量比にして15倍量のスクアレンと5倍量のPS80と、クエン酸緩衝液(pH7.0)を用いた。
(2)評価方法
a)RAW264.7細胞を用いたTNF−α活性評価:
試験例4(1)と同様に実施した。
b)BC−1細胞を用いたIL−12活性評価:
試験例11(3)と同様に実施した。
c)HEK−Blue−hTLR2細胞を用いたhTLR2のレポーター活性評価:
試験例4(2)の方法に準じて測定した。
(3)結果
a)TNF−α活性評価:
図5に示されるように、本発明のBCG−CWSを用いたエマルション製剤は、TNF−α誘導活性が特許文献3のBCG−CWSを用いたエマルション製剤よりも約16倍高かった。
b)IL−12活性評価:
図6に示されるように、本発明のBCG−CWSを用いたエマルション製剤は、IL−12誘導活性が特許文献3のBCG−CWSを用いたエマルション製剤よりも約6倍高かった。
c)TLR2のレポーター活性評価:
図7に示されるように、本発明のBCG−CWSを用いたエマルション製剤は、hTLR−2レポーター活性が特許文献3のBCG−CWSを用いたエマルション製剤よりも約22倍高かった。
BCG−CWSの水中油型エマルションにおけるin vitro活性と使用油量との相関を見る一環としてその中間体であるオイルペーストを用いてin vitro活性と油量との相関を検討した。
(1)評価サンプルの調製
BCG−CWSにスクワレン(BCG−CWSの8、16、24倍重量)とPS80(BCG−CWSの1.5倍重量)を添加混合した後、n−ヘキサンを添加し超音波照射を行いBCG−CWS分散液を調製した。96−wellガラスマイクロプレートにそれらBCG−CWS分散液を50μg/well添加し約24時間25℃で静置しn−ヘプタンを留去し、BCG−CWSペーストを得た。
(2)測定方法(TNF−α活性評価):
試験例4(1)の方法に準じて測定した。RAW264.7細胞を上記のBCG−CWSペーストを含有する96―wellマイクロプレートに5×10^5cells/wellで播種した。37℃、5%CO2、10%FBS含有DMEM培地で5時間培養して接着させた後、同種の新規培地で培地交換し更に20時間培養後、培養上清中のTNF−α濃度をサイトカインELISA法により測定した。
(3)結果:
図8に示されるように、本発明のBCG−CWS(A)をスクワレンとPS80でペースト化すると、ペースト基剤の量の増加に従ってTNF−α産生量が低下した。一方で、特許文献3のBCG−CWSはペースト化することにより、TNF−αの産生が未処理群と同程度に減少した。これは、ペースト表面に露出してRaw264.7細胞を刺激していたアラビノガラクタンが、ペーストの油成分が増えることにより閉塞、被覆されることを示している。
(1)サンプル
試験例5の各種BCG−CWSを用いて、実施例7に準じて水中油型エマルションを作成した。但し、使用したBCG−CWS重量比に対し、15倍量のスクアレンと、5倍量のPS80とクエン酸緩衝液(pH7.0)を用いた。
(2)方法
試験例4(1)の方法に準じて測定した。
(3)結果
図15に示す様に本発明BCG−CWSを用いたエマルションいずれもがTNF―αを約1000pg/mL誘導したのに対し、特許文献3のBCG−CWSを用いた場合には約300pg/mLしか誘導されなかった。
公知のモルモット皮内投与後のCWS挙動の評価実験(Drug Discov. Ther., 2(3), 168−177(2008)、Drug Discov. Ther., 2(3), 178−187(2008))を参考に、(試験例17に準じて製造した蛍光化BCG−CWS水中油型エマルションを調製し、蛍光強度を指標にしてリンパ節への移行性を評価する方法を確立した。その方法を用いて、本発明のBCG−CWSエマルションと特許文献3のBCG−CWSエマルションを比較した。
(1)モルモット投与及び組織摘出法
試験例17に準じて作製したラベル化BCG−CWSの蛍光化エマルションをモルモット(Hartley、雌、4週齢、SLC)の背中皮内に約50μg投与し、投与後1時間後の所属リンパ節(腋窩リンパ節)を採取した。摘出したリンパ節をホルマリン固定し、パラフィン切片を作成した。得られた切片を蛍光顕微鏡(株式会社キーエンス、BZ−X710)を用いて観察し、解析ソフト(BZ−X Analyzer)を用いて算出した、リンパ節面積及び蛍光強度(輝度)からその比率(輝度/面積)を求めた。
(2)結果
表12に示す結果の通り、いずれのBCG−CWSの水中油型エマルションにおいても1時間後にBCG−CWSがリンパ節に移行しているのが確認された。その結果を表12に示す。
公知文献(Cancer Sci., 99(7), 1435−1440(2008)
)に準じて本発明のBCG−CWSのin vivo免疫賦活活性を評価するために、マウス腹腔内製剤投与時の血中IFNγ産生誘導活性を評価した。
(1)評価サンプル
実施例7に準じて本発明のBCG−CWS或いは特許文献3のBCG−CWSを含有した水中油エマルションを製造した。具体的には、4mgのBCG−CWS、BCG−CWS重量の27倍重量のスクワラン、BCG−CWSの18倍重量のPS80を用いてオイルペーストを作成し、そこに4.5mLの45mg/mLD(−)マンニトール/8mMリン酸緩衝液(pH7.4)を加え、ポッターホモジナイザーで1,200rpm、60℃、12分間、乳化した。その後、45mg/mLD(−)マンニトール/8mMリン酸で希釈し、1mgCWS/mLの投与用のエマルションとした。ビークルエマルションは、BCG−CWSを使用せずに上記と同様の方法で製造した。
約1週間馴化させたSJL/Jマウス(メス、6週齢)に対し、0、3、6日目に各エマルション30μgCWS/30μLを腹腔内投与した。最終投与から6時間後に採血し、血清中のIFNγ量をELISA法にて測定した。
(3)結果
図10aに示すように、本発明のBCG−CWSのエマルション投与群の血清中IFNγ量は高い値を示したが、特許文献3のBCG−CWSのエマルション投与群では低かった。本願のBCG−CWSのエマルションは特許文献3のBCG−CWSのエマルションに比し、より強いIFNγ産生誘導活性を示すことが示された。
(1)評価サンプル
本発明のBCG−CWSと、特許文献3のBCG−CWSを用いて試験例24(IFN−γの系)と同様に評価用のエマルションを作成した。ビークルエマルションは、BCG−CWSを使用せずに同様の方法で製造した。
(2)方法
約1週間馴化させたC57BL/6マウス(6週齢、メス)にOVA発現E.G7細胞株(マウスリンパ腫由来細胞株)を1×10^6cells/50μLで皮内接種し、その後それぞれ1、4、7、14日目に各評価用のエマルションをそれぞれ50μgCWS/50μL/マウスとなるように腫瘍内投与した。細胞移植後21日目に剖検し腫瘍重量を秤量した。
図10bに示した通りであり、本発明のBCG−CWSのエマルションは特許文献3のBCG−CWSエマルションに比べ優れた効果を示している。
(1)評価サンプル
実施例7に準じて本発明のBCG−CWS或いは特許文献3のBCG−CWSを含有した水中油エマルションを製造した。具体液には、12mgのBCG−CWS、BCG−CWS重量の27倍重量のスクワランからオイルペーストを作成し、そこにBCG−CWSの18倍重量のPS80を含有した約4mLの8mMリン酸緩衝液を添加し、電動ホモジナイザーで乳化し乳化液を得た。その後、等容量の90mg/mLのD(−)マンニトール/8mMリン酸緩衝液溶液を添加し、実施例7と同様にしてBCG−CWS含有水中油エマルションを得た。ビークルエマルションは、BCG−CWSを使用せずに上記と同様の方で製造した。
(2)評価方法
a)細胞調製
10%FBS含有RPMI1640倍地中でin vitroにて継代維持したMethA細胞株(同系繊維肉腫細胞株)を使用した。抗腫瘍活性評価に使用するため、MethA細胞株をリン酸緩衝化生理食塩水で3度洗浄し、2×10^6cell/mLとなるよう再懸濁した。
b)細胞移植とエマルションの投与
約1週間馴化させたBALB/cマウス(メス、6週齢、チャールスリバー)の背上部に(2)a)MethA細胞株を10^5cell/50μLと上記の投与用液50μgCWS/50μLを混合し腹側腋窩皮内に移植した。移植後18日後の腫瘍の生着率を評価した。
(3)結果
得られた結果を表13に示した。本発明のBCG−CWSのエマルションは、ビークルエマルションに比べ、強く腫瘍の生着を阻止した。
Claims (16)
- BCG−CWS、水、油としてスクワラン、スクワレンまたはその混合物、界面活性剤としてポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する、下記条件を満たす水中油型エマルション製剤:
(a)レクチンに対する反応性を示す、
(b)エマルション製剤のゼータ電位がマイナスの値であり、BCG−CWSを含まない以外は同様にして作成されたビークル水中油型エマルションのゼータ電位との電位差が3〜14mVである。 - 上記BCG−CWSが、脂肪酸、糖鎖、ペプチドグリカンを含むものである、請求項1に記載の水中油型エマルション製剤。
- レクチンがコンカナバリンAである、請求項1又は2に記載の水中油型エマルション製剤。
- 上記電位差が4〜12mVである、請求項1〜3のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
- さらに抗酸化剤として、トコフェロール類、ジブチルヒドロキシトルエン(BHT)から選択される1以上の抗酸化剤を含有する、請求項1〜4のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
- 上記抗酸化剤がジブチルヒドロキシトルエンである、請求項5に記載の水中油型エマルション製剤。
- さらに緩衝剤として、リン酸バッファーまたはクエン酸バッファーを含有する、請求項1〜6のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
- 上記緩衝剤がクエン酸バッファーである、請求項7に記載の水中油型エマルション製剤。
- さらに単糖類、糖アルコール、多類糖、アミノ酸、タンパク質、ウレア、および無機塩からなる群から選択される一つ以上の賦形剤を含有する、請求項1〜8のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤。
- 上記賦形剤がマンニトール、スクロース又はトレハロースである、請求項9記載の水中油型エマルション製剤。
- 上記賦形剤がマンニトールである、請求項10に記載の水中油型エマルション製剤。
- 油がスクワレンまたはスクワランであり、さらに抗酸化剤としてジブチルヒドロキシトルエン、緩衝剤としてクエン酸バッファーを含有する、請求項1〜11のいずれかに記載の製剤。
- 油がスクワレンであり、緩衝剤としてクエン酸バッファーを含有する、請求項1〜12のいずれかに記載の製剤。
- 請求項9〜13のいずれかに記載の水中油型エマルション製剤の凍結乾燥製剤。
- 請求項1〜14のいずれかに記載のエマルション製剤または凍結乾燥製剤を含有する、ヒトを含む哺乳動物のための医薬組成物。
- 癌の治療のための、請求項15記載の医薬組成物。
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