JP5041279B2 - 細菌細胞壁骨格成分を含有する製剤 - Google Patents

Description

本発明は、安定性に富む、細菌細胞壁骨格成分〔以下、細菌−ＣＷＳと称する場合がある。また、細胞壁骨格成分（Cell Wall Skeleton）を、CWSと略する場合がある〕を有効成分として含有する医薬組成物、詳しくは凍結乾燥製剤に関する。

細菌細胞壁骨格成分（細菌−CWS）は、免疫賦活作用を有し、例えば動物モデルを用いた実験的腫瘍系、およびヒト癌の免疫療法において抗腫瘍活性を示すことが知られている。更に、上記の細菌細胞壁骨格成分を油成分中に分散、乳化させ、水中油型エマルション製剤として投与した場合、免疫賦活作用による抗腫瘍効果などが著しく高まることが知られている。

例えばBacille Calmette-Guerin菌（BCG菌）の細胞壁骨格成分（以下、BCG-CWSと略する場合がある）を含む水中油型エマルションを用いた癌免疫療法では、ヒトの癌治療において優れた成績が得られたことが報告されている(非特許文献１及び２を参照)。
前記水中油型エマルション製剤は、細菌-CWSを油中に分散したペースト状の組成物に、界面活性剤を含む水を加えてエマルション化することにより調製することができる（非特許文献３、４及び５を参照）。しかし、一般に細菌-CWSを含有する水中油型エマルション製剤は不安定であり、現在、臨床現場では、使用時に少量の水中油型エマルション製剤を用時調製している。しかし、常に一定の製剤を手作業で調製することは難しく、また用時調製では事実上医薬品としての実用化は不可能である。
そこで、水中油型エマルション製剤を凍結乾燥して凍結乾燥製剤とし、使用時に分散溶媒を加えて水中油型エマルション製剤を再調製させる方法が検討され、いくつかの凍結乾燥製剤に関する報告がなされた（特許文献１及び２を参照）。
細菌−CWSを含む凍結乾燥製剤を医薬品として供給するためには、(1)医薬品として求められる長期保存安定性を有すること、(2)凍結乾燥製剤に注射用蒸留水等の分散溶媒を添加して得られるエマルションが、凍結乾燥前の水中油型エマルションと実質的に同等であること等が重要である。しかしながら、これまでに知られていた凍結乾燥製剤は、高温条件等の苛酷な条件下で有効成分である細菌−CWSの含量が低下する現象が認められるなどの問題点があった。
以上のことから、更に保存安定性が優れた細菌−CWSの凍結乾燥製剤が求められていた。
一方、トコフェロール等の抗酸化剤は、酸化を受けやすい物質を含む薬剤や化粧品の液剤を安定化する目的等で汎用されている。しかしながら、細菌-CWSの分解を抑制する作用については全く知られていなかった。
国際公開パンフレット第００／３７２４号 国際公開パンフレット第２００４／０１２７５１号 A. Hayashi et al., Pro. Japan Acad., 70, Ser. B 205-209 (1994) A. Hayashi et al., Pro. Japan Acad., 74, Ser. B 20550-55(1998) J.Nat.CancerInst.48,831-835(1972) J.Bacteriol,92,869-879(1966) Gann,69,619-626(1978)

本発明が解決しようとする課題は、優れた保存安定性を示す、細菌細胞壁骨格成分を有効成分として含有する医薬組成物、詳しくは凍結乾燥製剤を提供することにある。

本発明者らは、細菌−ＣＷＳ及び油を含有する凍結乾燥製剤を医薬品として開発すべく鋭意検討を行っていた。
前記凍結乾燥製剤は、前述の特許文献１及び２に記載された方法を用いて調製することができることがわかっている。すなわち、(1)有機溶媒を用いて細菌−ＣＷＳ及びスクワラン等の油との混合油状物を調製し、(2)界面活性剤としてポリソルベート類を配合し、(3)賦形剤としてマンニトールを配合し、(4)(前記 3)を水中で乳化させることによって、均一性に富む水中油型エマルションを製造することができ、当該水中油型エマルションを凍結乾燥させることによって凍結乾燥製剤を得ることができる。
ところが、当該凍結乾燥製剤について、医薬品として要求される長期保存安定性を調べたところ、細菌−ＣＷＳの構造が一部分解し、構成成分の一種であるミコール酸が遊離することが判明した。また、長期間保存安定性試験に供した凍結乾燥製剤に水を添加して再懸濁（すなわち復水）して得られる水中油型エマルションのｐＨが酸性側に変化していることがわかった。これらの知見から、細菌−ＣＷＳを有効成分として含有する医薬組成物を医薬品として開発するためには、保存安定性を改良する必要があることが判明した。
そこで、本発明者らは、鋭意検討を行った結果、抗酸化剤を添加することによって、細菌−ＣＷＳを含有する凍結乾燥製剤の安定性が著しく向上することを見出した。更に、中間体となる水中油型エマルションを調製する際に緩衝剤を配合し、当該エマルションの溶液中のｐＨをｐＨ５．５〜８．５に調整することによって、凍結乾燥製剤の安定性が相乗的に向上することを見出した。すなわち、抗酸化剤を配合することにより、好ましくは加えて緩衝剤を配合することにより、凍結乾燥製剤の長期保存安定性は飛躍的に向上することを見出した。
本発明は、上記の知見をもとに、完成するに至ったものである。

即ち本発明は、
〔１〕 細菌細胞壁骨格成分、油及び界面活性剤を含有する水中油型エマルションの凍結乾燥製剤であって、更に抗酸化剤を含有することを特徴とする、凍結乾燥製剤；
〔２〕 界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、〔１〕に記載の凍結乾燥製剤；
〔３〕 抗酸化剤がトコフェロールである、〔１〕又は〔２〕に記載の凍結乾燥製剤；
〔４〕 更に、緩衝剤を含有し、当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が0.5 mg／ml〜1 mg/mlである水中油型エマルションのｐＨが、ｐＨ５．５〜８．５に調節されることを特徴とする、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の凍結乾燥製剤；
〔５〕 緩衝剤がリン酸塩である、〔４〕に記載の凍結乾燥製剤；
〔６〕 当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が0.5 mg／ml〜1 mg/mlである水中油型エマルションにおける緩衝剤の濃度が、約１０〜２０ｍＭとなるべく調製されていることを特徴とする、〔５〕に記載の凍結乾燥製剤；
〔７〕 更に、賦形剤としてマンニトールを含有することを特徴とする、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の凍結乾燥製剤；
〔８〕 細菌細胞壁骨格成分が、ウシ型結核菌Bacille Calmette-Guerin細胞壁骨格成分である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の凍結乾燥製剤；
〔９〕 以下の（１）及び（２）の特徴を有する〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
（１）80℃下で３０日間保存した場合、ミコール酸の遊離量が約2％以内であり、
（２）80℃下で３０日間保存した後に、当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が0.5 mg／ml〜1 mg/mlである水中油型エマルションのｐＨ値が、保存前のｐＨと実質的に同等である；
〔１０〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の凍結乾燥製剤に水性溶媒を添加して得られる、水中油型エマルション製剤；

〔１１〕 細菌細胞壁骨格成分、油及び界面活性剤を含有する水中油型エマルションであって、更に抗酸化剤を含有することを特徴とする、水中油型エマルション；
〔１２〕 界面活性剤がポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである、〔１１〕に記載の水中油型エマルション；
〔１３〕 抗酸化剤がトコフェロールである、〔１１〕又は〔１２〕に記載の水中油型エマルション；
〔１４〕 更に、緩衝剤を含有し、ｐＨが、ｐＨ５．５〜８．５に調節されていることを特徴とする、〔１１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の水中油型エマルション；
〔１５〕 緩衝剤がリン酸塩である、〔１４〕に記載の水中油型エマルション；
〔１６〕 緩衝剤の濃度が約１０〜２０ｍＭとなるべく調製されていることを特徴とする、〔１４〕又は〔１５〕に記載の水中油型エマルション；
〔１７〕 更に、賦形剤としてマンニトールを含有することを特徴とする、〔１１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の水中油型エマルション；
〔１８〕 細菌細胞壁骨格成分が、ウシ型結核菌Bacille Calmette-Guerin細胞壁骨格成分である、〔１１〕〜〔１７〕のいずれかに記載の水中油型エマルション；
〔１９〕 〔１１〕〜〔１８〕のいずれかに記載の水中油型エマルションを凍結乾燥させて得られる、凍結乾燥製剤；
〔２０〕 細菌細胞壁骨格成分、油及び界面活性剤を含有する凍結乾燥製剤に、抗酸化剤からなる安定化剤を配合することによって、前記凍結乾燥製剤中の細菌細胞壁骨格成分に長期保存安定性を与えることを特徴とする、前記凍結乾燥製剤の安定化方法；
〔２１〕 更に緩衝剤を配合して、当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が0.5 mg／ml〜1 mg/mlである水中油型エマルションのｐＨがｐＨ５．５〜８．５に調整されることを特徴とする〔２０〕に記載の方法；
〔２２〕 細菌細胞壁骨格成分、油及び界面活性剤を含有する凍結乾燥製剤中の細菌細胞壁骨格成分の分解抑制方法であって、抗酸化剤を配合することを特徴とする方法；
〔２３〕 細菌細胞壁骨格成分がBCG-CWSであり、油がスクワランであり、界面活性剤がポリソルベート８０であり、抗酸化剤がトコフェロールである、〔２０〕〜〔２２〕のいずれかに記載の方法；
〔２４〕 トコフェロールを有効成分として含有する、細菌細胞壁骨格成分、スクワラン及び界面活性剤を含有する水中油型エマルション又はその凍結乾燥製剤の安定化促進剤；
〔２５〕 更に、細菌細胞壁骨格成分の濃度が0.5 mg／ml〜1 mg/mlである凍結乾燥前の水中油型エマルション、及び当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が0.5 mg／ml〜1 mg/mlである水中油型エマルションのｐＨが、５．５〜８．５に調整されるべく緩衝剤が配合されていることを特徴とする、〔２４〕に記載の安定化促進剤；
〔２６〕 緩衝剤がリン酸塩である、〔２５〕に記載の安定化促進剤；
等に関する。

本発明により、優れた長期保存安定性を有する、細菌−ＣＷＳを有効成分として含有する凍結乾燥製剤を提供することが可能となった。当該凍結乾燥製剤は、癌免疫療法剤として有用である。

本明細書において、「細菌細胞壁骨格成分」（本明細書において、細菌−CWSと略する場合がある）とは、微生物由来の細胞壁骨格成分（Cell Wall Skeleton; CWS）を含む任意の菌体由来成分を表し、ヒト型結核菌の死菌等の、微生物の菌体そのもの、及びある程度単離された細胞壁骨格成分を共に含む概念である。CWSの由来微生物としては、グラム陽性棹菌のミコバクテリウム属細菌、ノカルディア属細菌、コリネバクテリウム属細菌、ロドコッカス属細菌、ゴルドナ属細菌などが挙げられる。「ミコバクテリウム属細菌」とは、抗酸菌であるミコバクテリウム属の細菌を表し、具体的には、結核菌群細菌のMycobacterium tuberculosis（結核菌）、Mycobacterium bovis［ウシ型結核菌、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン菌；Bacille Calmette-Guerin）を含む］、Mycobacterium africanum（アフリカ菌）、Mycobacterium microti（ネズミ型結核菌）があり、この他、Mycobacterium leprae（ライ菌）、非結核性抗酸菌群であるMycobacterium kansasii、Mycobacterium avium、Mycobacterium phlei等が挙げられる。中でも好ましいものとして、ミコバクテリウム属ウシ型結核菌の一種であるBCG菌およびノカルディア族細菌の一種であるノカルディア・ルブラを挙げることができる。
「細胞壁骨格成分（ＣＷＳ）」とは、細菌の菌体を物理的に粉砕した後、ヌクレアーゼによる除核酸、プロテアーゼによる除蛋白、有機溶媒での洗浄による脱脂などの精製工程を経て、不溶性残渣として得られるものを表し、その製法は公知である（J. Nat. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974) ）。
なお、本発明において、水中油型エマルションに含まれる細菌−ＣＷＳの濃度は、エマルションとして0.01〜10mg/mlになるように使用される。好ましくは、0.1mg/ml〜2mg/ml、さらに好ましくは0.2mg/ml〜1mg/ml、さらに好ましくは0.5mg/ml〜1mg/mlである。

本発明の「油」としては、Immunology 第２７巻、第３１１〜３２９項（1974年）に記載されているような鉱物油、動植物油が挙げられる。鉱物油としては、例えば、流動パラフィン（ドレコール6VR、モレスコバイオレスU-6、モレスコバイオレスU-8等）、バイオール（Bayol F)等が挙げられる。植物油としては、例えば大豆油、シンセラン４、オレイン酸エチル、落花生油、椿油、ゴマ油、AD-65（落花生油とアラセルとアルミニウムモノステアレートの混合物）等が挙げられる。動物油としては、例えば、スクワラン、スクワレンのようなテルペノイド誘導体が挙げられる。また、これら、動植物油、鉱物油の中から選ばれる複数の油の混合物を挙げることができる。好ましいものとしては、スクワランあるいは例えば、大豆油、オレイン酸エチルもしくはオレイン酸などの植物油（またはそれに由来する油）とスクワランとの混合物、例えば、ドレコール６VR、各種流動パラフィンなどの鉱物油とスクワランの混合物が挙げられる。
より好ましくは、スクワラン、ドレコール6VR、スクワランと大豆油の混合物、スクワランとオレイン酸エチルの混合物、またはスクワランとドレコール6VRの混合物を挙げることができる。更により好ましくはスクワランが挙げられる。
油の濃度は、後述する細菌−ＣＷＳと油のペースト（混合油状物）の粘度が約0.7poise（25℃）以下、好ましくは約0.2〜約0.6poise（25℃）、更に好ましくは約0.28〜0.55poise（25℃）となるように適宜調整される。複数の油との混合物を使用する場合、それぞれの油を適当な組成比で混合して使用できるが、細菌−CWSとの混合時の粘度が約0.2〜0.7poise（25℃）の粘度になるような組成比とする。
例えば、油としてスクワランを用いた場合、約0.35〜0.55poise（25℃）、更に好ましくは約0.39〜0.51poise（25℃）の粘度を有する細菌−CWS含有ペーストが好適である。具体的には、細菌−ＣＷＳ約0.66gに対して、スクワラン約6.6g〜35.2g、好ましくは約8.4g〜35.2gの組成が挙げられる。
前述のペーストは、以下の１）及び２）：
１）細菌−CWS及び油を、分散補助溶媒としての有機溶媒中で混合攪拌する工程；
２）前記１）の有機溶媒を留去する工程；
により調製することができる。用いられる有機溶媒としては、ヘプタン、トルエン等の炭化水素系溶媒、５〜２０％のエタノール等のアルコール系溶媒を含むヘプタン等の炭化水素系溶媒、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素系溶媒等が挙げられる。前記ペーストの調製方法および、前記工程（１）で用いられる有機溶媒については、国際公開パンフレット第2004/012751号を参照することができる。

本発明で使用可能な「界面活性剤」としては、医薬品製剤に使用される界面活性剤であれば特に制限されるものではない。例えばリン脂質、非イオン性界面活性剤などを挙げることができる。リン脂質としては、ホスファチジルアミン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリンまたはレシチン等を挙げることができる。また、水素添加されたリン脂質も使用することができる。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル等が挙げられる。当該ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート２０）、同モノパルミテート（ポリソルベート４０）、同モノステアレート（ポリソルベート６０）、または同モノオレート（ポリソルベート８０）等が挙げられる。ソルビタン脂肪酸エステルとしては、ソルビタンモノラウレート（Ｓｐａｎ２０）、同モノパルミネート（Ｓｐａｎ４０）、同モノステアレート（Ｓｐａｎ６０）、同モノオレート（Ｓｐａｎ８０）等を挙げることができる。
好ましい界面活性剤としては、卵黄ホスファチジルコリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０（ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０（ＨＣＯ−５０）、ポリオキシエチレン（１６０）ポリオキシプロピレン（３０）グリコール（プルロニックＦ６８）を挙げることができる。より好ましくはポリソルベート８０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート類）が挙げられ、特に好ましい界面活性剤としてポリソルベート８０を挙げることができる。
界面活性剤の濃度は、水中油型エマルションにおいて０．０１〜１０％w/wの範囲が適当であり、0.01〜3%w/wが好ましく、0.05%〜1%w/wが更に好ましい。これら界面活性剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。

本発明において、「抗酸化剤」とは、自動酸化の連鎖反応を抑制するラジカル阻害機能、又は過酸化物を非ラジカル分解して不活性化する過酸化物分解機能を有する化合物を表し、医薬品製剤に使用できる抗酸化剤であれば特に制限されるものでは無い。具体的には、トコフェロール類、ブチルヒドロキシトルエン（以下、ＢＨＴという），ブチルヒドロキシアニソール（以下、ＢＨＡという）、ノルジヒドログアヤレチン、没食子酸プロピル、ビタミンＣの脂肪酸エステル又はソルビン酸等を例示することができる。抗酸化剤として、好ましくはトコフェロール類を例示することができる。
トコフェロール類としては、α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール、又はこれらの中から任意に選択される、２〜４種類のトコロフェロールの混合物等が例示できる。具体的には、α−トコフェロール（商品名：Ｅミックス８０、Ｅミックス７０Ｌ等）が挙げられる。

本発明における、これらの抗酸化剤の配合量は、原薬の酸化分解を十分に防止するためには、組成物全体に対して０．０００１重量％以上が好ましく、同０．００１重量％以上がさらに好ましい。配合上限は特に限定されるものではないが、概ね組成物全体に対して１０．０重量％以下の範囲内で配合される。抗酸化剤の濃度は、好ましくは、水中油型エマルションにおいて０．００００１％〜１０％w/wの範囲であり、更に好ましくは０．０００１％〜５％w/wである。抗酸化剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。
抗酸化剤は、水中油型エマルションの製造工程における任意の工程で添加すればよいが、好ましくは、細菌−CWSと油の混合油状物（ペースト）を製造する際に、あらかじめ油に溶解させて用いることができる。

「賦形剤」とは、上記エマルションのエマルションとしての安定性または凍結乾燥製剤としての安定性を維持・向上する目的で使用される成分である。本発明で使用可能な賦形剤としては、単糖類、糖アルコール、多糖類、アミノ酸、タンパク質、ウレア、または無機塩などが挙げられる。単糖類および二糖類としては、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、トレハロース等が挙げられる。糖アルコールとしては、マンニトール、ソルビトール等が挙げられる。多糖類としては、デキストラン、でんぷん、マルトデキストリン、セルロース、ポリビニルピロリドン、またはアルギン酸ナトリウム等が好ましいものとして挙げられる。アミノ酸としては、アラニン、グリシン、プロリン等の中性アミノ酸が好ましく、より好ましい中性アミノ酸としてはグリシンを挙げることができる。タンパク質としては、アルブミン、ゼラチン、コラーゲン等が好ましいものとして挙げられる。無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。
好ましい賦形剤としては、単糖類、または糖アルコールが挙げられ、特に好ましい賦形剤としてはマンニトールが挙げられる。
これら賦形剤は、１種類に限らず、適宜、数種類組み合わせて使用することができる。
賦形剤の濃度は、水中油型エマルションにおいて0.1%〜20%w/wの範囲が適当であり、0.1〜10%w/wが好ましい。賦形剤の好適な濃度は、賦形剤の種類によって異なるが、製造スケールや各含有成分の含有量に応じて、適宜調整することができる。グリシン等のアミノ酸の場合、2.25%（300mM)〜11.25%（1500mM）、好ましくは約6.75%（900mM)である。マンニトールの場合、水中油型エマルションにおける濃度は、好ましくは1〜10%、さらに好ましくは１〜8%、より好ましくは約3〜6%である。マンニトールを賦形剤として用いることにより、等張と同程度の濃度で用いることができるので、より生体に負担の少ない安定な製剤を調製することができる。
前記賦形剤として挙げられた物質は、必要に応じて等張化剤として用いてもよい。これら賦形剤もしくは等張化剤は一種類に限らず、適宜、数種類を組み合わせて使用することができる。通常は、前記賦形剤が等張化剤を兼ねているが、前記賦形剤とは異なる物質を等張化剤として選択してもよい。等張化剤の濃度は、他の成分の含有量に応じて適宜設定されるが、通常0.1%〜30%W/W、好ましくは1%〜10%W/Wの範囲が適当である。

本明細書における「緩衝剤」として、具体的には、グリシン、アラニン、アルギニン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、バリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ε-アミノカプロン酸、リジン、ロイシンなどのアミノ酸またはその塩酸塩、ナトリウム塩、カリウム塩などの塩、ニコチン酸アミド、アミノ安息香酸などの両性電解質またはそのナトリウム塩などの塩、クエン酸、リン酸、乳酸、酢酸、ホウ酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、グリコール酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、リンゴ酸、フマル酸、マレイン酸、安息香酸、サリチル酸、フタル酸、酒石酸などの弱酸のナトリウム塩、カリウム塩などの塩、上記弱酸の塩と、弱酸、塩酸、硫酸などの強酸との組み合わせ、トリス緩衝液などが挙げられる。
例えば、リン酸緩緩衝液としては、５ｍＭ〜５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウムおよびリン酸水素二ナトリウムからなる緩衝液が挙げられ、通常はリン酸二水素ナトリウムおよびリン酸水素二ナトリウムの比率を１：２．３（重量比）で溶解し、適宜ｐＨを塩酸等の酸、又は水酸化ナトリウム等の塩基で微調整してもよい。トリス緩衝液としては、５ｍＭ〜５０ｍＭのトリス溶液からなる緩衝液が挙げられ、適宜ｐＨを０．１Ｎ〜４Ｎの塩酸等で微調整することができる。クエン酸緩衝液としては、５ｍＭ〜５０ｍＭのクエン酸溶液からなる緩衝液が挙げられ、適宜ｐＨを０．１Ｎ〜４Ｎの塩酸等で微調整することができる。緩衝液として、好ましくはリン酸緩衝液が挙げられる。

本発明における、これらの緩衝剤の配合量は、十分な緩衝能を発揮するために十分な量であれば特に限定は無いが、好ましくは、５〜２０ｍＭ、更に好ましくは、１０〜２０ｍＭである。
賦形剤としてアミノ酸などの緩衝作用を有する物質を用いる場合には、適宜緩衝剤の添加量を調整する。

本発明の凍結乾燥製剤は、長期保存安定性に優れており、以下の性質有する。すなわち、
（１）80℃下で３０日間保存した場合、ミコール酸の遊離量が約2%以内であり、
（２）80℃下で３０日間保存した後に、当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られる細菌細胞壁骨格成分の濃度が0.5mg/ml〜1mg/mlである水中油型エマルションのｐＨ値が、保存前のｐＨと実質的に同等である。
更に好ましくは、前記（１）において、ミコール酸の遊離量は、約１％以内である。また前記（２）において、「実質的に同等」とは、保存前後で、凍結乾燥製剤を復水して得られる水中油型エマルションのｐＨの差が０．８以内、好ましくは０．５以内であることを表す。

本発明の凍結乾燥製剤を、水性溶媒で再懸濁（復水）することによって、水中油型エマルション製剤を提供することができる。当該水中油型エマルション製剤もまた、本発明に含まれる。
本発明における凍結乾燥製剤を再懸濁するために使用される水性溶媒は、エマルション粒子の分散媒体となるものであり、注射用蒸留水、生理食塩水、または緩衝液等が挙げられるが、注射可能な水性溶媒であれば特に限定されない。ここで凍結乾燥製剤を再懸濁するために用いられる水性溶媒が生理食塩水や緩衝液などの無機塩を含む水性溶媒の場合、当該水性製剤の組成については、再懸濁後の水中油型エマルション製剤の安定性等を考慮して、適宜選択すればよい。また、再懸濁後の水中油型エマルション製剤における無機塩（緩衝剤や賦形剤として添加された無機塩）の濃度は、ヒトに投与される場合に等張液となるように調整されることが好ましい。

また、本発明の凍結乾燥製剤を調製するための製造中間体である、細菌−ＣＷＳ、油、界面活性剤及び抗酸化剤を含む水中油型エマルションも、本発明の範疇である。
当該「水中油型エマルション」は、更に、賦形剤、緩衝剤等を含有することができる。すなわち当該水中油型エマルションは、好ましくはマンニトール等の賦形剤を含みかつ、更に緩衝剤を配合されてｐＨが５．５〜８．５に調整されている。
当該水中油型エマルションは、上記国際公開第２００４／０１２７５１号パンフレットに記載された、以下の製造方法で得られることを特徴とする。すなわち、
１）細菌−ＣＷＳ及び油を、分散補助溶媒としての有機溶媒中で混合攪拌する工程、
２）１）の有機溶媒を留去して、細菌−ＣＷＳ含有ペーストを調製する工程、及び
３）得られた細菌−ＣＷＳ及び油からなるペースト（混合油状物）及び界面活性剤を水中で乳化する工程
により製造することができる。前述のとおり、抗酸化剤は上記１）または３）の工程で配合させることができるが、好ましくは、１）の工程で配合させる。また、上記３）の工程において、好ましくは、賦形剤を配合することができる。

前記で用いられる有機溶媒としては、トルエン、ヘプタン、ヘプタン−エタノール混合溶媒等が挙げられる。細菌−CWS含有ペーストの調製方法については、国際公開第００／3724号パンフレット、国際公開第２００４／０１２７５１号パンフレットに記載されている。
製造中間体としての水中油型エマルション及び、本発明の凍結乾燥製剤を復水して得られる水中油型エマルション製剤の組成としては、前記細菌−ＣＷＳ含有ペーストを含み、かつ、0.1%〜20%、好ましくは1%〜10%の賦形剤、0.01%〜10%、好ましくは0.01%〜3%の界面活性剤、0.001%〜10%、好ましくは0.001%〜0.1%の抗酸化剤を含むことを特徴とする。
具体的には２Ｌあたり、0.67〜3.35gの細菌−CWSおよび0.1〜10%w/w、好ましくは0.4〜8%w/w、更に好ましくは0.6〜5%のスクワランを含み、かつ、1%〜10%w/wの安定化剤、0.01%〜3%w/wの界面活性剤、および0.001%〜0.1%w/wの抗酸化剤を含むことを特徴とする。
前記水性溶媒としては、水、生理食塩水、または、緩衝液等が挙げられる。
前記「緩衝液」とは、水中油型エマルション製剤（凍結乾燥製剤を水で再懸濁させることにより得られるエマルションを含む。）のｐＨを一定に保つ目的で用いられる、緩衝剤を含む水溶液を表す。本発明で使用可能な緩衝液としては特に制限されるものは無いが、医薬品製剤に使用される緩衝液であれば好ましい。
本発明の水中油型エマルション製剤は、緩衝剤によってｐＨ５．５〜８．５、好ましくはｐＨ６．０〜７．０に調整されることが好ましい。

前述の水中油型エマルションを凍結乾燥することによって、凍結乾燥製剤を製造することができる。すなわち、本発明の凍結乾燥製剤は、水中油型エマルションを凍結乾燥し、最後に通常はバイアル内部を窒素置換し、打栓を行うことにより得ることができる。水中油型エマルションを凍結乾燥する際、凍結乾燥温度、および時間等は特に限定されず、例えば、国際公開パンフレット第00/3724号、国際公開パンフレット第2004/012751号などに記載された方法を挙げることができる。

本発明の水中油型エマルション製剤は、注射など非経口で投与される。投与形態は、治療目的などにより異なり、特に制限されるものではない。通常用いられる投与形態として例えば、注射剤として皮膚より投与すること等ができる。エマルション中の細菌−CWSの量は通常0.1〜1.0mg/ml、好ましくは0.5〜1.0mg/mlの濃度である。本発明の凍結乾燥製剤は、適量の水性溶媒、例えば水、生理食塩水、緩衝液にて本発明水中油型エマルションに再懸濁して用いる。凍結乾燥製剤を再懸濁して生体に投与する場合の水中油型エマルションにおける各成分の濃度は、凍結乾燥前の、製造中間体としての水中油型エマルションにおける各成分の濃度と異なっていてもよい。水性溶媒の適量とは、凍結乾燥前の液量の好ましくは0.5〜4倍の範囲であればよい。
投与量、投与回数は対象とする疾患、患者の症状、年齢、体重、性別等によって異なるが、例えば、成人に対して週１回もしくは4週１回の投与で1回あたり10〜250μgの範囲、好ましくは25〜200μgの範囲を投与することができる。
本発明の凍結乾燥製剤及びこれを復水した水中油型エマルション製剤は、癌治療薬または予防薬、詳しくは免疫療法剤として有用である。対象となる癌の種類に特に限定はないが、肺癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、子宮癌、乳癌、急性骨髄性白血病、舌癌、咽頭癌、卵巣癌、脳腫瘍等が挙げられる。ここで癌治療剤には、癌転移抑制剤としての態様も含まれる。
又は本発明の凍結乾燥製剤及びこれを復水した水中油型エマルション製剤は、他の免疫療法剤、具体的には各種癌抗原を有効成分とする癌ワクチンと供に用いることができる。

以下の実施例において、本発明を詳細に説明するが、もとより本発明はこれに限定されるものではない。

１ｍｇ／ｍＬトコフェロール（Ｅミックス８０又はＥミックス７０Ｌ）／１０％エタノール／９０％ヘプタン溶液を調製し、その６０ｍＬとスクワラン１０５．６ｇを充分混合する（混合物Ａとする）。
細胞壁骨格成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ２７７０ｍｇを用いて、混合物Ａ７０．４ｇおよび１０％エタノール／９０％ヘプタン溶液４００ｍＬの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素あるいは空気気流下７０℃に加熱しエタノール／ヘプタンを留去した。ついで、０．０２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０／１０ｍＭリン酸緩衝液８８８．６ｇを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化を行い、さらに、３６．７ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液を添加し本乳化を行った。最後に、１．５ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０溶液を添加混合し、ポリソルベート８０最終濃度を０．１ｗ／ｗ％に調整し、水中油型エマルションを得た。その後、６．７ｗ／ｗ％マンニトール／１．２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液３０００ｇを添加し、４０００ｇの最終製剤を得た。
この水中油型エマルション製剤をバイアルに２ｍＬずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機（ＤＦＭ−１３Ａ−Ｓ特、ＵＬＶＡＣ社製）を用いて行った。

１ｍｇ／ｍＬトコフェロール（Ｅミックス８０又はＥミックス７０Ｌ）／１０％エタノール／９０％ヘプタン溶液を調製し、その４０ｍＬとスクワラン７０．４ｇを充分混合する（混合物Ｂとする）。
細胞壁骨格成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ１３５８ｍｇを用いて、混合物Ｂ３５．２ｇおよび１０％エタノール／９０％ヘプタン溶液２００ｍＬの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素あるいは空気気流下７０℃に加熱しエタノール／ヘプタンを留去した。ついで、０．０２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０／１０ｍＭリン酸緩衝液４４４．３ｇを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化を行い、さらに、１８．４ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液を添加し本乳化を行った。最後に、０．７６ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０溶液を添加混合し、ポリソルベート８０最終濃度を０．１ｗ／ｗ％に調整し、水中油型エマルションを得た。その後、６．７ｗ／ｗ％マンニトール／１．２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液１５００ｇを添加し、２０００ｇの最終製剤を得た。
この水中油型エマルション製剤をバイアルに０．５ｍＬ又は１ｍＬずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機（ＤＦＭ−０５Ａ−Ｓ特、ＵＬＶＡＣ社製）を用いて行った。

（安定性試験）
実施例１、２、５及び６に記載の抗酸化剤もしくは緩衝剤を含む凍結乾燥製剤、国際公開パンフレット第2004/012751号実施例１４に記載された方法で調製された抗酸化剤を含まない凍結乾燥製剤（比較例１）の保存安定性を評価した。すなわち、各凍結乾燥製剤を組函に入れ、80℃に維持した気相インキュベーター内にて保存した。1週間後に製剤を取り出し、遊離ミコール酸量および注射用蒸留水で再懸濁した後のpHを測定した。
結果を表１に示した。

※1ヶ月のデータを記載。
表１に示すように、比較例１の製剤は80℃で１週間保存した結果、遊離ミコール酸量が著しく増加し、pHも大きく低下した。一方、実施例５及び６の凍結乾燥製剤では、遊離ミコール酸量及びpHの低下が共に抑制されることがわかった。更に、抗酸化剤と緩衝剤を共に含む実施例１および２の本発明の凍結乾燥製剤では、遊離ミコール酸量、ｐHともにほとんど変化することなく、長期保存安定性が著しく向上することがわかった。（ここで、遊離ミコール酸量は、ＢＣＧ−ＣＷＳ全量あたりの比率を表し、国際公開第2004/012751号パンフレットに記載の方法を用いて測定した。）

実施例１と同様の方法で（ただしトコフェロールを含まないエタノール−へプタン混合溶媒を用いた）5mM、10mM、20mM、100mMのリン酸緩衝液を含む凍結乾燥製剤を調製し、実施例３と同様の方法で、保存安定性を試験した。ｐHを測定した結果を表２に示した。

また、凍結乾燥製剤を水に再懸濁させて得られる水中油型エマルション製剤において、80℃１週間保存後における凍乾ケーキの性状を表３に示した。

表中の数値は、保存本数を表し、各30本のうち、変化を示したバイアルの本数をカウントしたものである。
表２の結果から、10mM以上のリン酸緩衝液を用いることにより、ｐＨの変化が抑制され、遊離ミコール酸量も抑制された、保存安定性が優れた凍結乾燥製剤が得られることがわかる。
一方、表３に示すように、100mMリン酸緩衝液から製造した凍結乾燥製剤は、強制劣化保存（80℃１週間）後における凍結乾燥ケーキの性状がシュリンクあるいは瓶の上部に浮上するバイアルが出現した。すなわち、高濃度のリン酸緩衝液で調製した凍結乾燥製剤は、強制劣化保存条件で、形態変化を起した。尚、ここでシュリンクとは、凍結乾燥中に凍結状態にある水の一部が融解することにより生ずるような、凍結乾燥ケーキが縮んだ状態を表す。
上記の結果より、凍結乾燥製剤の安定性を維持する為には、低いリン酸濃度が好ましいことがわかる。以上の結果から、10mM〜20mMのリン酸緩衝液が好適であることがわかる。

（２４０ｇスケール製剤）
１ｍｇ／ｍＬトコフェロール（Ｅミックス８０又はＥミックス７０Ｌ）／１０％エタノール／９０％ヘプタン溶液を調製し、その４０ｍＬとスクワラン１６ｇを充分混合する（混合物Ｂとする）。
細胞壁骨格成分としてＢＣＧ−ＣＷＳ：１６３ｍｇを用いて、混合物Ｂ４．２ｇおよび１０％エタノール／９０％ヘプタン溶液２０ｍＬの混合液に加え、振とうあるいは超音波により室温で分散した。その後、窒素あるいは空気気流下７０℃に加熱しエタノール／ヘプタンを留去した。ついで、０．０２ｗ／ｗ％ポリソルベート８０／５．７％マンニトール水溶液２１２ｇを添加し、ホモミキサーを用いて粗乳化を行い、さらに、１．７４ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０水溶液を添加し本乳化を行った。最後に、２１．８ｇの１０ｗ／ｗ％ポリソルベート８０溶液を添加混合し、ポリソルベート８０最終濃度を１ｗ／ｗ％に調整し、２４０ｇの水中油型エマルション（最終製剤）を得た。
この水中油型エマルション製剤をバイアルに２ｍＬずつ分注し、凍結乾燥を行って本発明の凍結乾燥製剤を得た。凍結乾燥は、凍結乾燥機（ＤＦＭ−０５Ａ−Ｓ特、ＵＬＶＡＣ社製）を用いて行った。

（２４０ｇスケールの比較例製剤）
実施例５と同様の方法で、トコフェロールを添加せずに凍結乾燥製剤を製造した。

本発明の細菌−ＣＷＳを有効成分として含有する凍結乾燥製剤は、優れた長期保存安定性を有する癌免疫療法剤として有用である。

Claims (7)

1. ウシ型結核菌Ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ細胞壁骨格成分（ＢＣＧ−ＣＷＳ）、油及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する水中油型エマルションの凍結乾燥製剤であって、
   更に抗酸化剤としてトコフェロール、
   緩衝剤としてリン酸塩、
   賦形剤としてマンニトール
   を含有し、
   当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られるＢＣＧ−ＣＷＳの濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌである水中油型エマルションのｐＨが、ｐＨ５．５〜８．５に調節される
   ことを特徴とする、凍結乾燥製剤。
2. 当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られるＢＣＧ−ＣＷＳの濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌである水中油型エマルションにおける緩衝剤の濃度が、約１０〜２０ｍＭになるべく調製されていることを特徴とすることを特徴とする、請求項１に記載の凍結乾燥製剤。
3. 上記ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルがポリソルベート８０である、請求項１または２に記載の凍結乾燥製剤。
4. 以下の（１）及び（２）の特徴を有する請求項１〜３のいずれかに記載の凍結乾燥製剤：
   （１）８０℃下で３０日間保存した場合、ミコール酸の遊離量が約２％以内であり、
   （２）８０℃下で３０日間保存した後に、当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られるＢＣＧ−ＣＷＳの濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌである水中油型エマルションのｐＨ値が、保存前のｐＨと実質的に同等である。
5. 請求項１〜４のいずれかに記載の凍結乾燥製剤に水性溶媒を添加して得られる、水中油型エマルション製剤。
6. ＢＣＧ−ＣＷＳ、油及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含有する凍結乾燥製剤に、
   抗酸化剤のトコフェロールを安定化剤として配合し、
   更に緩衝剤のリン酸塩を配合して、当該凍結乾燥製剤を水で復水して得られるＢＣＧ−ＣＷＳの濃度が０．５ｍｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌである水中油型エマルションのｐＨがｐＨ５．５〜８．５になるように調整する
   ことによって、前記凍結乾燥製剤中のＢＣＧ−ＣＷＳに長期保存安定性を与えることを特徴とする、前記凍結乾燥製剤の安定化方法。
7. トコフェロールを有効成分として含有する、請求項１〜５のいずれかに記載の水中油型エマルション又はその凍結乾燥製剤の安定化促進剤。